Biotecnologie avanzate in medicina

Biotecnologie avanzate: parte luconitecniche di studio delle proteine

La cellula è il costituente base del tessuto, organo, organismo; le metodiche di biologia molecolare permettono di fare analisi a vari livelli:

• DNA
• mRNA e miRNA → i miRNA possono regolare la trascrizione genica interagendo con sequenze di mRNA e alterandone la sintesi.
• Proteine → possono essere distinte in strutturali, enzimatiche e regolatrici e queste ultime sono le più studiate perché si può intervenire sulle proteine regolatrici per regolare altri processi; la regolazione proteica può avvenire a livello di:
  • Espressione → una proteina può essere più o meno espressa a livello cellulare.
  • Modificazioni post-traduzionali → alla proteina sono legate delle molecole che ne consentono la regolazione; tra le modificazioni post-traduzionali più rapide ci sono le fosforilazioni e defosforilazioni. Questi eventi in definitiva non alterano il contenuto ma permettono una regolazione molto rapida della proteina, diversamente dalla regolazione dell’espressione che sono invece più lente.
  • Attività enzimatica
  • Localizzazione → è possibile modificare l’attività di una proteina modificando la sua localizzazione a livello cellulare; infatti ci sono delle proteine che sono dei punti di ancoraggio per proteine enzimatiche e che ne permettono la collocazione nei vari compartimenti cellulari.

In definitiva le tecniche di biologia molecolare usate per lo studio delle proteine permettono di definire:

• Quantificazione dei livelli di espressione
• Modificazioni post-traduzionali
• Dosaggio dell’attività enzimatiche → in base alla formazione di prodotto o alla perdita di substrato.
• Interazioni enzimatiche → capacità delle proteine di interagire tra di loro
• Localizzazione intracellulare e intratissutale

Principali tecniche di biologia molecolare per lo studio delle proteine

• Immunocito/istochimica con microscopia ottica in fluorescenza che permette sia di quantificare che localizzare le proteine mediante lo sfruttamento dell’interazione antigene-anticorpo.
• Autoradiografia: prevede la localizzazione e riconoscimento di una proteina attraverso un probe specifico, che in passato era radiomarcato e che ora è stato sostituito da una molecola fluorescente, la cui emissione viene rivelata su una lastra.
• Laser capture microdissection → è un microscopio con un braccio mobile che permette di analizzare il prodotto in fettine o in singole cellule e consente di micromanipolare il preparato ritagliando la regione di interesse; ad esempio, in presenza di un tessuto tumorale ci sono sia cellule tumorali che normali quindi il risultato di un’analisi in termini di espressione di una determinata proteina può essere alterato → con questa tecnica è possibile ritagliare la regione di interesse e separarla in modo da fare analisi più specifiche che in genere prevedono l’analisi degli acidi nucleici più che proteica perché si tratta di regioni molto piccole. Un’altra applicazione prevede di mettere in coltura le cellule ricavate con questa metodica.
• Analisi citofluorimetrica FACScan → è un’analisi che prevede una complessa preparazione del tessuto e l’utilizzo di anticorpi attraverso i quali è possibile analizzare e selezionare le cellule portanti il marcatore di interesse analizzando contemporaneamente più eventi, cosa non possibile con tecniche immunocitochimiche ed immunoistochimiche che al contrario di queste permettono però di localizzare le cellule di interesse.
• Analisi proteomica → studia nel complesso l’espressione proteica e prevede diverse metodiche:
  • Gel elettroforesi mono e bidimensionale → la prima tecnica permette la separazione delle proteine sulla base del loro peso molecolare mentre la seconda prevede anche la discriminazione sulla base del punto isoelettrico, ovvero il valore di pH a cui la carica netta della proteina è 0.
  • Western blot → permette, dopo la separazione su gel, di trasferire le proteine su una membrana ed, usando anticorpi specifici, di cercare la proteina di interesse.
  • Protein differential display o DIGE → permette di comparare l’espressione proteica di campioni diversi in contemporanea su gel o matrice.
  • Protein microarrays → permette di comparare l’espressione proteica di campioni diversi in contemporanea in sospensione.
  • Analisi in ImmunoPCR → coniuga le proprietà dell’ELISA, ovvero il riconoscimento anticorpo-antigene, con le metodiche di PCR.
  • Spettrometria di massa
  • Profiling e imaging
• Interazione di proteine → attraverso metodiche di:
  • Co-immunoprecipitazione → prevede l’utilizzo di anticorpi
  • Microscopia confocale → prevede l’analisi dell’interazione sul preparato
  • Two yeast hybrid system
  • Fluorescence resonance energy transfer

