Chimica farmaceutica - anti hiv / aids

CAPITOLO 3.

FARMACI ANTIRETROVIRALI:

ANTI-AIDS

3.1. Introduzione

Una fase importante per lo sviluppo di nuovi farmaci è la ricerca dinamica dei targets

molecolari con cui interagiscono.

I farmaci antiretrovirali attualmente utilizzati, o ancora in fase di studio, nella terapia

dell’AIDS possono essere classificati sfruttando le conoscenze riguardanti questi targets [1a,b] in:

1) Modulatori dell’espressione del recettore cellulare CD4;

2) Inbitori della fase di attacco del virus all’ospite;

3) Antagonisti dei recettori delle chemochine;

4) Inibitori della fusione cellulare;

5) Inibitori della trascrittasi inversa:

5.1) Inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa (NRTIs);

5.2) Inibitori nucleotidici della trascrittasi inversa (NtRTIs);

5.3) Inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (NNRTIs);

6) Inibitori dell’integrasi;

7) Inibitori della trascrizione;

8) Inibitori della proteasi (PIs);

9) Inibitori della ribonucleasi H.

In questo capitolo è stata dedicata principale attenzione ai farmaci che inibiscono la

retrotrascrizione dell’HIV ed è stata riportata una breve trattazione delle prime quattro classi di

farmaci sopra citate. Infatti quest’ultimi potrebbero, “in futuro”, avere un ruolo importante nella

prevenzione dell’infezione virale. 29

3.1.1. Modulatori dell’espressione del recettore cellulare CD4

Per infettare una cellula l’HIV deve prima di tutto legarsi superficialmente ad essa tramite

uno specifico recettore, denominato CD4. I recettori di superficie CD4 potrebbero, quindi,

rappresentare un bersaglio farmacologico per prevenire l’attacco del virus nei confronti dell’ospite.

Recentemente, è stato notato che una molecola, la Ciclotriazadisulfonamide (CADA) (Figura 3.1),

nonché una ampia serie di suoi derivati [3], è in grado di evitare l’infezione da HIV regolando

l’espressione di questo recettore [2].

Figura 3.1: Struttura della Ciclotriazadisulfonamide.

L’azione specifica di CADA (che non altera l'espressione di alcun altro recettore cellulare)

differisce da quella dell’acido aurintricarbossilico, che lega direttamente il CD4, e da quella

dell’acetato forbol miristato che invece agisce attivando una proteina chinasi C [2].

Inoltre, si presume che CADA regoli l'espressione di CD4 a livello (post)translazionale [3],

il che renderebbe promettente un eventuale futuro impiego di questa molecola, nella terapia

antiretrovirale, in associazione con altri farmaci.

Da alcuni studi è emerso che sinergismo d’azione si può ottenere associando la

Ciclotriazadisulfonamide con NRTIs (zidovudina, lamivudina, zalcitabina, abacavir), NtRTIs

(tenofovir), NNRTIs (nevirapina, delavirdina), PIs (lopinavir, saquinavir, indinavir, nelfinavir,

amprenavir e ritonavir), inibitori della fusione (T-20 o enfuvirtide), antagonisti del corecettore

CXCR4 (AMD3100) e Lecitine estratte da Galanthus Nivalis (GNA) ed Hippeastrum (HHA) [4].

3.1.2. Inibitori della fase di attacco del virus all’ospite

estratte dalle piante su menzionate (Bucaneve ed Amarillo) sembrano

Le lecitine vegetali

essere efficaci inibitori dell’attacco virale interferendo con la glicoproteina gp120 [5], presente

sull’envelope, responsabile del legame al recettore cellulare CD4, ma non con la glicoproteina

30

gp41, situata più internamente all’envelope, responsabile invece delle fasi successive al legame.

