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cellule staminali 1

Appunti di ematologia su: ematopoiesi e Gerarchia Ematopoietica. Nicchia ematopoietica e plasticità. Fattori di crescita e di trascrizione. Appunti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Parente dell’università degli Studi del Sannio - Unisannio. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Ematologia docente Prof. D. Parente

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ESTRATTO DOCUMENTO

In uno studio ormai divenuto classico, risalente ai primi anni sessanta, Till e McCulloch definirono

staminali una popolazione di cellule ematopoietiche dotate di capacità clonogeniche e in grado di

ripopolare la milza di topi irradiati in risposta al microambiente.Queste cellule in alcuni casi

producevano cloni che se trasferiti in ospiti secondari provvedevano alla ricostituzione di tutti i

lineages .

La staminale ematologica è la cellula meglio caratterizzata.Tuttavia contrariamente alle neurali o alle

embrionali, individuate successivamente, non è tuttora possibile mantenere le HSCs ex vivo, se non per

tempi molto brevi, nè espanderle su vasta scala. Le difficoltà riscontrate nel loro studio sono

riconducibili al fatto che si tratta di cellule estremamente rare (la stima della loro frequenza nel midollo

5

osseo di topo è di una su 10 cellule), e dotate di un fenotipo indifferenziato che impedisce la loro

purificazione come popolazione omogenea. Dal momento che non possono ancora essere studiate in

vitro, per valutare la presenza di HSCs all’interno di una popolazione cellulare eterogenea e per

analizzarne le caratteristiche funzionali si ricorre a saggi di ripopolazione a lungo termine, che

sfruttano la capacità di queste cellule di ricostituire il sistema ematopoietico di topi letalmente irradiati

o geneticamente difettivi (Ogawa, 1993). L’esposizione a un’opportuna dose di radiazioni o la

somministrazione di sostanze citotossiche provoca la morte delle cellule ematopoietiche, pur mantendo

inalterata la funzionalità del microambiente midollare (Till e McCulloch, 1961). Gli animali sottoposti

a tale trattamento vanno incontro a morte nel giro di una o due settimane a meno che non vengano

trapiantati con cellule di midollo osseo proveniente da donatori compatibili. Le cellule trapiantate

costituiscono in realtà una popolazione eterogenea, comprendente oltre alle HSCs anche precursori a

diversi stadi differenziativi che garantiscono la ricostituzione delle diverse filiere nel periodo

immediatamente successivo il trattamento. Tuttavia si tratta di un’azione temporanea, dal momento che

i progenitori presentano una capacità di rinnovarsi tanto più ridotta quanto più sono differenziati. Il

contributo di queste cellule alla ricostituzione si esaurisce

infatti dopo circa tre mesi, ed è solo a partire da allora che gli elementi staminali presenti nel pool di

cellule trapiantate iniziano a ripopolare il compartimento ematopoietico e lo fanno in maniera definitiva

recuperando completamente la funzionalità ematopoietica (Harrison, 1980). Un altro sistema per

studiare il fenotipo e la funzione delle HSCs consiste nell’impiegare come riceventi animali

geneticamente modificati, quali ad esempio portatori di una mutazione in un determinato locus che

codifica per un prodotto indispensabile allo sviluppo di un normale sistema ematopoietico. Le cellule

ematopoietiche di questi topi hanno uno svantaggio di crescita rispetto a quelle dei wild-type, pertanto

il trapianto di midollo osseo in questi animali consente di testare la capacità di ripopolazione

competitiva di una certa popolazione cellulare (Szilvassy et al., 1990). Un modello largamente

impiegato anche per lo studio delle HSCs umane (dal momento che non è possibile effettuare dei saggi

di ripopolazione in vivo) è il topo NOD/SCID (non-obese diabetic/severe combined immunodeficient),

che avendo un sistema immunitario fortemente carente consente l’attecchimento di cellule umane

(Dick, 1996).

