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Biotecnologie Farmaceutiche

Appunti di Biotecnologie farmaceutiche basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Marinelli dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biotecnologie farmaceutiche docente Prof. F. Marinelli

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Acidi nucleici

 Membrana cellulare

 Parete cellulare

 Antimetaboliti (si sostituiscono ad un metabolita essenziale)

 Inibizione del DNA/RNA

I battericidi e i funghicidi sono caratterizzati da un legame irreversibile nei

confronti del target, mentre i batteriostatici sono caratterizzati da un legame

reversibile. Lo stesso antibiotico può essere sia battericida che batteriostatico,

in base al target e/o alla concentrazione di utilizzo.

La concentrazione minima battericida è la più bassa concentrazione di una

sostanza antimicrobica (come ad esempio un antibiotico) necessaria ad

uccidere un determinato batterio in coltura pura.

In altre parole trattasi di un parametro efficace per il controllo delle sensibilità

(o resistività) dei batteri ad un determinato agente antimicrobico.

Un'indicazione analoga, ma non sovrapponibile, viene fornita dalla

determinazione della MIC. Per determinare la MBC, dopo diluizione del brodo

della MIC, si rileva se la coltura presenta o meno crescita: nel primo caso la

coltura era solo inibita, (quindi l'azione dell'antibiotico è batteriostatica), nel

secondo invece uccisa, quindi l'azione dell'antibiotico è di tipo battericida.

La sintesi della parete cellulare

La parete cellulare è formata da un insieme di glicopeptidi legati da legami

peptidici. I Gram negativi, a differenza dei positivi, possiedono un sottile strato

di peptidoglicano circondato da una membrana cellulare esterna. Vi sono vari

prodotti che agiscono a livello della biosintesi della parete cellulare, a livello

della sintesi di peptidoglicano. I target specifici sono diversi. Il precursore

glicopeptidico del peptidoglicano è fomato da due zuccheri (N-

acetilglucosammina e acido N acetil muramico) e da un pentapeptide

(composto da L-alanina, D-glutammato, acido mesodiaminopimelico D-alanina,

D-alanina). Durante la sintesi, si formano dei dimeri di questi due zuccheri che

vengono trasportati verso la faccia esterna mediante un trasportatore lipidico,

il bactoprenolo. Questo dimero viene legato alla catena nascente di

peptidoglicano mediante l’azione delle transglicolasi. Si forma così un filamento

di peptidoglicano unito da legami zucchero-zucchero. Infine si ha la formazione

di legami tra catene peptidiche mediante l’azione dell’enzima transpeptidasi. In

questa reazione viene staccata una D-alanina dal pentapeptide; energia di

legame catalizza la formazione del legame transpeptidico. Vi sono diversi

antibiotici che inibiscono una delle fasi della sintesi del peptidoglicano:

Fosfomicina: inibisce la sintesi dei precursori

 12

Bacitracina: inibisce il riciclo del bactoprenolo, bloccando la traslocazione

 dei dimeri di zucchero

Glicopeptidi (vancomicina): si legano all’estremità carbossi-terminale del

 dimero D-alanina D-alanina del peptide dell’acido N acetil muramico,

interferendo con l’azione della transpeptidasi.

Beta lattamici (penicillina): si legano all’enzima transpeptidasi,

 bloccandola.

Meccanismo di azione degli antifungali

Poliossine: inibiscono la sintesi di chitina per i funghi che la contengono

 all’interno della parete cellulare.

Macrolidi polieni (anfotericina): agiscono andando a distruggere la

 membrana cellulare (il loro target scpecifico è l’ergosterolo), molto

conservata nelle varie specie di funghi.

Azoli: sono prodotti da banco di sintesi chimica

 Statine: inibiscono la sintesi di ergosterolo, tuttavia anche del colesterolo.

Ad oggi sono utilizzate proprio nei confronti della sintesi di colesterolo.

Genomica

I primi genomi sequenziati sono di microrganismi patogeni, al fine di scoprire

nuovi geni utili come target per farmaci innovativi. Il sequenziamento di

microrganismi patogeni si è rivelato abbastanza inutile al fine di trovare nuovi

metaboliti secondari; si è quindi sequenziato il genoma di microrganismi

produttori di metaboliti secondari.

-Streptomyces coelicolor (2002)

È un’attinomicete filamentoso gram positivo, ad alto contenuto in guanina e

citosina. Il sequenziamento del genoma di S.coelicolor è stato differente dal

sequenziamento dei primi patogeni in quanto questo microrganismo possiede

un genoma di 8.66 Mb, il doppio del classico E.coli. Questo microrganismo ha

molti più geni per le sue funzioni e per la produzione di metaboliti secondari

rispetto a E.coli. Esso contiene 20 cluster per la biosintesi di metaboliti

secondari.

Il cromosoma di Streptomyces è lineare e aperto alle estremità; nella parte

centrale vi sono i geni deputati al metabolismo primario mentre alle estremità

vi sono i geni deputati per il metabolismo secondario. Oltre ai cluster per la

produzione di metaboliti secondari, vi sono numerosi geni per la produzione di

enzimi idrolitici (come ad esempio le chitinasi) per la degradazione della

materia organica nel suolo (il suo habitat naturale).

I principali metaboliti secondari prodotti da questo microrganismo sono:

Actinoroidina

 Metilenomicina

 13

Undeciprodigiosina

 Perimicina

Gli altri 16 cluster non corrispondono a nessun altro metabolita secondario

noto. Per tentare di produrre i prodotti di questi cluster si dovranno cambiare le

condizioni di coltura di questo microrganismi.

-Streptomyces avermitilis

Il genoma di questo microrganismo è stato il secondo pubblicato.

Questo microrgamismo produce l’avernectina, una molecola nematocida. A

differenza del precedente, questo microrganismo viene utilizzato come

microrganismo industriale. S.avermitilis ha le seguenti caratteristiche:

Ha un cromosoma lineare, contenente 9 Mb e 7555 geni.

 Sono presenti 25 cluster sulle braccia laterali, al centro vi è il cluster per

 il metabolismo primario.

L’avernectina è un potente nematocida utilizzato in infezioni da nematode,

come ad esempio la river blindness. Questa infezione è comune in molte zone

dell’Africa e dell’India ed è provocata dall’ingestione di acqua infetta da questo

nematode. Una volta penetrato nel corpo, questo nematode si localizza a livello

della retina, causando così gravi problemi alla vista.

-Saccharopolyspora erythraea

È un attinomicete naturale produttore dell’antibiotico eritromicina. Ha

caratteristiche simili ai precedenti:

Genoma di 8.2 Mb, circa 7000 geni.

 Contiene 24 cluster localizzati sulle braccia del cromosoma per la

 produzione di metaboliti secondari mentre possiede 1 solo cluster per il

metabolismo primario.

GENOMICA Streptomyces coelicor

Il primo attinomicete sequenziato è stato e poi altri due

Streptomyces. I geni per gli antibiotici e gli altri metaboliti secondari sono

raggruppati in maniera continua sul cromosoma batterico in forma di cluster.

Ogni metabolita è sintetizzato da una serie di geni che sono presenti in

maniera contigua sul cromosoma. Non ci sono solo geni sintetici ma anche per

metabolismo secondario, auto-resistenza e per il trasporto all’esterno di

metaboliti secondari. Il sequenziamento genico mostra che esistono molti più

cluster di metaboliti secondari sconosciuti grazie all’informazione genomica.

