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R : in C3 il gruppo R influenza principalmente il metabolismo e le proprietà farmacocinetiche

3 3

delle cefalosporine, quali la durata di azione e la potenza. Modifiche in questa posizione

interesseranno anche lo spettro, infatti, l'aggiunta di atomi elettronegativi in R migliora la capacità

3

di attacco e di legame delle cefalosporine alle PBP.

R : il gruppo carbossilico deve essere libero, infatti, sotto forma di carbossilato stabilisce un

4

legame ionico essenziale per il binding con la transpeptidasi. La funzione acida si può esterificare

dando origine a dei profarmaci che modificano temporaneamente le proprietà farmacocinetiche

delle cefalosporine (incremento della lipofilia e dell’assorbimento gastroenterico), in vivo R è

4

rimosso per ripristinare le proprietà antimicrobiche.[1]

Tutte le sostituzioni esercitano influenze diverse e l’inserimento di diversi gruppi R e R , ha

1 3

portato alla formazione di composti dotati di buon’attività e bassa tossicità. Al tempo stesso, alcuni

sostituenti sono responsabili, in alcun individui, di intolleranza o di difetti dell’emostasi.

Essendo ancora poche le informazioni riguardanti la struttura topografica recettoriale, essendo

essa stessa variabile e specie-specifica, i metodi di “drug design” sono basati principalmente

sull’aspetto farmacoforico (“pharmacophore-based”), approccio classico in cui si modificano

strutture preesistenti, già attive, al fine di trovare la conformazione bioattiva, quella responsabile

dell’effetto biologico.

Tutti gli sforzi attuali sono diretti ad ottenere delle cefalosporine che abbiano una buon’attività

su cocchi Gram+, enterobatteri, Pseudomonas, Acinetobacter, anaerobi. [2]

2.3. I TARGETS MOLECOLARI: PBPs

β-lattamiche

I targets per le droghe sono le Penicillin Binding Proteins PBPs. I batteri hanno

diverse PBPs individuali, ognuna con una funzione separata, che convenzionalmente vengono

numerate in base alla dimensione, con PBP-1 come la proteina più grande. Le PBP fanno parte della

famiglia delle proteine serin-trasferasi, come gruppo di proteine specializzate nell’assemblaggio e

metabolismo della parete cellulare batterica. Questa famiglia può catalizzare il trasferimento di un

gruppo R -CO di un estere, tioestere o ammide carbonil donatore R -CO-X-R ad un accettore, HY,

1 1 2

attraverso la formazione di un legame intermedio serin-estere acil (R -CO-). Le PBP possono essere

1

classificate come lmw (basso peso molecolare) o come hmw (alto peso molecolare). Le hmw

possono ancora essere suddivise in quelle di classe A e classe B. Questi due gruppi combinano in

una singola catena polipeptidica i domini di transglicolazione e il dominio transpeptidasico.

Troviamo inoltre un segnale che non viene tagliato (verde in fig. 8), la cui funzione è quella di

ancorare il peptide alla membrana plasmatica. Questo dominio si trova fuso alla porzione N-ter del

10

modulo di transglicosilazione (arancione in fig. 8), che è ancora fuso al modulo di acyl-serin

transferasi (blu in fig. 8). In contrasto alle hmw, che sono enzimi mutlifunzionali, ed essenziali per

la sopravvivenza del batterio stesso, le lmw sono proteine monofunzionali e non essenziali per la

cellula batterica. [3-4] Fig. 8 Struttura della PBP2a* del

batterio Stafilococcus aureus.[6]

α-eliche

La struttura tridimensionale (Fig. 9,10,11) di molte PBP evidenzia che racchiudono

β-sheet

un core formato da 5 antiparalleli, supportati da due eliche da un lato e una singola elica

α-elica

dall’altro con un dominio centrale. (Fig. 12,13,14,15).[4]

Fig. 9 Struttura di una forma solubile di Fig. 10 Struttura di una forma solubile di

PBP1b di Streptococcus pneumoniae+

PBP1b di Streptococcus pneumoniae.[3] nitrocefin.[3] 11

Fig. 11 Struttura di una forma solubile di Fig. 12[4]

PBP1b di Streptococcus pneumoniae+

ceftisossima.[3]

Fig. 13[4] Fig. 14[4] Fig. 15[4]

