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Figura 3.11: Composto SCH-C.

Alcuni esperimenti clinici preliminari, condotti somministrando oralmente 25 mg del

composto in esame, due volte al giorno per 10 giorni di terapia, ad un certo numero di adulti

infattati con HIV-1, hanno indicato che questo composto è in grado di ridurre la carica virale di 0.5-

1.0 log10 [27].

Più recentemente lo studio di questo farmaco è stato abbandonato a causa del riscontro di

cardiotossicità (anomalie della conduzione cardiaca) in corso degli studi di fase I.

Partendo dal composto precedente, sono stati studiati nuovi antagonisti del recettore CCR5,

somministrabili oralmente, contenenti due gruppi simmetrici: 2,6-dimetilisonicotinamide e 2,6-

dimetilpirimidino 5-carbossamide.

Questi composti hanno mostrato uguale, o in alcuni casi migliore, affinità per il recettore

CCR5 rispetto a SCH-351125 [28,29].

(AD101) si legano su siti diversi della stessa tasca recettoriale

SCH351125 e SCH-350581

formata dalle eliche transmembranarie (TM) 1, 2, 3 e 7 del recettore CCR5. Questo legame

comporta un cambiamento conformazionale a livello della seconda ansa recettoriale, che sfavorisce

l’attacco della glicoproteina virale gp120 [30].

Un'altra classe di antagonisti del recettore CCR5 a basso peso molecolare è rappresentato

dalle Spirodichetopiperazine, come E913 (Figura 3.12), che inibiscono il legame di MIP-1a al suo

recettore, il flusso del Ca++ MIP 1a-dipendente e la replicazione in vitro sia del virus primario che

di alcuni suoi ceppi resistenti ad altre terapie farmacologiche [31].

Figura 3.12: Struttura di E913.

37

Tra i composti appartenenti alla classe delle spirodichetopiperazine, soltanto l’E913 sembra

possedere attività nei confronti dell’HIV, legandosi parzialmente al recettore CCR5.

Questo composto, inoltre, blocca la replicazione di HIV-1 R5 in topi HIV-1 (JRFL)-infetti

di hu-PBM NOD-SCID e possiede una biodisponibilità orale molto favorevole [32].

UK-427857 (Pfizer) (Figura 3.13), un altro antagonista del recettore CCR5, è stato

recentemente selezionato tra i farmaci candidati per la sperimentazione clinica nella terapia

dell’infezione da HIV. Figura 3.13: Struttura di UK-427857.

Tale molecola ha mostrato una potenza eccellente nei confronti di un’ampia serie di virus

isolati che utilizzano il recettore CCR5 per entrare nell’ospite (ad una IC90 <10 nM); mentre si è

visto che è inattiva nei confronti di ceppi CXCR4-tropici [33].

È stata inoltre valutata la sua efficacia in più di 400 volontari e pazienti HIV-1 R5 infetti.

I risultati sono stati molto positivi: ben tollerato anche a dosi superiori a quelle necessarie a

bloccare il recettore CCR5.

Ancora, la somministrazione pro-die di 200 mg di UK-427857 sembra provocare, in 10

giorni di terapia, una diminuzione media della carica virale di 1.42 log10 al giorno, mentre a dosi

di 25 mg pro-die i risultati non sono altrettanto soddisfacenti: solo 0.42 log10 al giorno [34].

Infine, è stato dimostrato che la carica virale dell’R5 HIV-1 rimane bassa per almeno 10

giorni dopo l’interruzione della terapia, la qual cosa suggerisce che per il trattamento con UK-

427857 (e forse anche quello con gli altri antagonisti del recettore CCR5) può essere suffiente una

singola somministrazione settimanale.

Oltre agli antagonisti del recettore CCR5 su menzionati, una numerosa serie di composti

appartenenti alla classe delle pirrolidin-1,3,4-trisostituite sembra possedere buona disponibilità

orale ed elevata attività antiretrovirale [35-39].

Il composto più rappresentativo di questa serie è riportato in figura 3.14.

38

Figura 3.14: Struttura di un pirrolidina 1,3,4-trisostituita.

Il sito di legame per tale molecola sembra trovarsi a livello di una tasca del recettore

CCR5, vicino la superficie extracellulare, formata dalle eliche TM 2, 3, 6 e 7 [40].

Ulteriori studi di modellistica molecolare (Molecular Modeling) potrebbero essere incisivi

nella progettazione di nuovi composti con attività antagonista nei confronti del recettore cellulare

CCR5. La prova del fatto che gli antagonisti del recettore CCR5 possono essere efficaci in vivo

contro l’HIV R5 è stata dimostrata per CMPD 167, in un primo momento designato come MRK-1

(Figura 3.15). Figura 3.15: Struttura del MRK-1 o CMPD 167.

Questo composto, secondo alcuni studi, causerebbe una rapida e sostanziale diminuzione (4-

200 volte) della viremia nel plasma di scimmie infettate cronicamente con il SIV (Scimmian

Immunodeficiency Virus). La replicazione virale potrebbe essere parzialmente inibita in seguito alla

somministrazione vaginale del composto sotto forma di gel.

