Biotecnologie per il Controllo degli Allergeni

Tematiche:

• moderne applicazioni di bt per limitare le problematiche delle allergie alimentari;
• approcci impiegabili nel campo delle bt vegetali.

Obiettivi:

• Illustrare e collegare i principi alla base delle applicazioni bt per la produzione di alimenti migliori per l’uomo.
• Conoscere la bt vegetali;
• Conoscere i principi di ingegneria genetica dei vegetali;
• Conoscere le potenzialità e i limiti per ottenere piante e cibo migliori;
• Descrivere le applicazioni per la rimozione degli allergeni.

Dove studiare:

• Slides Aggiornate
• Appunti (con richiesta di revisione dal docente, ma insomma, anche no...)

Valutazione:

• WebDocenti → Programmi → Visualizza → Note
• 2-3 argomenti (orale) OPPURE 10-15 domande (scritto)

Ricevimento: Lun (prima della lezione) – Via Pansini

1^a Parte:

• Cenni di bt vegetali
• Composti delle piante come target delle bt
• Allergeni e classificazioni
• Ingegneria metabolica
• Cenni sull’ingegneria dei Vegetali
• Applicazioni dell’IGV per la rimozione degli allergeni
• Limiti e potenzialità dell’IGV per la riduzione degli allergeni nelle piante

Piante: trasformazioni di composti inorganici in composti organici + prodotti (aromatici) con diverse finalità.

Migliorare una pianta: creare un Alimento Funzionale

• Aumento dei Macronutrienti (Proteine, Carboidrati, Grassi e Fibre)
• Aumento dei Micronutrienti (Vitamine, Cofattori e Minerali)
• Aumento dei Carotenoidi, Flavonoidi, Isoflavonoidi, Fenloni e Isotiocianati
• Riduzione degli Anti-Nutrienti (Allergeni, Tossine, Glicoalcaloidi)

La maggior parte delle piante che crescono “libere” contiene sostanze tossiche per l’uomo.

L’uomo ha imparato ad evitare, limitare o inattivare alcuno di queste sostanze tossiche:

• Conservazione
• Cucina (inattivazione col calore)
• Preparazione (fermentazione, macerazione, ...)

Alcune di queste sostanze tossiche hanno avuto grande importanza nello sviluppo della civiltà:

• Spezie
• Tabacco

• Zucchero
• Alcaloidi

Sostanza Tossica: sostanza che causa reazione avversa in un individuo. La tossicità di una sostanza dipende fortemente anche dalla sua quantità.

Quello che è cibo per un uomo è veleno per un altro.

Adverse reaction to food

European Academy of Allergology and Clinical Immunology (EAACI)

Non-toxic

Dipende dalla persona

Toxic

Dipende dalla dose

Immune mediated

FOOD ALLERGY

Non Immune mediated

FOOD INTOLERANCE

IgE mediated

Non IgE mediated

Enzymatic

Pharmacologic

Undefined

Jyonouchi. Non-IgE mediated food allergy. Inflamm Allergy Drug Targets. 2008 7(3):173-80.

Un'Allergia è una risposta di ipersensibilità (risposta infiammatoria estrema) a sostanze (“allergeni”) che normalmente sono considerate non-pericolose; gli allergeni possono essere di natura organica o inorganica.

L'allergia NON viene trasmessa geneticamente; la probabilità di sviluppare allergie, invece, viene ereditata.

Il 90% delle allergie alimentari è dovuto a:

• Arachidi
• Noci
• Soia
• Grano
• Latte
• Uova
• Pesci
• Frutti di Mare

Nella maggior parte dei casi, gli allergeni sono proteine di origine vegetale.

