Citochinine e gibberelline

Citochinine

La prima citochinina (CK) fu scoperta mentre si stavano cercando sostanze che fossero in grado di stimolare la crescita per divisione in colture di tessuti vegetali. Nel 1950 il gruppo di Skoog, avendo trovato che derivati dell’adenina stimolavano la divisione cellulare, iniziò a sospettare che tale effetto fosse riconducibile agli acidi nucleici. Per questo utilizzò estratti derivanti da spermi di aringa autoclavati e dimostrò che avevano un potente effetto stimolante la divisione cellulare.

Nel 1955, Miller e collaboratori, identificarono il composto come 6-furfurilamminopurina e lo denominarono chinetina. Si trattava comunque di un composto non naturale, ma di un prodotto di decomposizione del DNA in cui il deossiribosio dell’adenosina è convertito in furano che è distaccato dalla posizione 9 ed attaccato in posizione 6 dell’adenina. Il gruppo di Skoog dimostrò che la chinetina promuove in coltura la divisione cellulare e la formazione di organi: Fu dimostrato che IAA e chinetina agiscono in modo antagonista e che il rapporto delle loro concentrazioni è critico, poiché ha effetti diversi sull’organogenesi (calli, radici e fusti).

Totipotenza

È presente solo in poche cellule animali (cellule staminali), mentre è generalizzabile, con rare eccezioni (xilema e floema), alle cellule di tutti i tessuti vegetali.

Struttura delle citochinine

Nel 1973 Letham isolò la prima CK naturale da estratti di endospemi immaturi di mais e la chiamò zeatina. Poiché la catena laterale della zeatina ha un doppio legame, questa CK può esistere nella configurazione cis o trans, presenti entrambe nelle piante (anche se la forma trans è biologicamente più attiva). La zeatina è stata poi trovata in molte altre specie vegetali e rappresenta la CK prevalente. Le altre due CK naturali sono la diidrozeatina e la isopenteniladenina, che differiscono dalla zeatina per il gruppo sostituente in posizione N6.

Esistono anche forme coniugate delle citochinine con zuccheri come il ribosio (ribosidi e ribotidi, se il ribosio porta un fosfato) o con altri zuccheri. Le CK biologicamente attive sono quelle a forma libera (senza ribosio o altri zuccheri). Le CK sono presenti anche come forme legate: nel tRNA della serina del lievito di birra si nota nelle adiacenze della estremità 3’ dell’anticodone la presenza dell’isopentenil adenosina. Tale CK è stata anche ritrovata nei tRNA della cisteina, fenilalanina, leucina, triptofano e tirosina. La funzione delle CK legate potrebbe essere di signaling ormonale oppure di riserva di CK quando il tRNA è degradato.

Biosintesi e catabolismo

La scoperta dei geni per la sintesi delle CK è dovuta all’induzione del tumore del colletto da Agrobacterium tumefaciens. Esso penetra in una lesione sull’epidermide della pianta, poi il suo plasmide Ti penetra la cellula vegetale e si inserisce nel suo genoma. Queste cellule proliferano formando la massa tumorale. Il gene IPT del T-DNA codifica per l’enzima isopentenil transferasi (IPT). Inoltre il T-DNA (geni tmr, tumor) contiene due geni codificanti enzimi della biosintesi di auxine (da triptofano ad IAA). I tre geni suddetti sono chiamati fito-oncogeni poiché possono indurre tumori nelle piante.

Essendo i promotori di questi geni presenti solo nelle piante, non sono espressi nei batteri. La loro trascrizione nelle piante porta alla produzione di auxina, CK e opine (composti contenenti C e N per la nutrizione dei batteri, ma non delle piante). Il gene batterico IPT è stato usato per isolare i geni IPT di piante. Le proteine codificate da questi geni sono state espresse in E. coli e studiate. Si è così capito che l’enzima IPT vegetale usa ATP e ADP come substrati a differenza del batterico che preferisce l’AMP. Inoltre derivando la porzione terpenica dal MEP (metileritriolo fosfato) anziché dal mevalonato, la sua biosintesi avviene nei plastidi. Arabidopsis e riso codificano 7 e 8 geni IPT, rispettivamente. AtIPT2 (e AtIPT9) codificano per un enzima, la tRNAIPT, che usa il tRNA come substrato.