Questo meccanismo d’azione è stato confermato da evidenze sperimentali su virus mutanti per la

glicoproteina gp120. Infatti, l’N-glicosilazione di residui T ed S (treoninici e serinici) di

quest’ultima, e non della gp41, ha portato alla selezione di ceppi mutanti resistenti alle lecitine

vegetali ma non agli antagonisti dei recettori per le chemochine (AMD3100) o agli inibitori della

fusione (T-20) [6].

Le lecitine vegetali rappresentano una classe unica di molecole per ciò che concerne il loro

profilo di resistenza [6], ma sono anche dotate di interessanti proprietà (biodisponibilità, stabilità

della formulazione, efficacia e sicurezza) che le rendono i principali agenti antivirali candidati ad un

eventuale utilizzo topico per la prevenzione della trasmissione sessuale dell’HIV [5].

Altrettanto qualificata come potenziale microbicida sembra essere la Cianovirina-N (Figura

3.2), una proteina di 11 KDa isolata originariamente dal Cyanobacterium Nostoc Ellipsosporum [7].

Figura 3.2: Cianovirina N.

La Cianovirina-N presenta un’alta affinità per la gp120: blocca il legame di quest’ultima alle

cellule bersaglio, sia che queste esprimano il recettore CD4 sia che non lo esprimano, ed inoltre

blocca il legame della gp120 al corecettore CXCR4 [8].

La Cianovirina-N può esistere in forma monomerica o dimerica come dimostrano le analisi

di cristallografia ed NMR [9]. di alcuni antibiotici glicopeptidici

È stato notato da altri ricercatori che anche gli agliconi

(vancomicina, teicoplanina, eremomicina), sostituiti con gruppi di natura idrofobica, possono

presentare attività anti-HIV-1 e HIV-2, anche a basse concentrazioni molari ( M), ed essere

utilizzati per prevenirne la trasmissione sessuale [10]. Esperimenti eseguiti con alcuni prototipi

dell’aglicone della teicoplanina (Figura 3.3) hanno dimostrato la loro capacità di interferire con le

prime fasi di assorbimento virale, probabilmente legandosi alla gp120.

31

Figura 3.3: Aglicone di alcuni antibiotici di natura glicopeptidica.

I prototipi, invece, non hanno mostrato la stessa efficacia quando inoculati dopo 1-2 ore

dall’inizio dell’infezione.

Recentemente è stata identificata una nuova classe di inibitori della fase di attacco del virus

HIV-1 [il prototipo è il 4-benzoil-1-[4-metossi-1H-pirrolo[2,3-b]-piridin-3-il)ossoacetil]-2-(R)-

metilpiperazina (BMS - 378806) (Figua 3.4 a)], che sembra interferire con il legame tra il recettore

CD4 e la glicoproteina gp120 [11].

Figura 3.4: a) Struttura del prototipo BMS-378806; b) Composto BMS-488043.

Questo composto si lega direttamente alla gp120 in rapporto stechiometrico di 1:1, con

un'affinità di legame molto simile a quella del CD4 solubile. Il sito di binding del composto 4a è

stato localizzato su una specifica regione all'interno della tasca del recettore CD4 ove

presumibilmente si dovrebbe legare la glicoproteina gp120.

Sembra inoltre essere inattivo contro infezioni virali CD4-indipendenti e contro ceppi

mutanti per il recettore CD4; ciò conferma quanto è stato dimostrato sulla sua specificità d’azione

[12]. Le varianti resistenti presentavano il sito di binding per la gp120, sul recettore CD4,

sostituito con altri residui amminoacidici (M426L e M475I).

32

Infine, il prototipo ha mostrato un profilo farmacologico molto vantaggioso: scarso legame

ad altre proteine, buona biodisponibilità orale e bassa tossicità (negli studi preliminari su animali)

[13]. La prova che gli inibitori della fase di attacco possano effettivamente essere efficaci in vivo

contro l’infezione dell’HIV è arrivata in seguito alla progettazione del composto BMS-488043

(Figura 3.4 b), strutturalmente simile al prototipo 4a.