S. coelicor

Nel caso classico del erano conosciuti 5 prodotti prima del

sequenziamento, dopo il sequenziamento tramite informazione genomica si è

trovato il cluster corrispondente. Alcuni di questi prodotti sono stati indotti nel

microrganismo. Altri sono ancora non conosciuti. Questi microrganismi hanno la

capacità di produrre molto di più rispetto a quello per cui sono noti. 14

E.

Quando è stato sequenziato il genoma si è visto che: è il doppio di quello di

coli Bacillus,

e cromosoma lineare, parte centrale del cromosoma era simile tra

i microrganismi e codifica per il metabolismo primario e le due braccia sono

ricche di cluster per metabolismo secondario. Queste braccia laterali sono

ricche di sequenze riconducibili a trasposizioni, vuol dire che hanno un core

centrale conservato e due braccia ricche con tante sequenze di trasposizione

quindi queste zone sono ad alta mobilità, servono per scambi, per

ricombinazione, per trasferimento orizzontale di geni.

Cluster Streptomyces

Dopo questi tre l’altro genoma che è stato sequenziato è quello

Salinispora tropica,

di fa parte di nicchie particolari, attinomicete marino.

Questo è un microrganismo che è dipendente dalla concentrazione di sale

presene nel mezzo (hanno bisogno di sale diverso dalla tolleranza al sale).

Salinispora è importante perché ha il cromosoma circolare e oltretutto è un

cromosoma più piccolo, a 5 Mb; questo può sottointendere che ci sia stata una

riduzione della capacità genomica per adattamento ad una nicchia particolare.

Ha comunque 17 clusters per i metaboliti secondari.

Amycolatopsis mediterranei: è una pseudonocardiaceae, genoma

estremamente grande, cromosoma circolare con 10 mila coppie di basi e 26

clusters per il metabolismo secondario.

Amycolatopsis orientalis: produttore della vancomicina, ha 10 clusters.

È cambiato l’approccio dello screening ed anche integrato con l’approccio

classico, oltre a cercare nuove specie (tramite nuovi metodi di isolamento o

cercando nuove nicchie) l’idea è quello di fare il genome mining e poi bisogna

indurre il microrganismo a produrre i composti di interesse. Questo tipo di

approccio ha cambiato anche la mentalità della microbiologia perché si è

cominciato a pensare che le condizioni di laboratorio (coltura axenica, tanti

nutrienti) privano il microrganismo dei segnali ambientali e si cerca di attivare il

microrganismo a produrre prodotti non conosciuti in ambienti non originari. Si è

cercato di variare tutte le condizioni di terreno per far esprimere questi geni

oppure si utilizzano approcci genetici: clonare dei regolatori, serve per poter

indurre l’espressione di un nuovo cluster; oppure se da questo microrganismo

non si riesce ad indurre né tramite fisiologia o con mezzi genetici classici, si

15

può provare con l’espressione eterologa -> prendere tutto il cluster e metterlo

in un microrganismo che si conosce al meglio.

Penicillium: microrganismo produrre di penicillina, fa delle ife vegetative e poi

differenziano in un micelio aereo (pennellino) è in micelio faccio di conidi (spore

Penicillium

mitotiche, i funghi possono fare la meiosi), il ha solo il ciclo

Penicillium

asessuato noto. Secondo genoma sequenziato, nel 2008:

chrysogenum, non sono riusciti a trovare il wt, non si trova più! È già un over

produttore di penicillina rispetto al wt. I clusters sono organizzati allo stesso

modo degli Attinomiceti.

Aspergillus: il suo genoma è stato il primo ad essere sequenziato tra i funghi,

nel 2007; è un genoma più grande, perché è eucariote, 34 Mbp di DNA, ci sono

circa 14 mila ORF. Organizzazione dei clusters biosintetici simile a quella degli

Attinomiceti, ci sono dei clusters che contengono geni per la biosintesi,

regolatori, etc, dei veri e propri clusters biosintetici e dove ci sono questi c’è

una marea di sequenze e di elementi mobili, tipo i trasposoni.

Dal 1980 sono stati screenati anche i Cianobatteri e i Mixobatteri, hanno la

potenzialità genomica di produrre metaboliti secondari.

Si cercano batteri con genomi grandi, con sequenze per metabolismo

secondario, si cercano gli enzimi signature (macchine enzimatiche per fare

metaboliti secondari). Cianobatteri: fotoautotrofi e sono famosi per la

produzione di cianotossine, tossine che uccidono i pesci ad esempio, tossine

che in genere o inibiscono il sistema nervoso o il sistema digestivo-epatico.

Queste tossine sono dei metaboliti secondari e i loro clusters biosintetici sono

organizzati come i clusters dei metaboliti secondari. Hanno un differenziamento

biochimico legato ad un differenziamento morfologico, perché crescono come

catenelle, come strutture complesse, possono produrre le eterocisti.

Chemioeterotrofi: traggono energia dall’ossidazione dei composti organici e

traggono C dagli scheletri carboniosi della stessa ossidazione. I cianobatteri

convergono il loro metabolismo per la produzione di metaboliti secondari.

Questi (cianobatteri) però sono difficili da isolare e soprattutto per fare lo

scaling up; difficoltà anche di mantenerli in coltura axenica. Quasi tutti i

cianobatteri sono coperti da una capsula nella quale si annidano i vari batteri;

bisogna sempre tenerli esposti alla luce, sono faticosi anche da mantenere in

coltura e in conservazione; per fargli crescere serve la luce, quindi non si può

usare un reattore classico, bisogna insufflare la CO perché la fissano, bisogna

2

rimuovere l’ossigeno, hanno tempi di replicazione di giorni. Producono molecole

complesse che non possono essere prodotte per via sintetica, ma se l’approccio

biologico è troppo impegnativo si lascia perdere. Una volta identificato un

cluster interessante, si predice che possa produrre una molecola interessa -> si

Streptomyces

fa un’espressione eterologa, si mette in ad esempio. 16

Perché è più difficile esprimere un cluster rispetto ad un’espressione eterologa

di insulina ad esempio? Perché sono tanti geni, bisogna clonare un insieme di

geni che vanno dalle 30 alle 70 kb, poi non ci interessa il singolo gene, gli

enzimi devono lavorare tra di loro per ottenere il prodotto di sintesi, quindi

servono i substrati giusti e gli enzimi giusti.

I cianobatteri sono interessanti, tanti candidati preclinici, ma nessuno di questi

prodotti è arrivato in clinica.

Mixobatteri: sono chemioeterotrofi, vengono chiamati sociali e predatori. Ad

un certo punto del loro ciclo vitali si organizzano in corpi fruttiferi, tutte le

cellule migrano nella loro posizione nel corpo fruttifero, poi differenziano

formando le spore. Quando si muovono i mixobatteri lasciano una scia e si

concentrano nel copro fruttifero -> fenomeno sociale. Sono anche predatori,

E. coli

altro metodo per isolarli: se facciamo una striscia con nella piastra e poi

E.

si vede la striscia dei mixobatteri che lasciano dal loro punto di origine ad

coli, E. coli.

dove secernono enzimi per la lisi di [Primo predatore che viene

descritto è l’ameba, esempio di evoluzione] Hanno diversi pigmenti, hanno un

genoma di 9.1 Mb, genoma molto grande quindi, si è visto che ha 18 clusters

per i metaboliti secondari e sono organizzati classicamente con le macchine

biosintetiche, con i geni regolatori. A differenza di cianobatteri questi hanno un

prodotto che è stato portato in clinica, c’è stato un gruppo tedesco che ha

lavorato isolando questo produttore che si chiama epotilone, farmaco

principale per il tumore al seno.