Ciò pone le basi per un potenziale utilizzo dello stesso, come componente microbicida, per

prevenire la trasmissione sessuale dell’HIV-1 [41].

L'infezione virale di cellule linfoidi umane può essere inibita anche da:

- bacitracina;

- anticorpi per PDI (Protein-Disulfide Isomerasi) [42].

39

PDI è un enzima cellulare che apporta legami disulfidici sulla gp120 virale, provocandone

cambiamenti conformazionali indispensabili per i successivi processi di fusione del virus [43,44].

Circa due dei nove disulfidi della gp120 subiscono la riduzione durante la sua interazione con la

superficie linfocitaria dopo il legame al recettore CXCR4 [45]. Le riduzioni PDI-mediate, che

avvengono a livello del complesso gp120/CD4/corecettore, probabilmente rappresentano lo step

finale che porta all’attivazione della gp41 che, così, diverrebbe in grado di fondersi con la

membrana cellulare aprendo la porta d'ingresso al virus.

Questo processo PDI-mediato, attualmente non ancora esplorato, potrebbe essere un

importante obiettivo farmacologico.

3.1.3.3. Antagonisti dei corecettori CCR5 e CXCR4

Questi farmaci (es. NSC-651016), come i precedenti, agiscono solo sulla fase replicativa del

virus e pertanto non sono in grado di colpire il virus nella sua fase di latenza all'interno dei

reservoirs.

Gli inibitori della fusione e gli antagonisti dei recettori per le chemochine potrebbero essere

utilizzati anche in associazione in quanto è prevedibile un loro effetto sinergico.

40

3.1.4. Inibitori della Fusione

L'interazione della glicoproteina gp120 con i corecettori CXCR4 e CCR5 è seguita da

un'azione specifica della glicoproteina gp41 che si ancora, tramite la sua porzione ammino-

terminale, all’interno della membrana cellulare dando l’avvio al processo di fusione dell’envelope

virale con la membrana plasmatica. Durante questo processo le tasche idrofobiche sulla superficie

del dominio interno della glicoproteina gp41 divengono disponibili per l’eventuale legame da parte

di ligandi esogeni come l’Enfuvirtide (T-20, DP-178, pentafuside o Fuzeon®) (Figura 3.16), un

peptide sintetico di 36 aminoacidi che corrisponde ai residui aminoacidici 127-162 della gp41 e

643-678 del precursore gp160. .

Figura 3.16: Sequenza aminoacidica del peptide Enfuvirtide

Dopo un trial clinico eseguito somministrando in adulti HIV-infetti quattro diverse dosi del

composto (3, 10, 30, e 100 mg rispettivamente) due volte al giorno per 14 giorni, si è notato che

alla dose più alta (100 mg) il composto causava, dal quindicesimo giorno, una riduzione della carica

virale plasmatica di 1.5 - 2.0 volte. Questo risultato dimostra che gli inibitori della fase di fusione

sono capaci di ridurre la replicazione virale in vivo [46].

Due studi clinici di fase III, TORO 1 e 2 (T-20 Optimized Regimen Only), condotti

rispettivamente in Nord e Sud America [47] ed Europa e Australia [48], hanno dimostrato, dopo un

periodo di trattamento durato 24 settimane, che l’enfuvirtide offre un significativo beneficio

antiretrovirale (riduzione della carica virale di 0.932 e 0.781 log10 copie per millilitro

rispetivamente) ed un beneficio immunologico (aumento della conta linfocitaria di 44 e 275 cellule

per microlitro rispettivamente).

Successivi studi, durati più di 48 settimane, hanno confermato questi risultati [49,50].

L’enfuvirtide deve essere somministrato due volte al giorno attraverso iniezione

sottocutanea. Ciò comporta inevitabilmente lo scatenarsi di reazioni al sito di iniezione come

eritemi, noduli e cisti. Un altro inevitabile inconveniente è il suo costo di produzione. Si da il caso,

infatti, che il farmaco sia un peptide con peso molecolare pari a 5000 Da [51] e come tale richieda

elevati costi di produzione. 41

Inoltre, come per tutti i farmaci anti-HIV che agiscono attraverso specifici meccanismi,

anche per l’enfuvirtide si rende necessario il continuo ed attento monitoraggio della comparsa di

eventuali fenomeni di resistenza virale.

La monoterapia ha infatti facilitato la selezione di ceppi mutanti per la glicoproteina gp41,

nelle posizioni 36-38 della catena ammino-terminale (G36D e V38A) [52,53].

Esistono ben sette varianti di HIV-1 enfuvirtide-insensibili in una popolazione enfuvirtide-

naïve e questo può comportare la resistenza del virus al trattamento farmacologico [54].

Tuttavia, visto che l'enfuvirtide, così come SCH-C e RANTES, inibisce la replicazione di

ceppi primari isolati da molti tipi di cellule che usano il corecettore CCR5, dovrebbe essere valutato

un suo potenziale utilizzo nella prevenzione della trasmissione verticale e sessuale dell’HIV [55].