A seconda dell’analisi che è necessario condurre viene selezionata una metodica piuttosto che un’altra.

Immunocito/immunoistochimica

Queste metodiche permettono di quantificare e localizzare le proteine di interesse e necessitano la conoscenza a priori del target perché prevedono l’uso di anticorpi specifici per il target e si realizzano attraverso una serie di step:

• Coltura del tessuto o delle cellule su vetrino; se si parte da un tessuto questo deve essere sottoposto all’attività di un criotomo o criotomocongelatore se si tratta di un tessuto a fresco; il tessuto può essere congelato e poi tagliato oppure può essere incluso in paraffina per poi essere tagliato → queste due metodiche poi prevedono l’uso di anticorpi diversi in grado di lavorare su tessuto incluso in paraffina o congelato.
• Fissazione in paraformaldeide o alcol
• Bloccaggio dei siti aspecifici per evitare cross reattività soprattutto dell’anticorpo secondario → in genere si usa un siero non immune prodotto nella stessa specie dell’Ab. Il bloccaggio viene effettuato anche in altre metodiche come il western blot.
• Incubazione con Ab primario
• Incubazione con Ab secondario coniugato che si lega all’anticorpo primario ed è connesso ad un sistema di rivelazione → fosfatasi acida, perossidassi, avidina-biotina, FITC. Questo permette di amplificare il segnale perché gli anticorpi secondari riconoscono più siti di quello primario.
• Rivelazione del segnale → mediante l’incubazione con un substrato enzimatico (colorimetrico) o con un altro metodo di rilevazione (fluorescenza).

Queste tecniche possono essere distinte in:

• Dirette se prevedono l’uso di un solo anticorpo che consente la rilevazione. Il sistema diretto prevede la presenza di un anticorpo marcato per ogni target e questo è costoso; d’altra parte non presenta molte interferenze perché queste sono date prevalentemente dall’anticorpo secondario che può così determinare l’emissione del sistema di rilevazione in una regione in cui i target non è presente → maggiore specificità. Un'altra caratteristica è che in questa reazione non si ha amplificazione del segnale perché l’anticorpo interagisce con i target con un rapporto 1:1 → questo è piuttosto limitante se la concentrazione della proteina è bassa e per questo motivo è preferibile in questi casi usare il sistema indiretto → maggiore sensibilità.
• Indiretto se prevede l’uso di un anticorpo primario e secondario che deve essere della stessa specie del primo; questo permette di avere un maggiore risparmio.

Autoradiografia

L’autoradiografia è una tecnica che consente di rilevare la localizzazione e acquisire informazioni quantitative relative a una molecola marcata con un isotopo radioattivo, in passato, sostanza fluorescente → è basata sull’interazione ligando-recettore che ha una maggiore specificità rispetto a quella antigene-anticorpo. L’uso di fluorocromi invece che molecole radioattive, oltre ad essere un processo meno dannoso, permette di avere una sensibilità maggiore.

Gli usi attuali sono:

• Mappatura della localizzazione anatomica di ligandi marcati per visualizzare e quantificare i recettori di un tessuto.
• Valutazione del trasporto assonale nei neuroni di ammino-acidi, zuccheri, neurotrasmettitori.
• Misurazione della produzione del DNA (es. incorporazione di timina nel nucleo).

