cellule staminali 1

Ematopoiesi e gerarchia ematopoietica

Il sangue è costituito da elementi cellulari, globuli rossi, globuli bianchi e piastrine sospesi nel plasma. Essi svolgono funzioni molto diverse che vanno dal trasporto dell'ossigeno alla produzione di anticorpi e, mentre alcuni esauriscono il loro compito per intero all'interno del sistema vascolare, altri lo utilizzano solo come mezzo di trasporto per spostarsi fra i vari tessuti. Le cellule del sangue condividono, tuttavia, una serie di caratteristiche comuni. Sono incapaci di auto-rinnovarsi e possiedono, fatta eccezione per i linfociti, una durata di vita piuttosto limitata, basti pensare che in un individuo di 70 Kg, ogni giorno vengono normalmente sostituite circa 10¹² cellule ematiche tra cui 200 miliardi di globuli rossi e 70 miliardi di granulociti (Dancey et al., 1976, Erslev, 1983).

In seguito a traumi, malattie, condizioni di stress, oppure semplicemente in relazione al fisiologico turn-over, queste cellule vanno incontro a morte e devono essere pertanto continuamente rinnovate in modo tale da mantenere il loro numero nel sangue relativamente costante. Osservazioni cliniche e sperimentali hanno rivelato che le cellule mature del sangue sono tutte generate da cellule staminali che risiedono nel midollo osseo. Il processo responsabile della loro produzione e garante della loro omeostasi, prende il nome di ematopoiesi. All'apice di tale processo risiedono le cellule staminali ematopoietiche (Hematopoietic Stem Cells, HSCs), provviste di ampia capacità di proliferare, di dare origine a nuove cellule staminali (self-renewal), e di generare progenitori primitivi programmati a differenziare (commitment) in cellule mature di tutte le filiere, sia linfoidi (linfociti B e T), che mieloidi (eritrociti, granulociti, macrofagi, megacariociti, neutrofili, eosinofili e basofili).

L'intero e complesso programma di maturazione che dalle cellule staminali dà origine alle cellule mature del sangue avviene attraverso divisioni successive durante le quali le HSCs perdono progressivamente le loro proprietà e danno vita ad una progenie di precursori sempre più limitati nel loro potenziale differenziativo. Dalle cellule staminali originano il precursore clonogenico comune di tipo linfoide (Common Lymphoid Progenitor, CLP), in grado di generare esclusivamente cellule B, T e NK (Natural Killer), e il precursore clonogenico comune di tipo mieloide (Common Myeloid Progenitor, CMP), progenitore dei lineages mielo-eritroidi (trattati in Weissmann, 2000).

È stato proposto che l'intero potenziale linfo-mieloide delle long-term HSCs (LT-HSCs) si realizzi tramite le short-term HSCs (ST-HSCs) e i progenitori multipotenti (MPPs), sebbene essi siano dotati di ridotte capacità di autorinnovamento (Reya et al., 2001).

Virtualmente l'attività delle LT-HSCs, ST-HSCs e dei MPPs risiede nella piccola frazione Lin Sca-1 c-kit (LSK), che rappresenta lo 0,1% di tutte le cellule del midollo adulto (Ikuta e Weissman, 1992; Li e Johnson, 1995; Weissman et al., 2001). È stato dimostrato che all'interno di questo compartimento le LT-HSCs non esprimono CD34, né la tirosina chinasi recettoriale Flt3 (Adolfsson et al., 2001; Christensen e Weissman, 2001), mentre le ST-HSCs risultano LSKCD34⁺Flt3^- (Osawa et al., 1996; Yang et al., 2005). Quest'ultima popolazione origina a sua volta una terza categoria di HSCs, le quali coesprimono tutte sia CD34 che Flt3 e quando trapiantate provvedono all'immediata e robusta ricostituzione delle filiere linfoidi, tuttavia mancano della capacità di formare in vivo Colony-Forming Unit Spleen (CFU-S) al giorno 8, attività ritenuta indispensabile per permettere la ricostituzione dei lineages mielo-eritroidi in topi letalmente irradiati.