Recentemente è stato desritto un nuovo meccanismo di inibizione della fusione cellulare che

coinvolge il medesimo target molecolare [56,57] e che prevede lo sfruttamento di analogie

strutturali tra alcuni derivati terpenici tri-sostituiti (Figura 3.17) e le regioni N-elicoidali esposte

della glicoproteina gp41. Figura 3.17: Derivato Terpenico Trisostituito.

42

3.1.5. Farmaci che inibiscono la Trascrittasi Inversa

La Trascrizione Inversa è il processo con il quale le informazioni genetiche del virus,

contenute in una singola catena di RNA, vengono copiate in una doppia catena di DNA. Questo

processo, che avviene nel citoplasma della cellula nelle prime ore successive all'infezione, necessita

dell'intervento di un enzima virale multifunzionale, la Trascrittasi Inversa (RT) (Figura 3.18

[102]). La trascrizione inversa si svolge, infatti, in tre fasi:

1) prima fase: sintesi di una catena di DNA complementare all'RNA virale (attività DNA-

Polimerasica RNA-Dipendente della RT );

2) seconda fase: degradazione della catena di RNA originaria (attività Ribonucleasica della

RT ); 3) terza fase: costruzione della seconda catena di DNA complementare alla prima (attività

DNA-Polimerasica DNA-Dipendente della RT).

Il risultato è un DNA a doppia catena che contiene tutte le informazioni genetiche presenti

nel genoma originario ad RNA. Sito catalitico: 3 residui Aspartici 85-

86-110

Figura 3.18: Struttura della Trascrittasi Inversa.

Come si può notare dalla figura, la trascrittasi inversa dell’HIV-1 è un eterodimero,

strutturalmente simile ad una mano chiusa, costituito da due subunità molecolari molto ingombranti

di 66 e 51 KDa rispettivamente, denominate p66 (560 aa) e p51 (440 aa).

43

Quest’ultima subunità deriva dalla scissione proteolitica, ad opera di una proteasi virale,

dell’estremità carbossi-terminale di p66 che comporta la perdita del dominio dell’Rnasi H (aa 427-

Entrambe le subunità hanno in comune quattro sottodomini definiti: fingers (aa 1-85 e 118-

560).

155), palm (aa 86-117 e 156-237), thumb (aa 238-318) e connection (aa 319-426) ma assumono

una diversa conformazione spaziale. Inoltre, le attività catalitiche (DNA-Polimerasica e

catalitico: D185-186-110), mentre

Ribonucleasica) sono svolte dalla subunità enzimatica p66 (sito

la p51 è essenziale per stabilizzare il legame del primer del tRNA all’inizio della retrotrascrizione,

per lo spostamento della catena e la fase di processazione durante la sintesi del DNA.

La figura 3.19 evidenzia i siti enzimatici più importanti ai fini dello svolgimento e/o

dell’inibizione delle attività catalitiche della Trascrittasi Inversa HIV-1.

NRTI mutations

NNRTI mutations

Figura 3.19 a: Struttura della trascrittasi inversa HIV-1 indicante il sito attivo polimerasico ed i siti

di legame degli inibitori.

C’è solamente un sito attivo in ciascuna trascrittasi inversa ed è caratterizzato da una triade

di residui aspartici (D185-186-110) in prossimità dei quali termina il gruppo ossidrilico-3’ del

primer [103].

La subunità p66 è organizzata a formare una larga fenditura all’interno della quale si legano

la catena di RNA (Templato) e il DNA primer (Figura 3.19b). La subunità p51 non possiede la

fenditura e i residui coinvolti nella catalisi (D185, D186, D110) sono nascosti.

44

Figura 3.19 b: Particolare del sito attivo dell’RT.

Una volta legati primer e dNTP inducono un cambiamento conformazionale della subunità

p66. In particolare si è visto che, in seguito a questo legame, il sottodominio fingers shifta verso la

regione palm. Questo movimento porta nuovi residui aminoacidici in contatto con il dNTP. In

particolare, il sito per il dNTP, descritto bene da alcuni ricercatori [104] (Figura 3.19 c), mostra

chiaramente che la coordinazione di una lisina, una arginina e due ioni magnesio (A e B)

caratterizza il complesso attivo che incorpora il nucleotide.

Coordinazione di una lisina, una arginina e due ioni magnesio nel complesso attivo

Figura 3.19 c: che lega il nucleotide.

45

Una ulteriore immagine del sito attivo dimostra che il Mg (B) può presentare una geometria

di tipo ottaedrica che somiglia molto al dominio T7 della DNA-Polimerasi (Figura 3.19d fr. gialla).

Crystal

Figura 3.19 d: geometria ottaedrica del Mg (B) a livello del sito attivo.

Essendo un enzima virale essenziale, la RT è uno tra i principali obiettivi farmacologici

sfruttati nelle attuali terapie antiretrovirali.

A tale proposito, possiamo distinguere due importanti categorie di farmaci che inibiscono

l’azione di questo enzima:

1) Inibitori Nucleosidici e Nucleotidici della Trascrittasi Inversa (NRTIs e NtRTIs);

2) Inibitori Non Nucleosidici della Trascrittasi Inversa (NNRTIs).

