Biotecnologie Farmaceutiche

BIOSINTESI

Prime idee su come sia avvenuta la biosintesi della penicillina avviene

classicamente con due metodi: ci deve essere un’ipotesi, biochimico deve

capire com’è fatta la molecola e quali sono precursori, si fanno dei composti

marcati; altro metodo è avere dei mutanti bloccati. Si è visto che i 3 precursori

sono la L-cisteina, L-valina e L-alfa-amminoadipico. Questi vengono sintetizzati

sull’ACV sintasi e vanno a formare una catena. Durante questa prima fase della

sintesi la valina veniva epimerizzata (il carbonio chirale passava da forma L a

forma D) dopo si ha la ciclizzazione -> della cisteina S con anello beta

lattamico e ciclizzazione della valina che deve essere in forma D così ha una

disposizione spaziale predisposta alla ciclizzazione. L’alfa-aminoadipico rimane

come residuo R a quello legame. Questo prodotto si chiama ISOPENICILLINA N.

Successivamente si ha la sostituzione dell’alfa-aminoadipico con il fenilacetico.

SINTESI DELLE CEFALOSPORINE

La prima cefalosporina è stata scoperta nel 1953 da un sardo. Nel 1971 sono

Streptomyces.

state isolate le cefalosporine anche da Utilizzate per trattare le

infezioni dei Gram – e cercare di renderle più stabili dal punto di vista della

lipofilia e del pH e per ovviare ai meccanismi di resistenza. Anello beta-

lattamico simile a quello della penicillina, l’anello diidrotiazinico, contiene un S,

ma è a 6 atomi (nella penicillina a 5 atomi) e ci sono due posizioni in cui si

possono introdurre diversi gruppi: R1 che corrisponde alla posizione uguale

sullo scheletro della penicillina G ma anche la posizione R2 perché c’è un CH 2

che permette l’aggiunta di gruppi. La cefalosporina C ha la caratteristica quindi

di avere l’anello a 6 atomi e queste due posizioni per le sostituzioni. Per cui

subito i due gruppi sono stati sostituiti. Tutta la ricerca ha iniziato a produrre

composti in cui nella cefalopsporina C originale: in R1 c’è l’alfa-aminoadipico, in

R2 c’è CH COOH, un gruppo acetil. Per fare il primo prodotto clinico in R1 è

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stato aggiunto un composto aromatico per renderlo più solubile, mentre R2 è

rimasto invariato. In prodotti successivi si è variato l’R1 e si è eliminato l’R2.

Come si producono? Le fonti facilmente assimilabili di C, N, P, esercitano la

catabolite repression. La biosintesi parte dagli stessi 3 amminoacidi, avviene la

stessa ciclizzazione, si forma la isopenicillina N anche in questo caso, però

mentre nel caso del Penicillium nel quale l’aminoadipico viene sostituito dal

fenilacetico attivato in questo caso viene epimerizzato e viene trasformato in

forma D. In questo modo è reso molto più stabile. Nel cluster della biosintesi

della cefalosporina c’è un gene che è l’epimerasi che compie questa

epimerizzazione e poi c’è un secondo gene che espande l’anello, l’enzima si

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chiama espandasi che espande l’anello coniugato all’anello beta-lattamico.

Dopo di che avviene un’idrossilazione di questo metile, c’è un’idrossilasi e

questo gruppo viene transacetilato, viene introdotto un gruppo acetile sull’OH.

Questo tipo di modifica ha un impatto molto pesante sulla semi-sintesi degli

analoghi delle cefalosporine. Se nella penicillina G i fenilacetico viene rimosso

con un’acilazione, con un’acilasi classica, il 7-ACA (corrispondente del 6-APA)

viene formato con diversi steps, non è facile togliere il D-aminoadipico.

Si usa una serie di enzimi, non è la stessa cosa di un unico passaggio

enzimatico. Si passa attraverso una D-aminoacido ossidasi, rimuove un gruppo

NH introduce un gruppo chetonico, poi c’è una decarbossilazione che avviene

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anche naturalmente perché è instabile e dato che si è tolto il carbonio chirale il

gruppo può essere tolto tramite una glutaril-amidasi. Quindi sostanzialmente

per ottenere il 7-ACA non riusciamo ad utilizzare un unico enzima, ma

dobbiamo utilizzare almeno 3 diversi enzimi. Ci sono stati molti studi e molti

brevetti perché è un grosso ostacolo anche di costi.

Clonare l’espandasi nel cluster biosintetico della penicillina (se riusciamo a far

agire l’espandasi sull’isopenicillina N senza che ci sia l’epimerasi si può avere la

cefalosporina con l’L-aminoadipico. Ci sono vari brevetti anche per questo. Tutti

questi metodi sono poco efficienti dal punto di vista pratico, ma sono le 3 vie

grazie alle moderne tecnologie che vengono applicate.

Fino all’isopenicillina N vengono sintetizzate allo stesso modo sia la penicillina

che la cefalosporina. NRPS è stata scoperta con prodotti più complessi, non per

penicilline e cefalosporine.

L’enzima ACV (macchina) rientra nella famiglia delle NRPS, metodi di

assembling metabolico e la penicillina è l’esempio più semplice. Questi grossi

enzimi hanno una struttura modulare ed ogni modulo riconosce il suo aa,

quindi se gli aa sono 3 come nel caso della cefalosporina, la NRPS è fatta da 3

moduli: l’enzima è fatto da 3 domini, 3 regioni, ogni regione riconosce un

determinato aa. Il primo modulo riconosce l’acido aminoadipico, il secondo

riconosce la cisteina e il terzo la valina (in questo ordine). Queste sintasi si

chiamano anche tiotemplati, templato perché questo enzima è fatto in modo

che i 3 aa si attacchino con una determinata sequenza e prendano una certa

conformazione nello spazio che permette il legame e la ciclizzazione.