Sulla base di tali osservazioni, Adolfsson et al. hanno fornito prove a sostegno di un modello alternativo nel quale la prima fase di committment consiste nella produzione di un progenitore eritro-mieloide, CMP, derivante con tutta probabilità dalle LSK⁺Flt3^-, in concomitanza con quella di un progenitore mielo-linfoide (Limphoid-primed multipotent progenitor, LMPP), in grado di partecipare fortemente alla linfopoiesi, e in modo limitato alla mielopoiesi, dando origine sia a CLP che ai precursori di granulociti e macrofagi (Adolfsson et al., 2005). Questo modello è in accordo con osservazioni precedenti che suggerivano un'organizzazione gerarchica simile (Singh, 1996; Takano et al., 2004), e riesce a riconciliare l'ordine e il tipo di progenitori che emergono nello sviluppo con la gerarchia dell'adulto. In quest'ottica infatti, la sequenza di eventi osservata durante l'ontogenesi non fa altro che riflettere lo stabilirsi di una gerarchia definitiva, dove una HSC primordiale, che gradualmente acquisisce le piene potenzialità di una staminale adulta, genera una progenie eritro-mieloide prima di quella linfoide.

Mentre gli stadi differenziativi del precursore CLP non sono stati ancora del tutto chiariti, molti studi hanno concentrato l'attenzione sul precursore CMP rivelando molti aspetti della sua differenziazione nella mielopoiesi. Grazie a saggi di colonie spleniche, già a partire dal 1961 Till e McCulloch identificarono una classe precoce di questi precursori pluripotenti, le CFU-S (Colony Forming Unit-Spleen). Iniettando in topi letalmente irradiati midollo osseo da un donatore singenico, nell'arco di 7-14 giorni dal trapianto si osservano, a livello della milza, colonie macroscopiche contenenti sia cellule differenziate dei diversi lineages mieloidi, che CFU-S capaci di dare a loro volta colonie secondarie (Till e McCulloch 1961).

Per queste loro capacità di proliferare, auto-rinnovarsi e differenziare, le CFU-S sono state considerate a lungo cellule staminali, in realtà rappresentano una popolazione eterogenea come documentato da vari ricercatori. Infatti, al giorno 7-8 dal trapianto sulla milza del topo ospite si formano dei noduli contenenti cellule di un unico lineage predominante (prevalentemente eritroide), generate da precursori unipotenti, che scompaiono nell'arco di 72 ore, mentre al 14° giorno la maggior parte delle colonie spleniche sono composte da cellule di diverse filiere e sono capaci di formare colonie secondarie, esse pertanto derivano da precursori pluripotenti (Magli et al., 1982).

Un notevole contributo allo studio dei precursori ematopoietici proviene dallo sviluppo di saggi clonali in vitro su terreni semisolidi, i quali hanno permesso di stimare non solo qualitativamente, ma anche quantitativamente i numerosi progenitori che occupano diverse posizioni nell'ambito della gerarchia ematopoietica (Pluznik e Sachs, 1965; Stephenson et al., 1971; Metcalf et al., 1975). Una popolazione molto simile a quella delle CFU-S, capace di crescere in vitro, è quella delle CFU-Mix (Colony Forming Unit-Mix), dotate anch'esse di un elevato potenziale proliferativo e differenziativo ma con capacità di autoreplicarsi più limitate (Iscove, 1978; Johnson e Barker, 1980).

Operando scelte che ne riducono ulteriormente le caratteristiche di partenza i progenitori multipotenti danno vita a precursori bipotenti (CFU-GM, Colony Forming Unit-Granulocyte-Macrophage), che dopo 7-14 giorni di coltura, possono dare origine solo a granulociti e macrofagi. Infine, questi precursori bipotenti intraprendono uno specifico destino differenziativo, generando precursori unipotenti CFU-G e CFU-M capaci di formare colonie composte da un unico tipo cellulare G o M.

All'interno del lineage eritroide si distinguono due tipi di progenitori unipotenti: le BFU-E (Burst Forming Unit-Erythroid) e le CFU-E (Colony Forming Unit-Erythroid), rispettivamente precoci e tardivi. Le BFU-E formano colonie dall'aspetto aranciato, emoglobinizzate, costituite da 200 fino a milioni di cellule, identificabili a partire dal 7° giorno di coltura (Iscove e Sieber, 1975). Le CFU-E invece danno origine a piccole colonie dalla forma a "morula" costituite da 8-64 cellule. Si trovano ad uno stadio differenziativo più avanzato e per questo vengono identificate già a partire dal 2° giorno di coltura. Tali aggregati sono qualitativamente identici a quelli presenti nelle BFU-E, e sono formati da cellule che stanno subendo le ultime divisioni prima della completa maturazione (Iscove e Sieber, 1974).

