Chimica farmaceutica applicata

PONTI SALINI

Formati dalle catene laterali ionizzate di acido aspartico, acido glutamico, lisina, arginina, istidina, che si trovano di solito sulla superficie della proteina.

Fattori importanti sono il pH (se inappropriato, si distruggono i ponti salini) e i solventi organici (indeboliscono la forza dei ponti salini).

INTERAZIONI IDROFOBICHE

Dovute alle catene laterali idrofobiche (fenile e residui idrocarburici), solitamente localizzate all'interno della struttura proteica.

Fattori che possono causare la distruzione di tali interazioni e quindi portare a denaturazione sono calore, stress meccanici (shaking!), presenza di detergenti (tensioattivi). Anche la concentrazione della proteina stessa può portare alla distruzione delle interazioni idrofobiche: spesso le proteine si trovano in soluzioni concentrate, per cui le molecole di proteina si trovano molto vicine tra di loro e si possono formare interazioni idrofobiche non desiderate intermolecolari. In questo modo si formano aggregati.

• calore
• variazioni di pH
• solventi organici
• stress meccanici
• elevate concentrazioni di sali

Perché sequestrano l'acqua.

STABILITÀ dei farmaci

Stabilità di farmaci biologici:

• tensioattivi (soprattutto ionici) spesso contenenti proteine vengono formulate anche con deitensioattivi, che sono però non ionici.
• liofilizzazione spesso viene fatta a caldo e quindi può portare a denaturazione. Durante il processo inoltre è possibile che venga eliminata una quantità eccessiva di acqua, con conseguente rottura delle interazioni deboli.
• elevata umidità residua

In ogni caso, se la proteina forma degli aggregati, questi aggregati difficilmente sono solubili: precipitano.

La proteina può svolgersi ovunque ci sia un'interfaccia:

Le interfacce esistono ovunque siano presenti due fasi:

• Aria-liquido: è quindi necessario evitare la formazione di schiume (nel bioreattore, nel ricostituire la soluzione parenterale, durante la spedizione, somministrazione...)
• Ghiaccio-liquido:

è quindi necessario porre attenzione ad un’eventuale formazione di ghiaccio durante la liofilizzazione in frosting molte proteine non possono essere congelate.

• Solido-liquido: le proteine si adsorbono ai materiali dei contenitori

Tecniche di stabilizzazione

Malgrado l’approccio “compound specific” è possibile elencare le principali tecniche con cui è possibile stabilizzare le proteine in modo da realizzare una ff adeguata:

1. Tenere sotto controllo la temperatura, sia in fase di conservazione che in fase di produzione la temperatura elevata favorisce la degradazione chimica e contemporaneamente, conferendo maggiore mobilità alle particelle, favorisce la tendenza agli urti e all’aggregazione. Per esempio durante la liofilizzazione.

Figura 13 – elettromiografie di trasmissione di fibrille di insulina formate (a) a 37°C, (b) a 80°C.

2. Scegliere accuratamente solvente e componenti della formulazione: ci sono

• Sostituiscono l'acqua durante l'essiccamento o la liofilizzazione. Eccipienti come i disaccaridi sono "sostituti dell'acqua": interagiscono con la proteina come fa l'acqua durante la liofilizzazione, conservandone la struttura nativa e sostituendo l'acqua che viene persa durante l'essiccamento, stabilizzandola anche durante la conservazione. Queste sostanze vengono chiamate crioprotettori.
• Esiste un'evidenza sperimentale e spettroscopica che l'interazione tra zuccheri e proteine sia simile all'interazione acqua-proteina. I crioprotettori agiscono tramite pura stabilizzazione termodinamica. È necessario stare attenti di non utilizzare zuccheri riducenti, in modo da evitare la reazione di Maillard.

• Aumentano la

Temperatura di transizione vetrosa delle proteine: la Tg nel caso delle proteine viene chiamata Temperatura di collasso Tc. La proteina, nel suo stato vetroso, è meno mobile e quindi meno prona alla degradazione, perché la sua struttura è tendenzialmente più rigida. Al di sopra di Tc, invece, la proteina è più flaccida e prona alla degradazione. È necessario quindi che la proteina venga conservata e processata a temperature al di sotto di Tc. Se Tc è molto bassa, sarà necessario aggiungere alla proteina agenti antiplastificanti, che rendono più vetroso tutto il sistema, alzando il valore di Tc.