Anche il BMS-488043 sembra interagire, in maniera specifica, con la glicoproteina gp120

modificandone la conformazione e bloccandone il legame con il recettore CD4 [14]. In adulti

infetti, inoltre, è stato dimostrato che la sommministrazione orale di 1800 mg di BMS-488043 ogni

12 h per 8 giorni di terapia portava, dopo 14 giorni, ad una riduzione della carica virale >1.0 log10

nel 67% dei pazienti trattati.

Infine, sono stati notati: una buona tollerabilità e l’assenza di seri eventi avversi.

3.1.3. Antagonisti dei recettori per le chemochine (CCR5 e CXCR4)

Per infettare l’ospite, in seguito al legame con il recettore CD4, le particelle di HIV devono

interagire, attraverso la gp120, con un recettore cellulare CXCR4 o CCR5 (recettori per le

chemochine). CXCR4 è il corecettore presente sui linfociti-T, mentre CCR5 è il corecettore

macrofagico. Possiamo quindi distinguere, in funzione dei corecettori, due sottotipi virali: HIV T-

linfotropico (o X4) e HIV M-tropico (o X5).

CXCR4, normalmente, funziona come recettore per la chemochina SDF-1 (Stromal cell

Derived Factor), mentre CCR5 per RANTES (Regulated upon Activation, Normal T-cell

Expressed, and Secreted), MIP-1a e MIP-1b (Macrophage Inflammatory Proteins); quindi, queste

chemochine potrebbero inibire l’infezione da parte dei due rispettivi sottotipi virali (X4 e X5).

La scoperta che i recettori per le chemochine vengono utilizzati dall'HIV come corecettori

durante la fase di penetrazione all'interno della cellula bersaglio ha portato a considerare lo sviluppo

di una nuova classe di farmaci che, a differenza di quelli attualmente disponibili, andrebbero ad

interagire con molecole cellulari e non direttamente con il virus. Vari studi hanno infatti evidenziato

che il blocco farmacologico dell'entrata del virus nella cellula bersaglio potrebbe essere utilmente

associato alle terapie antiretrovirali attualmente disponibili. Con questo preciso obiettivo sono

quindi in fase di studio varie molecole che antagonizzano i recettori su menzionati:

1) Antagonisti del corecettore CXCR4;

2) Antagonisti del corecettore CCR5;

3) Antagonisti dei corecettori CXCR4 e CCR5.

33

3.1.3.1. Antagonisti del corecettore CXCR4

Il prototipo degli antagonisti del recettore CXCR4 è una molecola biciclica che è stata

denominata AMD3100 (AnorMED Inc) (Figura 3.6).

Figura 3.6: Struttura del AMD3100.

Tale composto ha mostrato specificità per il recettore CXCR4, quindi efficacia contro l’HIV

di tipo X4. Non sembra interagire, invece, con l’altro recettore per le chemochine [15].

Durante la prima fase di studi clinici, su alcuni volontari, è stato notato che la suddetta

molecola apporta un significativo miglioramento, nel tempo, della conta linfocitaria (WBC) [16].

È stato dimostrato, inoltre, che lo stesso composto è in grado di mobilitare le cellule

ematopoietiche dal midollo verso la circolazione sanguigna e, poiché si è riscontrato sinergismo

d’azione con il G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor), è attualmente in atto una

seconda fase di studi clinici su pazienti affetti da mieloma multiplo e linfoma non-Hodgkin.

Gli antagonisti del recettore CXCR4 sembrano essere in grado di sopprimere in vivo anche

la replicazione di virus con duplice tropismo (X4/R5 HIV) [17].

Anche in individui affetti da X4/R5 HIV o X4 + R5 HIV, si è notata, infatti, una riduzione

della carica virale dopo 10 giorni di trattamento (per infusione continua) con basse dosi di

AMD3100 [17].

AMD3100, però, è disponibile solo per via parenterale (endovenosa o sottocutanea) ed è

attivo verso ceppi virali che utilizzano il corecettore CXCR4 e non verso ceppi che impiegano il

corecettore CCR5.