I primi sono anologhi del substrato naturale (dNTP) e, competendo con il suo sito di legame

(dTTP), si comportano da terminatori di catena (Figura 3.19e). Per esplicare questo meccanismo

devono necessariamente possedere un gruppo ossidrilico in 3’. Hanno però lo svantaggio di essere

dannosi per le cellule.

Figura 3.19e: Sito di binding degli NRTIs (freccia blu) e NNRTIs (freccia gialla) .

46

Invece gli inibitori non nucleosidici sono molecole, chimicamente diverse dal substrato

naturale, che bloccano l’attività polimerasica dell’enzima interagendo con esso in maniera non

competitiva. Infatti si legano su un sito allosterico (NNIBP) distante quasi 10Å dal sito catalitico

(Figura 3.19e). Questo è formato da due residui di triptofano che circondano la molecola di NNRTI

e la incorporano [105]. Si pensa che gli NNRTIs prevengano i cambiamenti conformazionali

essenziali per l'allungamento del filamento di DNA. Inoltre, rispetto agli NRTIs, non causano

citotossicità a dosi terapeutiche. 47

3.1.5.1. Inibitori Nucleosidici della Trascrittasi Inversa (NRTIs)

Sono attualmente tra i farmaci più usati nella terapia dell’AIDS anche se mostrano diversi

effetti collaterali e nelle terapie prolungate producono, per mutazione, ceppi virali resistenti al

trattamento farmacologico.

I farmaci più importanti appartenenti a questa classe sono (Figura 3.20):

(Zidovudina, Retrovir®);

- 3’-azido-2’,3’-dideossinucleosidi: AZT

- 2’-3’-dideossinucleosidi: DDI (Didanosina,Videx®) e DDC (Zalcitabina, Hivid®);

(Stavudina, Zerit®);

- 2’,3’-dideidro-2’,3’-dideossinucleosidi: d4T

- 3TC (Lamivudina, Epivir®), anche introdotto sul mercato in combinazione con

Zidovudina (Combivir®) e con Abacavir (Epzicom®);

- ABC o 1592U89 (Abacavir, Ziagen®), anche presente sul mercato in combinazione con

Zidovudina e Lamivudina (Trizivir®);

- Emtricitabina (2’,3’-dideossi-3’-tio-5-fluorocitidina, (-)- FTC), inizialmente introdotto

sul mercato come Coviracil® ed attualmente presente come Emtriva®, è il settimo analogo

2’,3’-dideossinucleosidico ufficialmente approvato (dal 2 luglio 2003) per il trattamento

dell’infezioni da HIV.

Figura 3.20: Analoghi Nucleosidici utilizzati nella terapia dell’HIV (NRTIs).

48

Essendo strutturalmente analoghi nucleosidici, competono con i substrati naturali e vengono

incorporati dalla Trascrittasi Inversa nelle catene del DNA virale in crescita, bloccandone

l’ulteriore sviluppo. Per fare questo le molecole devono per prima cosa subire fosforilazione

sequenziale in 5’ da parte di apposite chinasi e venire trasformate nei loro trifosfati (specie attive).

La fosforilazione è una tappa importante per esplicare l’azione anti-HIV data la maggiore affinità

verso la trascrittasi inversa e verso altri enzimi virali manifestata dai nucleotidi in confronto ai

nucleosidi.

I requisiti strutturali necessari per l’attività si possono definire sulla base di studi di

relazione struttura-attività (SAR):

1) in 5’ deve essere presente un OH;

2) in 3’ devono essere presenti un gruppo azidico, un atomo di H o uno di F o in alternativa

il legame 2’,3’ deve essere doppio;

3) al posto di un metilene dello zucchero può esserci un eteroatomo (zolfo).

o zidovudina (3’-azido-2’-3’-didesossitimidina) è un analogo della timidina in cui

L’ AZT

al C3 del desossiribosio è presente un gruppo azidico. Essa è altamente efficace nel bloccare la

riproduzione di HIV ed è utile nel trattamento dell’AIDS e del complesso AIDS-correlato (ARC)

per tenere sotto controllo le infezioni opportunistiche.

Questa molecola per esplicare la sua azione deve prima essere fosforilata ad opera di una

timidina chinasi cellulare. Dopo essere stata convertita a mono-, di- e trifosfato da parte della

chinasi va a competere con i dedossinucleotidi naturali per il legame con il DNA.

Questo processo previene il normale legame 5’-3’-fosfodiestereo e la catena di DNA cessa

di allungarsi a causa della presenza del gruppo azidico. A dosi adeguate l’AZT trifosfato blocca la

moltiplicazione dell’HIV per inibizione selettiva della DNA-polimerasi virale.

I 2’-3’-dideossinucleosidi (DDC e DDI) sono nuovi nucleosidi che presentano diversi

vantaggi rispetto l’AZT quali la minore tossicità, la maggiore tollerabilità e l’attività inibente nei

confronti dei mutanti resistenti all’AZT.

Anche i nucleosidi solforati quali 3TC e FTC hanno mostrato potente attività nei confronti

dell’HIV.

