Citologia Colombo

Acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono polimeri informazionali di grande importanza biologica poiché regolano tutti i processi vitali e la costruzione della cellula. Esistono due tipi di acidi nucleici nelle cellule, il DNA e l'RNA: tRNA (trasportatore di aminoacidi), rRNA (componente ribosomiale), mRNA (determina la sequenza primaria di una proteina).

I monomeri degli acidi nucleici sono definiti nucleotidi.

Nucleoside

Zucchero + Base Azotata

I nucleotidi

Ogni nucleotide presenta la stessa struttura generale: Zucchero + Base Azotata + Gruppo Fosfato.

Zucchero

Esistono due zuccheri negli acidi nucleici: il Ribosio (RNA, ATP, GTP) e il Desossiribosio (DNA). Nella formazione di un nucleotide esistono precise regole con cui i carboni dello zucchero si legano agli altri componenti del monomero:

• Il C-1’ lega la base azotata
• Al C-3’ si lega un altro monomero
• Il C-5’ lega il gruppo fosfato ed ha la particolarità di legare, oltre al gruppo ossidrile, due atomi di H

Base azotata

Le basi azotate sono la parte variabile di ogni nucleotide ed è in questa variabilità che risiede l’informazione genetica portata dal DNA. Sono composti aromatici idrofobici. Si dividono in purine (due anelli, uno esatomico e uno pentatomico) e pirimidine (singolo anello esatomico). Le purine sono la Guanina e l'Adenosina, le pirimidine sono la Citosina, la Timina (DNA) e l’Uracile (RNA).

Una base a doppio anello si lega sempre ad una base a singolo anello ed in particolare le coppie, nel DNA, risultano essere A-T (formazione di 2 legami) e G-C (formazione di 3 legami). Oltre che ad essere le coppie chimicamente più stabili, l’ingombro sterico di questi legami è lo stesso conferendo stabilità all’intera molecola di DNA.

Gruppo fosfato

Il gruppo fosfato ha formula bruta (PO₄)^3-. Le tre cariche negative spesso sono neutralizzate da ioni H⁺ che trasformano lo ione in acido fosforico H₃PO₄. Ha la possibilità di formare 3 legami con altre molecole, uno di essi si formerà sempre con il C-5’ dello zucchero.

Legame fosfodiesterico

Questo tipo di legame è alla base dell’incatenamento di diversi nucleotidi. Si forma a seguito di una reazione di condensazione tra il gruppo ossidrile del C-3’, che viene completamente perso, e un gruppo -OH del gruppo fosfato che cede l’atomo di idrogeno restante per liberare acqua. L’atomo di ossigeno del gruppo fosfato satura i suoi due legami con P e C-3’.

Si forma naturalmente una polarizzazione della molecola di DNA con l’identificazione di un’estremità 5’, in cui il gruppo fosfato resta vincolato solo al C-5’, e una 3’, in cui il C-3’ lega un gruppo OH. La direzionalità è importante per le macromolecole biologiche per favorire l’inserimento di enzimi.

Energia di legame

L’energia per la formazione di questi legami, ed anche per altri processi biologici, deriva dalla molecola di ATP, o più raramente di GTP. L’Adenosin-Trifosfato è un nucleoside con 3 gruppi fosfati legati al C-5’. La rottura dei legami fosfoanidridici tra i due gruppi fosfati più esterni libera l’energia necessaria per molti processi.

Il DNA

L’Acido Desossibonucleico è l’informazione genetica di ogni essere vivente. È una molecola con struttura elicoidale formata da 2 filamenti polinucleotidici antiparalleli e complementari. L’antiparallelismo comporta la direzione opposta dei due filamenti. Esiste un asse immaginario comune attorno a cui si avvolgono i due filamenti. La struttura portante è chiamata Scheletro Zucchero-Fosfato.

Su ogni molecola di DNA si identificano tratti codificanti chiamati geni. Gene: Tratto di DNA che porta l’informazione per trascrivere un tipo di RNA. La parte esterna del DNA ha caratteristiche idrofiliche poiché a contatto con l’ambiente intracellulare o intranucleare.

L’appaiamento delle basi viene favorito energeticamente da:

• Ingombro sterico costante
• Formazione del maggior numero di legami H

TATA Box: Punti deboli del DNA corrispondenti a sequenze ATATAT. In presenza di queste sequenze si aprono contemporaneamente molte bolle di replicazione da cui inizia la duplicazione.