Biosintesi della principale CK: la trans-zeatina

I substrati preferenziali di IPT sono ATP o ADP e DMAPP (dimetilallil difosfato) che deriva dalla biosintesi del MEP. I precursori delle CK biologicamente attive, iPDP o iPTP, possono essere idrossilati dalla citocromo P450 monoossigenasi (CYP735A) per produrre tZDP o tZTP, precursori di tZ. Perciò l’attività di CYP735A contribuisce all’abbondanza relativa di iP oppure di tZ. Come è perso il ribosio fosfato? CK riboside 5'-monofosfato sono convertite direttamente per via enzimatica in CK attive. L’enzima coinvolto è stato scoperto analizzando il mutante di riso (Oryza sativa) lonely guy (log), caratterizzato dal meristema apicale difettoso e incapace di funzionare.

Il gene LOG codifica per l’enzima CK riboside 5'-monofosfato-fosforibosio idrolasi che rilascia direttamente CK base e ribosio 5’monofosfato. Il nome lonely guy (log) del mutante deriva dal fatto che i fiori contengono un solo elemento staminale (lonely = singolo e guy = “tipo”, individuo; ricorda che lo stame è l’organo riproduttivo maschile), mentre non presentano pistilli. La distribuzione spazio-temporale delle citochinine attive è regolata da enzimi metabolici. Una sovraespressione ectopica di LOG causa fenotipi pleiotropici, come la riduzione della dominanza apicale e il ritardo della senescenza fogliare.

Catabolismo e coniugazione delle CK

Le CK sono degradate in modo irreversibile (ossidazione) o coniugate con zuccheri (reversibile). La CK ossidasi è distribuita in tutti i tessuti della pianta. L’enzima è incapace di ossidare le forme coniugate delle CKs. La CK-glucosiltransferasi lega il glucosio in posizione 7 alle CKs, mentre la CK-β-glucosidasi idrolizza il glucoside. Le CKs coniugate rappresenterebbero forme di trasporto e di riserva inattive.

Trasporto

Esperimenti con innesti tra il wild-type e i mutanti ipt1;3;5;7 rivelano che le CKs agiscono come segnali mobili a lunga distanza: I mutanti ipt1;3;5;7 presentano fusti molto stretti con scarse ramificazioni secondarie ed incapacità a differenziare il cambio cribrovascolare. Questo fenotipo è “salvato” innestandolo col fusto o con la radice del wild-type. Queste ricerche dimostrano che:

• Le CKs sono trasportate a lunga distanza a partire sia dal fusto che dalla radice agendo da segnali mobili;
• Le CKs sono essenziali nella differenziazione del cambio.

Le CKs agiscono anche come segnali paracrini: L’induzione localizzata (nodo) del gene IPT promuove la crescita delle gemme laterali (rilascio della dominanza apicale) solo al livello del nodo indotto. Ciò indica che le CKs sintetizzate agiscono solo localmente, appunto come un segnale paracrino. Autocrino: sistema di segnalazione cellulare in cui la CK prodotta da una cellula, modifica il comportamento della cellula stessa. Paracrino: sistema di segnalazione cellulare in cui la CK prodotta da una cellula, modifica il comportamento delle cellule circostanti.

Trasporto della citochinina attraverso la membrana plasmatica

- Le permeasi AtPUP1, 2 e 14 possono trasportare ck libere, come iP e tZ, in simporto con protoni. - I trasportatori ENT trasportano ck ribosidi come iPR e tZR. La famiglia ENT è stata osservata anche in animali, funghi e batteri e facilita la diffusione dei nucleosidi secondo gradiente.

1. CKs iP sono convertite in tZ nelle cellule della radice.

2,3. Le CKs sono esportate nello xilema da ABCG14 verso il germoglio.

4. La permeasi PUP14 trasporta citochinine attive dall’apoplasto.

5. Di conseguenza la riserva di citochinine nell’apoplasto viene consumata e la percezione di ck è soppressa. Viene quindi inibita la segnalazione cellulare di citochinine.

Modello del trasporto delle CKs attraverso la membrana plasmatica

L’assorbimento di nitrato da parte delle radici induce l’espressione di IPT3, gene della biosintesi delle ck, che induce la traslocazione delle ck tZR attraverso lo xilema. La ck trans idrolasi è coinvolta nella sintesi di tZR. Quest’ultima è traslocata verso l’alto lungo lo xilema grazie al flusso causato dalla traspirazione.

Le iP nel floema invece viaggiano verso il basso o verso i tessuti.