Tra gli NRTIs sopra citati, l’emtricitabina, è stata introdotta recentemente in terapia ed è

stata considerata “Farmaco Ideale” in quanto mostra:

- sinergismo d’azione con altri farmaci antiretrovirali, soprattutto con didanosina ed efavirenz

[60,61]; 49

- eccellente tollerabilità dopo lunghi periodi di terapia, sia da sola che in combinazione con

altri agenti anti-virali [61];

- lunga emivita intracellulare anche dopo singola somministrazione giornaliera (200 mg)[59];

- efficacia in vitro circa 4-10 volte più elevata rispetto alla lamivudina [62, 63].

Altri composti appartenenti alla classe degli analoghi nucleosidici (NRTIs) sono attualmente in fase

di sviluppo (Figura 3.21)(in questa sede verranno solo citati e per un approfondimento si fa

riferimento a quanto riportato in letteratura):

- 2’-deossi-3’-ossa-4’-tiocitidina (dOTC, BCH-10652) [64];

[64];

- il derivato 5-fluoro-sostituito di dOTC: FdOTC (Racivir)

- l’'enantiomero levo-giro di dOTC (Figura 3.21), detto anche SPD754 [65];

- -D-2’,3’-dideidro – 2’,3’-dideossi-5-fluorocitidina ( - D-d4FC, RVT, Reverset).

Figura 3.21: nuovi analoghi nucleosidici.

L’enantiomero (-) - dOTC ha mostrato una promettente attività nei confronti di ceppi virali

mutanti (singole mutazioni, come M184V, ma anche mutazioni multiple a carico della timidina,

TAMs). Tuttavia questo farmaco può essere antagonizzato dal composto 3TC, quindi è

controindicata una loro co-somministrazione in terapia [66]. -D-d4C ( - D-2’,3’-

L’RVT (Figura 3.21) corrisponde al derivato 5-fluoro-sostituito di

dideidro-2’,3’-dideossicitidina), composto già considerato, nel 1986, un potente e selettivo farmaco

anti-HIV [67]. L’RVT è in grado di esplicare la sua azione contro ceppi virali resistenti al

trattamento con 3TC e AZT [68], mentre sembra essere meno efficace nei confronti dei virus

resistenti a molti farmaci NRTIs, in modo particolare verso ceppi che portano la mutazione Q151M

sul gene della trascrittasi inversa [69]. Inoltre lo stesso composto causa, in vitro, la selezione di

ceppi mutanti (K65R) [69]. In studi di Fase I è stato dimostrato che possono essere ottenute

concentrazioni plasmatiche ottimali, del composto, somministrando 50 mg per via orale [70, 71,

72]. Tra i nuovi analoghi 2’,3’-dideossinucleosidici (con base purinica) il migliore sembra

essere l’amdoxovir ((-) - D-2,6-diaminopurina diossolano, DAPD) (Figura 3.21). DAPD viene

convertito ad opera di una adenosina deaminasi nel derivato diossolano guanina (DXG), che a sua

50

volta viene fosforilato in 5’ al livello intracellulare [73]. Il metabolita attivo (DXG-TP) agisce da

substrato alternativo e quindi inibisce la trascrittasi inversa di HIV-1 [74, 75].

DAPD/DXG si è dimostrato molto attivo contro ceppi mutanti, di HIV-1, resistenti al

trattamento con zidovudina (M41L/D67N/K70R/T215Y/K219Q) e lamivudina (M184V) [73],

tuttavia si è da poco notata una sua minore attività nei confronti dei virus che presentano le

mutazioni K65R e Q151M [76] ed è stato causa esso stesso della selezione di nuovi ceppi mutanti

[77]. 3.5.2. Inibitori Nucleotidici della Trascrittasi Inversa (NtRTIs)

Contrariamente agli NRTIs, gli Inibitori Nucleotidici della Trascrittasi Inversa (NtRTIs),

quali:

- Adefovir (9-2-fosfonilmetossietiladenina, PMEA) e (Figura 3.22),

- Tenofovir (R-9-(2-fosfonilmetossipropiladenina, PMEDAP)

sono dotati di un gruppo fosfonico laterale, quindi hanno bisogno solo di due fosforilazioni, in vivo,

per essere convertiti nei rispettivi metaboliti attivi (PMEApp, PMEDAPpp). Quest’ultimi,

sostituendosi al substrato naturale (dNTP), durante le fasi di retrotrascrizione, agiscono da

terminatori di catena e inibiscono la replicazione virale [78]. R = H PMEA

R = NH PMEDAP

2

.

Figura 3.22: Fosfonilmetossietilderivati

Studi recenti hanno messo in evidenza che questi fosfonilmetossietilderivati sono più attivi

dell’AZT, manifestano una azione molto duratura e hanno uno spettro allargato anche agli herpes

virus. PMEA è efficace quanto l’AZT nell’infezione retrovirale ed è attivo quanto l’aciclovir nel

trattamento delle infezioni da virus herpes simplex (probabilmente per la somiglianza strutturale).

