Biotecnologie microbiche

PCR.

Fasi della PCR:

1) Esponenziale, i componenti sono in eccesso e si verifica un raddoppio esatto

2) Lineare, i componenti iniziano ad esaurirsi e di conseguenza la reazione rallenta

3) Plateau, la reazione si arresta e non viene più generato prodotto 23

Applicazioni della PCR:

• Amplificazione e sequenziamento del gene 16S rRNA per l'identificazione delle

specie. Un frammento che viene sequenziato per avere buone probabilità di

individuare la specie dell'isolato, ma non sempre è discriminante (es tra S.

thermophiuls e S. salivarius).

• Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) per caratterizzare a livello di ceppo

i diversi isolati appartenenti alla stessa specie (fingerprinting genomico, ceppi della

stessa specie possono distinguersi tra loro per specifiche variazioni a livello del

genoma).

• Differenziazione di sottospecie (subspecie, appartenenti alla stessa specie, non è un

unità tassonomica). PCR

specifiche consentono ad esempio di distinguere L. delbrukii subsp. lactis e

bulgaricus, oppure Lactococcus lactis o cremoris, sempre con primer specifici.

L'uso delle sequenze del gene 16S rRNA per studiare la filogenesi e la tassonomia batterica

è stato di gran lunga il più comune marcatore genetico housekeeping utilizzato per una serie

di motivi:

1) La sua presenza in tutti i batteri, spesso sotto forma di famiglia multigenica, o

operoni

2) La funzione del gene 16S rRNA non è cambiata nel tempo, suggerendo che i

cambiamenti casuali della sequenza sono una misura più accurata del tempo

(evoluzione)

3) Il gene 16S rRNA (1.500 bp) è sufficientemente grande per gli scopi informatici

Il ribosoma batterico è costituito da 2 sub-unità: 30S (con il 16S e proteine) e il 50S (con

23S e 5S con proteine).

Il gene 16S, nel dettaglio, è presente in tutti i batteri, l'operone ribosomiale può essere

presente in una singola cellula in multicopia.

Si usa il 16S per l'identificazione della specie in quanto nel corso dell'evoluzione ha

mantenuto alcune regioni invariate (per scopi evolutivi), mentre altre sono ipervariabili (per

l'identificazione a livello di specie) e si trovano con un tratteggio grigio in immagine (1500

pb in tutto con 9 regioni ipervariabili). 24

Si hanno poi specifici primer più comunemente impiegati per l'identificazione a livello di

specie (ad esempio non posso usare il 27F e il 341F in quanto mi servono un front e un

reverse per poter delimitare una regione, altrimenti così ognuno va per i fatti suoi, il 27F va

bene con il 685R ad esempio).

Indispensabile che abbiano un verso opposto per identificare una specifica regione.

L'omologia di due isolati appartenenti alla stessa specie a livello del 16S deve essere almeno

il 98.7%, quindi maggiore.

La RAPD non richiede alcuna conoscenza specifica della sequenza del DNA dell'organismo

bersaglio: gli identici primer a 10 bp amplificheranno o meno un segmento di DNA, a

seconda delle posizioni complementari alla sequenza dei primer stessi.

È stata sviluppata per la mappatura genetica e il fingerprinting nelle analisi del

polimorfismo inter- e intraspecifico delle popolazioni di diversi organismi (microrganismi,

piante e mammiferi).

Si basa sull'amplificazione del DNA genomico con singoli e brevi primer di sequenza scelta

arbitrariamente che, essendo più corti e meno specifici, si legano a sequenze complementari

di entrambi i filamenti di DNA a basse temperature di annealing, determinando

l'amplificazione delle regioni intermedie: si ottiene così un insieme di frammenti amplificati

che, separati mediante elettroforesi su gel, producono uno standard di bande specifiche noto

come fingerprinting genomico.

Nel caso della RAPD non c’è la necessità di conoscere l’intera sequenza del genoma in

quanto si basa sull’amplificazione a partire da primer generalmente più corti per andare a

vedere la presenza o assenza di un gene (PCR 20 nucleotidi, qui 10) quindi sarà facile che si

possano appaiare più volte nel genoma, quindi impiegando primer corti di 10 nucleotidi

possiamo andare random ad amplificare più di una regione del nostro isolato, si usa sia per

caratterizzare i batteri mediante un fingerprinting genomico, ma anche di piante, muffe e

lieviti.

Si selezionano quindi sequenze random di primer di 10 nucleotidi e per ciascuna reazione

necessitiamo di 2 primer forward e reverse per la PCR, nella RAPD solo 1.

Affinché la reazione di PCR funzioni (e si ottenga l’amplificato), i primer devono

annealizzarsi in modo da puntare l'uno verso l'altro e a una distanza ragionevole l'uno

dall'altro.

In teoria, l'annealing dei primer avviene contemporaneamente in molte regioni del genoma.

Tuttavia, l'amplificazione geometrica si verifica solo in quelle regioni in cui le estremità 3'

dei primer annealizzati sono rivolte l'una verso l'altra su filamenti opposti e non distano più

di 3 chilobasi l'una dall'altra.

Deve appaiarsi più volte e in zone vicine tra loro affinchè la DNA polimerasi sia in grado di

sintetizzare un frammento.

Se si ottengono due bande il primer si è appaiato almeno 4 volte in modo a avere la

replicazione di 2 regioni del genoma. (Lo stesso primer fa da forward e reverse). 25

Il fingerprinting genomico consiste nell’andare a vedere quante volte il primer si è appaiato

in modo da ottenere un amplificato, se si è appaiato più volte ottengono più allineamenti.

L'elettroforesi su gel di agarosio separa i prodotti di amplificazione per generare

un'impronta digitale batterica che viene utilizzata per identificare e caratterizzare i ceppi

batterici.