Sorangium cellulosum,

Mixobatterio: genoma con 13 Mb, 20 clusters per

metaboliti secondari. Si chiama così perché i mixobatteri sanno degradare la

cellulosa.

Se voglio isolare i mixobatteri metto la cellulosa nel terreno. È difficile

mantenere i ceppi. Difficoltà di isolamento e conservazione. Anche nel caso dei

mixobatteri si è passati ad una espressione eterologa. Il cluster per epotilone è

E. coli, S. coelicolor, M. xanthus S. venezuelae;

stato clonato in e in tutti questi

ceppi si è arrivati a microgrammi di prodotto per coltura; nessuno di questi

ceppi è diventato un produttore perché la quantità non basta. Si cerca di

Sorangium cellulosum. Cosa

produrre mutagenizzando l’ospite omologo ovvero

vuol dire quando un microrganismo duplica lentamente? Un’altra coltura

microbica potrebbe prendere il sopravvento, rischio di contaminazione molto

elevato.

Che cosa hanno detto i metodi molecolari applicati allo studio dei

microrganismi oltre alla sequenza genomica? Quale altra rivoluzione c’è stata

nella microbiologia con l’avvento delle tecniche molecolari? I microrganismi che

noi conosciamo ed isoliamo è solo l’1%. Andando ad isolare il DNA in natura si

è visto che il DNA che conosciamo è riconducibile ad una piccola parte dei

microrganismi che conosciamo, ci sono altre migliaia di specie che noi non

17

conosciamo. Il 99% delle specie microbiche non è possibile farla vivere in

laboratorio perché non si conosce. Ogni singolo organismo ha più clusters di

quanto si pensa; altri microrganismi hanno tanto clusters che nessuno ha mai

utilizzato. Molti degli attinomiceti e funghi non si conoscono perché vivono in

simbiosi con altri microrganismi, sono associati alle radici, nei fondali marini; ci

sono dei simbionti obbligati ovvero dei microrganismi che non potremo mai

isolare.

Metagenomica (ultimo approccio di questa fase di

innovazione): l’accesso alla potenzialità genica di

microrganismi non coltivabili, creare librerie di

DNA non coltivabili. Prendere DNA ambientali,

(E. coli,

estrarlo, clonarlo ed introdurlo in un ospite

limite) poi si ha una libreria di DNA ambientale, si

può screenare geneticamente tramite PCR o

funzionalmente tramite dei saggi.

β-LATTAMICI

La maggior parte degli antibiotici che ci interessano derivano dalla

condensazione di aminoacidi o dagli aminoacidi stessi. Ci sono 4 categorie di

beta-lattamici, dal punto di vista clinico sono una categoria molto importante:

1. Penicillina G, non si usa più perché i nostri microbi sono resistenti alla

penicillina G

2. Cefalosporine, ci sono anche quelle semi-sintetiche in clinica

3. Tienamicina

4. Acido clavulanico, inibitore enzimatico della beta-lattamasi

Queste 4 classi sono le classi più importanti dei beta-lattamici: hanno un anello

beta-lattamico che chiude come un lattame, legame ammidico (NH e un acido)

2

per chiudere un ciclo; condensato all’anello beta-lattamico ci sono cose diverse

(nelle penicilline c’è un anello a 5C, nelle cefalosporine c’è un anello a 6C, in

entrambi c’è lo zolfo; nella tienamicina c’è un anello a 5C senza zolfo;

nell’acido c’è un anello a 5C senza S, ma con O); poi c’è il gruppo R (penicillina

-> gruppo fenilacetico).

PENICILLINE (Appunti da fermentazioni)

È un β-lattamico, inibisce la formazione della parete cellulare batterica, i β-

lattamici coprono ancora il 65% del mercato degli antibiotici e vengono

utilizzati come prima linea di difesa. La penicillina G ha una certa complessità

chimica, struttura formata dalla condensazione di 3 aa, 3 metaboliti, è un

Come

tripeptide abbastanza modificato. La cefossitina è una cefalosporina.

sono i β-lattamici? Hanno un anello β-lattamico che è uguale in tutti gli

antibiotici, si chiama così perché un legame che chiude un ciclo ed è legame

18

ammidico intraciclo. Coniugato a questo anello nella penicillina c’è un anello

eterociclico a 5 atomi con S, N e 3C. nelle cefalosporine questo anello cambia

Com’è fatta la penicillina G?

ed è a 6 atomi. Anello ciclico e sostituenti. La

struttura si divide:

Anello β-lattamico

 Anello tiazolidinico

 Gruppo fenilacetico

Se alla penicillina si toglie il gruppo fenilacetico si ottiene il 6-APA, da questo

tramite reazioni chimiche si ottengono diversi composti -> in questo modo si

contrasta la resistenza alla penicillina G da parte dei microrganismi. Nella

posizione R sono state aggiunte negli anni varie cose e in questo modo si

creano le penicilline semisintetiche, semi perché non si fa tutta la penicillina

per via chimica, si fa per fermentazione, si rimuove il fenilacetico e si aggiunge

qualcos’altro. Si è andato a sostituire il gruppo fenilacetico perché appunto i

microrganismi hanno sviluppato resistenze riuscendo a produrre enzimi β-

lattamasi, in grado di aprire l’anello β-lattamico. Capendo come funzionava il

trasferimento del plasmide si capì perché si diffondeva la resistenza alla

penicillina, in quanto sul plasmide è presente il gene che codifica per una β-

lattamasi e in questo modo il microrganismo diventa resistente all’antibiotico.

Prima si fecero penicilline naturali o biosintetiche: si faceva il feeding di un altro

composto chimico simile al fenilacetico e si introduceva un altro gruppo al

posto dell’R; quindi invece che togliere il fenilacetico chimicamente si

Cosa si introdusse?

introduceva un altro composto simile. Dei composti

ingombranti, ad esempio strutture aromatiche con tanti sostituenti per 3

motivi:

1. Fare penicilline semisintetiche resistenti alla β-lattamasi, per ingombro

sterico impediscono alla β-lattamasi di arrivare all’anello

2. Per aumentare la stabilità al pH acido, fondamentale perché può

essere assunta per via orale quindi arriva nello stomaco, quindi si passati

dall’iniezione alla pastiglia

3. Per aumentare la lipofilia, importante perché sono antibiotici

tipicamente attivi su Gram positivi e aumentando la lipofilia potevano

entrare anche nelle membrane dei Gram negativi, quindi possibilità di

allargare lo spettro d’azione

Il meccanismo di azione dei β-lattamici è quello di inibire la sintesi del

peptidoglicano della parete cellulare e hanno il target esposto fuori dalla parete

cellulare.

