Biotecnologie Farmaceutiche

Biotecnologie farmaceutiche

Introduzione ai metaboliti secondari

Questo modulo si occupa di prodotti del metabolismo secondario. Si propone di studiare i metaboliti secondari prodotti da vari microrganismi, quali possono essere batteri, archea, funghi unicellulari (comprendenti i lieviti, eucarioti), microalghe e protozoi. I batteri sono molto importanti per la loro diversità metabolica, ma non sono gli unici.

Distinzione tra metaboliti primari e secondari

Si può fare una distinzione tra prodotti biotecnologici utilizzati in ambito farmaceutico, ad esempio tra metaboliti primari (prodotti essenziali per la crescita e lo sviluppo del microrganismo, prodotti durante la fase di crescita, aa, acidi nucleici, vitamina B12, componenti essenziali per la crescita del microrganismo) e metaboliti secondari (prodotti non essenziali per la crescita, prodotti in fase stazionaria, i principali sono gli antibiotici, anche altri prodotti che vengono usati nell’industria farmaceutica).

Applicazioni dei metaboliti secondari

Dal punto di vista applicativo i metaboliti secondari sono antibiotici (più conosciuti, ma non gli unici), immunosoppressori (ciclosporina A prodotta da un fungo per evitare il rigetto del trapianto), statine (molecole ipocolesterolemiche, abbassano il livello di colesterolo nel sangue, prodotte da funghi), taxolo o derivati (il taxolo deriva principalmente dalle piante), avermectine (insetticidi e vermicidi, utili nei confronti anche di alcune patologie), enzimi industriali e ricombinanti, farmaci di natura proteica.

Produzione e funzione degli antibiotici

I microrganismi hanno il grande vantaggio di essere in grado di svolgere reazioni chimiche difficilmente replicabili per via chimica. Per quanto riguarda il metabolismo secondario, i microrganismi più interessanti sono gruppi di batteri ed eucarioti (funghi, lieviti compresi).

La prima definizione di metabolita secondario deriva da un fisiologo vegetale nel 1961; egli chiamò metaboliti secondari le sostanze prodotte ma non coinvolte nella vita cellulare e nello sviluppo cellulare. Questa definizione non è completamente vera: un antibiotico fornisce un vantaggio competitivo per il controllo dei nutrienti.

Metaboliti secondari vs primari

In natura non esiste una coltura pura, quindi un microrganismo in fin dei conti necessita di produrre un antibiotico al fine di avere delle risorse nutritive da consumare e alla fine un antibiotico dopotutto serve indirettamente anche per lo sviluppo!

Ad oggi, il termine metabolita secondario sta per essere pian piano sostituito dal termine metabolita speciale (metaboliti specializzati). I metaboliti secondari non servono per fare la biomassa. Da che cosa è fatta la biomassa? Proteine, polisaccaridi (non zuccheri semplici), acidi nucleici, lipidi, acqua. La biomassa è fatta da polimeri (strutturali e funzionali) di metaboliti primari. Il metabolismo secondario è molto conservato.

Differenze tra metaboliti primari e secondari

Vi è una grande differenza tra metaboliti primari e secondari: i metaboliti primari sono molecole che andranno a formare polimeri strutturali e funzionali; i metaboliti secondari specializzati differiscono dai metaboliti primari in quanto non andranno a formare polimeri. Inoltre i metaboliti secondari sono caratterizzati:

• Da basso peso molecolare (< 3000 Da), intermedio tra i metaboliti primari (basso PM) e i polimeri formanti la biomassa (alto PM).
• Dal fatto di essere sintetizzati solo da determinati gruppi microbici (concetto di specialista metabolico).

Ci sono prodotti che sono fatti da 10/20 aa, non arrivano alla lunghezza della proteina ma vengono polimerizzati. Ad esempio, nella produzione di antibiotici i gruppi di specialisti metabolici sono gli attinomiceti (procarioti) e gli ascomiceti (eucarioti, in particolare Penicillium e Aspergillus).

Produzione dei metaboliti secondari

Questi gruppi sono dotati di particolari differenziazioni morfologiche (processo di differenziamento microbico adattativo-metabolico che ha permesso loro di vivere ovunque e in qualsiasi condizione). Un esempio di questa differenziazione morfologica è la spora. Sia gli attinomiceti che gli ascomicota crescono sotto forma di micelio pluricellulare (un micelio è formato da ife, sono dei filamenti di cellule). Negli attinomiceti le ife sono costituite da cellule procariote mentre negli ascomicota sono formate da cellule eucariote.