Esistono altri precursori unipotenti (CFU-Mk, CFU-Eo e CFU-Ba), responsabili delle rimanenti filiere del compartimento mieloide (megacariociti, granulociti eosinofili e granulociti basofili). Alla base della gerarchia ematopoietica vi sono infine le cellule mature del sangue, dalla morfologia definita ed alle funzioni specifiche seppur dotate di vita limitata (Pluznik e Sachs, 1965; Metcalf et al., 1975).

Sistemi di isolamento e caratterizzazione

In uno studio ormai divenuto classico, risalente ai primi anni sessanta, Till e McCulloch definirono staminali una popolazione di cellule ematopoietiche dotate di capacità clonogeniche e in grado di ripopolare la milza di topi irradiati in risposta al microambiente. Queste cellule in alcuni casi producevano cloni che, se trasferiti in ospiti secondari, provvedevano alla ricostituzione di tutti i lineages. La staminale ematologica è la cellula meglio caratterizzata. Tuttavia, contrariamente alle neurali o alle embrionali, individuate successivamente, non è tuttora possibile mantenere le HSCs ex vivo, se non per tempi molto brevi, né espanderle su vasta scala. Le difficoltà riscontrate nel loro studio sono riconducibili al fatto che si tratta di cellule estremamente rare (la stima della loro frequenza nel midollo osseo di topo è di una su 10⁵ cellule), e dotate di un fenotipo indifferenziato che impedisce la loro purificazione come popolazione omogenea.

Dal momento che non possono ancora essere studiate in vitro, per valutare la presenza di HSCs all'interno di una popolazione cellulare eterogenea e per analizzarne le caratteristiche funzionali si ricorre a saggi di ripopolazione a lungo termine, che sfruttano la capacità di queste cellule di ricostituire il sistema ematopoietico di topi letalmente irradiati o geneticamente difettivi (Ogawa, 1993). L'esposizione a un'opportuna dose di radiazioni o la somministrazione di sostanze citotossiche provoca la morte delle cellule ematopoietiche, pur mantenendo inalterata la funzionalità del microambiente midollare (Till e McCulloch, 1961). Gli animali sottoposti a tale trattamento vanno incontro a morte nel giro di una o due settimane a meno che non vengano trapiantati con cellule di midollo osseo proveniente da donatori compatibili.

Le cellule trapiantate costituiscono in realtà una popolazione eterogenea, comprendente oltre alle HSCs anche precursori a diversi stadi differenziativi che garantiscono la ricostituzione delle diverse filiere nel periodo immediatamente successivo il trattamento. Tuttavia si tratta di un'azione temporanea, dal momento che i progenitori presentano una capacità di rinnovarsi tanto più ridotta quanto più sono differenziati. Il contributo di queste cellule alla ricostituzione si esaurisce infatti dopo circa tre mesi, ed è solo a partire da allora che gli elementi staminali presenti nel pool di cellule trapiantate iniziano a ripopolare il compartimento ematopoietico e lo fanno in maniera definitiva recuperando completamente la funzionalità ematopoietica (Harrison, 1980).

Un altro sistema per studiare il fenotipo e la funzione delle HSCs consiste nell'impiegare come riceventi animali geneticamente modificati, quali ad esempio portatori di una mutazione in un determinato locus che codifica per un prodotto indispensabile allo sviluppo di un normale sistema ematopoietico. Le cellule ematopoietiche di questi topi hanno uno svantaggio di crescita rispetto a quelle dei wild-type, pertanto il trapianto di midollo osseo in questi animali consente di testare la capacità di ripopolazione competitiva di una certa popolazione cellulare (Szilvassy et al., 1990). Un modello largamente impiegato anche per lo studio delle HSCs umane (dal momento che non è possibile effettuare saggi di ripopolazione in vivo) è il topo NOD/SCID (non-obese diabetic/severe combined immunodeficient), che avendo un sistema immunitario fortemente carente consente l'attecchimento di cellule umane (Dick, 1996).

Una strategia di grande utilità e ormai largo impiego per isolare popolazioni fortemente arricchite in cellule staminali ematopoietiche o precursori molto precoci sfrutta l'espressione di antigeni di membrana rivelata tramite FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). Al momento nessuno dei marcatori noti è risultato esclusivo delle HSCs, pertanto combinazioni di diversi antigeni vengono in genere utilizzate per ottenere la loro univoca caratterizzazione immuno-fenotipica. Il primo screening può essere realizzato tenendo conto del fatto che le HSCs non esprimono marcatori di lineage caratteristici di cellule ematopoietiche differenziate terminalmente, quali CD3, CD4, CD8, B220, Gr-1, Mac-1, TER119, sono quindi Lin^- (Spangrude et al., 1988).