Una strategia di grande utilità e ormai largo impiego per isolare popolazioni fortemente arricchite in

cellule staminali ematopoietiche o precursori molto precoci sfrutta l’espressione di antigeni di

membrana rivelata tramite FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). Al momento nessuno dei

marcatori noti è risultato esclusivo delle HSCs, pertanto combinazioni di diversi antigeni vengono in

genere utilizzate per ottenere la loro univoca caratterizzazione immuno-fenotipica. Il primo screening

può essere realizzato tenendo conto del fatto che le HSCs non esprimono marcatori di lineage

caratteristici di cellule ematopoietiche differenziate terminalmente, quali CD3, CD4, CD8, B220, Gr-1,

-

Mac-1,TER119,sono quindi Lin (Spangrude et al., 1988). Alla fine degli anni Novanta si era fatta

strada l’ipotesi che la sialomucina CD34 (Cluster of Differentiation), espressa solo in piccole frazioni

di cellule midollari che comprendono precursori ed HSCs, fosse un marcatore di cellule staminali. I

3

+

primi esperimenti, condotti utilizzando cellule donatrici CD34 per il trapianto di topi letalmente

irradiati o immunocompromessi, mostravano la capacità di queste cellule di ripopolare a lungo termine

l’intero sistema ematopoietico dell’animale recipiente (trattati in Goodell, 1999). Inoltre l’utilizzo di

+

popolazioni di midollo osseo umano arricchito in cellule CD34 migliorava notevolmente l’efficienza

dei trapianti di midollo e ne diminuiva le complicazioni (Civin et al., 1996; Link et al., 1996; Yabe et

-

al., 1996) Tuttavia analisi più approfondite hanno rivelato che anche cellule CD34 sono in grado di

realizzare una completa ricostituzione del sistema ematopoietico. L’ipotesi corrente è invece che la

presenza di questo marcatore sulla membrana cellulare sia indicativa dello stato di attivazione della

cellula staminale (Sato et al., 1999). Infatti nel midollo osseo la maggior parte delle HSCs si trova in

uno stato di quiescenza e non esprime CD34 o lo fa ad un livello molto basso, mentre in seguito ad

attivazione comincia ad esprimerlo ad alti livelli. La sovraespressione di questo antigene sembra un

fenomeno reversibile, cosicché cellule attivate possono dividersi e differenziare oppure tornare in stato

di quiescenza e non esprimere più questo marcatore. Nel topo l’espressione di CD34 in cellule

ematopoietiche primitive decresce col procedere dello sviluppo, e questo è in accordo con il fatto che

-

le cellule staminali adulte quiescenti sono maggiormente presenti nella frazione CD34 (Matsuoka et

al., 2001). Anche l’espressione di un'altra glicoproteina, CD38, è stata oggetto di simili controversie:

in un primo tempo sembrava che le HSCs e i progenitori primitivi

umani fossero CD38(Novelli et al., 1998), mentre studi successivi hanno evidenziato che nel topo sia

le HSCs fetali che quelle adulte sono CD38(Dagher et al., 1998). In realtà pare che anche l’espressione

di questo marcatore sia influenzata dallo stato di attivazione delle cellule staminali, pertanto le cellule

- +

in divisione sarebbero CD34+ CD38-, quelle in G invece CD34 CD38 (Tajima.,2001). Il recettore

endoteliale della proteina C (Endothelial Protein C receptor, EPCR), conosciuto anche come CD201, è

un interessante marcatore identificato attraverso lo studio del profilo genico di cellule ematopoietiche

primitive altamente purificate (Ivanova et al., 2002; Akashi et al., 2003). CD201 è un recettore

transmembrana di tipo I, espresso durante l’embriogenesi dalle cellule giganti del trofoblasto coinvolte

nello sviluppo della placenta, e presente nell’adulto a livello della superficie luminale delle cellule

endoteliali, dove, durante la coagulazione, aumenta l’attivazione della proteina C tramite il complesso

trombina-trombomodulina (Fukudome e Esmon, 1994; Esmon, 2000; Crawley et al., 2002). Esso è

strutturalmente correlato alla famiglia di molecole che costituiscono il complesso maggiore di

istocompatibilità (MHC) di classe I, coinvolte negli stati infiammatori. E’ un dato recente che cellule

di midollo isolate sulla base della sola espressione di EPCR, se trapiantate in topi riceventi mieloablati,

presentano un’elevata capacità di ricostituire il loro sistema emopoietico, al pari di staminali purificate

utilizzando i metodi tradizionali. L’analisi fenotipica di questa popolazione ha evidenziato che la

frazione di cellule che esprime maggiormnte EPCR è uniformemente positiva per Sca-1 e c-Kit e

negativa per CD34 e marcatori terminali (Balazs et al., 2006).