Sfortunatamente gli studi di fase I/II sono stati interrotti a causa del riscontro di tossicità

cardiaca (episodi di tachicardia ventricolare).

Recentemente è stato candidato per gli stessi studi clinici un derivato di AMD3100,

AMD070.

Quest’ultimo ha mostrato importanti proprietà: oltre quella di presentare una buona

biodisponibilità dopo somministrazione orale sembra possedere una potente attività anti-HIV come

antagonista del recettore CXCR4 [18,19].

Studi di relazione struttura-attività (SAR) con analoghi biciclici hanno dimostrato che :

34

- il biciclo non è un requisito indispensabile per l’esplicazione dell’attività antivirale;

- l’apertura di uno dei due cicli con formazione di un guppo piridinometilen-amminico

comporta il mantenimento dell’attività nei confronti di HIV di tipo X4 [20].

Esempio tipico ne è dato dal composto AMD3465 (Figura 3.7). Come si può notare dalla

figura non c’è più il biciclo ma la struttura è solo parzialmente conservata.

Figura 3.7: Composto AMD3465.

(Figura 3.8), un altro antagonista del corecettore CXCR4, sembra essere

Anche KRH-1636

dotato di attività anti-HIV con un profilo farmacologico simile a quello di AMD3100.

Figura 3.8: Composto KRH-1636. [21]

Inoltre, sembra essere ben assorbito a livello duodenale nei ratti e, come AMD070, può

essere somministrato oralmente.

3.1.3.2. Antagonisti del corecettore CCR5 (Figura

Tra gli antagonisti del recettore CCR5, il derivato ammonico quaternario TAK-779

3.9.) è stato il primo nonapeptide ad avere mostrato efficacia comprovata contro la replicazione del

virus HIV-1 M-tropico (X5) (in concentrazioni nanomolari) [22]. Il sito di binding per tale

composto è stato identificato all'interno delle eliche transmembranarie (TM) 1, 2, 3, e 7 del

corecettore CCR5 [23]. 35

Figura 3.9: Struttura di TAK-779.

Sfortunatamente TAK-779 non è somministrabile per via orale e provoca irritazione al sito

di iniezione.

Un’ulteriore ricerca ha condotto, quindi, all'identificazione di un’altra molecola, TAK-220

(da parte della Takeda), un antagonista del recettore CCR5, somministrabile oralmente e con

potente attività anti-HIV-1 R5 o X5 [24].

TAK-220 blocca la replicazione di HIV-1 R5 con una EC50 di 1.1 nM ed una EC90 di 13

nM. Secondo alcuni studi, la disponibilità orale di TAK-220 in ratti e scimmie, a digiuno, è stata

rispettivamente del 9.5% e del 28.5% e si è trovata maggiormente concentrata a livello linfatico,

rispetto al plasma.

Recentemente è stata riportata, in uno studio condotto da alcuni ricercatori [25], la struttura

di un composto analogo di TAK-220 (Figura 3.10).

Figura 3.10: Analogo di TAK-220.

SCH-351125 (SCH-C) (Schering-Plough) (Figura 3.11) è stato, invece, il primo

antagonista del recettore cellulare CCR5 testato clinicamente. Quest’ultimo ha mostrato potente

attività in vitro contro HIV-1 R5 ed in vivo su topi SCIDhu Thy/Liv infetti; inoltre si è notato che il

composto possiede un profilo farmacocinetico favorevole (buona somministrazione orale in ratti,

cani e scimmie) [26]. 36

Figura 3.11: Composto SCH-C.

Alcuni esperimenti clinici preliminari, condotti somministrando oralmente 25 mg del

composto in esame, due volte al giorno per 10 giorni di terapia, ad un certo numero di adulti

infattati con HIV-1, hanno indicato che questo composto è in grado di ridurre la carica virale di 0.5-

1.0 log10 [27].