Esclusione preferenziale: gli eccipienti non sono affini alla proteina, o sono caratterizzati da un ingombro sterico importante. La proteina quindi si tiene lontano da questi eccipienti, rimanendo avvolta nella sua conformazione nativa piuttosto che svolgersi.

STABILITÀ dei farmaci: Stabilità di farmaci

STABILITÀ dei farmaci

Stabilità di farmaci biologici

Altra tecnica per ridurre i fenomeni interfacciali è ricorrere alla manipolazione delicata (shaking/shearing).

Alternativamente, è possibile andare a scegliere l'adeguato contenitore (inclusi i tappi), in modo da ridurre i fenomeni di adesione della proteina ai contenitori. La scelta migliore sembra essere il vetro siliconato, per i contenitori; il teflon per i tappi. Il vetro utilizzato per proteine è vetro di tipo I borosilicato, il tipo più puro presente nell'industria farmaceutica, perché le formulazioni proteiche sono spesso per uso parenterale. Nei grafici seguenti possiamo vedere il grado di

perdita del titolo proteico a seconda del contenitore utilizzato.

6) Migliorare la solubilità della formulazione, utilizzando agenti solubilizzanti. Vengono usati sia per ridurre i fenomeni interfacciali che per migliorarne la solubilità. Talvolta vengono utilizzati anche sali e ciclodestrine.

Formula e processo di formulazione per un anticorpo monoclonale:

Formula = i componenti della formulazione.

• Più concentrato = contenitore più piccolo, maggiori interazioni intermolecolari
• Stabilità a pH variabili:
  • Mannitolo usato per rendere maneggevole la sostanza aumentandone il volume
  • Aggiustamento del pH
  • Aggiunta di un crioprotettore estabilizzante
• Selezione di un contenitore → più piccolo possibile poca aria = poca ossidazione
• Contenitore: fialetta di vetro borosilicato con tappo siliconato. Chiuso sottovuoto e rimpiazzo dell'aria con N2 per evitare i fenomeni di ossidazione.

Liofilizzazione conoscere

La temperatura Tc!!

Calcolo dell'acqua residua[- 193 -]

STABILITÀ dei farmaci

Stabilità di farmaci biologici

Riassumendo

Lioprotettori/crioprotettori = sostanze che stabilizzano durante il processo di liofilizzazione. Lo zucchero spesso ha una doppia funzione: crioprotettore e sostanza in grado di garantire l'isotonicità.

I conservanti sono generalmente presenti nel caso di formulazioni a dosaggi multipli.

Figura 14 – fattori che favoriscono l'aggregazione proteica.

Esempi di farmaci biologici in commercio: [- 194 -]

STABILITÀ dei farmaci

Stabilità di farmaci biologici

Stabilità microbiologica - Conservazione

Conservare vuol dire stabilizzare la formulazione dal punto di vista microbiologico. I più comuni inquinanti delle preparazioni farmaceutiche sono:

• batteri
• lieviti (saccaromiceti)
• funghi inferiori in particolare muffe, come gli aspergilli
• →virus, parassiti di cellule dovrebbero poter

inquinare solo determinate forme farmaceutiche come isieri e i vaccini

L'inquinamento microbiologico della forma farmaceutica può avvenire attraverso le materie prime stesse (acqua, prodotti naturali - vegetali o minerali -) o nel corso della lavorazione per contatto con apparecchiature e/o superfici di lavoro contaminate o a causa del personale. Ultima fonte di contaminazione possibile ma non meno importante è quella ad opera del consumatore, durante l'uso del prodotto.

È molto più probabile che sostanze naturali o di derivazione naturale (come la bentonite, cellulosa...) siano già in partenza contaminate da microrganismi e siano più suscettibili alle alterazioni rispetto alle sostanze sintetiche.

Negli impianti per formulazioni parenterali è importantissimo evitare qualunque fonte di inquinamento. L'aria circola in modo da fluire dalle