Di recente interesse sono anche l’endoglina CD105, componente del recettore del fattore di crescita

trasformante TGF-β (Chen et al., 2002), e una glicoproteina di

120 Kd detta AC133. L’espressione dell’antigene AC 133 è ristretta alle HSCs e ai progenitori

ematopoietici provenienti dal fegato fetale, dal midollo osseo e dal sangue periferico umano. La

+

popolazione AC133 umana, in trapianti effettuati su modelli animali tra cui i feti di pecora, ha

presentato elevate capacità di attecchimento e le cellule umane provenienti dal midollo osseo di queste

chimere sono state capaci di ripopolare il sistema emopoietico di animali riceventi in seguito a

trapianto secondario (Yin et al., 1997).

Molte evidenze sperimentali suggeriscono che il gene Flt3 codificante per il recettore della tirosina-

chinasi 3 nel fegato fetale (Fetal Liver Tyrosine kinase-3), abbia un’espressione correlabile alla perdita

della capacità di autorinnovamento delle HSCs e di conseguenza ne possa identificare esclusivamente

la scelta differenziativa (Adolfsson et al., 2001; Christensen e Weissman, 2001). Nei tessuti

+

ematopoietici umani postnatali, dallo 0.1 fino allo 0.5% delle cellule CD34 esprimono VEGFR2

4

(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2), conosciuto anche come KDR. La maggioranza delle

+ +

HSCs pluripotenti sono così inglobate nella frazione CD34 KDR , viceversa i progenitori lineage-

+ -

committed sembrano trovarsi in quella CD34 KDR (Ziegler et al., 1999).

Di particolare interesse è risultata anche la tirosina chinasi endoteliale ed ematopoietica Tie2 in grado

+ + low/- +

di arricchire la popolazione KSLA (Kit Sca-1 , lin , and AA4.1 ), presente nel fegato fetale al giorno

14, di progenitori che danno una ricostituzione multilineage. Le cellule positive a Tie-2 KSLA

+

(T KSLA) rappresentano infatti lo 0.01%-0.02% di tutte quelle presenti nel FL. Saggi clonogogenici in

+

vitro hanno mostrato che in presenza di SCF, IL-3, EPO l’80% delle cellule T KSLA formano colonie

-

contro il 40% delleT KSLA. Analisi per diluizione limite e trapianti primari e secondari hanno indicato

che le LT- +

HSCs sono presenti solo nella frazione positiva con una frequenza di 1 su 8 cellule T KSLA (Hsu et al.,

2000).

In aggiunta ai nuovi marcatori già citati, restano quelli classici: Kit, il recettore dello Stem Cell Factor;

Sca-1, condiviso dalle cellule staminali di altri tessuti; CD45, specifico per le cellule ematopoietiche.

1.2.2 Nicchia ematopoietica

La capacità di autoreplicazione e di differenziazione delle HSCs e dei progenitori sembra essere

regolata da eventi casuali, mentre l’interazione delle HSCs con lo specifico microambiente è critica per

il mantenimento di proprietà quali l’adesione cellulare, la sopravvivenza e la quiescenza/proliferazione

delle cellule staminali stesse. Poco si sa dei meccanismi molecolari responsabili ad esempio

dell’attecchimento delle HSCs in seguito a trapianto e dell’avvio della loro proliferazione e

differenziazione per produrre cellule ematopoietiche mature e funzionali all’interno del midollo.