L’autoradiografia può essere fatta:

• In vitro → sezioni di tessuto montate su un vetrino vengono incubate con il ligante marcato, esposte a un film o una emulsione.
• In vivo → i recettori sono marcati nell’animale dopo somministrazione sistemica del legante marcato (PET/TAC). Spesso questo approccio viene utilizzato per lo studio dello sviluppo del tumore in piccoli animali → il topo può essere trapiantato con cellule tumorali marcati o può essere indotto il tumore nel topo e le cellule marcate successivamente; in questo modo si può studiare la dinamica di crescita di un tumore, oppure si può utilizzare il glucosio marcato in considerazione del fatto che le cellule tumorali utilizzano elevate concentrazioni di questa molecola → si valuta l’emissione del glucosio marcato in corrispondenza del tumore; in genere vengono anche marcati il cuore ed il cervello che usano elevate concentrazioni di questa molecola.

Analisi proteomica

L’analisi proteomica permette di studiare il proteoma ovvero l’espressione complessiva delle proteine corrispondente al genoma attivo in una cellula, tessuto, organismo relativo ad una particolare condizione metabolica. In questo tipo di indagine non è necessario disporre dell’anticorpo per identificare la proteina perché viene studiata in toto l’espressione.

Le proteine possiedono quattro livelli strutturali:

• Struttura primaria: è la sequenza di amminoacidi che compongono la proteina.
• Struttura secondaria: è l’organizzazione degli amminoacidi in domini.
• Struttura terziaria: è l’associazione tra i vari domini.
• Struttura quaternaria: aggregazione in diversi monomeri.

Tutti questi livelli possono essere studiati mediante queste metodiche ed oltre alla struttura nativa è anche possibile studiare la struttura denaturata → le interazioni che organizzano la proteina nella struttura spaziale vengono distrutte.

La realizzazione di un’analisi proteomica prevede:

• Preparazione del campione: è necessario utilizzare:
  • Detergenti (NP-40, Triton X)
  • Agenti denaturanti (SDS)
  • Fissativi (glutaraldeide, paraformaldeide)
  • Riducenti (DTT, mercaptoetanolo)
• Dosaggio proteico: è importante soprattutto nel caso in cui si vogliano comparare campioni diversi o situazioni diverse → è fondamentale caricare sul gel la stessa quantità della proteina altrimenti i risultati sono sfalsati; inoltre anche se non si fanno comparazioni questo step è necessario.

Ci sono diverse metodiche attraverso le quali è possibile realizzare il dosaggio; in genere si fa uso di un colorante valutabile in spettrometria o fluorimetria e si costruisce una curva standard con concentrazioni note di standard proteici; dalla curva si estrapola la concentrazione ignota del campione.

I principali metodi utilizzati sono:

• Assorbimento ultravioletti → i residui aromatici delle proteine (Tyr, Phe, Trp) assorbono a 280 nm ma non a 260 nm; è un metodo molto sensibile (microgrammi/ml) ma il limite è legato al fatto che non tutte le proteine presentano residui aromatici.
• Metodo Lowry → reattivo di Folin e Cocalteau (Na e acidi tungstico, molibdico e fosforico) che reagisce con fenoli e tirosine che in presenza di ioni rameici riducono il reattivo dando color porpora. L’assorbimento viene valutato a 660 nm ed è molto sensibile (microgrammi/ml).
• Metodo del Biureto: soluzione alcalina di CuSO4 con tartrato di Na e K; si forma un complesso di coordinazione con 4 NH di 4 legami peptidici. L’assorbimento viene valutato a 540 nm. Questa tecnica si basa sul legame peptidico ed è quindi molto efficace ma poco sensibile (1mg/ml).
• Metodo Comassie → si lega aminoacidi basici; l’assorbimento è a 595 nm ed è molto sensibile (microgrammi/ml) → è una tecnica molto usata perché poco costosa e molto sensibile ma che può portare a errori; se ad esempio nella proteina si trovano solo amminoacidi acidi, la concentrazione che viene detectata è pari a 0 anche se la proteina è presente nel campione.