Fondamentalmente troviamo tre motivi dominanti in tutte le PBPs, che costituiscono i siti

attivi di queste proteine (Fig. 16). Il primo è dato da una sequenza amminoacidica costituita da

SXXK N-ter della catena 2α, ed assume una posizione centrale nel sito attivo. Nel sito attivo

mostrato in figura, relativo all’enzima R6 PBP2x di streptococcus pneumoniae, la serina e la lisina

assumono la posizione 337/340. Il secondo dominio S/YxN/C è un loop che connette due eliche

dell’α dominio (Ser 452 e Asn 464 in figura) e definisce un lato del dominio catalitico. L’ultimo

motivo è dato da TGS che si trova nel 3β sheet e definisce l’altro lato del centro catalitico.[6-4]

Fig. 16 Sito attivo nella

struttura Nitrocefin-acil-

SauPBP2a. Il Nitrocefin

è mostrato in viola. [6] 12

La caratterizzazione del sito attivo permette di individuare i siti di interazione e di legame

tra enzima e inibitore e questo potrebbe rappresentare un primo passo verso la sintesi di nuove

molecole altamente specifiche e selettive perché complementari al proprio bersaglio.

3. RESISTENZA BATTERICA

Un altro aspetto importante per questa classe di antibiotici è la resistenza. Quando un antibiotico

è ampiamente usato si sviluppano inevitabilmente sistemi batterici resistenti. I batteri possono

β-lattamici

sviluppare resistenza ai mediante tre meccanismi:

1. prevenzione dell'interazione fra antibiotico e PBP bersaglio,

2. impossibilità dell'antibiotico di legarsi alla PBP e

β-lattamasi.

3. idrolisi dell'antibiotico da parte delle

1. Il primo meccanismo di resistenza è stato visto solo nei batteri gram-negativi (in particolare in

Pseudomonas species), poiché essi hanno una membrana esterna che copre lo strato di

β-lattamici

peptidoglicano. La penetrazione di antibiotici nei gram-negativi richiede il passaggio

attraverso i pori della membrana esterna. Modificazioni delle proteine (porine) che formano le

pareti dei pori possono alterare le dimensioni e la carica di questi canali e provocare l'esclusione

dell'antibiotico (Fig. 17 e 18).[7-8]

Fig. 17 Struttura della parete Fig. 18 Struttura della parete

cellulare dei Gram+. [8] cellulare dei Gram-. [8] β-

2. I batteri possono anche acquisire una PBP modificata che è incapace di legarsi agli antibiotici

lattamici, ma che contribuisce alla sintesi del peptidoglicano. La PBP modificata può aver origine

da una mutazione del gene della PBP o dall'acquisizione di una nuova PBP.[7]

Un esempio è la Meticillina-resistenza in MRSA, dovuta all’acquisizione del gene mecA

mediante trasferimento da una specie indefinita. Il gene mecA è altamente conservato è codifica per

PBP2a, una nuova PBP differente dalle PBPs normalmente prodotte dallo S.aureus. PBP2a è

β-lattamici clinicamente usati e rimane attiva per sostenere

altamente resistente a tutti gli antibiotici 13

β-lattamici. Vari studi cinetici

la sintesi della parete cellulare a concentrazioni normalmente letali di

hanno dimostrato che la resistenza di PBPs2a è principalmente dovuta all’inefficiente formazione

dell’intermedio covalente acil-PBP(cioè ad una bassa velocità di acilazione k2) e non è causata dal

β-lattamico

ridotto accesso del nel sito attivo, visto che i valori delle kd sono relativamente bassi, né

da una più rapida rottura dell’intermedio acil-PBP. Fig. 19 Sito attivo

nell’Apo-struttura di

SauPBP2a. E’ mostrato il

Nitrocefin, con la stessa

conformazione che

presenta nella struttura

precedente, per notare

meglio la distorsione del

sito attivo.[6]

In seguito, il confronto tra due strutture cristallografiche, quella dell’apo-enzima SauPBP2a (enzima

non legato all’inibitore, fig.19) e quella della SauPBP2a legata al Nitrocefin (un tipo di

cefalosporina) (fig.16), ha rivelato che la scarsa velocità d’acilazione è dovuta ad un distorto sito

β3

attivo che deve subire cambiamenti conformazionali al foglietto e alla porzione N-terminale