L’attecchimento delle HSCs sembra rappresentare il culmine di una serie di eventi grazie ai quali

cellule temporaneamente circolanti vengono convertite in cellule residenti ed efficacemente integrate

nel midollo. La prima fase di tale processo (HSC ‘‘homing’’), prevede il reclutamento delle HSCs

circolanti da parte dei

microvasi midollare, cui fa seguito la loro migrazione transendoteliale fino ai cordoni emopoietici. I

dati suggeriscono che l’homing è un evento specifico che richiede l’interazione di molecole di adesione

cellulare (CAMs), citochine e fattori chemiotattici, inoltre sembra che esso avvenga in maniera simile

al passaggio dei leucociti nei tessuti (Carlos e Harlan, 1994; Frenette et al., 1998). Un ruolo chiave per

la sua realizzazione è stato attribuito a diverse molecole, tra cui la sialomucina recettore della P-

selettina (P-Selectin Glycoprotein Ligand 1, PSGL-1), l’antigene dell’integrina β1 (Very Late Antigen,

VLA), con il suo corecettore (Vascular Cell Adhesion Molecole-1, VCAM-1). il recettore per il fattore

1 derivato dallo stroma (Stromal Derived Factor1, SDF1), e quello delle chemochine CXCR (trattati in

4

Nilsson et al., 2006). Uno studio recente di Katayama et al., ha dimostrato che anche la E-selettina è

critica in questo processo, in quanto svolgerebbe un’azione sinergica con VLA-4 (Katayama et al.,

2003). E’ stato confermato che P-selettina, E-selettina e VCAM-1 sono espresse costitutivamente sulle

cellule endoteliali del midollo (Schweitzer et al.,1996) dove sembrano essere coinvolte nel passaggio

delle HSCs attraverso i microvasi (Mazo et al.,1998). In aggiunta anche la citochina FL, ligando di flt-

3, medierebbe l’adesione dei progenitori all’endotelio vascolare (Solanilla et al., 2003). Studi in vitro

hanno infine identificato SDF-1 quale molecola in grado di attrarre efficacemente cellule di midollo

+ -

primitive CD34 CD38 , fra le quali HSCs che già presentano il recettore CXCR (Jo et al., 2000).

4

Terminata questa prima fase le HSCs compiono una migrazione specifica all’interno del tessuto

emopoietico (HSC ‘‘lodgment’’) per raggiungere le sedi anatomiche che rappresentano la loro

posizione della nicchia. Sembra infatti che i progenitori committed si distribuiscano soprattutto nella

regione centrale del midollo, nei pressi della vena longitudinale, mentre quelli primitivi nella regione 5

adiacente all’osso, l’endostio (Mason et al., 1989; Lord, 1990). Queste osservazioni hanno fortemente

avvalorato l’ipotesi che la distinta distribuzione spaziale esibita dalle varie popolazioni cellulari nel

midollo sia il frutto delle interazioni adesive specifiche che si realizzano con il tessuto stromale. Una

volta in situ, le HSCs sviluppano prima un’intima associazione con la popolazione eterogenea delle

cellule stromali quindi avviano il programma di proliferazione e differenziazione in dipendenza da una

complessa rete di interazioni con altre cellule, fattori dei crescita, molecole di adesione e proteine della

matrice extracellulare. Come inizialmente dimostrato da Croizat et al., la scelta di una cellula staminale

se rimanere nel suo stato di quiescenza o andare incontro a divisione è guidata dal microambiente.

Studi recenti hanno suggerito che la nicchia comprenda verosimilmente una sottopopolazione di

osteoblasti, di cui risulta particolarmente ricca la regione trabecolare del midollo. Tali studi hanno

anche permesso di chiarire alcuni dei meccanismi molecolari responsabili della regolazione della

proliferazione delle staminali ematopoietiche all’interno della nicchia, puntando l’attenzione in

particolare sull’importanza del contatto diretto e dell’interazione tra HSCs e osteoblasti alla superficie

dell’endostio (Arai et al., 2004; Calvi et al., 2003; Zhang et al., 2003). E’ stato dimostrato ad esempio

che l’interazione di Ang-1 (Angiopoietin-1), un fattore secreto dagli osteoblasti, e Tie2, recettore

presente sulla membrana delle HSCs, induce la stretta adesione delle HSCs alle cellule stromali e,

mantenendole in uno stato di quiescenza, ne preserva la massima capacità di ripopolazione a lungo

termine (Arai et al., 2004). La mancanza di osteoblasti è associata a difetti del midollo (Visnjic et

al.,2004), viceversa topi mutanti che presentano regioni espanse di osso trabecolare e in cui si assiste ad