Sia gli attinomiceti che gli ascomiceti formano un micelio di substrato, in cui le ife si fanno strada nel substrato (come delle radici). Nel momento in cui si ha carenza di nutrienti, il micelio di substrato va incontro alla formazione di un micelio aereo, formato da ife contenenti le spore neoformate e utili per la propagazione. Successivamente si ha la lisi delle ife e il rilascio delle spore.

Fermentazione e produzione industriale

I metaboliti secondari sono prodotti mediante fermentazione da microrganismi produttori specializzati. In coltura liquida, la produzione dei metaboliti secondari è strettamente dipendente dalle condizioni di coltura ed è generalmente correlata con la fase stazionaria di crescita. Solitamente, nelle produzioni industriali, i metaboliti secondari sono prodotti in terreno liquido in un bioreattore. In queste condizioni si può definire un grafico di time course della fermentazione, in cui vi sono schematizzate le variazioni di tutti i parametri (fonte di C e di N, pH, quantità di prodotto formato, etc.).

Produzione di antibiotici

I metaboliti secondari vengono prodotti solo quando i nutrienti iniziano a scarseggiare, ovvero quando il microrganismo smette di crescere (al termine della fase di crescita esponenziale). Questo perché gli antibiotici sono prodotti come vantaggio competitivo per ottenere il predominio sui pochi nutrienti presenti e per far avvenire in tranquillità la sporulazione.

Dal punto di vista pratico, prima si cerca di ottenere abbastanza biomassa successivamente si cerca di andare in carenza di nutrienti al fine di produrre il metabolita secondario di interesse. La maggior parte dei metaboliti secondari sono prodotti sotto forma di complex, ovvero gruppi di molecole strettamente correlate tra loro, ciò perché il metabolismo secondario è “meno stringente” rispetto al metabolismo primario, in pratica è come se il prodotto ammettesse errori (questa cosa non è prevista nel metabolismo primario, in cui ad esempio un amminoacido “sbagliato” può provocare la formazione di una proteina dannosa che andrà a causare la morte cellulare).

Identificazione e proprietà dei metaboliti secondari

I metaboliti secondari sono prodotti durante la fase stazionaria di crescita (idiofase), quando i nutrienti iniziano a scarseggiare. La maggior parte dei metaboliti secondari è rilevabile mediante HPLC utilizzando un rilevatore UV-visibile. Questo perché le molecole di metaboliti secondari presentano gruppi cromofori, come ad esempio anelli aromatici e doppi legami. In un profilo cromatografico di metabolita secondario si hanno diversi picchi, ciò perché solitamente sono prodotti sotto forma di complex, ossia un gruppo di molecole correlate tra loro.

Definizione e produzione degli antibiotici

Un antibiotico è una sostanza chimica, dalle citazioni di Waksman e Fleming, di origine microbica che possiede proprietà antimicrobica. Gli antibiotici sono molecole caratterizzate dal basso peso molecolare; hanno la proprietà di inibire la crescita microbica di altri microrganismi, anche a basse concentrazioni. Tutti i composti chimici usati ad alte concentrazioni sono antimicrobici! Gli antibiotici hanno la particolarità di avere attività antimicrobica a bassa concentrazione.

Inizialmente gli antibiotici venivano prodotti esclusivamente per via fermentativa; ad oggi vengono prodotti anche per via esclusivamente chimica (sintetici) oppure per metà per via fermentativa e per l’altra metà per via chimica (semi-sintetici).

Screening e sviluppo di nuovi antibiotici

Subito dopo la 2^a Guerra Mondiale, Waksman pose i “postulati” per lo screening al fine di trovare nuovi antibiotici:

• Collezione sistematica di microrganismi provenienti dal suolo.
• Crescita di suddetti microrganismi in coltura axenica.
• Test del brodo colturale per valutare la loro capacità di inibire la crescita di microrganismi patogeni.
• Recupero delle sostanze attive presenti.

Questo approccio venne trasferito all’industria fermentativa; negli anni 40-60 (Golden Age degli antimicrobici) sono state scoperte tutte le classi di antibiotici antibatterici usati tutt’ora.

Evoluzione degli antibatterici e delle resistenze

Gli antibatterici si dividono in più classi, a seconda della struttura molecolare. Si possono anche dividere in base alla tipologia e alla larghezza dello spettro, in base al target cellulare molecolare (es. sintesi del peptidoglicano, inibita a livello della transpeptidasi dalla penicillina). Da quegli anni fino ai giorni nostri si sono anche sviluppati fenomeni di resistenza batterica; questo fatto ha portato alla necessità di sviluppare nuovi antibiotici modificati al fine di bypassare questi fenomeni. Questo è ottenibile mediante modifica chimica delle molecole ottenute per via fermentativa.