Storia del DNA

Watson e Crick nel 1953 definirono la struttura del DNA grazie alla quale vinsero il premio Nobel una decina di anni dopo. Furono aiutati nel loro lavoro da Rosalind Franklin (cristallografa) e Chargaff (biochimico). I lavori di cristallografia determinarono:

• Struttura lunga e sottile della molecola con elementi ripetitivi
• Molecola elicoidale a doppio filamento
• Forma B-DNA

Chargaff scoprì che le concentrazioni di A-T (C-G) erano uguali. Nel 1958 Meselson e Stahl scoprirono la duplicazione semiconservativa. Nel 1961 Kornberg scoprì l’antiparallelismo.

Dimensioni

Due nucleotidi adiacenti sono distanti circa 0.34 nm. Il diametro della molecola è di circa 2 nm.

Conformazione

Nel DNA si identificano solchi maggiori e solchi minori che servono ad ospitare le proteine istoniche, gli istone (nel solco maggiore).

• B-DNA: Doppia elica destrorsa → Biologicamente attiva
• Z-DNA: Doppia elica sinistrorsa → Inattiva e artificiale. Non presenta la sequenza di solchi adatta ad ospitare gli istoni.

Ruolo biologico

Immagazzinare e rendere disponibile l’informazione biologica per trascrivere gli RNA. Il DNA è la molecola stampo e i nucleotidi vengono inseriti in seguito ad una specifica interazione tra basi. ATP e ADP sono nucleotidi energizzanti.

Complesso di Golgi

Il Golgi è un complesso suddivisibile in compartimenti ognuno con una funzione specifica. Fu scoperto da Camillo Golgi nel 1898 durante un test di colorazione cellulare con nitrato d’argento. È un complesso di 3 fino a 20 cisterne impilate una sopra l’altra, l’intero complesso possiede una polarità. Dal punto di vista funzionale è correlato al RER in quanto coinvolto nel traffico vescicolare e il trasporto e sintesi di proteine. Le vescicole gemmano o si fondono sempre dal dominio laterale di una cisterna del Golgi.

Durante la divisione cellulare si è notato come il Golgi scompaia per poi riformarsi nelle cellule figlie: un caso limite è rappresentato dagli spermatozoi in cui la “vescicola acrosomiale” è di derivazione golgiana ma c’è la totale assenza di altre vescicole. Per spiegare questo comportamento si è ipotizzato che un gruppo di proteine fibrose formano una matrice di Golgi a livello del citoplasma che aiuti poi la ricostruzione del complesso dopo la divisione cellulare.

Nel Golgi continua la glicosilazione delle proteine mediata dalla Glicosil-transferasi in conformazioni diverse a seconda della cisterna in cui la proteina si trova. Gli oligosaccaridi servono a instaurare legami covalenti coi gruppi R, la glicosilazione dipende dalla struttura tridimensionale della proteina. Il complesso di Golgi svolge anche la funzione di sintesi di polisaccaridi complessi come i glicosamminoglicani (GAG), pectine ed emicellulosa.

Ad oggi non si sa ancora bene come l’apparato del Golgi si comporti, coesistono due modelli che descrivono il suo funzionamento:

Modello trasporto vescicolare

Ipotizzato nei primi anni ’90, si basa sul fatto che le vescicole trasportino il carico proteico.

ERGIC: Endoplasmic Reticolum Golgi Intermediate Compartment, Struttura intermedia tra il RER e il Golgi dove le vescicole si accumulano fondendosi tra di loro.

L’apparato del Golgi è una struttura polarizzata perché si possono identificare due estremità diverse:

• CGN: Regione cis-Golgi formato da una rete di tubuli e vescicole, questo è il lato di formazione poiché le vescicole dell’ERGIC entrano a far parte del Golgi
• TGN: Regione trans-Golgi è il lato di maturazione dove le vescicole contenenti carichi proteici definitivi si staccano

Il cammino di una generica proteina prevede le seguenti tappe:

• Uscita dal RER tramite una vescicola e accumulo nel ERGIC
• Cis-Golgi network: Fosforilazione degli oligosaccaridi, funzione di smistamento
• Cis-cisterna: Rimozione dei residui di mannosio
• Cisterma mediale: Aggiunta di GlcNAc (una glucosammina) e rimozione del mannosio
• Tras-Cisterna: Aggiunta del galattosio o dell’acido sialico (a opera della Sialil-transferasi)
• Trans-Golgi network: Solfatazione e centro di smistamento per la destinazione finale
• Lisosomi, Membrana Plasmatica o Vescicole di secrezione

Il passaggio da una regione all’altra è mediato da vescicole anterograde. Questo modello è sostenuto da due principali evidenze:

• Ciascuna cisterna ha un corredo enzimatico residente peculiare
• Le vescicole gemmano dai margini esterni delle cisterne

Modello maturazione delle cisterne

Teoria del 1985 secondo la quale ogni cisterna si muove in direzione cis-trans cambiando composizione durante la marcia. Le vescicole compiono anche dei movimenti retrogradi riportando indietro carichi enzimatici utili. Questa teoria è sostenuta da tre principali evidenze:

• Il complesso di Golgi è dinamico, soprattutto in fase di divisione cellulare
• Alcuni materiale viaggiano dal RER al Golgi senza mai uscire dalle cisterne, un esempio è il precollagene dei fibroblasti
• Sono state osservate vescicole retrograde come meccanismo di recupero

Alcuni biologi sostengono tuttavia che questi due modelli possano coesistere tra di loro.

