Citologia e Istologia - Appunti

Polo San Paolo Anno 2008-2009

Cellule: unità biologiche elementari

Le cellule sono unità biologiche elementari delimitate rispetto all'ambiente da una struttura sovramolecolare (membrana cellulare o plasmatica). All'interno della cellula c'è il protoplasma (materia vivente), un sistema di macromolecole inorganiche e organiche in grado di svolgere una serie integrata di reazioni. Ogni cellula ha attività vitali.

Attività vitali di base

• Metabolismo: sintesi e demolizioni;
• Adattamento all'ambiente;
• Accrescimento;
• Differenziamento;
• Riproduzione.

Tipi di cellule

• Procariotiche: genoma addensato in masse non delimitato da involucro (nucleoide). Sono cellule che non hanno vita di relazione (unicellulari); dunque non si organizzano in tessuti (strutture sovracellulari).
• Eucariotiche: nucleo delimitato da involucro che contiene il genoma. Possono essere unicellulari (protozoi o protofiti) o pluricellulari. Se hanno le stesse caratteristiche si associano formando tessuti (peculiarità degli eucarioti).

Ogni organo è formato da tessuti diversi, ciascuno in proporzione diversa, tutti indispensabili. Più organi integrati formano gli apparati. È importante in medicina conoscere i tessuti in quanto molte patologie possono essere individuate dal danno tissutale.

Citologia e microscopia

La citologia è nata dopo l'anatomia, questo perché i microscopi sono stati inventati dopo che già da tempo si effettuavano le autopsie. Con il microscopio ottico si è scoperto che i tessuti sono fatti di cellule, con quello elettronico che le cellule si differenziano al loro interno le une dalle altre.

Studi e scoperte sui tessuti

Bishà (?) ha visto che gli organi avevano trame differenti e aveva individuato 21 tessuti (per cui dobbiamo il termine "tessuto" proprio a lui). Con l'utilizzo del microscopio ottico si sono individuati invece solo 4 tessuti con morfologia e funzione diversa:

• Epiteliale: cellule tutte attaccate (a mutuo contatto) con pochissima sostanza intercellulare;
• Connettivi: cellule distanti le une dalle altre. Con molta sostanza intercellulare;
• Muscolari: per contrarsi sono molto lunghi, con capacità di allungarsi e accorciarsi velocemente;
• Nervoso: neuroni hanno prolungamenti di vario tipo che scambiano messaggi con altri neuroni.

Teoria cellulare

Il termine cellula è nato a fine 1600, inizio 1700 perfezionando il microscopio di Galilei (sistema doppio di lenti), tramite il quale Hooke ha potuto osservare il sughero notando la sua struttura di "cellette" vegetali. Da ciò è nata la teoria cellulare per cui "ogni cellula nasce da una cellula preesistente". Si scoprì che un nuovo organismo si forma dalla fusione di due gameti di sesso diverso.

Composizione del protoplasma (materia vivente)

• Acqua 80%
• Sali 1,5%
• Lipidi 2%
• Zuccheri 0,5%
• Acidi nucleici Dna 0,4%
• Rna 0,7%
• Proteine 10%

Le molecole di acqua in quanto dipolari hanno cariche elettrostatiche fra loro, per cui costituiscono un ottimo solvente (per questo le cellule sono piene di acqua). L'acqua si trova in forma dissociata in H⁺ e OH^- (idrogenione e ossidrilione). H⁺ è responsabile del pH. Il pH fisiologico è pari a 7,35.

Le proteine

Le proteine costituiscono il 14% del peso corporeo, sono polimeri di aminoacidi legati da legame peptidico. A seconda della quantità di monomeri si distinguono in:

• Peptidi: piccole catene di aminoacidi;
• Proteine vere e proprie: lunghe catene.

In base ai costituenti si distinguono in:

• Semplici: costituite solo da aminoacidi;
• Complesse o coniugate: con gruppi prostetici che conferiscono funzioni particolari alla proteina. Il gruppo prostetico ha una composizione chimica non aminoacidica (ad es. il ferro nell'emoglobina).

Le proteine hanno strutture:

• Primaria: sequenza degli aminoacidi;
• Secondaria: causata dalle attrazioni all'interno della proteina. Può assumere forme diverse (ventaglio, elica (capelli ricci o lana)). I "domini" sono porzioni di proteine con una determinata struttura;
• Terziaria: ulteriore livello di ripiegamento; struttura spaziale necessaria per la funzione della proteina;
• Quaternaria: organizzazione di più subunità che deve garantire la funzionalità delle proteine (es. la funzionalità dell'emoglobina è condizionata dal mantenimento di una particolare struttura di quattro subunità).