L’inserimento di un gruppo fluorometilico nella catena laterale della PMEA ha dato origine a

derivati purinici più selettivi di PMEA e PMPA sia in vitro che in vivo.

Da poco si è notato che, come lamivudina, emtricitabina, ed amdoxovir, gli NtRTIs

adefovir e tenofovir non solo sono attivi contro l’HIV, ma sembrano essere efficaci contro il virus

51

dell’epatite B (HBV). Questa scoperta non ha sorpreso i ricercatori, in quanto l’HBV utilizza,

durante le fasi di replicazione, un enzima piuttosto simile alla RT dell’HIV. Adefovir e tenofovir

sono stati, quindi, ufficialmente approvati, rispettivamente, per il trattamento del HBV e dell’HIV,

sotto forma di profarmaci somministrabili oralmente (Figura 3.23):

- Adefovir Dipivoxil (bis(pivaloyloxymethyl)-PMEA, Hepsera®)

- Tenofovir Disoproxil (il bis(isopropyloxycarbonyloxymethyl)-PMPA, Viread®).

Figura 3.23: Struttura dei profarmaci somministrabili oralmente.

Del Tenofovir Disoproxil Fumarato (TDF) è sufficiente una singola dose giornaliera di

300 mg per ottenere un buon effetto antivirale, inoltre il composto sembra, secondo alcuni studi,

essere efficace contro ceppi virali mutanti (K65R) anche in seguito ad uso prolungato [79].

Molti altri studi sono stati portati avanti con lo scopo sia di valutare ulteriormente

l’efficacia di questo composto che di confrontarla attraverso vari regimi terapeutici [80-89].

52

3.5.3. Inibitori Non-Nucleosidici della Trascrittasi Inversa (NNRTIs)

Gli Inibitori Non Ncleosidici della Trascrittasi Inversa interagiscono con la trascrittasi

dell’HIV-1, a livello di un sito di legame diverso da quello del substrato naturale. L’inibizione di

HIV-1 è specifica (non sono altrettanto attivi nei confronti di HIV-2 o di altri retrovirus) e si ottiene

a concentrazioni significativamente più basse di quelle citotossiche [90]. La potenza e la selettività

degi NNRTIs si evince dai valori di EC e dall’indice di selettività (EC /CC ).

50 50 50

Sulla base di queste premesse, possono essere considerate più di 30 differenti classi di

composti [90] (Tabella 6). Tre NNRTIs: Nevirapina (Viramune ), Delavirdina (Rescriptor ),

® ®

ed Efavirenz (Sustiva ) sono stati finora formalmente autorizzati per l’uso clinico nel trattamento

®

delle infezioni da HIV-1. L’Emivirina (MKC-442) [91] sarebbe dovuto essere il quarto, ma il suo

sviluppo è stato al momento interrotto.

Tra quelle riportate in tabella le classi più rappresentative sono:

1. HEPT (idrossi etossi feniltio timina) e derivati;

(diaril butil ossi) derivati;

2. DABO

3. TIBO (tetraidro metil imidazo benzodiazepin one);

4. PETT (fenil etil tiazol tiouree);

(Nevirapina)

5. NVP

6. Derivati piridonici: piridone (L-697661);

[bis(eteroaril)piperazine]: delaviridina, atervidina;

7. BHAP

8. a-APA (alfa-anilinofenilacetamide);

(spiro – Si);

9. TSAO

10. Solfoni. 53

Code Laboratori Attività

TABELLA 6 Nome Citotossicità

Farmaceutici contro

Sperimentale

Abbr. commerciale

Composto e/o Classe HIV-1 RT

IC50 µM EC50 CC50 IS

(µM) (µM)