Nuove frontiere nella ricerca di antibiotici

Nel frattempo, l’attenzione si è spostata su altri tipi di composti; i microrganismi sono stati screenati per la ricerca di altri farmaci antibiotici attivi su altri tipi di target (chemioterapici, immunosoppressori, antifungali, antivirali, erbicidi, antiparassitari...). La scoperta e la produzione dei composti sopra-citati permette la produzione di molecole utili ha permesso alla società di progredire; basti pensare alle operazioni chirurgiche e alle fasi post-operatorie, le quali necessitano di antibatterici e antivirali. Inoltre ha permesso la notevole evoluzione dei saggi biologici in uso, la scelta del saggio biologico ovviamente dipende strettamente sul target del prodotto da testare.

Tipi di saggi biologici

I saggi posso essere classificati in:

• Saggi cell whole (basato sull’effetto sulle cellule procariote o eucariote).
• Saggi cell free (basato sull’effetto su enzimi, per studiare determinati passaggi di qualche biosintesi).
• Saggi in vivo (su animali).

Produzione di antibiotici da attinomiceti

Circa il 48 % dei metaboliti secondari con attività antibiotica è prodotto da attinomiceti; ciò è legato anche al loro differenziamento morfologico che causa il differenziamento biochimico. Le classi di metaboliti secondari utilizzati come farmaci sono circa 200. In seguito allo screening passano anni prima che il metabolita secondario trovato possa essere utilizzato sotto forma di farmaco. Vi sono svariate fasi che si devono effettuare prima di commercializzare un farmaco:

• Inizialmente si opera con la fase di ricerca e di screening HTS (High Through-put Screening) to hit (hit = risultato in un saggio data da una determinata attività biologica) e Hit To Lead (si cerca di capire com’è la struttura chimica del composto di interesse).
• Una volta passata questa fase si provvede a coprire la molecola di interesse con un brevetto, il quale protegge per 20 anni la proprietà intellettuale sulla stessa.
• Al termine del brevetto si procede con lo sviluppo e l’ottimizzazione del composto lead in analisi in development candidate e successivi test clinici (fase 1, 2, 3; 1 su volontari sani per verificare la presenza di effetti collaterali, 2 su pazienti reclutati con patologia specifica per verificare la capacità di cura del farmaco, 3 comparazione di dati ottenuti con i dati di altri farmaci sul mercato per verificare che non ci siano farmaci “competitivi”).

Produzione e scaling-up

L’azienda investe ingenti capitali in queste fasi, inoltre pianificano molto bene le tipologie di prodotto su cui investire, onde evitare di perdere soldi. Un’azienda si trova anche a confrontarsi anche con il problema del supply, ovvero il problema di produrre abbastanza prodotto per sostenere le fasi di ricerca o il mercato. Nel passaggio tra le varie fasi è necessario uno scaling-up, in modo da aumentare i volumi di produzione e di poter quindi rispondere alla domanda del mercato.

Caratteristiche degli ascomiceti

Ascomiceti sono produttori di penicilline (antibatterico beta lattamico), cefalosporine (antibatterico beta lattamico), echinocandine (antifungali), statine (ipocolesterolemici), ciclosporina (immunosoppressore). Gli ascomiceti prendono il nome da una struttura detta asco. Si sviluppano formando conidi, ovvero filamenti di spore. I funghi ascomiceti possono riprodursi asessuatamente (mitosi) o sessuatamente (meiosi con conseguente fusione di cellule).

Caratteristiche degli attinomiceti

Attinomiceti sono batteri Gram + ad alto contenuto in G+C, aerobi e chemiorganotrofi. Sono i produttori di circa il 70 % di antibiotici. Dallo screening alla fase di sviluppo, i produttori principali di questi metaboliti sono i funghi e gli attinomiceti.

Quasi tutti formano il micelio aereo e possono formare anche dei corpi fruttiferi come i funghi, sono sporangiofori, diversi dai classici batteri frammentanti. Il genere più noto è quello degli Streptomyces, si isola più facilmente rispetto agli altri, ha portato ad una serie di prodotti che vengono utilizzati in clinica. Dai β-lattamici alla daptomicina sono tutti antibatterici e sono molto importanti. La daptomicina viene usata solo a livello ospedaliero. Poi ci sono prodotti antifungali.