I carboidrati (glucidi)

I carboidrati includono:

• Monosaccaridi: zuccheri non idrolizzabili a più semplici. Hanno nomi diversi a seconda del numero di atomi di carbonio che li costituisce:
  • Triosi;
  • Tetrosi;
  • Pentosi (ribosio (rna); desossiribosio (dna));
  • Esosi (glucosio; fruttosio).
• Oligosaccaridi: 2-10 monosaccaridi. I più attivi biologicamente sono i disaccaridi (saccarosio).
• Polisaccaridi: lunghe catene di zuccheri.
  • Omopolisaccaridi: polimeri dello stesso zucchero (cellulosa; amido; glicogeno (principale fonte energetica cellulare, formato da glucosio. È insolubile per cui si accumula senza variare pressione osmotica. Si accumula in cellule muscolari (si idrolizza per fornire energia) ed epatiche)).
  • Eteropolisaccaridi: costituiti da monomeri diversi.
  • Glicosaminoglicani (GAG) (una volta si dicevano mucopolisaccaridi), cosiddetti perché contengono gruppi ammidici. Sono ricchi di cariche negative (polianioni) per cui molto idrofili e presenti nei tessuti connettivi. Costituiscono i "mattoncini" degli eteropolisaccaridi complessi come:
    • Proteoglicani: vi è un "core" (struttura che fa da "asse") a cui si attaccano i GAG.
    • Glicoproteine: come i proteoglicani, ma invece dei GAG ci sono proteine.

I lipidi

I lipidi non sono solubili in acqua per cui necessitano alcool, etere o benzolo. Questo perché sono fatti in maggioranza da gruppi apolari idrofobici. Possono essere:

• Semplici: non sono idrolizzabili (grasso, olio, cere), in quanto apolari e dunque idrofobi. In genere sono costituiti da glicerolo esterificato con acidi grassi. Questi possono essere:
  • Saturi: poco reattivi. Si attaccano alle arterie formando placche (es. burro);
  • Insaturi: reattivi perché vi sono atomi di carbonio con doppio legame. Per questo motivo hanno due elettroni disponibili per legame e sono quindi molto reattivi. Si accumulano come riserva nelle cellule (olio).
• Complessi: coniugati con un altro gruppo che li rende idrolizzabili (gruppo polare che interagisce con acqua). Questa parte costituirà la membrana cellulare. Questi costituenti di membrana hanno di solito la seguente struttura:
  • Due code di acidi grassi idrofobe;
  • Una testa idrofila polare, se questa è costituita da acido fosforico si hanno i "fosfolipidi", se invece è fatta da un residuo glucidico forma i "glicolipidi".
• Steroidi: acidi grassi esterificati con steroli (colesterolo, ormoni sessuali, alcune vitamine). Sono fatti da piccole quote polari ed una struttura ad anelli policiclici polari.

Acidi nucleici

Sono così detti perché identificati inizialmente nel nucleo, poi si è scoperta la presenza dell'rna nel citoplasma. Dna ed Rna si trovano in tutte le forme di vita (procarioti, eucarioti e virus). Sono polimeri di nucleotidi composti da tre parti:

• Residuo di acido fosforico che si lega ad uno...
• Zucchero pentoso (desossiribosio o ribosio) che si lega ad una...
• Base azotata (adenina, timina, citosina, guanina).

Lo zucchero pentoso e la base azotata senza l'acido fosforico costituiscono un "nucleoside".

Il DNA

Siccome i nucleotidi possono mettersi uno in costa all'altro le combinazioni sono tantissime. È fatto da una doppia elica di filamenti singoli che somiglia ad una scala a pioli dove i pioli sono la parte interna (appaiamento rigoroso delle basi). Diciamo "appaiamento rigoroso" perché l'adenina si lega sempre alla timina con un doppio legame a idrogeno mentre la citosina si lega sempre alla guanina con un triplo legame a idrogeno. La sequenza dei nucleosidi è tenuta insieme dalle molecole di acido fosforico. Il DNA può essere denaturato (separato in due filamenti) a 70°C. I due filamenti sono legati in maniera antiparallela (all'estremità 5' corrisponde l'estremità 3').

La funzione del DNA è duplicare sé stesso con l'enzima replicasi. Può procedere poi alla trascrizione su mRNA ed alla traduzione nel processo di produzione proteica. Non tutte le cellule producono le stesse proteine ma sono specializzate. Un "gene strutturale" contiene l'informazione genetica per una proteina. Tale gene viene trascritto e poi tradotto in proteina. Il DNA è la molecola stabile della cellula.