Separazione delle proteine mediante gel elettroforesi e fissazione su matrice. Il gel viene preparato utilizzando l’acrilammide, una sostanza che gelificando crea un sistema di reti che formano un setaccio molecolare → le dimensioni dei pori sono proporzionali al contenuto di acrilammide che dipende quindi dall’esperimento; se ad esempio si vogliono separare proteine con basso peso molecolare, i pori devono essere minori ed il contenuto di acrilammide maggiore → il gel viene quindi ottimizzato sulla base delle proteine di interesse se questa è nota. Grazie all’uso di un pettine, il gel presenta una serie di pozzetti in cui possono essere messi più campioni.

Nel gel, oltre al running gel, dove si realizza la corsa elettroforetica, esiste una regione, con acrilammide più lassa, che permette alle proteine di separarsi in maniera grossolana, sulla base del peso molecolare in modo che, quando le proteine relative al campione giungono nel running gel, sono già state distinte a grandi linee sulla base del peso molecolare → maggiore risoluzione.

Per separare le proteine, ai capi dei gel viene applicata una differenza di potenziale mediante due elettrodi; le proteine, poiché cariche diversamente, vengono trattate con SDS per caricare tutte le proteine negativamente e quindi consentirne la migrazione verso il polo positivo. In questo modo le proteine sono separate solo sulla base del peso molecolare → il peso molecolare è inversamente proporzionale alla migrazione.

Per definire il peso molecolare, è necessario usare uno standard noto di peso molecolare che corre insieme alle proteine del campione. Per visualizzare le proteine si utilizzano colorazioni come Comassie blue brilliant (microgrammi), colorazione argentica (nanogrammi) o in fluorescenza (picogrammi).

Caratterizzazione della proteine mediante:

• Spettrometria di massa → lo spot di interesse viene ritagliato da gel, digerito in peptidi e la proteina viene caratterizzata mediante MS e MS/MS.
  • MALDI-TOF-MS: massa peptidi
  • ESI-MS/MS: sequenza aa peptidi
• Analisi Western blot → prevede l’uso di anticorpi che identifica lo specifico target; le proteine vengono trasferite, mediante una differenza di potenziale, dal gel su una membrana di nitrocellulosa o nylon. Le proteine sono incubate con una membrana e si effettua un’incubazione con bloccante, Ab primario, si fanno poi dei lavaggi, incubazione con Ab secondario marcato, lavaggi e rivelazione, soprattutto in chemioluminescenza → l’emissione in chemioluminescenza è proporzionale alla quantità di target. Questo è un sistema qualitativo e quantitativo ma non permette di localizzare la proteina; tuttavia, sulla base della preparazione del campione e della regione isolata, è possibile acquisire anche questa nozione.

Identificazione e analisi mediante bioinformatica: comparazione con database su internet e modelli in silico; queste tecniche sono necessarie nel caso della spettrometria di massa perché la proteina deve essere identificata.

Elettroforesi bidimensionale

L’elettroforesi è una efficace metodica di separazione delle proteine basata su due caratteristiche della proteina:

• Focalizzazione isoelettrica → rappresenta la prima dimensione di separazione; c’è una striscia di gel in cui sono state fatte polimerizzare delle proteine (immobiline) a pH noto in modo da creare un gradiente di pH. In questo modo le proteine migrano sul gel sulla base della loro carica fermandosi una volta raggiunto il punto isoelettrico ovvero il valore di pH a livello del quale la proteina ha carica netta uguale a 0. In questo modo le proteine possono essere separate in bande la cui posizione corrisponde al pH in quella regione.
• Peso molecolare → rappresenta la seconda dimensione; la striscia di gel in cui sono localizzate le proteine precedentemente separate è caricata sul gel di poliacrilammide → per consentire la migrazione, poiché le proteine hanno carica 0, la striscia viene incubata con SDS in modo da fornire alle proteine la carica negativa. Questa metodica permette anche di evidenziare modificazioni post-traduzionali come la fosforilazione, glicosilazione, metilazione che modificano prevalentemente punto isoelettrico. Anche in questo caso è necessario usare uno standard noto e una colorazione del gel (comassie blue-brilliant, colorazione argentica, fluorescenza, isotopi radioattivi).

Il risultato di una elettroforesi bidimensionale non prevede, come la monodimensionale, la presenza di spot ma ci sono delle bande → permette una risoluzione maggiore.