Penicilline biosintetiche: addizione di precursori al terreno. Penicilline

semisintetiche fatte durante la golden age. Ci sono varie generazioni di

penicillina clinica fatte tutte a livello semisintetico. Vengono fatte tramite 3

19

passaggi: fermentazione, deacilazione (rimozione residuo R, veniva fatta

chimicamente ore viene fatta enzimaticamente) e poi riacilazione chimica,

produzione penicilline semisintetiche. Quando viene fatta la deacilazione si ha

il 6-APA, attraverso un processo microbiologico, e poi viene acilato

Perché vengono

chimicamente. L’Italia è stata un grosso produttore di 6-APA.

fatte queste penicilline? Per i 3 motivi!

Dove agiscono le penicilline? Agiscono sulla fase esterna alla membrana

cellulare batterica (la membrana plasmatica) quando avviene il crosslinking,

quando si forma la matrice del peptidoglicano. Agiscono sulle transpeptidasi. Il

loro target è un target enzimatico, le penicilline mimano il D-ala-D-ala,

bloccano l’azione del legame transpeptidasico, si legano in maniera covalente,

legame irreversibile, in questo modo bloccano le transpeptidasi (sono chiamate

penicillium binding protein). Il target molecolare della penicillina è stato

chiamato così perché è stato scoperto dopo la penicillina. (RIGUARDA SINTESI

PARETE CELLULARE). La penicillina si lega al sito attivo bloccando la sintesi

della parete cellulare -> perdita di forma cellulare, perdita pressione osmotica,

le cellule lisano. La composizione del peptidoglicano può cambiare e il legame

può non essere diretto, ci può essere un ponte con la glicina ad esempio. A

questo livello agiscono anche le transglicosilasi per fare il filamento di glicano.

La penicillina naturale è la G con il fenilacetico, nel brodo di fermentazione ci

sono altre penicilline, la cui unica variazione è la catena laterale R. Gli enzimi

terminali della biosintesi sono più elastici rispetto agli enzimi che servono per

produrre il 6-APA.

Il processo di dare dei precursori durante la fermentazione per produrre le

penicilline biosintetiche = Precursor direct biosynthesis, aggiungere

prodotti fatti a parte durante la fermentazione facendo in modo che il

microrganismo li incorpori, si orienta la biosintesi. Questi precursori vengono

dati massimamente al microrganismo che deve integrarli.

Il primo processo che è stato utilizzato per fare il 6-APA era il processo di

deacilazione chimica, processo con 3 passaggi, ad ogni passaggio si perde di

prodotto e in più vengono utilizzati prodotti tossici (butanolo), temperature

bassissime, catalizzatori, condizioni estreme. Quindi è stata una grande

scoperta trovare un enzima che fa questo processo in un unico passaggio, in

E. coli

acqua a 37°C -> penicillina acilasi. Ora si produce in ricombinante o

microrganismi ricombinanti, si passano in fermentazioni in batch. Il fenilacetico

viene riciclato perché viene ridato al produttore e questo permette di produrre

una maggior quantità di penicillina.

Penicillium notatum

Il produttore (wt) produceva 2 U/mL = 0.03 g/L,

produttività degli isolati wt. Da questo microrganismo si è intensificata la

produzione di penicillina. Si è arrivati ai 50 g/L e ad ora siamo intorno ai 70-80

g/L, il microrganismo quindi è stato trasformato in una macchina da

20

produzione. Com’è stato trasformato il ceppo? Mutagenesi e selezione

fenotipica, introduzione mutazioni random e selezionando fenotipi ad alta

produzione, classical strain improvement. Classico perché è stato fatto dagli

Penicillium chrysogenum.

anni ’60 ad adesso. Si è utilizzato successivamente

Aspergillus

Anche alcuni ceppi di sono in grado di produrre penicillina.

PROCESSO FERMENTATIVO

Penicillina fatta da: cisteina, valina (aminoacidi proteogenici) e il terzo aa è L-

aminoadipico, precursore della lisina che a sua volta è un aa proteogenico;

quindi la penicillina è un tripeptide. La sua produzione è stata studiata tramite

precursori marcati e si è visto che andavano a formare lo scheletro della

penicillina. Primo tentativo per migliorare la resa della fermentazione è stato

intuitivo aggiungere gli aa dall’esterno; in realtà si è visto che l’aggiunta di

lisina e valina inibisce la biosintesi della penicillina, feedback negativo. Se si

accumulano monomeri, a basso peso molecolare, l’acqua entra nella cellula in

eccesso e questa muore a causa della pressione osmotica. Altro tentativo, si

aggiungono glucosio, fosfati e ammonio, ma in questo caso si inibisce la

penicillina -> repressione da catabolita. Tutti i metaboliti secondari sono

sotto controllo a repressione da catabolita, quando il microrganismo nella fase

iniziale ha abbastanza zuccheri e ammonio e fosfati non ha alcun interesse a

produrre i metaboliti secondari, inizia a produrre i metaboliti secondari durante

la fase di differenziamento, deve competere con gli altri microrganismi, la

Come si risolve

produzione inizia solo quando questi fattori diventano limitanti.

questo problema? Se si dà lattosio al posto di glucosio questo è meno inibente,

perché il microrganismo idrolizza il lattosio (esternamente alle cellule con la β-

galattosidasi) e poi utilizza il glucosio. Questo processo è modulato, la

concentrazione libera di glucosio rimane sempre bassa ed è questa che induce

la pressione per l’inibizione. Queste fonti sono chiamate fonti a lento rilascio

e dipendono dalla stessa attività del microrganismo. Per alcuni microrganismi

funziona in questo modo anche l’amido, la scissione dell’amido è complessa e

quindi si ha un rilascio abbastanza lento di glucosio. Corn steep liquor ->

miscela a basso costo, deriva dal trattamento del mais, questo è l’elemento

che stimolava la produzione di penicillina; si è scoperto che contiene l’acido

fitico = fosforo legato in maniera organica.

Altro sistema per evitare la repressione da catabolita è fare un feeding, prima si

fa crescere il microrganismo e poi verso la fine della fase esponenziale si fa un

perché?

feeding. Si fanno dei feeding di zuccheri, Ci si rimette nel concetto del

lento rilascio, si lascia il glucosio sempre sotto al livello soglia, sfruttando la

capacità metabolica del microrganismo.

Le penicilline sono secrete nel mezzo quindi si raccoglie il mezzo di coltura, il

prodotto attivo è la penicillina G e la sua attività viene aumentata con il feeding

di fenilacetico nel mezzo. Man mano che il microrganismo produce penicillina si

fa fatica a produrre il quarto componente (fenilacetico che va a sostituire

21

l’aminoadipico), ma se si aggiunge all’inizio della fermentazione questo dà un

effetto tossico, invece facendo un feeding nel momento in cui le cellule sono

già cresciuto questo fenilacetico va a finire tutto nella biosintesi. Facendo

questo feeding non si fa un processo bastch, si fa per stimolare la produzione.

TIME COURSE penicillina. Si aspetta che esaurisca il glucosio e si fa un feeding

di glucosio e di ammonio.