L'RNA

L'RNA è sia nel nucleo che nel citoplasma, è un acido nucleico fatto di ribosio (invece del desossiribosio) ed invece della timina ha l'uracile. È costituito da un singolo filamento e può essere di tre tipi:

• RNA messaggero (mRNA): nel processo della trascrizione l'mRNA si forma come uno stampo sul DNA aperto, questo poi esce dal nucleo trasportando l'informazione genetica nel citoplasma. È formato da triplette di basi azotate, ad ognuna delle quali corrisponde un aminoacido.
• RNA di trasferimento (tRNA): fatto da anse per cui sembra un trifoglio. Ha un'estremità con tre basi azotate libere che legano un aminoacido a seconda del codone del mRNA legato all'altra estremità (anticodone).
• RNA ribosomiale: quando si riconoscono aminoacido ed mRNA si forma un legame peptidico grazie all'RNA ribosomiale che ha zone elicate legate a proteine. Insieme formano i ribosomi deputati a sintesi proteica.

Unità di misura

La necessità di misure molto piccole è dovuta alla bassa risoluzione dell'occhio umano capace di distinguere due punti a 0,1 mm. Un microscopio ottico giunge alla risoluzione di 0,2 micrometri (una cellula ha dimensioni variabili tra 1 e 100 micrometri).

• Micron (micrometro): vale 10^-6 m
• Nanometro: vale 10^-3 micron; 10^-9 m
• Angstrom: vale 10^-4 micron; 10^-10 m

La struttura della cellula

"La citologia studia la morfologia e la funzione generale delle cellule"

Le fasi dello studio della cellula, storicamente parlando, sono legate alla nascita degli strumenti di ingrandimento: il microscopio ottico prima e quello elettronico dopo. Questi differiscono per il rapporto di risoluzione. Per risolvere nel dettaglio le cellule è utile il microscopio elettronico. Si usa una cellula tipo per studiare i caratteri comuni a tutte le cellule. Le cellule vengono studiate durante il periodo interfasico, ovvero nel lasso di tempo in cui la cellula non si divide, altrimenti le caratteristiche della cellula subirebbero delle variazioni. Per lo studio si utilizzano cellule sezionate. Dal momento che il nucleo si trova generalmente al centro della cellula, una eventuale sezione presenta il nucleo nel centro geometrico della cellula.

Struttura della cellula

La cellula è racchiusa da una membrana cellulare. Al centro vi è il nucleo rivestito da una membrana nucleare. Fra la membrana cellulare ed il nucleo vi è il citoplasma che contiene una "sostanza fondamentale" o "ialoplasma" (parte bianca, "amorfa" della cellula) in cui ci sono metaboliti non visibili e organelli cellulari e mitocondri responsabili della produzione di energia e del metabolismo cellulare.

• Reticolo endoplasmatico:
  • Granulare: struttura a cui aderiscono i ribosomi (nella diapositiva i puntini neri) responsabili della sintesi delle proteine;
  • Liscio: insieme di membrane che si occupano della sintesi di materiale lipidico.
• Apparato di Golgi: cisterne appiattite e sovrapposte. Entità allungate delimitate da membrana.
• Centrioli: utili alla divisione cellulare.
• Inclusioni citoplasmatiche: gocce lipidiche, glicogeno (materiali di riserva per la cellula). Il materiale più esterno è più consistente ed è detto ectoplasma, quello più interno è meno consistente ed è detto endoplasma.

L'analisi cellulare

L'analisi cellulare si caratterizza per un approccio funzionale e morfologico per avere informazioni di tipo sia qualitativo che quantitativo sulle cellule. Si possono effettuare analisi di tipo biochimico, fisiologico e morfologico (queste ultime descrivono le forme a cui far corrispondere una caratterizzazione chimica).

Esempio di analisi biochimica

• Prelevamento tessuto: (es. un pezzetto di fegato) che contiene sia cellule epatiche che cellule di capillari;
• Omogeneizzazione: rottura del tessuto con un pestello o delle lame;
• Centrifugazione: rotazioni con velocità crescente durante i vari passaggi. La parte più leggera va in alto (surnatante o sovranatante), quella più pesante va in basso. Si preleva il surnatante e si conserva. Si centrifuga il rimanente e si ricava un surnatante di mitocondri. Prelevati i mitocondri, si centrifuga il resto e si ottengono microsomi che non esistono come tali nella cellula ma sono prodotti della centrifugazione. Centrifugando i microsomi si ottengono in basso ribosomi e in alto proteine del reticolo endoplasmatico liscio (derivante anche dal rugoso per perdita di ribosomi, quindi non si può stabilire la derivazione dal reticolo endoplasmatico liscio o rugoso). Nella centrifugazione si imprimono un certo numero di giri a seconda del componente cellulare che si vuole isolare.