Più recentemente lo studio di questo farmaco è stato abbandonato a causa del riscontro di

cardiotossicità (anomalie della conduzione cardiaca) in corso degli studi di fase I.

Partendo dal composto precedente, sono stati studiati nuovi antagonisti del recettore CCR5,

somministrabili oralmente, contenenti due gruppi simmetrici: 2,6-dimetilisonicotinamide e 2,6-

dimetilpirimidino 5-carbossamide.

Questi composti hanno mostrato uguale, o in alcuni casi migliore, affinità per il recettore

CCR5 rispetto a SCH-351125 [28,29].

(AD101) si legano su siti diversi della stessa tasca recettoriale

SCH351125 e SCH-350581

formata dalle eliche transmembranarie (TM) 1, 2, 3 e 7 del recettore CCR5. Questo legame

comporta un cambiamento conformazionale a livello della seconda ansa recettoriale, che sfavorisce

l’attacco della glicoproteina virale gp120 [30].

Un'altra classe di antagonisti del recettore CCR5 a basso peso molecolare è rappresentato

dalle Spirodichetopiperazine, come E913 (Figura 3.12), che inibiscono il legame di MIP-1a al suo

recettore, il flusso del Ca++ MIP 1a-dipendente e la replicazione in vitro sia del virus primario che

di alcuni suoi ceppi resistenti ad altre terapie farmacologiche [31].

Figura 3.12: Struttura di E913.

37

Tra i composti appartenenti alla classe delle spirodichetopiperazine, soltanto l’E913 sembra

possedere attività nei confronti dell’HIV, legandosi parzialmente al recettore CCR5.

Questo composto, inoltre, blocca la replicazione di HIV-1 R5 in topi HIV-1 (JRFL)-infetti

di hu-PBM NOD-SCID e possiede una biodisponibilità orale molto favorevole [32].

UK-427857 (Pfizer) (Figura 3.13), un altro antagonista del recettore CCR5, è stato

recentemente selezionato tra i farmaci candidati per la sperimentazione clinica nella terapia

dell’infezione da HIV. Figura 3.13: Struttura di UK-427857.

Tale molecola ha mostrato una potenza eccellente nei confronti di un’ampia serie di virus

isolati che utilizzano il recettore CCR5 per entrare nell’ospite (ad una IC90 <10 nM); mentre si è

visto che è inattiva nei confronti di ceppi CXCR4-tropici [33].

È stata inoltre valutata la sua efficacia in più di 400 volontari e pazienti HIV-1 R5 infetti.

I risultati sono stati molto positivi: ben tollerato anche a dosi superiori a quelle necessarie a

bloccare il recettore CCR5.

Ancora, la somministrazione pro-die di 200 mg di UK-427857 sembra provocare, in 10

giorni di terapia, una diminuzione media della carica virale di 1.42 log10 al giorno, mentre a dosi

di 25 mg pro-die i risultati non sono altrettanto soddisfacenti: solo 0.42 log10 al giorno [34].

Infine, è stato dimostrato che la carica virale dell’R5 HIV-1 rimane bassa per almeno 10

giorni dopo l’interruzione della terapia, la qual cosa suggerisce che per il trattamento con UK-

427857 (e forse anche quello con gli altri antagonisti del recettore CCR5) può essere suffiente una

singola somministrazione settimanale.

Oltre agli antagonisti del recettore CCR5 su menzionati, una numerosa serie di composti

appartenenti alla classe delle pirrolidin-1,3,4-trisostituite sembra possedere buona disponibilità

orale ed elevata attività antiretrovirale [35-39].

Il composto più rappresentativo di questa serie è riportato in figura 3.14.

38

Figura 3.14: Struttura di un pirrolidina 1,3,4-trisostituita.

Il sito di legame per tale molecola sembra trovarsi a livello di una tasca del recettore

CCR5, vicino la superficie extracellulare, formata dalle eliche TM 2, 3, 6 e 7 [40].

Ulteriori studi di modellistica molecolare (Molecular Modeling) potrebbero essere incisivi