Time course: andamento dell’ultimo reattore produttivo. Scaling up: Flow

sheet: descrive tutte le operazioni che si fanno per gestire un processo. Si parte

da coltura liofilizzata con spore -> coltivazione inoculo -> terreno di attivazione

(terreno ricco) -> 2 reattori per coltura vegetativa -> reattore di produzione

con i feeding, programmati con il pc in base agli studi. Upstream: dal

mantenimento del ceppo al reattore di produzione. Downstream: quando si

raggiunge il momento conveniente per l’harvest (raccolta) inizia il recupero del

prodotto, momento in cui c’è il massimo di penicillina prodotta e non viene

degradata, è il momento ideale in base al time course. Quando si decide che la

fermentazione deve essere bloccata, tramite delle valvole si ferma la

fermentazione e si recupera il brodo tramite filtri e si toglie il micelio, viene

raffreddato e si fa un’estrazione con solvente in acido. Chiaramente tutto

questo dipende dal prodotto. Il downstream è una fase molto costosa, si perde

molto prodotto; producendo 100 g/L con un processo di downstream

ottimizzato si raccolgono 80 g/L, normalmente si raccoglie il 50% quindi 50 g/L.

Si lavora molto di più sull’upstream per facilitare il downstream. Si eliminano i

solidi (biomassa) e si può recuperare anche dal micelio se dentro c’è il

prodotto, si fanno cromatografie ad esempio; se bisogna usare il brodo si fa

un’estrazione. Se avanza del materiale organico si può fare un feeding per gli

animali. Il micelio va ucciso per sterilizzazione e poi introdotto nei sistemi di

purificazione delle acque. Il processo di downstream è molto semplice: si

raffredda e si fa estrazione a Ph acido.

Parametri fermentazione:

Temperatura 25-27°C

 Ph6.5

 Areazione 0.5 vvm

 Fonti di carbonio: glucosio, lattosio, melasse

 Fonti di azoto: corn steep liquor, farina di soia, sali di ammonio

 Fonti di zolfo: proteine o sali inorganici

 Fonti di fosfato: Sali inorganici o acido fitico in corn steep liquor

Problemi fermentativi:

Poca ossigenazione

 Molta viscosità

 Instabilità genetica, perché ci sono tanti elementi di trasposizione

 22

La tecnologia dei mutanti che è stata utilizzata è varia, è basata sul concetto di

overlay (si piastrano le colonie mutagenizzate, queste crescono, si versa un

composto di inibizione e si crea un alone, quindi si fa una selezione fenotipica).

Bisogna trovare i mutanti che migliorano la produttività. Si è fatta selezione

degli auxotrofi, si introducono mutazioni genetiche: perché l’auxotrofia è

l’incapacità di crescere in un terreno minimo in assenza di un determinato

aminoacido. Gli auxotrofi si fanno per le vie competitive. Si è fatto così per

convogliare il metabolismo primario nel metabolismo secondario, forma di

deregolazione del metabolismo amminoacidico.

Si possono fare anche dei resistenti agli antimetaboliti, ad esempio la valina

inibisce la sua biosintesi, se voglio avere un alto produttore di penicillina se

trovo un mutante deregolato nella produzione a feedback della valina, questo

mutante sarà libero di produrre l’aminoacido che mi interessa per il mio

prodotto. L’antimetabolita è un composto che assomiglia molto all’aa ma non lo

è, quindi vuol dire che se viene incorporato nelle proteine fa delle proteine

ricombinanti e il microrganismo muore. Se si screena per la resistenza agli

antimetaboliti troviamo dei microrganismi mutanti che non sentono più l’effetto

tossico del metabolita finale e quindi possono continuare a produrre il

metabolita senza sentire l’effetto tossico dell’antimetabolita. Quindi questi

mutanti sono deregolati.

Resistenti ad analoghi del glucosio, fosfato e ammonio. Se trovo un

microrganismo che non sente degli analoghi tossici di questi composti vuol dire

che non sente più il segnale di regolazione dall’esterno. Come sono stati fatti

? Penicillium,

questi screening Si prende il se gli do tanto glucosio inibisce il

Penicillium

metabolismo secondario, se gli do un analogo del glucosio il non lo

può utilizzare. Se il mutante può resistere a questo analogo vuol dire che ha i

suoi modi per utilizzare glucosio senza essere inibito dall’esterno. L’analogo del

fosfato è l’arsenico.

Mutanti resistenti ai precursori come il fenilacetico, si fa il feeding di questo

quando le cellule sono cresciute. Penicillium

Altro modo con cui sono stati migliorati i mutanti di riguarda i

Penicillium

problemi di digestione, perché crea dei brodi molto viscosi che si

fanno fatica a girare e ad ossigenare. Si creano dei mutanti morfologici che

frammentano facilmente, che non formano ife compatte, in questo modo

facilitiamo la riduzione della viscosità del mezzo e facilitiamo l’ossigenazione.

Lo strain improvement classico ha cercato di sistemare tante cose: far

migliorare l’autoproduzione, anche sopperire ad esempio alla necessità di

aggiungere alte concentrazione di fenilacetico oppure per migliorare

caratteristiche di processo. 23

Gli screening sono quasi tutti fenotipici all’inizio, faccio introduzione di

variabilità random con sistemi che causano mutazione e riarrangiamenti del

DNA e screeno i mutanti con le caratteristiche che a me interessano.

BIOSINTESI

Prime idee su come sia avvenuta la biosintesi della penicillina avviene

classicamente con due metodi: ci deve essere un’ipotesi, biochimico deve

capire com’è fatta la molecola e quali sono precursori, si fanno dei composti

marcati; altro metodo è avere dei mutanti bloccati. Si è visto che i 3 precursori

sono la L-cisteina, L-valina e L-alfa-amminoadipico. Questi vengono sintetizzati

sull’ACV sintasi e vanno a formare una catena. Durante questa prima fase della

sintesi la valina veniva epimerizzata (il carbonio chirale passava da forma L a

forma D) dopo si ha la ciclizzazione -> della cisteina S con anello beta

lattamico e ciclizzazione della valina che deve essere in forma D così ha una

disposizione spaziale predisposta alla ciclizzazione. L’alfa-aminoadipico rimane

come residuo R a quello legame. Questo prodotto si chiama ISOPENICILLINA N.

Successivamente si ha la sostituzione dell’alfa-aminoadipico con il fenilacetico.

SINTESI DELLE CEFALOSPORINE

La prima cefalosporina è stata scoperta nel 1953 da un sardo. Nel 1971 sono

Streptomyces.

state isolate le cefalosporine anche da Utilizzate per trattare le

infezioni dei Gram – e cercare di renderle più stabili dal punto di vista della

lipofilia e del pH e per ovviare ai meccanismi di resistenza. Anello beta-

lattamico simile a quello della penicillina, l’anello diidrotiazinico, contiene un S,

ma è a 6 atomi (nella penicillina a 5 atomi) e ci sono due posizioni in cui si

possono introdurre diversi gruppi: R1 che corrisponde alla posizione uguale

sullo scheletro della penicillina G ma anche la posizione R2 perché c’è un CH 2

che permette l’aggiunta di gruppi. La cefalosporina C ha la caratteristica quindi

di avere l’anello a 6 atomi e queste due posizioni per le sostituzioni. Per cui

subito i due gruppi sono stati sostituiti. Tutta la ricerca ha iniziato a produrre

composti in cui nella cefalopsporina C originale: in R1 c’è l’alfa-aminoadipico, in

R2 c’è CH COOH, un gruppo acetil. Per fare il primo prodotto clinico in R1 è

3

stato aggiunto un composto aromatico per renderlo più solubile, mentre R2 è

rimasto invariato. In prodotti successivi si è variato l’R1 e si è eliminato l’R2.