0.05 0.0046 138 30000

Tivirapina 8-cloro- R86183

(Tetraidrometil-Imidazo- TIBO

BenzodiazepinOne) 0.012 0.014 >100 >7000

Emivirina HEPT MKC-442

(Idrossi-Etossi-Feniltio-Timine) I-EBU 0.084 0.048 >50 >1000

Nevirapina NVP BI-RG-587 Viramune® Boehringer

Ingelheim 0.019 0.012 >60 >4800

Piridinone L-697,66 0.26 0.01 >100 >10000

Delavirdina BHAP U-90152 Rescriptor® Pfizer

(Bis(eteroAril)Piperazine) 4.7 0.034 139 4088

TSAO-m3 T 0.2 0.013 710 54615

Loviride a-APA R89439

(alfa-Anilino-Fenil-Acetamide) 0.007 0.016 87 5438

Trovirdine PETT LY300046

(Fenil-Etil-Tiazolo Tiourea) 0.02 0.002 >100 >50000

Tiocarbossanilide UC-78 0.08 0.001 200 20000

Chinossalina HBY 097 0.5 0.21 60 292

Tiazolobenzimidazolo TBZ NSC625487 0.016 0.01 >50 >5000

Tiazoloisoindolinone BM+51.0836 0.003 <0.003

Indolo carbossamide L-737.126 1.2 4 >130 >32

Benzotiadiazina NSC 287474 0.012 <0.025

Chinazolinone Bristol-Myers 0.003 0.001 80 80000

Efavirenz (Benzossazinone) DMP266 Sustiva® Squibb 0.07 0.1 20 200

Canolide A 0.04 <0.3 10 >33

Pirrolobenzodiazepinone 0.156 <0.002 >10 >5000

Imidazodipiridodiazepina UK-129.485 0.0006 0.01 26 2.600

Imidazopiridazina 0.5 0.012 28 2280

TDA RD 4-2024 0.18 0.0025 38 15000

MEN 10979 1.8 0.8 >335 >418

(Di-Aril-Butil-Ossi) Derivati DABO 0.1 0.01 >10 >1000

HEPT-

Piridinone 12 100 8

Benzilossimetilpiridinone 12.3 0.064 33 516

Alcossi(ariltio)uraxile 0.028

Indolildipiridodiazepinone 0.25 0.47 4.9 10

Pirrolobenzoazepinone 0.64 2.3 175 76

Pirrolo sostituiti 50-80 0.3 >16 >50

Benziltiopirimidine U-31355 54

Studi SAR su 10 classi importanti di NNRTIs [101]:

1. Il capostipite di nuovi composti antiretrovirali dotati di potente attività inibente nei

confronti di RT HIV-1 è rappresentato da un derivato aciclouridinico 6-sostituito, denominato

HEPT, ossia 1-[(2-idrossietossi)metil]-6-(feniltio) timidina (Figura 3.24).

Figura 3.24: Struttura HEPT.

Da studi di relazione struttura attività (SAR) si è notato che:

- L’introduzione di un gruppo alchilico (metile, etile, isopropile) in 5 nella struttura del

derivato uracilico HEPU inattivo fornisce prodotti altamente attivi;

- La sostituzione del gruppo -CH OH con il gruppo -CH porta ad un forte incremento

2 3

dell’attività;

- I composti contenenti due gruppi metilici nelle posizioni 3’,5’ del benzene sono molto più

attivi dei corrispondenti composti privi dei metili;

- La conversione del CO in posizione 2 con il gruppo CS porta ad un debole incremento di

attività (HEPT-S risulta più attivo di HEPT, ma è anche citotossico);

- La sostituzione dell’atomo di zolfo con il gruppo -CH fornisce prodotti più potenti di

2-

quella della serie HEPT.

2. Con la scoperta di HEPT e di E-BPU-dM è stata avviata una ricerca nella sintesi di

isomeri di HEPT, ossia i composti DABO, che differiscono dai primi per la presenza di una catena

alchilossi in posizione 2 invece che in posizione 1 del nucleo pirimidinico, di cui mimano però la

parte benzilica in 6 (Figura 3.25).

Gli studi SAR indicano che:

- la sostituzione della catena butilossi con catene alchiliche (lineari e ramificate, sature ed

insature) e cicloalchiliche è ammissibile;

- l’Introduzione di uno o due metili nel nucleo benzenico nelle posizioni 3 e 5;

- la sostituzione della catena alchilossi con quella alchltio; introduzione di un gruppo etilico in

5; 55

6-feniltio aciclotimidina 6-benzil 5-etil aciclouridina

Isomero HEPT

HEPT E-BPU-dM

DABO

Figura 3.25.

I DABO sono altamente selettivi nei confronti di HIV-1. In associazione con AZT ne

potenziano l’azione e diminuiscono la formazione di ceppi mutanti resistenti.

3. Il lead compound dei derivati TIBO è R14458. Tale composto (Figura 3.26) è costituito

da una struttura triciclica imidazobenzodiazepinica e ha dato origine a nuovi derivati per

omologazione della catena insatura in 6, trasformazione del -CO- ureidico in -CS nella posizione 2

del nucleo imidazolidonico e introduzione di un atomo di alogeno nella posizione 9, tipica delle

benzodiazepine ad attività ansiolitica, o nella posizione 8

Figura 3.26: Lead Compound dei derivati TIBO.

TIBO e HEPT sono selettivi verso l’HIV-1 e non inibiscono l’HIV-2 a differenza di AZT,

DDI e DDC. 56

Tra i composti con un elevato indice di selettività sono i derivati: R82150, R82913, R86183

(tivirapina) e R86775 (Figura 3.27). Figura 3.27: Derivati TIBO.

Relazione Struttura-Attività (SAR):

- I derivati TIBO hanno potenza simile a quella dell’AZT, ma con selettività maggiore. Il

capostipite agisce su un sito allosterico e inibisce l’attività della RT a livello della

polimerizzazione del DNA;

- Un derivato con Cl in 9 può inibire differenti ceppi di HIV-1. Anche gli 8-alogeno derivati

sono molto potenti;

- Il gruppo ureico ciclico è indispensabile per l’attività, ma l’ossigeno carbonilico può essere

sostituito da S e Se.