I genotipi sono valutati per mezzo di marcatori, le bande comuni a tutti gli individui sono

interpretate come somiglianze genetiche e le bande non comuni sono interpretate come

differenze genetiche.

Nel primo esempio, si formano solo due prodotti RAPD PCR. Il prodotto A è generato

dall'amplificazione PCR della sequenza di DNA che si trova tra i primer legati alle posizioni

2 e 5. Il prodotto B è generato dall'amplificazione PCR della sequenza di DNA che si trova

tra i primer legati alle posizioni 3 e 6.

Nessun prodotto di PCR si forma dai primer legati alle posizioni 1 e 4 perché questi primer

sono troppo distanti per consentire il completamento della reazione di PCR.

Nella reazione 2, il primer non è più in grado di annealizzarsi alla posizione 2 e quindi non

viene prodotto il prodotto PCR A, ma solo il prodotto B.

Per discriminare diversi isolati non si usa mai un unico primer ma si eseguono diverse

amplificazioni con diversi primer per tutti i DNA, in quanto, se dal gel di una RAPD vedo

che ho lo stesso profilo (bande) non necessariamente i due isolati sono la stessa cosa, se

invece dal RAPD vedo che due isolati hanno profili diversi allora sono sicuramente

diversi. 26

La RAPD è un metodo semplice, utilizzabile con un largo numero di campioni ed

economica

È però poco riproducibile, anche è molto difficile ottenere gli stessi risultati in quanto il

risultato dipende molto dalla sequenza del primer e dalla qualità dell’estrazione del DNA.

Le variabili che possono influenzare la reazione:

• Qualità e purezza del DNA

• Dimensioni dei primer, dalle dimensioni influenzo il legame e l’amplificato di

conseguenza

• Ciclo termico

• Tipo e concentrazione della polimerasi

• Concentrazione di magnesio 27

ESEMPIO analisi RAPD su isolati di Pediococcus acidilactici con primer mirato al gene

plasmidico (pedA) codificante la pediocina AcH/PA-1.

I tre box rossi mostrano i tre diversi profili RAPD che permettono di fare tali tre

raggruppamenti. L’isolato 1-2-3-4 hanno lo stesso identico profilo con un frammento a

basso pm (attorno a 400 pb) e dei frammenti più alti, ciò che li differenzia dal 5 sono

l’assenza di tale frammento più in basso e la presenza di un frammento a più alto pm.

non c’è è

Negli isolati 9-10 una chiara amplificazione e in tale analisi non stata

è è

standardizzata la quantità di DNA che stata impiegata, così facendo un fattore critico che

interferisce sulla riproducibilità della RAPD.

Corsie 1-5, ceppi DSMZ 20284T, DSMZ 20238, ATCC 8042, ATCC 12697 e ATCC 25740;

corsie 6-8, ceppi LMG 17674, LMG 17687 e LMG 17689; corsie 9 e 10, ceppi Pdi11 e PG;

corsie 11-15, ceppi PAC1. 0, Psp2, F, UL5 e JD-23; corsie 16 e 17, ceppi LMG 17680 e

LMG 17692; M, marcatore di massa molecolare 100 bp ladder.

I ceppi testati hanno mostrato diversi profili di amplificazione (basati sul primer pedAF)

1. tipico dei ceppi DSMZ 20284T, DSMZ 20238, ATCC 12697 e ATCC 8042, ha

mostrato tre frammenti principali amplificati di circa 450, 950 e 2200 bp. Il

frammento di 450 bp era presente anche nei restanti ceppi, con l'eccezione di ATCC

25740.

2. eccezione di ATCC 25740

è

3. Un modello analogo stato osservato nei ceppi LMG 17674, LMG 17687 e LMG

17689, che hanno mostrato frammenti di 450 e 950 bp.

4. Un frammento amplificato di 700 bp e una banda di 1350 bp hanno permesso di

raggruppare tutti i ceppi produttori di pediocina. 28

La terza applicazione della RAPD implica la differenziazione di una subspecie.

L. delbrueckii ha 3 subsp. ovvero bulgaricus, lactis e delbruekii. Possono derivare da

diverse matrici e la proto-cooperazione tra i batteri del latte si instaura solo con il

bulgaricus.

Quindi è fondamentale distinguere tali subspecie che si comportano fenotipicamente in

modo diverso.

Anche se dopo il sequenziamento del16s si ottiene che è L. delbrueckii ma non possiamo

conoscere la subs in quanto è un gene conservato che consente l’identificazione della specie

e basta.

Si usa il gene che codifica per la prolina-imino-peptidasi.

Nel presente studio abbiamo sviluppato un sistema di identificazione-rilevazione mediante

PCR eseguita con primer specifici progettati sulla base dei dati di sequenza del gene della

prolina iminopeptidasi (pepIP) di L. delbrueckii subsp. bulgaricus e abbiamo utilizzato

questo sistema per la differenziazione di L. delbrueckii subsp. Bulgaricus e subsp. lactis

Con primer specifici per la subspecie si ottengono frammenti specifici.

Con 1-2-3 per bulgaricus e 4-5-6 lactis. E nell’8 con il delbrueckii.

Quello che è stato ottenuto con il lactis non è quello che ci saremmo aspettati quindi la

dimensione del frammento ottenuto mi permettono di discriminarlo. 29

L’unico modo a nostra disposizione per la visualizzazione del prodotto di una PCR è la

corsa elettroforetica, ma con le seguenti metodiche non ce ne sarà bisogno:

• Retro Trascrittasi (RT-PCR)

• PCR quantitativa in real time (qPCR)

• PCR quantitativa in real time Retro Trascrittasi (RT-qPCR)

Geni cos