Come si producono? Le fonti facilmente assimilabili di C, N, P, esercitano la

catabolite repression. La biosintesi parte dagli stessi 3 amminoacidi, avviene la

stessa ciclizzazione, si forma la isopenicillina N anche in questo caso, però

mentre nel caso del Penicillium nel quale l’aminoadipico viene sostituito dal

fenilacetico attivato in questo caso viene epimerizzato e viene trasformato in

forma D. In questo modo è reso molto più stabile. Nel cluster della biosintesi

della cefalosporina c’è un gene che è l’epimerasi che compie questa

epimerizzazione e poi c’è un secondo gene che espande l’anello, l’enzima si

24

chiama espandasi che espande l’anello coniugato all’anello beta-lattamico.

Dopo di che avviene un’idrossilazione di questo metile, c’è un’idrossilasi e

questo gruppo viene transacetilato, viene introdotto un gruppo acetile sull’OH.

Questo tipo di modifica ha un impatto molto pesante sulla semi-sintesi degli

analoghi delle cefalosporine. Se nella penicillina G i fenilacetico viene rimosso

con un’acilazione, con un’acilasi classica, il 7-ACA (corrispondente del 6-APA)

viene formato con diversi steps, non è facile togliere il D-aminoadipico.

Si usa una serie di enzimi, non è la stessa cosa di un unico passaggio

enzimatico. Si passa attraverso una D-aminoacido ossidasi, rimuove un gruppo

NH introduce un gruppo chetonico, poi c’è una decarbossilazione che avviene

2

anche naturalmente perché è instabile e dato che si è tolto il carbonio chirale il

gruppo può essere tolto tramite una glutaril-amidasi. Quindi sostanzialmente

per ottenere il 7-ACA non riusciamo ad utilizzare un unico enzima, ma

dobbiamo utilizzare almeno 3 diversi enzimi. Ci sono stati molti studi e molti

brevetti perché è un grosso ostacolo anche di costi.

Clonare l’espandasi nel cluster biosintetico della penicillina (se riusciamo a far

agire l’espandasi sull’isopenicillina N senza che ci sia l’epimerasi si può avere la

cefalosporina con l’L-aminoadipico. Ci sono vari brevetti anche per questo. Tutti

questi metodi sono poco efficienti dal punto di vista pratico, ma sono le 3 vie

grazie alle moderne tecnologie che vengono applicate.

Fino all’isopenicillina N vengono sintetizzate allo stesso modo sia la penicillina

che la cefalosporina. NRPS è stata scoperta con prodotti più complessi, non per

penicilline e cefalosporine.

L’enzima ACV (macchina) rientra nella famiglia delle NRPS, metodi di

assembling metabolico e la penicillina è l’esempio più semplice. Questi grossi

enzimi hanno una struttura modulare ed ogni modulo riconosce il suo aa,

quindi se gli aa sono 3 come nel caso della cefalosporina, la NRPS è fatta da 3

moduli: l’enzima è fatto da 3 domini, 3 regioni, ogni regione riconosce un

determinato aa. Il primo modulo riconosce l’acido aminoadipico, il secondo

riconosce la cisteina e il terzo la valina (in questo ordine). Queste sintasi si

chiamano anche tiotemplati, templato perché questo enzima è fatto in modo

che i 3 aa si attacchino con una determinata sequenza e prendano una certa

conformazione nello spazio che permette il legame e la ciclizzazione.

Tiotemplati perché gli aa vengono legati ad una sorta di scheletro enzimatico

attraverso un legame tioestere. Tra i vari moduli c’è un legame tioestere, c’è un

-SH che è il punto di attacco di ogni singolo aa. I 3 moduli riconoscono il proprio

aa e lo legano. All’interno del modulo il dominio A corrisponde all’attivazione,

ogni modlo attiva il suo aa, e lo lega sul peptidil carrier protein con legame

tioestere, il secondo modulo riconosce tramite il suo dominio di attivazione il

secondo aa e fa così anche il 3. Il tutto avviene tramite attivazione ad opera del

TSH, ognuno dei moduli ha il dominio di attivazione e si lega al peptidil carrier

proteine. Il modulo 2 ha il dominio della condensazione che fa sì che questo aa

25

si condensi con il classico legame ammidico al secondo aa, il modulo 3 ha il suo

dominio di condensazione che lega il 3 aa ai primi due che intanto si liberano,

perché il legame viene spiazzato. Alla fine del terzo modulo c’è sempre un

dominio per la tioesterasi che deve tagliare il legame tioestere sul tiotemplato,

quello che succede è che stacca la tioesterasi, taglia il legame e il prodotto si

stacca nella giusta posizione e viene ciclizzato. Cosa succede nel terzo modulo,

che non c’è nel secondo? C’è il dominio E = epimerasi, in questo avviene

l’epimerizzazione della valina, se non è nella forma D non c’è la ciclizzazione.

Oltre alla formazione del tripeptide grazie ad ACV serve capire come vengono

sintetizzati. Tutti questi antibiotici hanno due cose che la sintesi proteica non

accetta: un D-aminoacido che viene generato durato la ciclizzazione e aa non

proteogenici. Nella sintesi ribosomiale viene tradotto un codice che dà

indicazione su quale aa deve essere inserito dopo l’altro aa. Se la sintesi di 7,

8, 10, 11 aa non avviene attraverso il codice genetico e non avviene attraverso

la sintesi ribosomiale, dove è il codice? Chi decide che dopo un aa va dopo un

altro aa e il peptide che vogliamo fare è così? Ci deve essere comunque un

codice, è l’organizzazione dell’enzima stesso. Il numero dei moduli è

direttamente proporzionale al numero degli aa che vanno inseriti. Il primo

modulo ha il dominio di attivazione, ma non ha il dominio di condensazione. Gli

altri moduli hanno sempre attivazione e condensazione. L’ultimo modulo è

sempre seguito dal dominio della tioesterasi perché deve sempre staccare.

Ma perché i moduli riconoscono gli aa giusti? Il modulo A riconosce il primo aa,

quindi bisogna capire il codice che è diverso da quello che viene tradotto dalla

sintesi ribosomiale. L’altra cosa è che ogni modulo oltre ad avere sempre

attivazione, peptidil carrier protein, condensazione, in alcuni casi può avere dei

domini accessori (come valina che ha dominio accessorio per l’epimerasi).

Il concetto è che noi abbiamo un gene che produce un enzima che è fatto da

moduli diversi, il primo modulo è più piccolo, gli altri sono più grandi e tramite

questi costruiamo peptidi più lunghi.

Cefalosporina abbiamo bisogno di 3 moduli, ciclosporina che è un prodotto

fatto da 11 aa, sul gene corrispondente per la NRPS abbiamo una struttura

ripetuta fatta di moduli, nella quale ad esempio nel modulo 5 abbiamo

l’attivazione, dei peptidil carrier protein (codificano per il più piccolo dominio,

sistema di trasporto della proteina con SH) e modulo di condensazione. La

condensazione è un dominio conservato è quasi sempre uguale tra modulo e

modulo, l’adenilazione (attivazione) sarà leggermente diversa perché ciò che

adenila una valina non è la stessa cosa che adenila la cisteina. Il peptidil carrier

protein è sempre uguale.