un incremento del numero degli osteoblasti, presentano anche un

parallelo aumento delle HSCs (Calvi et al., 2003; Zhang et al., 2003). Zhang et al. sono partiti

dall’analisi della via di segnalazione di BMP (Bone Morphogenetic Protein), essenziale nell’indurre il

tessuto ematopoietico durante l’embriogenesi, per indagare il ruolo di questa proteina nel regolare lo

sviluppo delle HSCs in vivo. In particolare sono stati generati topi mutanti in cui è possibile ottenere

l’inattivazione condizionale del recettore IA per il BMP. Questo studio ha condotto all’identificazione

di una specifica sottopopolazione di osteoblasti che esprimono la N-caderina e formano un complesso

N-caderina/beta-catenina con le HSCs, verosimilmente mediando l’adesione di queste cellule alla loro

nicchia (Zhang et al., 2003). Diversi fattori prodotti dagli osteoblasti possono regolare il numero delle

HSCs. Ne è un esempio l’osteopontina (Opn), una proteina fosforilata multidominio della matrice,

sintetizzata dagli osteoblasti e coinvolta nell’adesione cellulare, nelle risposte infiammatorie,

nell’angiogenesi e nelle metastasi tumorali. Nilsson e collaboratori hanno dimostrato che questa

proteina riveste un ruolo critico nella regolazione della localizzazione fisica e della proliferazione delle

HSCs. La sua espressione è ristretta alla superficie dell’endostio e contribuisce alla migrazione

transmidollare delle HSCs, come dimostrato dalla distribuzione aberrante delle stesse in topi Opn-/- in

seguito a trapianto. Inoltre la somministrazione esogena di Opn sembra sopprimere in vitro la

proliferazione dei progenitori primitivi. Questa molecola quindi è considerata a tutti gli effetti parte

della nicchia ematopoietica dove partecipa alla localizzazione delle HSCs e funziona da regolatore

negativo della loro proliferazione (Nilsson et al., 2005; Stier et al., 2005). Il contributo di altre

componenti, quali cellule stromali o perivascolari resta ancora da definire, tuttavia recentemente è stata

postulata la presenza di un secondo tipo di microambiente per le HSCs a livello

dell’endotelio fenestrato dei sinusoidi del midollo (Kiel et al., 2005). La stretta associazione fra le

HSCs e le cellule endoteliali non giunge peraltro inattesa dal momento che entrambi questi lineages

derivano dallo stesso precursore embrionale, l’emangioblasto ,D’altra parte cellule dell’endotelio

vascolare isolate da diversi organi non-ematopoietici adulti non riescono a sostenere le HSCs in vitro

(Li et al., 2004), pertanto sembra che le cellule endoteliali del midollo siano funzionalmente e

fenotipicamente diverse da quelle della microvasi di altri organi (Kopp et al.,2005). Infatti queste

cellule esprimono costitutivamente citochine quali CXCL12 (CXC-chemokine ligand 12) e molecole

di adesione quali la E-selettina e VCAM-1 (Vascular Cell-Adhesion Molecole 1), importanti per la

6

mobilizzazione, l’homing e l’attecchimento delle HSCs (Avecilla et al., 2004). L’esistenza di una

“nicchia vascolare” è stata postulata sulla base degli effetti osservati nel midollo in seguito a

mieloablazione: le HSCs quiescenti si distaccano dall’endostio e migrano al centro del midollo in

prossimità della zona vascolare, dalla quale ristabiliscono l’ematopoiesi. Sembra che la nicchia

localizzata a livello dell’endostio serva da luogo di immagazzinamento delle HSCs quiescenti, ed in

certi siti possa contenere anche cellule in fase di autorinnovamento, mentre la nicchia vascolare sia

costituita per lo più da cellule in attiva replicazione. Tra l’altro, l’eliminazione degli osteoblasti

determina la comparsa di un’ematopoiesi extramidollare e questo suggerisce che la nicchia vascolare

da sola non è sufficiente a sostenere l’ematopoiesi a lungo termine; è invece verosimile che la nicchia

vascolare e quella dell’endostio

collaborino strettamente nel mantenere l’omeostasi del sistema ematopoietico o il suo ripristino in

seguito a danno (trattato in Wilson e Trumpp 2006).