Diversità e produzione di nuovi prodotti

Oltre agli Streptomyces ci sono altre famiglie meno note che comunque portano alla produzione di prodotti interessanti. Diversità sia microbiologica che chimica. I metaboliti secondari hanno un peso molecolare superiore ai metaboliti primari, ma più basso rispetto alle proteine o agli acidi grassi. Classe chimica e meccanismo d’azione delle molecole è l'obiettivo del corso. Gli attinomiceti che frammentano (la loro riproduzione assomiglia alla scissione binaria dei Clostridi ad esempio) non producono così tanti metaboliti secondari. I Bacillus possono produrre alcuni peptidi che sono una categoria chimica definita. Lo screening è iniziato con la ricerca degli antibiotici.

Antibiotici e Golden Age

I antibiotici possono essere antibatterici, antifungali, antiprotozoi, antialghe. Sono molecole a basso peso molecolare, prodotti da microrganismi che inibiscono altri microrganismi a basse concentrazioni. Non vengono solo utilizzati per uso umano, ma anche per usi ambientali o come additivi nel cibo animale e come cura veterinaria.

• Penicilline e cefalosporine, rappresentano i β-lattamici.
• Macrolidi.
• Amminoglicosidi.
• Tetracicline.
• Chinoloni, non rientrano nella definizione standard perché non sono prodotti per via fermentativa ma sono prodotti per via sintetica.
• Altri, gruppo che incide poco sul mercato di produzione mondiale, ma molto importanti perché sono spesso antibiotici salvavita; si trovano solo a livello ospedaliero, riguardano patologie gravi (ciclopeptidi ad esempio).

Nella Golden Age (1940-1960), natural product screening: sono stati prodotti molti dei prodotti che conosciamo. Prima si usavano i sulfamidici: fatti per sintesi chimica. Poi tutti i prodotti dalla golden age in poi sono stati fatti per via fermentativa o per semi-sintesi, per migliorare le proprietà dei prodotti. Poi si è cambiato approccio: analisi della genomica (identificazione target) e di screening delle chemical library, il numero dei prodotti è molto diminuito; questo è più facile e semplice da fare. Questo shift è stato disastroso perché non si è portato a scoprire niente.

Nuove strategie di scoperta

Il primo genoma sequenziato è stato Haemophilus influenzae, patogeno. Si è voluto identificare dei nuovi target; screenare ha portato ad ottenere negli inibitori enzimatici che funzionano però in vitro e non nella cellula. L’evoluzione biologica ha evoluto delle molecole che tengono in considerazione due cose: l’inibizione del bersaglio e l’entrata nella cellula. Trovare dei target per genomica dei patogeni ha aperto una strada molto importante: reverse vaccinology (partendo dal genoma del patogeno si possono trovare dei nuovi vaccini), per noi non è stato particolarmente promettente. Problema: sviluppo da parte dei batteri di resistenze ai farmaci.

Screening moderno e resistenze

Dal 2000 ad oggi nuovo natural product screening: genomica dei produttori; abbandono del chemical library screening e si cerca di rinaturalizzare. Ci sono dei patogeni che sono resistenti a tutte le classi di antibiotici. Staphylococcus aureus, problemi antibatterici ed antifungali, resistenza a ci sono microrganismi resistenti ai β-lattamici. In ospedale si selezionano i patogeni più distruttivi, perché qui si isolano i patogeni più forti. Tra i Gram positivi (eterococco e stafilocco) abbiamo i casi più critici perché possono essere multiresistenti. Perché Clostridium è un patogeno così importante? Perché colpisce i pazienti immunocompromessi. Anche alcuni Gram negativi sono resistenti o patogeno, derivanti dal fenomeno di globalizzazione. Ci sono anche alcuni ceppi di E. coli che sono molto patogeni.

Approccio originale di screening di antibiotici di Waksman

Come si è evoluto nell’industria farmaceutica? Non si isolano più i microrganismi dal suolo, perché ci sono pochi nutrienti e poca disponibilità. Quando sono subentrate le aziende farmaceutiche gli isolamenti sono stati più massivi (high throughput mode), isolando da qualsiasi campione possibile (suolo, acqua, piante, anche dalle simbiosi, dai macroorganismi acquatici, insetti, si è allargato lo spettro di isolamento). Si isolano i microrganismi in coltura pura con metodi selettivi fino ad avere il ceppo puro, poi farlo fermentare in beuta -> prelevare il brodo col micelio.