Caratteristiche

Dominio A: attivazione o adenilazione, il singolo aa viene attivato con una

molecola di ATP. L’aa viene riconosciuto, attivato, serve anche il Mg, e questi

26

sistema di attivazione determina la sequenza primaria del peptide. L’aa viene

attivato e attaccato al tiotemplato. Dominio di circa 550 aa, dominio

intermedio, con determinate caratteristiche come enzima e come gene che ne

determina la sequenza.

Peptidil carrier protein: è una piccola sequenza proteica di 80-100 aa, il cui

sostanziale ruolo è quello di legare al tiotemplato l’aa attivato. Dove viene

attivato con l’AMP il gruppo carbossilico dell’aa reagisce con SH, esce AMP e si

lega l’aa al tiotemplato. È uguale in tutti i moduli.

Dominio di condensazione: proteine di 450 aa, è il corpo centrale, crea il

legame tra i due aa, si forma il gruppo acido attivato reagisce con gruppo

amminico dell’aa successivo, esce il primo peptidli carrier proteine e la catena

cresce sul tiotemplato.

Tioesterasi: dominio di 250 aa che segna la fine della sintesi del peptide e

stacca, reazione di idrolisi del tioestere, il peptide dal peptidil carrier protein.

NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthesis)

Trovati sia in funghi che in batteri, hanno la caratteristica principale di

sintetizzare aa proteogenici che non proteogenici (L-aa e D-aa) e sono alla base

di strutture anche molto più complesse.

Caratteristiche: antibiotici peptidici sono complessi da vedere, strutture varie,

contengono aa non comuni, spesso contengono degli eterocicli e sono delle

strutture cicliche.

Predizione del codice (1999-2000) si è capito che il sito di adenilazione

riconosce un sito rispetto ad un altro. Il primo aa di cui hanno capito come

interagisce con il dominio di adenilazione è la fenilalanina. Viene riconosciuta

da un dominio particolare, forma una tasca in cui la fenilalanina entra e viene

attivata. Ognuno dei moduli di attivazione riconosce il suo substrato. Nel gene

si trova una determinata sequenza, una determinata struttura del dominio di

attivazione del modulo dell’ACV -> concetto del genome mining.

Le tasche di ogni modulo sono specifiche per uno specifico amminoacido, ciò

grazie alla forma della tasca stessa. La complessità e il numero dei moduli

dipende dal numero di amminoacidi formanti l’antibiotico. Più moduli ci sono,

più amminoacidi costituiranno l’antibiotico; ad esempio la bacitracina

interferisce con la sintesi del peptidoglicano andando a interferire con l’attività

del bactoprenolo. L’NRPS deputato alla sintesi della bacitracina è costituita da

12 moduli. Il primo modulo è privo del domino di condensazione mentre

l’ultimo modulo è dotato di una tioesterasi, al fine di staccare la catena

amminoacidica precursore della bacitracina.

Nel caso dell’NRPS della bacitracina vi è anche un modulo che provoca la

ciclizzazione della cisteina. 27

Tornando ai β-lattamici, come detto in precedenza, vi sono 4 classi:

Penicilline

 Cefalosporine

 Tienamicina

 Acido clavulanico

Per quando riguarda la tienamicina, è stato il primo carbapenem utilizzato in

Streptomyces cattleya.

clinica, è prodotto dallo È attivo contro i Gram + e i

Pseudomonas aeruginosa.

Gram –, incluso

Inizialmente la tienamicina è instabile chimicamente, per questo motivo è stato

pesantemente modificato al fine di migliorarne la stabilità (il primo derivato

interessante fu l’imipenem, tuttavia questo veniva eliminato molto facilmente

dalle peptidasi renali; al fine di ovviare a questo problema, si somministrano in

combinazione con una cilastatina inibente le peptidasi renali. È resistente alle

-β-lammatasi. Ad oggi si producono per via chimica in quanto è più conveniente

rispetto alla via fermentativa. I carbapenem agiscono a livello della

transpeptidasi, inibendo la formazione di legami crociati tra catene

amminoacidiche.

Meccanismi di resistenza verso gli antibiotici

Vi sono diversi modi in cui un microrganismo resiste nei confronti di un

antibiotico:

Inattivazione del farmaco (ad esempio l’enzima beta lattamasi, codificata

 dall’omonimo gene posto su plasmidi o elementi genetici mobili. Esistono

più classi di beta lattamasi; ogni classe è attiva nei confronti di uno

specifico antibiotico betalattamico).

Modifica del target molecolare (ottenibili mediante mutazioni dei geni

 riguardanti le penicillium binding protein PBP nel cromosoma batterico).

Pompe di efflusso nei Gram -.

 Modifiche della permeabilità nei Gram -.

 Streptomyces clavuligerus,

L’acido clavulanico è prodotto dallo il quale produce

anche la cefamicina.

Nonostante l’ampio spettro di azione e la povera attività antibiotica, è molto

utilizzato in combinazione con altri antibiotici in quanto l’acido clavulanico

inibisce l’azione delle beta lattamasi legandosi covalentemente e

irreversibilmente ad esse. In questo modo permette di evitare l’inattivazione

dell’antibiotico utilizzato in combinazione con l’acido clavulanico. Nella forma

più comune, il sale di potassio dell’acido clavulanico è utilizzato in

combinazione con l’amoxicillina.

La forma salina è molto importante in quanto l’acido clavulanico in forma acida

in liquido è innocuo ma in forma solida (polvere) è esplosivo. 28

Questa tattica è utilizzata anche in natura dai microrganismi produttori di

cefalosporine (ciò si è scoperto dopo aver scoperto la possibilità di utilizzare

l’acido clavulanico in combinazione con un secondo antibiotico). L’acido

clavulanico è una molecola piccola originata mediante condensazione

dell’arginina con la gliceraldeide 3 fosfato (tutte molecole originatesi dal

metabolismo primario).

La condensazione NON è svolta da un NRPS; in questo caso non vi è nessun

NRPS implicato nella sintesi di acido clavulanico.

Nel cluster di produzione dell’acido clavulanico vi sono early genes e late

genes, finemente co-regolati tra loro al fine di evitare sprechi energetici per la

sintesi dell’amminoacido arginina.

Gli antibiotici peptidici

Possono essere classificati in base alla loro struttura:

Lineari

 Ciclici

 Semplici

 Complessi

 Con legame desipeptidici

 Glicopeptidici e lipoglicopeptidici

Ciclosporina: peptide ciclico composto da 11 amminoacidi, utilizzato in clinica

come immunosoppressore

Vancomicina: glicopeptide composta da 7 amminoacidi (5 aromatici e 2 non

aromatici), presenta decorazioni di zuccheri (un disaccaride) e atomi di cloro.

