Biotecnologie Farmaceutiche

BIOTECNOLOGIE FARMACEUTICHE

Questo modulo si occupa di prodotti del metabolismo secondario.

Questo modulo si propone di studiare i metaboliti secondari prodotti da vari

microrganismi, quali possono essere batteri, archea, funghi unicellulari

(comprendenti i lieviti, eucarioti), microalghe e protozoi. I batteri molo

importanti per la loro diversità metabolica, ma non sono gli unici.

Si può fare una distinzione tra prodotti biotecnologici utilizzati in ambito

farmaceutico, ad esempio si può distinguere tra metaboliti primari (prodotti

essenziali per la crescita e lo sviluppo del microrganismo, prodotti durante la

fase di crescita, aa, acidi nucleici, vitamina B12, componenti essenziali per la

crescita del microrganismo) e metaboliti secondari (prodotti non essenziali per

la crescita, prodotti in fase stazionaria, i principali sono gli antibiotici, anche

altri prodotti che vengono usati nell’industria farmaceutica).

Dal punto di vista applicativo i metaboliti secondari sono antibiotici (più

conosciuti, ma non gli unici), immunosoppressori (ciclosporina A prodotta da

un fungo per evitare il rigetto del trapianto), statine (molecole

ipocolesterolemiche, abbassano il livello di colesterolo nel sangue, prodotte da

funghi), taxolo o derivati (il taxolo deriva principalmente dalle piante),

avernectine (insetticidi e vermicidi, utili nei confronti anche di alcune

patologie), enzimi industriali e ricombinanti, farmaci di natura proteica.

I microrganismi hanno il grande vantaggio di essere in grado di svolgere

reazioni chimiche difficilmente replicabili per via chimica.

Per quanto riguarda il metabolismo secondario, i microrganismi più interessanti

sono gruppi di batteri ed eucarioti (funghi, lieviti compresi).

La prima definizione di metabolita secondario deriva da un fisiologo

vegetale nel 1961; esso chiamò metaboliti secondari le sostanze prodotte ma

non coinvolte nella vita cellulare e nello sviluppo cellulare. Questa definizione

non è completamente vera: un antibiotico fornisce un vantaggio competitivo

per il controllo dei nutrienti.

In natura non esiste una coltura pura, quindi un microrganismo in fin dei conti

necessita di produrre un antibiotico al fine di avere delle risorse nutritive da

consumare e alla fine un antibiotico dopotutto serve indirettamente anche per

lo sviluppo! A che cosa serve l’antibiotico al microrganismo? Il

vantaggio competitivo in una competizione, ma se lo metto in una coltura il

microrganismo si toglie la competizione.

Ad oggi, il termine metabolita secondario sta per essere pian piano sostituito

dal termine metabolita speciale (metaboliti specializzati). I metaboliti secondari

non servono per fare la biomassa. Da che cosa è fatta la biomassa?

Proteine, polisaccaridi (non zuccheri semplici), acidi nucleici, lipidi, acqua. La

biomassa è fatta da polimeri (strutturali e funzionali) di metaboliti primari. Il

metabolismo secondario è molto conservato. 1

Vi è una grande differenza tra metaboliti primari e secondari: i metaboliti

primari sono molecole che andranno a formare polimeri strutturali e funzionali;

i metaboliti secondari specializzati sono differiscono dai metaboliti primari in

quanto non andranno a formare polimeri. Inoltre i metaboliti secondari sono

caratterizzati:

Da basso peso molecolare (< 3000 Da), intermedio tra i metaboliti

 primari (basso PM) e i polimeri formanti la biomassa (alto PM)

Dal fatto di essere sintetizzati solo da determinati gruppi microbici

 (concetto di specialista metabolico). Ci sono prodotti che sono fatti da

10/20 aa, non arrivano alla lunghezza della proteina ma vengono

polimerizzati.

Ad esempio, nella produzione di antibiotici i gruppi di specialisti metabolici

sono gli attinomiceti (procarioti) e gli ascomiceti (eucarioti, in particolare

Penicillium e Aspergillus). Questi gruppi sono dotati di particolari

differenziazioni morfologiche (processo di differenziamento microbico

adattativo-metabolico che ha permesso loro di vivere ovunque e in qualsiasi

condizione).

