Citologia e Istologia - lezione

Le grandezze lineari. Dal corso di fisica si dovrebbe già conoscere il metro e il millimetro; al di

sotto del millimetro, le scale vanno di mille in mille, le microscale. In istologia è molto importante il

millesimo di millimetro, il micrometro il cui simbolo è µm (mi greca), chiamato “volgarmente”

micron. Le cellule normalmente misurano intorno ai 10 micron, e si possono vedere al microscopio

ottico, che riesce a distinguere oggetti tanto piccoli quanto 0,2 micron. Questa è la misura più

piccola che il microscopio ottico può distinguere. Questo si chiama potere di risoluzione. Oggetti

vicini, più piccoli di 0,2 µm il microscopio non li distingue, li vede come un unico punto. Ad occhio

nudo, la misura più piccola che si riesce a distinguere è di circa di un decimo di millimetro (poi

dipende da persona a persona). Quindi il microscopio ottimo, da un decimo di mm a due decimi di

µm, è 500 volte più potente dell’occhio umano, cioè può risolvere oggetti 500 volte più piccoli di

quelli che vede l’occhio. Esistono due tipi di microscopio elettronico, invece, uno a scansione e

uno a trasmissione, che comunque hanno circa lo stesso rapporto: sono 500 volte più potenti del

microscopio ottico. Quindi con il microscopio elettronico si possono vedere oggetti dell’ordine di

nanometri (nm) , il millesimo del micron. Certi microscopi elettronici possono andare nell’ordine

teorico al di sotto del nanometro.

Un aspetto importante che chi si affaccia a questa disciplina spesso non avverte è che il

microscopio elettronico ha un potere di risoluzione enorme, mentre il microscopio ottico minore;

ma svolgono due ruoli ben diversi. Ed esempio, il riconoscimento di un tessuto non potrà mai

essere fatto con il microscopio elettronico perché riesce a distinguere oggetti molto piccoli

(dell’ordine di nm), però ha un campo visivo che è al massimo una o poche cellule

contemporaneamente, quindi non ci si può rendere conto di quale tessuto è nella sua complessità.

Quello che il microscopio elettronico vede è una porzione molto piccola, di pochi micron, quindi

non può essere usato per certe cose. Il microscopio ottico, che ha, invece, una risoluzione molto

minore, ha, però, un campo visivo molto grande. L’informazione quindi non viene soltanto dal

potere di risoluzione, ma anche dal contesto. Noi ci possiamo rendere conto delle diverse parti di

un tessuto, ed esempio distinguere le diverse parti dell’osso (midollo, periostio) solo al microscopio

ottico, perché muovendo il vetrino ci spostiamo già di millimetri. Con il microscopio elettronico,

invece, ci possiamo spostare di mezzo micron alla volta, tramite i giri di una rotellina. Tral’altro i

preparati per il microscopio elettronico sono frammenti di un millimetro quadrato, quindi sono molto

piccoli, quindi non consentono al preparato stesso di avere quella grandezza tipica del tessuto.

Lo studio della citologia, dell’istologia, della microscopia in genere, si fa su sezioni. Le sezioni sono

necessarie perché la luce (al microscopio ottico) o gli elettroni (al microscopio elettronico) devono

attraversare il preparato, che deve essere molto sottile. Non solo perché deve essere attraversato,

ma anche perché se fosse grosso noi potremmo anche sparare un fascio di luce capace di

attraversare un tessuto spesso, ma ne uscirebbe un ‘immagine estremamente confusa. Quindi la

sezione è necessaria sia per facilitare il passaggio della luce (o degli elettroni) sia per vedere

nitidamente gli oggetti (se la sezione è grossa gli oggetti si sovrappongono e ne viene fuori

un’immagine molto confusa).

Prima di fare la sezione bisogna stabilizzare il tessuto. In termini tecnici la stabilizzazione si

chiama fissazione. La fissazione è il primo passaggio obbligato. La fissazione rende il tessuto

stabile anche per mesi e anni, quindi le sostanze organiche non sono soggette a quei processi di

deterioramento spontaneo. La fissazione deve essere sempre un compromesso, perché comporta

sempre un’alterazione delle strutture, però è un compromesso necessario, quindi bisogna

scegliere un processo di fissazione che abbia il minimo artefatto. Per l’istologia il fissativo più

utilizzato è la formalina al 4% tamponata. Per certi scopi particolari, si possono utilizzare altri tipi di

fissativi, ed esempio per lo striscio di sangue non si una sa la formalina ma l’alcol etilico. Dopo la

fissazione il tessuto deve essere incluso, per essere sezionato. Incluso vuol dire inglobato

all’interno di una sostanza che poi solidifica e la sostanza è la paraffina. La paraffina si scalda,

diventa liquida (ad una temperatura che non sia eccessiva senno il tessuto rischia la cottura). Ci

sono paraffine che fondono a temperature relativamente basse. Quando solidifica (il tessuto si

presenterà come una macchia all’interno della paraffina) si può sezionare. Esiste una macchina,

molto simili alle affettatrici di salumeria, chiamata microtòmo. Le fette usate per i preparati istologici

dono dell’ordine di 7 micron. Per fare sezioni più piccole (fino ad un micron) è necessario utilizzare

un altro mezzo di inclusione. Dopo aver fatto la sezione, il preparato va colorato. Prima bisogna

togliere la paraffina, e la sezione viene colorata. La colorazione è necessaria perché la sezione di

pochi micron di tessuto, è completamente trasparente, diafana, al microscopio non di vedrebbe

niente. Quindi bisogna evidenziarne i componenti. I coloranti più utilizzati sono due soluzioni

acquose, l’eosina e l’ematossilina. L’eosina colora prevalentemente i gruppi basici, mentre

l’ematossilina colora i gruppi acidi. Nella cellula,tutti gli acidi nucleici, quindi il nucleo e i ribosomi