α2

dell’elica affinché avvenga l’acilazione. Nell’apo-struttura, infatti, la serina403 è in una cattiva

posizione per l’attacco nucleofilo e c’è un ingombro sterico tra il carbossilato del Nitrocefin e il Cα

della gly599. Fig. 20 Sovrapposizione delle strutture

Apo-(in blu) e Nitrocefin-acil-SauPBP2a

(in giallo).Il Nitrocefin è mostrato in

viola. [6]

La sovrapposizione delle due strutture (Fig. 20) rivela, inoltre, che

β3 α2

la torsione del foglietto è necessaria per accomodare l’elica nella giusta conformazione in

quanto si può vedere un ingombro sterico tra il carbonile della ser598 nel complesso acil-PBP e il

Cβ della serina403 nell’apo-struttura.

Tutti questi cambiamenti conformazionali, energeticamente sfavoriti, impediscono la formazione

dell’intermedio acil-PBP che si traduce in una ridotta velocità d’acilazione. I valori di kd bassi

β-lattamici

indicano invece che il legame iniziale dei in SauPBP2a non è molto impedito e questo

suggerisce che la posizione del Nitrocefin nel complesso iniziale differirà da quell’osservata nella

β

struttura acil-PBP in modo che il foglietto non debba distorcersi durante il legame iniziale. Tutto

ciò trova conferma nell’assenza d’equivalenti differenze conformazionali tra le strutture apo- e acil-

β-lattamici (Fig. 21), che concorda con una transizione

PBP per R61 PBP e R6 PBP2x sensibili ai 14

più rapida dal complesso iniziale all’intermedio acil-PBP, come rivelano le loro alte velocità

d’acilazione (k2). Fig. 21 Sovrapposizione delle strutture apo-enzima

β-lattamico,

(gialla), cioè non legato al e complesso

Acil-PBP (viola) di R6 PBP2x di S.Pneumoniae in

corrispondenza della regione del sito attivo.[6]

Si può, quindi, affermare che, essendo l’acilazione uno step chiave nell’inibizione delle PBPs da

β-lattamici,

parte dei la proposta che il sito attivo effettivamente bilancia una ritenzione dell’attività

transpeptidasica essenziale (attraverso la conservazione dei residui chiave catalitici) con una

β-lattamici

riduzione dell’affinità per i (attraverso la distorsione del sito attivo per ridurre l’efficacia

catalitica) è probabilmente applicabile a PBP2a e alle altre PBPs resistenti in generale. Si è visto,

α2

infatti, che mutazioni nella regione N-terminale dell’elica in R6 PBP2x influenzano

significativamente la velocità d’acilazione in quanto la conformazione della porzione N-terminale

α2

dell’elica gioca un ruolo fondamentale nel collocare correttamente la catena laterale della

serina337 per l’attacco nucleofilo (fig.21).

Dato che la scarsa efficienza d’acilazione è una caratteristica intrinseca della SauPBP2a, un

importante aspetto per il disegno d’inibitori sarà quello di migliorare l’affinità di legame

incrementando il numero d’interazioni non covalenti tra inibitore e sito attivo, in modo da

aumentare l’efficacia complessiva di acilazione e ridurre, quindi, la resistenza.

Le strutture di Nitrocefin-acil-, penicillina G-acil- e meticillin-acil-PBP (Fig. 22 A,B,C)

identificano le caratteristiche responsabili delle differenti affinità di SauPBP2a per questi composti

β-lattamici, che determinano una diversa resistenza. In A si osservano una serie di legami idrogeno

che ritroviamo anche in B; in B sono assenti le interazioni di Van der Waals prodotte dal

sostituente R3 del Nitrocefin., che determinano un aumento dell’affinità di legame (kd bassa)e,

quindi, una più elevata velocità d’acilazione del Nitrocefin rispetto a quella della penicillina G. La

meticillina presenta una velocità d’acilazione ancora più bassa a causa dei limitati legami

all’interno del sito attivo. La figura C mostra, infatti, la meticillina in una posizione che permette

al voluminoso dimetossifenil R1 sostituente di accomodarsi nella regione occupata dal sostituente

R1 del Nitrocefin; ma, questo incrementa la distanza tra l’O terminale della ser462 e l’N dell’anello

β-lattamico rispetto a quanto osservato nel complesso del Nitrocefin, ritardando il trasferimento del

protone dalla ser462 all’N durante l’acilazione. Cosi l’acilazione intrinsecamente lenta di SauPBP2a

15

lavora in associazione con i limitati legami all’interno del ristretto sito attivo (Fig. 22 C) per

β-lattamici

produrre una accresciuta resistenza contro ingombranti, come la meticillina.