Alla fine degli anni Novanta si era fatta strada l'ipotesi che la sialomucina CD34 (Cluster of Differentiation), espressa solo in piccole frazioni di cellule midollari che comprendono precursori ed HSCs, fosse un marcatore di cellule staminali. I primi esperimenti, condotti utilizzando cellule donatrici CD34⁺ per il trapianto di topi letalmente irradiati o immunocompromessi, mostravano la capacità di queste cellule di ripopolare a lungo termine l'intero sistema ematopoietico dell'animale recipiente (trattati in Goodell, 1999). Inoltre l'utilizzo di popolazioni di midollo osseo umano arricchito in cellule CD34⁺ migliorava notevolmente l'efficienza dei trapianti di midollo e ne diminuiva le complicazioni (Civin et al., 1996; Link et al., 1996; Yabe et al., 1996). Tuttavia analisi più approfondite hanno rivelato che anche cellule CD34^- sono in grado di realizzare una completa ricostituzione del sistema ematopoietico. L'ipotesi corrente è invece che la presenza di questo marcatore sulla membrana cellulare sia indicativa dello stato di attivazione della cellula staminale (Sato et al., 1999). Infatti nel midollo osseo la maggior parte delle HSCs si trova in uno stato di quiescenza e non esprime CD34 o lo fa ad un livello molto basso, mentre in seguito ad attivazione comincia ad esprimerlo ad alti livelli. La sovraespressione di questo antigene sembra un fenomeno reversibile, cosicché cellule attivate possono dividersi e differenziare oppure tornare in stato di quiescenza e non esprimere più questo marcatore. Nel topo l'espressione di CD34 in cellule ematopoietiche primitive decresce col procedere dello sviluppo, e questo è in accordo con il fatto che le cellule staminali adulte quiescenti sono maggiormente presenti nella frazione CD34^- (Matsuoka et al., 2001).

Anche l'espressione di un'altra glicoproteina, CD38, è stata oggetto di simili controversie: in un primo tempo sembrava che le HSCs e i progenitori primitivi umani fossero CD38^- (Novelli et al., 1998), mentre studi successivi hanno evidenziato che nel topo sia le HSCs fetali che quelle adulte sono CD38⁺ (Dagher et al., 1998). In realtà pare che anche l'espressione di questo marcatore sia influenzata dallo stato di attivazione delle cellule staminali, pertanto le cellule in divisione sarebbero CD34⁺ CD38^-, quelle in G⁰ invece CD34^- CD38⁺ (Tajima, 2001).

Il recettore endoteliale della proteina C (Endothelial Protein C receptor, EPCR), conosciuto anche come CD201, è un interessante marcatore identificato attraverso lo studio del profilo genico di cellule ematopoietiche primitive altamente purificate (Ivanova et al., 2002; Akashi et al., 2003). CD201 è un recettore transmembrana di tipo I, espresso durante l'embriogenesi dalle cellule giganti del trofoblasto coinvolte nello sviluppo della placenta, e presente nell'adulto a livello della superficie luminale delle cellule endoteliali, dove, durante la coagulazione, aumenta l'attivazione della proteina C tramite il complesso trombina-trombomodulina (Fukudome e Esmon, 1994; Esmon, 2000; Crawley et al., 2002).

Esso è strutturalmente correlato alla famiglia di molecole che costituiscono il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I, coinvolte negli stati infiammatori. È un dato recente che cellule di midollo isolate sulla base della sola espressione di EPCR, se trapiantate in topi riceventi mieloablati, presentano un'elevata capacità di ricostituire il loro sistema emopoietico, al pari di staminali purificate utilizzando i metodi tradizionali. L'analisi fenotipica di questa popolazione ha evidenziato che la frazione di cellule che esprime maggiormente EPCR è uniformemente positiva per Sca-1 e c-Kit e negativa per CD34 e marcatori terminali (Balazs et al., 2006).

Di recente interesse sono anche l'endoglina CD105, componente del recettore del fattore di crescita trasformante TGF-β (Chen et al., 2002), e una glicoproteina di 120 Kd detta AC133. L'espressione dell'antigene AC133 è ristretta alle HSCs e ai progenitori ematopoietici provenienti dal fegato fetale, dal midollo osseo e dal sangue periferico umano. La popolazione AC133⁺ umana, in trapianti effettuati su modelli animali tra cui i feti di pecora, ha presentato elevate capacità di attecchimento e le cellule umane provenienti dal midollo osseo di queste chimere sono state capaci di ripopolare il sistema emopoietico di animali riceventi in seguito a trapianto seco.