Un esempio di questa differenziazione morfologica è la spora. Sia gli

attinomiceti che gli ascomicota crescono sotto forma di micelio pluricellulare

(un micelio è formato da ife, sono dei filamenti di cellule). Negli attinomiceti le

ife sono costituite da cellule procariote mentre negli ascomicota sono formati

da cellule eucariote. Sia gli attinomiceti che gli ascomiceti formano un micelio

di substrato, in cui le ife si fanno strada nel substrato (come delle radici). Nel

momento in cui si ha carenza di nutrienti, il micelio di substrato va incontro alla

formazione di un micelio aereo, formato da ife contenenti le spore neoformate

e utili per la propagazione. Successivamente si ha la lisi delle ife e il rilascio

delle spore.

I metaboliti secondari sono prodotti mediante fermentazione da

microrganismi produttori specializzati. In coltura liquida, la produzione dei

metaboliti secondari è strettamente dipendente dalle condizioni di coltura ed è

generalmente correlata con la fase stazionaria di crescita. Solitamente, nelle

produzioni industriali, i metaboliti secondari sono prodotti in terreno liquido in

un bioreattore. In queste condizioni si può definire un grafico di time course

della fermentazione, in cui vi sono schematizzate le variazioni di tutti i

parametri (fonte di C e di N, pH, quantità di prodotto formato, etc.) 2

I metaboliti secondari vengono prodotti solo quando i nutrienti iniziano a

scarseggiare, ovvero quando il microrganismo smette di crescere (al termine

della fase di crescita esponenziale). Questo perché gli antibiotici sono prodotti

come vantaggio competitivo per ottenere il predominio sui pochi nutrienti

presenti e per far avvenire in tranquillità la sporulazione.

Dal punto di vista pratico, prima si cerca di ottenere abbastanza biomassa

successivamente si cerca di andare in carenza di nutrienti al fine di produrre il

metabolita secondario di interesse.

La maggior parte dei metaboliti secondari sono prodotti sotto forma di

complex, ovvero gruppi di molecole strettamente correlate tra loro, ciò perché

il metabolismo secondario è “meno stringente” rispetto al metabolismo

primario, in pratica è come se il prodotto ammettesse errori (questa cosa non è

prevista nel metabolismo primario, in cui ad esempio un amminoacido

“sbagliato” può provocare la formazione di una proteina dannosa che andrà a

causare la morte cellulare).

I metaboliti secondari sono prodotti durante la fase stazionaria di crescita

(idiofase), quando i nutrienti iniziano a scarseggiare. La maggior parte dei

metaboliti secondari è rilevabile mediante HPLC utilizzando un rilevatore UV-

visibile. Questo perché le molecole di metaboliti secondari presentano gruppi

cromofori, come ad esempio anelli aromatici e doppi legami. In un profilo

cromatografico di metabolita secondario si hanno diversi picchi, ciò perché

solitamente sono prodotti sotto forma di complex, ossia un gruppo di molecole

correlate tra loro. Un antibiotico è una sostanza chimica

Dalle citazioni di Waksman e Fleming ->

di origine microbica che possiede proprietà antimicrobica.

Subito dopo hanno cambiato la definizione -> Gli antibiotici sono molecole

caratterizzate dal basso peso molecolare; hanno la proprietà di inibire la

crescita microbica di altri microrganismi, anche a basse concentrazioni. Tutti i

3

composti chimici usati ad alte concentrazioni sono antimicrobici! Gli antibiotici

hanno la particolarità di avere attività antimicrobica a bassa concentrazione.

Inizialmente gli antibiotici venivano prodotti esclusivamente per via

fermentativa; ad oggi vengono prodotti anche per via esclusivamente chimica

(sintetici) oppure per metà per via fermentativa e per l’altra metà per via

chimica (semi-sintetici).

Subito dopo la 2 WW, Waksman pose i “postulati” per lo screening al fine di

trovare nuovi antibiotici:

Collezione sistematica di microrganismi provenienti dal suolo,

 Crescita di suddetti microrganismi in coltura axenica,

 Test del brodo colturale per valutare la loro capacità di inibire la crescita

 di microrganismi patogeni,

Recupero delle sostanze attive presenti.



Questo approccio venne trasferito all’industria fermentativa; negli anni 40-60

(Golden Age degli antimicrobici) sono state scoperte tutte le classi di antibiotici

antibatterici usati tutt’ora.

Gli antibatterici si dividono in più classi, a seconda della struttura

molecolare. Si possono anche dividere in base alla tipologia e alla larghezza

dello spettro, in base al target cellulare molecolare (es. sintesi del

peptidoglicano, inibita a livello della transpeptidasi dalla penicillina).

Da quegli anni fino ai giorni nostri si sono anche sviluppati fenomeni di

resistenza batterica; questo fatto ha portato alla necessità di sviluppare

nuovi antibiotici modificati al fine di bypassare questi fenomeni. Questo è

ottenibile mediante modifica chimica delle molecole ottenute per via

fermentativa.