Giunzioni

Le giunzioni sono specializzazioni cellulari tipiche di cellule che devono stare in associazioni stabili nel tempo con l’obbiettivo di formare un tessuto o un organo. Richiedono specializzazioni delle membrane plasmatiche nei punti di contatto tra le due cellule o con la matrice extracellulare.

Complesso giunzionale: Insieme di diverse giunzioni con diverse funzioni, tipico delle cellule dei tessuti epiteliali, si compone di:

• Tight junction
• Fascia di adesione
• Desmosoma
• Giunzione gap

Sono caratterizzate da un ampio pool di proteine transmembrana prodotte da un’ampia gamma di mRNA e trasportate poi da opportune vescicole. Vengono coinvolte anche proteine ponte per bloccare le proteine transmembrana agli elementi citoscheletrici.

Classificazione

• Occludenti: Localizzate nella parte apicale della cellula, a livello del cortex, impediscono il passaggio di materiale negli spazi intracellulari
  • Giunzioni strette (vertebrati)
  • Giunzioni settate (invertebrati)
• Di ancoraggio: Assicurano l’aderenza tra cellule o con la lamina basale
  • Giunzione aderente: cellula-cellula con microfilamenti
  • Contatto focale: cellula-matrice con microfilamenti
  • Desmosomi: cellula-cellula con filamenti intermedi
  • Emidesmosomi: cellula-matrice con filamenti intermedi
• Comunicanti: Mettono in comunicazione fisica i citoplasmi (sincizi) permettendo il passaggio di molecole. Hanno conformazione “Aperta” o “Chiusa”
  • Giunzioni gap

Giunzione occludente

Anastomizzano porzioni di membrana cellulare, le proteine stanno tra i due doppi strati fosfolipidici formando uno schema a rete. Le proteine coinvolte nella formazione della rete sono la “Occludina” e la “Claudina”. Queste giunzioni sono localizzate nella porzione apicale della cellula con funzione di barriera contro la diffusione paracellulare.

Nelle giunzioni di ancoraggio si formano robuste unità strutturali di proteine coadiuvate da elementi citoscheletrici. Per ogni giunzione di ancoraggio lo schema è sempre lo stesso: due “Proteine linker transmembrana” dello stesso tipo si uniscono nello spazio extracellulare e sono sostenute da un connettore proteico intracellulare che le lega alla componente citoscheletrica della cellula di appartenenza.

Giunzione aderente

Tipiche degli epiteli, formano cinture che circondano le cellule.

• Proteina linker: Caderina
• Componente citoscheletrica: Actina tenuta in fasci da α-actinina
• Connettore proteico:
  • α-catenina che lega l’Actina
  • β-catenina che si lega al linker

Le due catenine si legano tra di loro per assicurare stabilità e connessione tra il linker e la componente citoscheletrica. Interviene anche la “catenina p-120” che si aggancia alla porzione citosolica della Caderina e alla β-catenina regolando la resistenza della giunzione, essa funziona come componente della via di trasduzione del segnale.

Desmosoma

• Proteina linker:
  • Desmogleina
  • Desmocollina
• Componente citoscheletrica: Filamenti intermedi
• Connettore proteico:
  • Desmoplachina che lega i filamenti
  • Placoglobina che lega il dominio citosolico del linker

Un desmosoma separa le membrane di circa 25-35 nm. I filamenti intermedi si ripiegano nel momento in cui si legano alla Desmoplachina per aumentare la resistenza allo stress meccanico.

Giunzioni gap

Instaurano una comunicazione elettron-chimica tra due cellule adiacenti. Una giunzione gap è formata da molti canali proteici, ciascuno dei quali si chiama “Connessone”. Un connessone è un agglomerato esaproteico di sole “Connessine”. La chiusura di un Connessone dipende dal cambiamento di voltaggio, dalla fosforilazione della Connessina o dai livelli di Ca²⁺.