A B C

Fig. 22 A,B,C A. Sito attivo nella struttura Nitrocefin-acil-SauPBP2a. B. Sito attivo nella struttura

Penicillina G-acil-SauPBP2a. C sito attivo nella struttura Meticillin-acil-SauPBP2a. Le tre immagini

mettono in evidenza le interazioni che si instaurano nel sito attivo di queste tre strutture.[6]

β-lattamici

Nel disegnare inibitori più efficaci è prevedibile che la riduzione della kd gioca

un grande ruolo nel miglioramento dell’efficacia complessiva dell’acilazione(k2/kd). Coerente con

questo, l’alta affinità di parecchie Cefalosporine sviluppate di recente per SauPBP2a è correlata con

i loro più lunghi sostituenti, che in base alle strutture viste, conferiscono una forma più

complementare al sito attivo e permettono un più largo numero d’interazioni non covalenti

stabilizzanti.[6] β-lattamasi

3. Il terzo meccanismo di resistenza batterica consiste nella produzione di che

β-lattamici.

inattivano i Sono state descritte più di 200 diverse beta lattamasi. Alcune sono

specifiche per le penicilline (penicillinasi) e le Cefalosporine (Cefalosporinasi), mentre altre hanno

β-lattamici.

un ampio spettro d’attività e sono capaci di inattivare la maggior parte degli antibiotici

β-lattamasi (β-lattamasi a spettro esteso [ESBL]) è particolarmente

Questo ultimo gruppo di

problematico, poiché è comunemente codificato da plasmidi e può essere trasferito da un organismo

β-lattamici

all'altro. Ciò ha limitato l'uso dei in alcuni ospedali.[7]

β-lattamasi

Le a serina derivano per evoluzione dalle PBP batteriche. Esse hanno una serina nella

tasca del sito attivo simile alla serina catalitica delle PBP e presentano un meccanismo catalitico

analogo per la fase d’acilazione; tuttavia, mentre l’acilenzima delle PBP batteriche sensibili è

β-lattamasi β-

si autoidrolizza velocemente, rigenerando la

stabile, l’analogo acilenzima delle

lattamasi attiva.[1]

β-lattamasi fanno la stessa cosa, ma usano uno ione zinco anziché un amminoacido della

Altre β-lattamiche. β-lattamico

serina per inattivare le molecole In ogni caso, il risultato è che l’agente è

16

rapidamente idrolizzato annullando la sua attività.[1] In generale i batteri Gram+ producono una

β-lattamasi

gran quantità di che è secreta a livello extracellulare. Molti di questi enzimi sono

β-

penicillinasi e la loro sintesi è indotta dalla presenza dello stesso antibiotico. Nei batteri Gram- le

lattamasi si trovano in quantità relativamente piccole, ma sono localizzate nello spazio

periplasmatico tra la membrana cellulare esterna ed interna, dove assicurano la massima protezione

al microbo. Nei Gram- le sono costitutive, cioè sono normalmente prodotte, e

β-lattamasi

inattivano sia le penicilline che le Cefalosporine.[1-2]

Le Cefalosporine, come abbiamo già detto, si distinguono in generazioni anche sulla base della loro

a

β-lattamasi.

resistenza alle In particolare i composti di 3 generazione mostrano una certa resistenza

all’idrolisi da parte di tali enzimi perchè, oltre ad essere inibitori delle PBP, sono anche inibitori

β-lattamasi.

delle Cefalosporine contenenti, nella catena alchilaminica in 7, sostituenti ingombranti

e rigidi oppure il gruppo metossi in 7α inducono nell’acilenzima una conformazione non produttiva

per la fase d’autoidrolisi, orientando il C=O estere in una direzione sfavorevole per l’attacco

dell’acqua.[1]

Cefalosporine contenenti un gruppo uscente nella catena in 3 orientano il C=O estere in una

direzione sfavorevole per l’attacco dell’acqua.[1] 17


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AUTORE

flaviael

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher flaviael di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Chimica farmaceutica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Grasso Silvana.

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