1.2.3 Plasticità

La pluripotenza e la plasticità sono due caratteristiche classicamente attribuite alle cellule staminali

embrionali, mentre le staminali adulte per definizione sono limitate nel loro potenziale differenziativo

alla progenie del tessuto nel quale risiedono. Tuttavia studi sempre più accurati sembrano sfidare

questo dogma, suggerendo che la capacità delle cellule staminali di generare una progenie matura può

essere sorprendentemente più estesa di quanto si creda. La premessa iniziale di tali studi è sempre la

stessa: l’esposizione di una cellula staminale ad un ambiente che essa normalmente non incontrerebbe

mai, in maniera tale che essa non esegua solamente un programma di differenziazione intrinseco ma

risponda ai segnali provenienti dal microambiente esterno, abbandonando il cammino differenziativo

già intrapreso e essendo in qualche modo “riprogrammata” a differenziare verso un altro lineage

cellulare. In quest’ottica, la ragione per cui una cellula staminale di un certo tessuto generi soltanto

progenie di quel tessuto è da attribuirsi al fatto che le cellule circostanti la istruiscono in tal senso o

alternativamente possono esserci nei tessuti dei segnali che impediscono ad una cellula di acquisire un

fenotipo indesiderato (Clarke e Frisén, 2001). Le prime evidenze a favore della plasticità delle cellule

staminali adulte sono emerse da studi sul sistema ematopoietico. Attraverso saggi funzionali in vivo è

stato osservato che cellule di midollo, genotipicamente o fenotipicamente distinguibili, quando

trapiantate in animali mutanti difettivi o mieloablati, sono in grado di rigenerare, anche se ad una

frequenza piuttosto bassa, altri tessuti.). L’implicazione di questi studi è che se l’efficienza di

attecchimento delle cellule ematopoietiche è sufficientemente alta, il trapianto di midollo può essere

usato per trattare una vasta gamma di malattie; questo è vero soprattutto riguardo a quelle patologie che

colpiscono tessuti disseminati all’interno dell’organismo, quale la distrofia muscolare (Camargo et al.,

2004). Il concetto emergente di plasticità delle staminali adulte è stato ulteriormente confermato

dall’osservazione che staminali neurali (NSC) possono differenziare in tessuto ematopoietico: NSCs

derivate clonalmente da topi esprimenti il gene LacZ sono state inoculate in topi irradiati subletalmente

e attraverso saggi in vitro e in vivo sono state ritrovate cellule ematopoietiche derivanti dai donatori,

indicando che le staminali neurali hanno transdifferenziato in cellule ematopoietiche (Bjornson et al.,

1999). Inoltre,

esperimenti di chimerismo hanno dimostrato che NSCs possono generare diversi tessuti embrionali di

origine ectodermica, mesodermica e endotermica (Clarke et al., 2000). Così come le NSCs anche una

popolazione cellulare residente nel tessuto scheletrico ha dimostrato di possedere un certo potenziale

ematopoietico (Gussoni et al., 1999; Jackson et al., 1999). A queste prime osservazioni, si sono

aggiunti dati sperimentali che sembrano attribuire alle HSCs capacità differenziative sempre più ampie.

Sembra ad esempio che le cellule del midollo possano genereare cellule mature del fegato in risposta a

7

danni tissutali e perfino prendere parte al fisiologico turn-over cellulare che avviene in quest’organo

(Petersen et al., 1999; Lagasse et al., 2000). Saggi funzionali in vivo ed in vitro suggeriscono che le

cellule di midollo osseo adulto siano in grado di dare origine a cellule di molteplici altri tessuti non

ematopoietici, quali pancreas (Ianus et al., 2003), reni (Gupta et al., 2002), pelle (Krause et al., 2001),

tratto gastro-intestinale (Okamoto et al., 2002), sistema nervoso (Castro et al., 2002). Tuttavia il tema

della plasticità delle cellule staminali continua ad essere argomento di acceso dibattito. Molte

perplessità nascono dal fatto che le tecniche fino ad oggi adottate non sono in grado di fornire una

prova certa delle loro effettive potenzialità differenziative, inoltre, molto spesso, i dati ottenuti non

sono riproducibili. Camargo et al. hanno evidenziato inoltre che questi studi tendono ad approdare a

conclusioni descrittive, senza indicare chiaramente un possibile meccanismo biologico alla base di tale

fenomeno e senza identificare con precisione il fenotipo delle cellule direttamente coinvolte in esso

(Camargo et al., 2004).