Organizzazione del TCSS (sistema di trasduzione del segnale a due componenti)

Il TCSS comprende un recettore chinasi SK e un regolatore di risposta RR. Il dominio input del SK riconosce uno specifico segnale esterno. Questo segnale attiva la chinasi e si ha autofosforilazione del dominio output, ad un residuo istidinico. Questo interagisce con il dominio ricevente di RR, causanto il trasferimento di un fosfato ad un residuo di aspartato del dominio ricevente. Ciò attiva il dominio output di RR, il che cambia la sua conformazione mediando diverse attività biologiche. I sistemi di fosforelay batterici comprendono un SK e un RR. Hanno anche regolatori intermedi che mancano di un dominio output e una proteina che trasferisce fosfati usando un residuo istidinico. Il sistema del recettore CK delle piante è simile ad un recettore batterico a due componenti con sensore a istidina chinasi. Nelle piante però il sensore è ibrido perché l’istidina chinasi H è fusa col dominio ricevente D (aspartato). Inoltre è presente l’istidina fosfotransferasi HPt che trasferisce il fosfato al dominio ricevente D del RR.

Il sistema fosforelay di segnale a due componenti

Il sistema fosforelay di segnale a due componenti è diverso da una cascata proteina-chinasi, in cui una successione di enzimi opera il trasferimento di un gruppo fosforico dall’ATP sull’-OH di un aminoacido (serina o treonina o tirosina). Nel sistema fosforelay, il trasferimento di un gruppo fosforico è operato dall’istidina fosfotransferasi in sostituzione della chinasi. L’enzima HPt, trasferendo un gruppo fosforico al dominio ricevente D del regolatore di risposta, ne altera l’attività. In definitiva lo HPt funziona come un relay azionato da gruppi fosforici che va ad attivare il regolatore di risposta.

Nota. Il relay è un interruttore azionato elettricamente (elettromagnete) che attiva un meccanismo di accensione di tipo meccanico.

Il sistema fosforelay coinvolge legami ad alta energia: l’autofosforilazione

La chinasi autofosforila il residuo di istidina (H) nel dominio del trasmettitore. Il gruppo fosforico è in seguito trasferito ad un residuo di acido aspartico (D) nel dominio ricevente fuso col trasmettitore. Il legame fosforico della fosfoistidina ha abbastanza energia da consentire il trasferimento del gruppo fosforico senza il bisogno di energia aggiuntiva.

Il sistema fosforelay coinvolge legami ad alta energia: il fosforelay

Il gruppo fosforico è trasferito dall’aspartato del dominio ricevitore fuso ad una istidina dell’enzima HPt ed infine su di un aspartato del dominio ricevente del regolatore di risposta. L’energia, trattenuta nel legame del fosfoaspartato, può consentire i successivi trasferimenti del gruppo fosforico.

I componenti della via di percezione e signaling delle CKs in Arabidopsis

I recettori di CKs sono di natura proteica, formati da chinasi ibride e presenti come componenti transmembrana. Tutti i recettori di CKs hanno in comune un dominio *CHASE extracellulare che lega la CK. I tre recettori hanno distinte affinità per diversi tipi di CKs, suggerendo funzioni distinte nella pianta.

*AHK = Arabidopsis Histidine Kinase; *CHASE = Cyclase/Histidine kinase – Associated Sensing Extracellular; *wol = wooden leg o gamba di legno. La radice del mutante *wol è troncata a causa dei disturbi alla differenziazione nel cilindro centrale.

I recettori delle citochinine influenzano i processi regolati dalle citochinine in diversi modi

I semi mutanti presentavano una germinazione più rapida, una riduzione della richiesta di luce e una diminuzione della sensibilità alla luce molto rossa, mostrando le funzioni delle citochinine nel controllo della germinazione dei semi. I semi triplo-mutanti erano grandi più del doppio dei semi selvatici. L'analisi genetica indicava un controllo endospermico e / o materno ck-indipendente delle dimensioni dell'embrione. La sensibilità alla luce rossa invariata dell'amplificazione dell'ipocotile mutante suggerisce che la segnalazione della luce rossa da parte dei regolatori di risposta di tipo A potrebbe non dipendere dalla citochinina. La perdita combinata di AHK2 e AHK3 ha portato ai cambiamenti più importanti durante lo sviluppo vegetativo. Le foglie di mutanti ahk2 ahk3 formavano meno cellule, avevano ridotto il contenuto di clorofilla e mancavano dell'inibizione dipendente dalla citochinina.