Esempio di analisi morfologica

Si può considerare l'analisi morfologica da due punti di vista diversi: la microscopia ottica e quella elettronica che richiedono procedure diverse. Bisogna inoltre considerare la possibilità di fare un'analisi del campione vivo o meno. Il campione vivo presenta però delle limitazioni: non si può sezionare e guardare all'interno. Per vederli meglio e sezionarli i tessuti vanno resi "stabili", ovvero vanno uccisi e "fissati" dopo essere stati prelevati.

Fissazione

Può essere fisica o chimica. Deve preservare cellule e strutture cellulari dalla decomposizione che le altera in modo che mantengano le loro caratteristiche.

Come trarre informazioni da preparati vivi

Si prende un animale vivo, si fa una incisione, si mette al suo interno una piccola lastra di plexiglas e si prelevano delle cellule. Le cellule, essendo per la maggior parte costituite d'acqua, sono incolori (ciò è una limitazione, in quanto sono necessari ulteriori processi di colorazione per uno studio efficace del campione).

Per l'osservazione diretta si utilizzano delle colture: embrionali, tessutali, cellulari. Il processo di coltura ha però delle limitazioni. Si prende un pezzo di organo di embrione; possiamo notare la risposta alle diverse condizioni di crescita (ai diversi terreni di coltura). Dunque si sigilla la coltura sul vetrino. Il tutto non è colorato e sezionato, dunque sono limitato nell'osservazione.

Colture cellulari (presentano delle limitazioni)

Il frammento viene separato attraverso un enzima: la tripsina (il processo è detto tripsinizzazione). Si usa una bottiglia trasparente (si può così vedere all'interno) con un'apertura. Le cellule cominciano a crescere e possiamo prelevarle o riseminarle. Queste iniziano una fase di crescita con aumento di numero esponenziale fino al raggiungimento di un "plateau", dopo il quale il numero delle cellule inizia a diminuire. Si tratta di un comportamento, che avviene nel terreno di cultura simile a quello che le stesse cellule hanno all'interno dell'organismo, come se conservassero una "memoria" dell'organismo. Tuttavia alcune cellule perdono la capacità di dividersi forse perché sviluppano un corredo poliploide (limitazione). Ci sono anche cellule che non smettono di dividersi (cellule neoplastiche (tumorali)), utili ai ricercatori per studiare delle cure antitumorali in quanto è facile nelle colture osservarne il comportamento.

Tuttavia non è possibile una buona osservazione: conviene vederle colorate in vivo. Per fare ciò si utilizzano dei coloranti vitali o sopravitali. La china è un colorante vitale che si può iniettare nell'animale. I coloranti sopravitali si utilizzano direttamente sui tessuti prelevati (come il verde Janus che mantiene il colore fino a che non viene metabolizzato, poi cambia colore ed in seguito diviene tossico).

Come trarre informazioni da preparati morti

Un altro approccio possibile è l'uccisione del tessuto mantenendone intatte le caratteristiche (fissazione). In riferimento alla microscopia ottica la fissazione può essere:

• Fisica;
• Chimica.

Fissazione fisica

Un preparato da conservare con fissazione fisica impiega o il congelamento rapido o l'essiccamento dopodiché è possibile l'osservazione al microscopio ottico.

Il congelamento: si utilizza nelle biopsie quando si vogliono delle informazioni sulle strutture cellulari che verrebbero alterate se utilizzassimo sostanze chimiche, il congelamento infatti non altera le strutture cellulari. Si effettua utilizzando l'azoto liquido a -180°C. Una volta congelato e divenuto un blocchettino rigido si può trasportare con un "criostato" che ha una temperatura variabile da -40°C a -10°C a seconda del tessuto. Il pezzo prelevato viene montato su di una lama e viene sezionato ruotando una manopola che attiva la lama d'acciaio. Si può fare direttamente una diagnosi. Si possono ora fare rapide sezioni per identificare elementi.

Essiccamento (di uno striscio di sangue): si prende una goccia di sangue, si poggia su un vetrino e con un vetrino inclinato si striscia il sangue per spargerlo. Si lascia asciugare e si colora col "Rait" e si può vedere al microscopio ottico.