Contatto focale

L’Integrina si lega a ligandi extracellulari che ne modificano la conformazione favorendone il legame con i filamenti di collagene extracellulari per garantire l’unione della cellula alla matrice extracellulare. Se l’integrina è una β-Integrina il legame tra collagene e integrina è mediata dalla “Fibronectina”. Si deduce che α-Integrina e collagene si legano direttamente. La “Vinculina” sul lato citosolico media il legame tra i filamenti di actina e la α-actinina che a sua volta lega la caderina. Ogni caderina sul lato extracellulare lega l’integrina. I filamenti di actina citoscheletrici sono tenuti in fasci dalla miosina. Le adesioni focali sono strutture dinamiche che si disassemblano durante la mitosi.

Emidesmosoma

È metà desmosoma, la proteina linker è della famiglia delle integrine. Si trovano sulla regione basale della cellula per legarla alla membrana basale. Le integrine sul lato citoplasmatico hanno come proteina connettore la “Plectina” che le fissa ai filamenti intermedi. Le integrine sul lato extracellulare prendono contatto con le “Laminine”: proteine matriciali.

I ribosomi

Un ribosoma è formato da due subunità diverse tra loro composte da rRNA e proteine, si distinguono in:

• Subunità maggiore: RNA 28s + RNA 5,8s + RNA 5s
• Subunità minore: RNA 18s

Tra questi il 28s, 18s e 5.8s derivano da un solo trascritto che viene poi tagliato da una “nucleasi”, mentre il 5s proviene da un precursore diverso di RNA sintetizzato fuori dal nucleolo e secondariamente importato. L’rRNA neosintetizzato si ripiega in alcuni suoi tratti per appaiamento tra basi e a livello di questi ripiegamenti si associano le proteine. In un ribosoma si identificano 4 siti specifici:

• Sito attivo: Sulla subunità minore dove l’mRNA si lega per essere tradotto.
• Sito A (amminoacile): Sito in cui i tRNA si agganciano dopo l’inizio della traduzione.
• Sito P (peptidile): Sito in cui il primo tRNA si aggancia.
• Sito E (exit): Sito dove il tRNA libero torna nel citosol.

I ribosomi catalizzano il legame peptidico tra due aminoacidi, forniscono il supporto meccanico e strutturale alla sintesi proteica.

Struttura del tRNA

Sono composti da 53 a 73 nucleotidi. A livello delle anse (3 su ciascun tRNA) ci sono 10 basi modificate post-trascrizione. Su ogni tRNA si identifica un sito “ACC” sulla sua estremità 3’ in cui si legano gli aminoacidi per condensazione tra il gruppo -COOH (aa) e -OH (tRNA) con formazione di un legame esterico. Per il tRNA maturo si parla di una conformazione a trifoglio.

Aminoacil-tRNA sintetasi

Enzima che lega l’aminoacido al tRNA corrispondente. Esistono 20 aminoacil-tRNA sintetasi diverse nell’uomo.

Traduzione

Per la traduzione sono richiesti:

• mRNA
• Fattori di inizio
• tRNA
• Ribosoma

La traduzione inizia con la sequenza AUG che specifica per la Metionina che è incorporata all’estremità N-terminale della catena nascente, essa viene poi tagliata via alla fine della sintesi. Ci sono due tRNA diversi per la Metionina: uno per l’inizio della traduzione e l’altro per l’effettivo inserimento dell’aminoacido della catena polipeptidica. Il ribosoma legge l’mRNA andando incontro a cambiamenti meccanici. La sequenza di triplette del mRNA determina la sequenza di aminoacil-tRNA sintetasi che il ribosoma usa. Gli rRNA dei ribosomi selezionano i tRNA assicurando l’accuratezza della trascrizione. Essi legano anche enzimi regolatori e catalizzano per il legame peptidico che essendo spontaneo non richiede l’utilizzo di ATP. Una componente proteica regola l’assemblaggio delle subunità e controlla il cambiamento meccanico.

I fattori d’inizio favoriscono:

• La preparazione della subunità minore per legare l’mRNA
• La stabilità di questo legame
• Il legame Metionil-tRNA alla subunità minore nel sito P

Il tRNA si colloca col criterio “codone-anticodone” portando il suo aminoacido nel sito A. Si forma il legame peptidico tra i due aminoacidi. Il complesso slitta in avanti, il primo tRNA va nel sito E rendono disponibile il sito A all’arrivo di un altro tRNA. Quando il tRNA finisce nel sito E viene traslocato altrove.

Il nucleo

Il nucleo è il deposito dell’informazione genica e centro di controllo della cellula. In ogni nucleo si individuano al massimo due nucleoli: siti di sintesi degli rRNA e di assemblaggio delle subunità ribosomiali. L’informazione contenuta nel DNA deve essere trasmessa: Alla generazione successiva e coordinata alla sintesi proteica.