Per la sintesi di vancomicina e altri glicopeptidi sono necessarie alogenasi; i

geni per questi enzimi sono quindi delle importanti indicazioni per

l’individuazione di metaboliti secondari glicopeptidici

I glicopeptidi => attivi solo sui Gram +, in quanto il loro target è esterno alla

cellula e perché sono molecole ingombranti, ciò rende impossibile il passaggio

attraverso le membrane; agiscono a livello della sintesi di peptidoglicano. Essi

agiscono legando il dimero D-ala D-ala della catena pentaglicanica del dimero

glicanico formante il peptidoglicano, impedendo così il cross link tra catene

amminoacidiche di altri dimeri. In pratica agiscono andando a sequestrare il

substrato delle transpeptidasi. I glicopeptidi si legano al dimero mediante la

formazione di 5 legami idrogeno.

Il primo glicopeptide studiato e isolato fu la vancomicina, prodotto dal

Amycolatopsis orientalis,

microrganismo un attinomicete raro. Inizialmente fu

isolata solo come attività, molto simile alle cefalosporine. In principio però non

fu utilizzata in quanto presentava degli effetti collaterali. Solo quando sono

29

spuntati i microrganismi resistenti ai beta lattamici, la vancomicina fu

rivalutata; questo farmaco è utilizzato nei casi gravi di resistenze ospedaliere

nei confronti di gram+ (last resort) come ad esempio alcuni ceppi di

Staphylococcus aureus multiresistenti.

La teicoplanina è costituita da 7 amminoacidi aromatici e 3 zuccheri. Possiede

anche una catena lipidica; la teicoplanina è quindi un lipoglicopeptide. La

teicoplanina è stata scoperta in Italia dal gruppo di ricerca Lepetit intorno agli

Actinoplanes theicomyceticus.

anni 80, venne isolata dall’attinomicete La

teicoplanina venne isolata utilizzando un metodo per isolare le spore mobili di

Actinoplanes theicomyceticus, mediante l’utilizzo di sostanze attrattive. Inoltre

utilizzarono un sistema di screening basato sul meccanismo di azione della

molecola da ricercare (in questo caso altri glicopeptidi oltre alla vancomicina,

già fin troppo utilizzata). I ricercatori hanno utilizzato una resina funzionalizzata

con dimeri D-ala D-ala per ottenere il legame della teicoplanina. Il brodo veniva

saggiato per la sua attività antibiotica sia prima che dopo il passaggio nella

resina funzionalizzata. Se il prodotto antibiotico è un glicopeptide, l’attività

microbiologica sparisce in seguito al passaggio nella resina. Se il prodotto non

è un glicopeptide, l’attività microbiologica permane anche dopo il passaggio in

resina e quindi l’attività microbiologica è data da altro.

La teicoplanina e la vancomicina hanno lo stesso meccanismo di azione,

comune a quello degli altri glicopeptidi tuttavia, nel caso della teicoplanina, la

catena lipidica stabilizza il legame con il dimero in quanto questa si inserisce

nella membrana cellulare.

Fin dal primo momento dall’utilizzo di questi glicopeptidi, si è cercato di non

ripetere l’errore fatto con i beta lattamici, ovvero di sovrautilizzarli causando la

proliferazione di fenomeni di resistenza.

Tuttavia, nel 2002 si è isolato il primo microrganismo resistente ai glicopeptidi.

S. aureus

Fu uno reso resistente in seguito al trasferimento orizzontale

Enterococcus fecalis.

avvenuto nel paziente dei geni Van da Il paziente era già

immunocompromesso, quindi è morto. Il fenomeno di insorgenza di questi

ceppi multirestistenti è veramente molto bassa.

La resistenza dei patogeni nei confronti dei glicopeptidi è data dalla

sostituzione della D-alanina del pentapeptide con una D-lattato o dalla D-

serina.

I microrganismi resistenti acquisiscono ben 5 geni; questi geni sono denominati

VAN genes, essi sono indotti dalla presenza di glicopeptidi e causano la

modificazione della parete citata in precedenza. I geni principali sono VAN H

(codificante per una lattato deidrogenasi) VAN A (attacca il D-lattato alla D-

alanina,) e VAN X (causa il clivaggio di tutto il D-ala D-ala presente). 30

Questo è un sistema che modifica il pentapeptide e nello stesso momento

causa la distruzione di tutto il D-ala D-ala già presente.

Questo sistema è stato inizialmente scoperto negli enterococchi resistenti a

questi tipi di antibiotici (E.fecalis). Questo pacchetto genico è presente su

trasposoni e può essere trasferito a gram + pericolosi, come ad esempio

S.aureus.

Ad oggi si sta cercando ulteriori prodotti al fine di riuscire a risolvere il

problema dei patogeni Gram positivi multiresistenti. Ad oggi si sta cercando

anche di capire da dove provengono i geni di resistenza VAN. Vi è l’ipotesi che

derivino dai geni produttori. La resistenza ai glicopeptidi si è espansa molto dal

momento in cui un glicopeptide è stato utilizzato come additivo nei mangimi

animali. Negli anni passati un glicopeptide è stato utilizzato come additivo; ciò

ha facilitato la diffusione di meccanismi di resistenza. Dal punto di vista

biosintetico, i glicopeptidi sono prodotti dal Non Ribosomal Peptide Synthesis.

La struttura comune è formata da un core eptapeptidico contenente

amminoacidi aromatici.

La teicoplanina è prodotta dall’Actinoplanes theicomyceticus, appartenente alla

famiglia delle micromonosporaceae. È un lipoglicopeptide. È costituito da un

core di sette aminoacidi aromatici, alcuni non proteinogenici in quanto

clorurati. Questi amminoacidi provengono dal metabolismo primario e in

seguito sono modificati. Inizialmente si forma una catena di sette aminoacidi

uniti tra loro da legami amidici. In seguito si ha un legame etere e tre legami

estere tra anelli aromatici. Questo causa il blocco nello spazio dei suddetti

anelli aromatici e forma la tasca di reazione dell’antibiotico. Questo scaffold si

chiama aglicone. In seguito sul suddetto scaffold si innesteranno 3 zuccheri.

Su uno zucchero si legherà una catena lipidica.

La sintesi della teicoplanina è notevolmente complessa, anche dal punto di

vista metabolico; la produzione del suddetto metabolita secondario è quindi

finemente regolata.

L’aglicone è sintetizzabile anche per via chimica ma è un processo

decisamente lungo e complesso; questo processo è quindi impossibile da

utilizzare in ambito industriale per la produzione di ingenti quantità di aglicone.

Ciò perché la teicoplanina ha diversi centri chirali, i quali sono difficilmente

ottenibili mediate tecniche di sintesi di chimica organica. Il cluster deputato alla

produzione di teicoplanina prende il nome di tei cluster. Esso contiene i geni

per la NRPS, per la regolazione (tei15 e 16), per l’auroresistenza (simili ai geni

VAN per azione svolta) e per il trasporto del glicopeptide teicoplanina. Le ORFs

delle p450 ossigenasi codificano per enzimi che formano i legami tra anelli

aromatici. Le ORFs delle alogenasi codificano per enzimi che legano gli atomi di

cloro. L’attribuzione della funzione di molte ORFs è stata assegnata mediante

l’utilizzo di tecniche di bioinformatica. Il cluster quindi contiene tutti i geni per

la produzione, per l’autoresistenza e la regolazione del prodotto. 31


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elaisa9

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Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie molecolari e industriali
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie farmaceutiche e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Marinelli Flavia.

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