Tiotemplati perché gli aa vengono legati ad una sorta di scheletro enzimatico

attraverso un legame tioestere. Tra i vari moduli c’è un legame tioestere, c’è un

-SH che è il punto di attacco di ogni singolo aa. I 3 moduli riconoscono il proprio

aa e lo legano. All’interno del modulo il dominio A corrisponde all’attivazione,

ogni modlo attiva il suo aa, e lo lega sul peptidil carrier protein con legame

tioestere, il secondo modulo riconosce tramite il suo dominio di attivazione il

secondo aa e fa così anche il 3. Il tutto avviene tramite attivazione ad opera del

TSH, ognuno dei moduli ha il dominio di attivazione e si lega al peptidil carrier

proteine. Il modulo 2 ha il dominio della condensazione che fa sì che questo aa

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si condensi con il classico legame ammidico al secondo aa, il modulo 3 ha il suo

dominio di condensazione che lega il 3 aa ai primi due che intanto si liberano,

perché il legame viene spiazzato. Alla fine del terzo modulo c’è sempre un

dominio per la tioesterasi che deve tagliare il legame tioestere sul tiotemplato,

quello che succede è che stacca la tioesterasi, taglia il legame e il prodotto si

stacca nella giusta posizione e viene ciclizzato. Cosa succede nel terzo modulo,

che non c’è nel secondo? C’è il dominio E = epimerasi, in questo avviene

l’epimerizzazione della valina, se non è nella forma D non c’è la ciclizzazione.

Oltre alla formazione del tripeptide grazie ad ACV serve capire come vengono

sintetizzati. Tutti questi antibiotici hanno due cose che la sintesi proteica non

accetta: un D-aminoacido che viene generato durato la ciclizzazione e aa non

proteogenici. Nella sintesi ribosomiale viene tradotto un codice che dà

indicazione su quale aa deve essere inserito dopo l’altro aa. Se la sintesi di 7,

8, 10, 11 aa non avviene attraverso il codice genetico e non avviene attraverso

la sintesi ribosomiale, dove è il codice? Chi decide che dopo un aa va dopo un

altro aa e il peptide che vogliamo fare è così? Ci deve essere comunque un

codice, è l’organizzazione dell’enzima stesso. Il numero dei moduli è

direttamente proporzionale al numero degli aa che vanno inseriti. Il primo

modulo ha il dominio di attivazione, ma non ha il dominio di condensazione. Gli

altri moduli hanno sempre attivazione e condensazione. L’ultimo modulo è

sempre seguito dal dominio della tioesterasi perché deve sempre staccare.

Ma perché i moduli riconoscono gli aa giusti? Il modulo A riconosce il primo aa,

quindi bisogna capire il codice che è diverso da quello che viene tradotto dalla

sintesi ribosomiale. L’altra cosa è che ogni modulo oltre ad avere sempre

attivazione, peptidil carrier protein, condensazione, in alcuni casi può avere dei

domini accessori (come valina che ha dominio accessorio per l’epimerasi).

Il concetto è che noi abbiamo un gene che produce un enzima che è fatto da

moduli diversi, il primo modulo è più piccolo, gli altri sono più grandi e tramite

questi costruiamo peptidi più lunghi.

Cefalosporina abbiamo bisogno di 3 moduli, ciclosporina che è un prodotto

fatto da 11 aa, sul gene corrispondente per la NRPS abbiamo una struttura

ripetuta fatta di moduli, nella quale ad esempio nel modulo 5 abbiamo

l’attivazione, dei peptidil carrier protein (codificano per il più piccolo dominio,

sistema di trasporto della proteina con SH) e modulo di condensazione. La

condensazione è un dominio conservato è quasi sempre uguale tra modulo e

modulo, l’adenilazione (attivazione) sarà leggermente diversa perché ciò che

adenila una valina non è la stessa cosa che adenila la cisteina. Il peptidil carrier

protein è sempre uguale.

Caratteristiche

Dominio A: attivazione o adenilazione, il singolo aa viene attivato con una

molecola di ATP. L’aa viene riconosciuto, attivato, serve anche il Mg, e questi

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sistema di attivazione determina la sequenza primaria del peptide. L’aa viene

attivato e attaccato al tiotemplato. Dominio di circa 550 aa, dominio

intermedio, con determinate caratteristiche come enzima e come gene che ne

determina la sequenza.

Peptidil carrier protein: è una piccola sequenza proteica di 80-100 aa, il cui

sostanziale ruolo è quello di legare al tiotemplato l’aa attivato. Dove viene

attivato con l’AMP il gruppo carbossilico dell’aa reagisce con SH, esce AMP e si

lega l’aa al tiotemplato. È uguale in tutti i moduli.

Dominio di condensazione: proteine di 450 aa, è il corpo centrale, crea il

legame tra i due aa, si forma il gruppo acido attivato reagisce con gruppo

amminico dell’aa successivo, esce il primo peptidli carrier proteine e la catena

cresce sul tiotemplato.

Tioesterasi: dominio di 250 aa che segna la fine della sintesi del peptide e

stacca, reazione di idrolisi del tioestere, il peptide dal peptidil carrier protein.

NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthesis)

Trovati sia in funghi che in batteri, hanno la caratteristica principale di

sintetizzare aa proteogenici che non proteogenici (L-aa e D-aa) e sono a