(se sono molto abbondanti) vengono colorati dall’ematossilina, invece le proteine, che in genere

hanno, prevalenza di gruppi –NH2 sono colorati dell’eosina. Si vedranno nella cellula delle

sfumature viola e delle sfumature rosa che ci consentono di distinguere nuclei, citoplasma e

consentono di vederli abbastanza bene. [fa vedere un’immagine che mostra delle cellule colorate

con la sola ematossilina, in cui si vedono molto bene i nuclei; una in cui le cellule sono colorate

solo con l’eosina; e infine un gruppo di cellule con entrambi i coloranti (sono immagini di cellule

diverse, comunque)]. Quando due coloranti sono assieme di può distinguere il citoplasma in rosa

e i nuclei in viola scuro. Oltre ai nuclei si vedono delle zone violette che indicano le zone di

citoplasma in cui sono presenti molti ribosomi. Tutto ciò si è scoperto solo negli anni ’50, quando si

è potuto vedere che queste zone contenevano i ribosomi, sconosciuti prima dell’utilizzo del

microscopio elettronico. Questo tipo di colorazione è la più usata in tutto il mondo, anche se non è

molto specifica, perché potrebbero esserci nella cellula sostanza di natura acida che non sono

necessariamente ribosomi. Ma va bene per la maggior parte dei casi. Quando ci sono necessità

diverse, si usano altre tecniche che si chiamano tecniche istochimiche in cui si possono mettere in

evidenza dei lipidi, o proteine o degli zuccheri (una qualsiasi molecola in particolare). Ogni

molecola è una colorazione istochimica propria. Da circa trent’anni è stata sviluppata una tecnica

ancora più specifica, che è l’immunofluorescenza (o immunoistochimica). Con questa tecnica si

usano degli anti-corpi, altamente specifici, appositamente creati contro la sostanza da mettere in

evidenza. Prima, però, bisogna legare all’anticorpo un rivelatore, una sostanza fluorescente

oppure una sostanza colorata. Questo è un metodo che non ha limiti alla sua applicabilità ed è

altamente specifico. Il microscopio a fluorescenza ha solitamente un fondo scuro, perché la luce

colpisce il preparato e viene riflessa,e un filtro taglia la lunghezza d’onda della luce che illumina il

preparato. Ciò fa in modo che solo i corpi con attaccati una sostanza fluorescente possano essere

visti, perché la sostanza fluorescente emette una luce con lunghezza d’onda maggiore (ad

esempio, illuminando di blu emetterà una luce gialla o arancione, o verde o rossa; illuminata con

luce gialla potrà emettere una luce rossa, più lunga). In questo modo si può anche battere il limite

di risoluzione del microscopio, perché permette di vedere oggetti più piccoli, perché legati ad una

grandissima quantità di anticorpi che emanano una luce fluorescente che consente di vederli

comunque. Non si vede l’oggetto reale, ma vediamo qualcosa che segue l’oggetto che lo decora.

In questo modo si possono vedere oggetti come i microtubuli o le vescicole che hanno il diametro

di poche decine di nanometri. Un ‘altra cosa interessante delle tecniche di sezione è la possibilità

di giocare con le sezioni. [qui ci sono dei continui riferimenti ad un immagine di un arancia

sezionata in diversi punti che mostra come ad una sezione diversa corrisponda un tipo di

immagine visibile al microscopio diversa]. Si possono avere solo sezioni periferiche, o che

comprendono tutte le parti del tessuto. In istologia si indica con stroma l’architettura portante

dell’organo, con capsula la parete delimitante e con parenchima la “polpa” dell’organo, formato

dalle cellule specifiche dell’organo. Ad esempio il fegato ha un capsula praticamente inesistente,

uno stroma sottilissimo e una grandissima quantità di parenchima, al contrario la milza ha una

capsula molto spessa, uno stroma molto imponente fibroso e il parenchima specifico della milza. Il

tutti gli organi quindi hanno una componente strutturale non specifica, diversa con architetture

differenti a cui si da il nome di stroma e una componente specifica che adempie le funzioni che si

chiama parenchima. Le sezioni presentano un altro problema. Immaginiamo un salsiccia arrotolata

per il barbecue, tagliandola longitudinalmente, ne facciamo la sezione e troviamo tanti oggetti

circolari. Molto spesso nelle sezioni troviamo molti oggetti circolari, che sembrano separati ma in

realtà sono sezioni di un oggetto tubulare, ad esempio, continuo, di un lungo filamento avvolto su

se stesso (ad esempio alcuni organelli come i mitocondri o gli endosomi precoci, possono

sembrare piccoli organelli sferici ma in realtà sono parti di una struttura più grande). Per la

microscopia elettronica i concetti solo gli stessi, c’è una fissazione, un’inclusione (fatta in una

resina), sezione e colorazione. Il microscopio elettronico non utilizza però il fascio di luce, ma un

fascio di elettroni, quindi non esistono i colori al microscopio elettronico (quelli che s