Alcuni apparenti eventi di plasticità possono essere riconducibili ad altri fenomeni, quali la

contaminazione o la fusione cellulare. In particolare, dal

momento che le cellule staminali ematopoietiche sono in grado di migrare, attraverso la circolazione, in

tutto l’organismo (Wright et al., 2001), è possibile che l’osservata transdifferenziazione verso il destino

ematopoietico di cellule di un diverso tessuto non sia determinata dalla loro plasticità ma dalla

presenza, nel tessuto stesso, di HSCs che ivi transitano (trattati in Camargo et al., 2004).

D’altra parte, la bassa frequenza con la quale si verificano gli eventi di transdifferenziazione ha

sollevato la possibilità che si tratti di eventi stocastici non-fisiologici (Wagers et al., 2002; Camargo et

al., 2003). La fusione cellulare può essere un spiegazione alternativa per alcuni casi di osservata

plasticità. Quest’ipotesi è difficile da saggiare in tessuti come il muscolo dove questa rappresenta un

naturale processo biologico che contribuisce alla formazione dei miotubi, tuttavia è stato confermato

che nel fegato, nel cervello e nel cuore le cellule ematopoietiche possono fondersi con quelle tessuto

specifiche (Alvarez-Dolado et al., 2003; Vassilopoulos et al., 2003; Wang et al., 2003). Diverse

osservazioni lasciano intendere inoltre che le cellule responsabili degli eventi di fusione non siano le

HSCs, ma piuttosto la loro progenie: infatti affinché le cellule ematopoietiche contribuiscano ai tessuti

non ematopoietici è necessario che ricostituiscano prima il sistema ematopoietico dei topi riceventi,

inoltre quando le HSCs sono trapiantate direttamente nel muscolo e nel fegato non attecchiscono

(Wang et al., 2002); infine i modelli sperimentali della plasticità in genere richiedono danni a diversi

tessuti ed un esteso reclutamento dei leucociti infiammatori (Camargo et al., 2004). I macrofagi sono i

migliori candidati per questa funzione, in quanto sono particolarmente adatti a rispondere ad attacchi

infiammatori, passano dal circolo ai tessuti non ematopoietici dove possono risiedere e possono

fondersi tra di loro e con altre cellule (Vignery, 2000).

Camargo et al. utilizzando una strategia di marcatura di lineage per seguire la progenie dei macrofagi in

vivo hanno provato che le cellule di midollo capaci di generare tessuto muscolare ed epatico sono

macrofagi e granulociti (Camargo et al., 2003).

Il fenomeno della plasticità è tuttora molto dibattuto e diverse ipotesi sono state avanzate per spiegarne

i meccanismi di base. Concettualmente sono stati proposti diversi modelli attraverso i quali si possono

esplicare le capacità plastiche delle cellule staminali (Frisén, 2002): il modello gerarchico, la

transdifferenziazione, la transdeterminazione e la dedifferenziazione.

Il modello gerarchico prevede l’esistenza, nei vari tessuti, di cellule staminali pluripotenti non ancora

indirizzate verso un determinato destino differenziativo e capaci, quindi, di dare origine a più tipi

cellulari. A questo proposito, è stata isolata dal midollo osseo umano e murino, dal muscolo e dal

cervello una popolazione molto primitiva di cellule (MAPCs, Multipotent Adult Progenitor Cells) che

sono in grado di dare origine, in vitro, a tutti i tipi cellulari somatici (Jiang et al., 2002). 8

La transdifferenziazione definisce la condizione in cui una cellula matura acquisisce un altro

fenotipo, spesso senza subire divisioni cellulari. Ne è un esempio la transdifferenziazione di cellule del

muscolo liscio in miociti nell’esofago durante il normale sviluppo dei mammiferi (Frisén, 2002).

La transdeterminazione descrive invece la condizione in cui una cellula staminale o un precursore

primitivo già indirizzati verso uno specifico cammino differenziativo generano una progenie

appartenente ad un altro lineage cellulare.