4. In seguito ad alcuni studi di semplificazione molecolare dei TIBO è stato trovato un

nuovo lead compound (Figura 3.28), LY73497 (N1-fenil-N3-tiazol-2-il-tiourea) e quindi dei

(fenil etil tiazol tiouree). Tale composto presenta una modesta attività inibente

derivati PETT

l’RT, per cui è stato deciso di avviare la ricerca di nuovi analoghi più potenti. Tale ricerca

consisteva nel sezionare la molecola in 4 parti (parte aromatica benzenica, catena alchilica legante,

tiourea e parte eterociclica tiazolica) modificandole via via per giungere a nuovi prodotti da

saggiare contro il virus dell’AIDS. 57

Figura 3.28: Scoperta di un nuovo lead compound (e dei derivati PETT).

Studi SAR e computazionali hanno portato a stabilire che:

- una struttura conformazionale rigida era da preferirsi alla struttura a catena lineare

completamente aperta;

- i derivati dell’urea risultavano meno attivi dei corrispondenti composti della tiourea;

- opportuni gruppi sostituenti (-F,-Cl, -CH3, -OCH3) portavano ad un forte incremento

dell’attività anti-HIV;

il nucleo tiazolico poteva essere sostituito da altri gruppi eterociclici.

- Il composto MSC-127 è uno tra i più potenti della serie.

5. L’identificazione di un lead compound su composti correlati con la pirenzepina e la sua

ottimizzazione mediante studi SAR, indagini sul metabolismo e sulla farmacocinetica hanno portato

alla scoperta della Nevirapina (NVP).

La nevirapina (Figura 3.29) appartiene alla classe dei dipiridodiazepinoni ed è un potente

inibitore dell’attività polimerasica di HIV-1 RT. Agisce non-competitivamente nei confronti dei

nucleotidi (nucleosidi trifosfato) legandosi alla RT in prossimità del sito d’azione ed inibisce la

moltiplicazione dell’HIV-1. 58 .

Figura 3.29: Struttura della Nevirapina

Studi SAR per la Nevirapina:

- In associazione con AZT presenta sinergismo d’azione e manifesta azione inibente nei

confronti dei mutanti HIV-1 resistenti all’AZT;

- il punto di unione tra l’anello piridinico ed il nucleo benzodiazepinico è cruciale per

l’attività;

- l’attività ottimale si ha quando uno dei due anelli laterali del sistema triciclico è un

eterociclico di tipo piridinico, meglio ancora se entrambi sono piridine, ed in tal caso è

importante la posizione dei due atomi di azoto. Il massimo della potenza si raggiunge come

nel composto lead, se la posizione 4 porta un piccolo gruppo lipofilo (un metile) e l’azoto

lattamico ha un idrogeno libero;

Come verrà successivamente accennato gli studi di molecular modeling hanno permesso di

confrontare i composti TIBO e la nevirapina in cui sono presenti elementi strutturali comuni:

due sistemi orientati tra di loro come le ali di una farfalla (Figura 3.30), una regione

lipofila intermedia tra di essi e un gruppo carbonilico o tiocarbonilico ecc.

modello molecolare attivo che permette di prevedere se un nuovo sistema triciclico risulta

Figura 3.30: bioisosterico e quindi presenta attività anti-HIV come TIBO e Nevirapina.

59

Questo modello molecolare è stato confermato da molti studi ed è attualmente sfruttato per il

drud desing di nuovi composti attivi [106].

I primi studi dimostravano, infatti, che le strutture di alcune classi di NNRTIs,

apparentemente, divergono tra loro, ma da una analisi più attenta si è notato che la maggior parte

possiede delle caratteristiche comuni:

- un “corpo” di natura idrofila rappresentato da un gruppo (tio) carbossamidico o (tio)

acetamidico o ureidico, circondato da

due “ali” idrofobiche, una delle quali è spesso sostituita da un atomo di alogeno.

-

Quindi, la struttura complessiva ricorda molto quella di una farfalla, con un corpo (idrofilo) e due

ali (idrofobiche).

Questo modello “Butterfly-like” è stato confermato, da analisi cristallografiche, durante gli studi

sulla Nevirapina e TBZ.

Sulla base di quanto scoperto, è stato in seguito dedotto anche un modello farmacoforico (3D)

attraverso l’utilizzo di ben otto farmaci noti (Nevirapina, Delavirdina, Efavirenz, Trovirdine,

Loviride, Indolo Carbossamide, Benzotiadiazina-1-ossido e Tiocarbossanilide). Tutti i ligandi sono

stati ottimizzati geometricamente tramite la determinazione dell’energia interna ottenuta a sua volta

attraverso calcoli di meccanica molecolare (parametrizzazione MM3), per assicurare un

campionamento uniforme delle conformazioni a più bassa energia (Figura 3.31).

Figura 3.31: Modello farmacoforico (3D) per il drug desing di nuovi NNRTIs.

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AUTORE

Moses

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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti di Chimica farmaceutica della professoressa Grasso su anti hiv con analisi dei seguenti argomenti: farmaci antiretrovirali (anti-aids), recettore cellulare cd4, inibitori della fase di attacco, antagonisti dei recettori, inibitori della fusione cellulare, inibitori della trascrittasi inversa, inibitori dell'integrasi, inibitori della trascrizione, inibitori della proteasi, inibitori della ribonucleasi.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Moses di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Chimica farmaceutica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Grasso Silvana.

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