DNA Plasmidico (pTi)

Geni: Vir | Geni: Vir | T-DNA: | Opine | R. Bordere

• Conferiscono Virulenza alla Sequenza
• Codificano per la sintesi di: Auxine, Citochine e Opine

La Proliferazione Cromosomale + sopravvivenza del batterio

Vettore Binario

• Plasmide Helper | Geni: Vir | B | R.B |
• Marcatore Batterico | L.B | Cassetta di Espressione | (Marcatore per i: celli) | R.B | ORI (x 1+2)

| Promotore | cDNA | Terminatore |

Eliminazione di una Proteina di Difesa/Struttura dalla Pianta

• WT – Pianta di pomodoro “nano” Wild Type; cresce e produce frutti e fiori.
• 11 – Quasi non presenta profilina; non produce né frutti, né fiori.
• 32 – Poche profiline; produce fiori a stento.
• 39 – Meno profiline della WT; produce fiori ma non frutti.

Si potrebbe ridurre l’accumulo di profilina solo nei frutti, attraverso specifici promotori; questi però sono molto complessi e non danno un sufficiente livello di silenziamento (80%).

Complementazione

Tecnica che serve a ristorare la funzione di un organismo mutato attraverso l’introduzione di una funzione genica mediante l’utilizzo di un gene esterno, proveniente da un’altra specie (per evitare lo sviluppo di allergie).

Es: rimozione di profilina del pomodoro ed introduzione di quella del lievito (30-40% di complementarità tra le due proteine); se fosse stata utilizzata una profilina vegetale, avrebbe comunque portato allo sviluppo di un’allergia.

Biomassa (%): WT = 100%; Con Prf di Lievito = 77%; Senza Prf = 44%

Silenziamento Genico

Inserimento di geni di interesse nella pianta, mediante l’Abtf.

Transgeni introdotti per conferire nuove caratteristiche alla pianta:

• resistenza ai virus;
• resistenza agli antibiotici.

Inoltre si pensò di incrementare una caratteristica «positiva» di una pianta, andando ad introdurre copie addizionali di un gene già presente in pianta.

Non sempre, però, un transgene introdotto in pianta si esprime.

Antocianine: determinano il colore blu/viola di alcune piante/frutti.

Calcone-sintasi (CHS): enzima chiave all'inizio della via biosintetica degli antociani; la sua aggiunta a piante che già producono antociani serve a ottenere un colore più acceso.

• Non tutte le piante producevano la stessa quantità di pigmenti colorati;
• Alcune piante perdevano il colore Co-Soppressione: nell’RNA non era presente nemmeno l’RNA del gene endogeno.

I transgeni possono essere silenziati a livello trascrizionale (TGS) e post-trascrizionale (PTGS).

Il silenziamento può essere innescato da:

• Alti livelli di espressione/mRNA;
• dsRNA che derivano dal transgene/inserto transgenico;
• RNA aberranti che derivano dal transgene.

La molecola più efficace per determinare il silenziamento genico è il dsRNA.

L’RNA interferente è un meccanismo naturale di grande importanza nella regolazione dell’attività dei nostri geni.

Gli smallRNA sono una classe di RNA di dimensione compresa tra i 21 e i 24 nucleotidi, solitamente coinvolti nei fenomeni di silenziamento; contribuiscono al:

• Silenziamento Post-Trascrizionale (PTGS) – il gene viene trascritto dal nucleo ma non vi è traduzione nel citoplasma;
• Silenziamento Trascrizionale (TGS) – alterazioni del grado di accessibilità della cromatina, degli istoni e del DNA.

2 Classi di Enzimi Fondamentali per il Silenziamento:

• Dicer: endonucleasi che processano i dsRNA e gli RNA in corti duplex di DNA di dimensioni fisse (21- 25 bps); non c’è specificità di sequenza. Le piante sono invece dotate di enzimi Dicer-like (DCL). Dicer di tipo diverso tagliano frammenti di dimensioni diverse.
• Proteine Argonauta: proteine che legano le piccole molecole di RNA che si formano per azione delle Dicer. Taglia l’mRNA solo in caso di appaiamento tra quest’ultimo e gli sRNA.

Gli sRNA sono distinti e classificati in base alla loro biogenesi (e non al loro ruolo):

• dsRNA → miRNA, siRNA, scanRNA;
• non-dsRNA → miRNA secondari, piRNA.