Infine, il quarto modello è quello della dedifferenziazione, secondo il quale una cellula lineage-

specifica riacquisisce dapprima le proprietà di cellula staminale o

di precursore primitivo e, in seguito, intraprende un altro cammino differenziativo. Questo fenomeno è

ampiamente documentato negli anfibi urodeli che lo utilizzano ad esempio per rigenerare arti amputati,

ma è ancora poco studiato nei mammiferi. Da tutte queste considerazioni emerge chiaramente che per

poter parlare con assoluta certezza di plasticità è necessario un rigore assoluto nelle procedure

sperimentali adottate. La prima questione da affrontare quando ci si appresta ad uno studio di questo

tipo è la definizione delle cellule che si stanno studiando. Non sono pochi infatti i casi in cui sono state

utilizzate popolazioni cellulari eterogenee che hanno precluso qualsiasi conclusione al riguardo. Un

altro caveat può essere la presenza di cellule staminali eterologhe in certi tessuti: ad esempio la

presenza di cellule dal potenziale ematopoietico nel muscolo è stata originariamente interpretata alla

luce del fenomeno della plasticità, tuttavia una caratterizzazione più approfondita di tali cellule ha

rivelato che il potenziale ematopoietico risiede esclusivamente in una popolazione di cellule che

esprime tutti i marker delle HSCs (McKinney-Freeman, 2002). Un’altra fonte di equivoci interpretativi

è il fatto che cellule trasformate possono generare lineages cellulari non correlati, pertanto le cellule

utilizzate per il trapianto devono essere periodicamente ben controllate. Infine è importante

caratterizzare le cellule generate dalle staminali di interesse dal punto di vista funzionale. L’identità di

una cellula in genere viene definita dalla sua morfologia e dall’espressione di certi marcatori; si

dovrebbe dimostrare anche la sua attività, anche se in alcuni casi questo è molto difficile. Infine, come

già detto, non bisogna confondere eventi di fusione con la plasticità: un cariotipo anomalo è facile da

rivelare sebbene cellule tetraploidi tendano ad espellere i cromosomi soprannumerari.

1.3 ONTOGENESI DEL SISTEMA EMATOPOIETICO

E’ molto difficile riuscire a definire con la dovuta chiarezza i fondamenti della gerarchia ematopoietica

sotto un profilo di sviluppo a causa di molte questioni, peraltro ancora ampiamente dibattute, che hanno

a che vedere con l’origine embrionale, l’espansione e la migrazione delle HSCs e la loro conservazione

durante l’evoluzione dei Vertebrati.

La sede anatomica predominante dell’ematopoiesi cambia diverse volte durante l’ontogenesi di un

organismo e nel complesso lo sviluppo del sistema ematopoietico adulto si attua in due fasi: quella

primitiva avviene nel sacco vitellino, e quella definitiva ha luogo, in sequenza, nella regione

splancnopleura para-aortica/aorta-gonadi-mesonefro (PAS/AGM), nel fegato fetale, ed infine nella

milza, nel timo e nel midollo osseo adulto (Marshall e Thrasher, 2001). Il sacco vitellino (Yolk Sac,

YS) è la prima sede ematopoietica dell’embrione. Esso possiede una struttura a doppio strato con

cellule che derivano dal foglietto endodermico e cellule di origine mesodermica. E’ proprio in seguito

all’aggregazione di queste ultime nella regione centrale del cilindro dell’uovo che si formano le isole

sanguigne (Blood Islands), costituite da uno

strato endodermico che ne supporta la crescita, un core centrale di eritroblasti primitivi e uno strato

endoteliale che le circonda e riveste.. Con il progredire dello sviluppo, non appena il sacco vitellino

diviene più estesamente vascolarizzato, intorno al giorno 8.5, la circolazione extraembrionale si

connette all’aorta dorsale attraverso l’arteria onfalomesenterica. In conseguenza di ciò gli eritroblasti

primitivi cominciano a circolare intravascolarmente fra i siti embrionali e quelli extraembrionali e 9


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DETTAGLI
Esame: Ematologia
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher cenerella.90 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Ematologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Sannio - Unisannio o del prof Parente Domenico.

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