Nel frattempo, l’attenzione si è spostata su altri tipi di composti; i

microrganismi sono stati screenati per la ricerca di altri farmaci antibiotici attivi

su altri tipi di target (chemioterapici, immunosoppressori, antifungali, antivirali,

erbicidi, antiparassitari...). La scoperta e la produzione dei composti sopra-citati

permette la produzione di molecole utili ha permesso alla società di progredire;

basti pensare alle operazioni chirurgiche e alle fasi post-operatorie, le quali

necessitano di antibatterici e antivirali. Inoltre ha permesso la notevole

evoluzione dei saggi biologici in uso, la scelta del saggio biologico ovviamente

dipende strettamente sul target del prodotto da testare.

I saggi posso essere classificati in:

Saggi cell whole (basato sull’effetto sulle cellule procariote o eucariote)

 Saggi cell free (basato sull’effetto su enzimi, per studiare determinati

 passaggi di qualche biosintesi)

Saggi in vivo (su animali)

 4

Circa il 48 % dei metaboliti secondari con attività antibiotica è prodotto da

attinomiceti; ciò è legato anche al loro differenziamento morfologico che causa

il differenziamento biochimico. Le classi di metaboliti secondari utilizzati come

farmaci sono circa 200. In seguito allo screening passano anni prima che il

metabolita secondario trovato possa essere utilizzato sotto forma di farmaco ->

vi sono svariate fasi che si devono effettuare prima di commercializzare un

farmaco:

Inizialmente si opera con la fase di ricerca e di screening HTS (High

 Through-put Screening) to hit (hit = risultato in un saggio data da una

determinata attività biologica) e Hit To Lead (si cerca di capire com’è la

struttura chimica del composto di interesse).

Una volta passata questa fase si provvede a coprire la molecola di

 interesse con un brevetto, il quale protegge per 20 anni la proprietà

intellettuale sulla stessa.

Al termine del brevetto si procede con lo sviluppo e l’ottimizzazione del

 composto lead in analisi in development candidate e successivi test

clinici (fase 1, 2, 3; 1 su volontari sani per verificare la presenza di effetti

collaterali, 2 su pazienti reclutati con patologia specifica per verificare la

capacità di cura del farmaco, 3 comparazione di dati ottenuti con i dati di

altri farmaci sul mercato (per verificare che non ci siano farmaci

“competitivi”).

L’azienda investe ingenti capitali in queste fasi, inoltre pianificano molto bene

le tipologie di prodotto su cui investire, onde evitare di perdere soldi.

Un’azienda si trova anche a confrontarsi anche con il problema del supply,

ovvero il problema di produrre abbastanza prodotto per sostenere le fasi di

ricerca o il mercato. Nel passaggio tra le varie fasi è necessario uno scaling-

up, in modo da aumentare i volumi di produzione e di poter quindi rispondere

alla domanda del mercato.

ASCOMICETI

Gli ascomiceti sono produttori di penicilline (antibatterico beta lattamico),

cefalosporine (antibatterico beta lattamico), echinocandine (antifungali),

statine (ipocolesterolemici), ciclosporina (immonosoppressore). Gli ascomiceti

prendono il nome da una struttura detta asco.Si sviluppano formando conidi,

ovvero filamenti di spore. I funghi ascomiceti possono riprodursi

asessuatamente (mitosi) o sessuatamente (meiosi con conseguente fusione di

cellule).

ATTINOMICETI

Gli attinomiceti sono batteri Gram + ad alto contenuto in G+C, aerobi e

chemiorganotrofi. Sono i produttori di circa il 70 % di antibiotici. 5

Dallo screening alla fase di sviluppo

I produttori principali di questi metaboliti sono i funghi e gli attinomiceti, quasi

tutti formano il micelio aereo e possono formare anche dei corpi fruttiferi come

i funghi, sono sporangiofori, sono diversi dai classici batteri frammentanti. Il

genere più noto è quello degli Streptomyces, si isola più facilmente rispetto

agli altri, ha portato ad una serie di prodotti che vengono utilizzati in clinica.

Dai β-lattamici alla daptomicina sono tutti antibatterici e sono molto importanti.

La daptomicina viene usata solo a livello ospedaliero. Poi ci sono prodotti

antifungali.

Oltre agli Streptomyces ci sono altre famiglie meno note che comunque

portano alla produzione di prodotti interessanti. Forma di differenziamento

biochimico che serve a conferire capacità addizionali a microrganismi che

presentano un differenziamento microbiologico. Isolando attinomiceti, non

appartenenti agli Streptomyces, si è arrivati ad avere dei nuovi prodotti.

Diversità sia microbiologica che diversità chimica. I metaboliti secondari hanno

un peso molecolare superiore ai metaboliti primari, ma hanno un peso

molecolare più basso rispetto alle proteine ad esempio o agli acidi grassi.

[Classe chimica e meccanismo d’azione delle molecole -> obiettivo corso]

Diversità chimica: enzimi dedicati a questo metabolismo, ci sono geni

dedicati.

Gli attinomiceti che frammentano (la loro riproduzione assomiglia alla scissione

binaria dei Clostridi ad esempio) non producono così tanti metaboli secondari. I

Bacillus possono produrre alcuni peptidi che sono una categoria chimica

definita. Screening è iniziato con la ricerca degli antibiotici.

ANTIBIOTICI

Possono essere antibatterici, antifungali, antiprotozoi, antialghe. Sono molecole

a basso peso molecolare, prodotti da microrganismi che inibiscono altri

microrganismi a basse concentrazioni. Non vengono solo utilizzati per uso

umano, ma anche per usi ambientali o come additivi nel cibo animale e come

cura veterinaria.

Categorie chimiche più importanti:

Penicilline e cefalosporine, rappresentano i β-lattamici

 Macrolidi

 Amminoglicosidi

 Tetracicline

 Chinoloni, non rientrano nella definizione standard perché non sono

 prodotti per via fermentativa ma sono prodotti per via sintetica 6

Altri, gruppo che incide poco sul mercato di produzione mondiale, ma

 molto importanti perché sono spesso antibiotici salvavita; si trovano solo

a livello ospedaliero, riguardano patologie gravi (ciclopeptidi ad esempio)

GOLDEN AGE (1940-1960), natural product screening: sono stati prodotti molti

dei prodotti che conosciamo. Prima si usavano i sulfamidici: fatti per sintesi

chimica. Poi tutti i prodotti dalla golden age in poi sono stati fatti per via

fermentativa o per semi-sintesi, per migliorare le proprietà dei prodotti. Poi si è

cambiato approccio: analisi della genomica (identificazione target) e di

screening delle chemical library, il numero dei prodotti è molto diminuito;

questo è più facile e semplice da fare. Questo shift è stato disastroso perché

non si è portato a scoprire niente. Il primo genoma sequenziato è stato

Haemophilus influenzae, patogeno. Si è voluto identificare dei nuovi target;

screenare ha portato ad ottenere negli inibitori enzimatici che funzionano però

in vitro e non nella cellula. L’evoluzione biologica ha evoluto delle molecole che

tengono in considerazione due cose: l’inibizione del bersaglio e l’entrata nella

cellula.

Trovare dei target per genomica dei patogeni ha aperto una strada molto

importante -> reverse vaccinology (partendo dal genoma del patogeno si

possono trovare dei nuovi vaccini), per noi non è stato particolarmente

promettente. Problema: sviluppo da parte dei batteri di resistenze ai farmaci.

Dal 2000 ad oggi nuovo natural product screening: genomica dei produttori;

abbandono del chemical library screening e si cerca di rinaturalizzare. Ci sono

dei patogeni che sono resistenti a tutte le classi di antibiotici.

Staphylococcus aureus,

Problemi antibatterici ed antifungali, resistenza a ci

sono microrganismi resistenti ai β-lattamici. In ospedale si selezionano i

patogeni più distruttivi, perché qui si isolano i patogeni più forti. Tra i Gram

positivi (eterococco e stafilocco) abbiamo i casi più critici perché possono

essere multiresistenti. Perché Clostrudium è un patogeno così

importante? Perché colpisce i pazienti immunocompromessi. Anche alcuni

Gram negativi sono resistenti o patogeno, derivanti dal fenomeno di

globalizzazione. Ci sono anche alcuni ceppi di E. coli che sono molto patogeni.

Approccio originale di screening di antibiotici di Waksmann: 7

Come si è evoluto nell’industria farmaceutica?

Non si isolano più i microrganismi dal suolo, perché ci sono pochi nutrienti e

poca disponibilità. Quando sono subentrate le aziende farmaceutiche gli

isolamenti sono stati più massivi (high throughput mode), isolando da qualsiasi

campione possibile (suolo, acqua, piante, anche dalle simbiosi, dai

macrorganismi acquatici, insetti, si è allargato lo spettro di isolamento). Si

isolano i microrganismi in coltura pura con metodi selettivi fino ad avere il

ceppo puro, poi farlo fermentare in beuta -> prelevare il brodo col micelio ->

fare dei tra