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Il ruolo degli antigeni nel trapianto, nelle allergie, negli autoanticorpi e nei tumori
La coltura viene mantenuta per 5-6 giorni senza l'aggiunta di fattore di crescita in modo che dal pool eterogeneo dei linfociti T, solo quelli che riconoscono l'antigene proliferano; l'aggiunta dopo 6-8 giorni di IL-2 permette quindi l'espansione dei linfociti T specifici generando una linea cellulare T specifica.
La valutazione in vitro della risposta ad un antigene ha due obiettivi:
- Valutazione della presenza di linfociti antigene-specifici attraverso la proliferazione all'antigene.
- Espansione delle cellule antigene-specifiche per poi poterne studiare le caratteristiche e indurre linee cellulari specifiche.
Per condurre questa metodica si parte da una popolazione di cellule mononucleate in cui sono contenuti sia i linfociti T che le APC; la proliferazione viene fatta in una piastra da 96 pozzetti in cui si pongono 100.000 cellule/pozzetto.
100μl in terreno + siero autologo 5%.→il siero aggiuntoè AUTOLOGO perché il sistema deve consentire l’analisi di una risposta di un pool di cellule ridottoe se si aggiungesse siero animale, poiché questo determina una risposta antigenica, la rispostaspecifica sarebbe mascherata.Inoltre è necessario avere un CONTROLLO NEGATIVO, ovvero le cellule poste nel solo TERRENO,senza lo stimolo ed un CONTROLLO POSITIVO, ovvero le cellule poste ad uno stimolo MASSIMALEe POLICLONALE(PHA 1%). Negli altri pozzetti è aggiunto l’ALLERGENE e generalmente questo vieneposto a CONCENTRAZIONI SCALARI; per fare le diluizioni in genere si parte dalla soluzione piùconcentrate e si fanno delle diluizioni da questa.Il volume finale del pozzetto è 200 MICROLITRI di cui 100 sono rappresentati dal VOLUME con leCELLULE e 100 dal VOLUME con gli STIMOLI→lo stimolo viene diluito 1:2 quindi nel preparare ilterreno bisogna tener conto di questa.Una volta preparata la piastra di proliferazione, le cellule vengono incubate per tempi diversi a seconda dello stimolo; solitamente per una risposta antigene-specifica sono richiesti 5 giorni.
La proliferazione viene valutata mediante l'aggiunta, dopo 5 giorni, di TIMIDINA TRIZIATA (50microlitri/pozzetto), una timidina in cui l'H è sostituito con il TRIZIO quindi le cellule che si dividono incorporano TIMIDINA TRIZIATA a livello del DNA e valutando l'emissione del trizio si può determinare la presenza di cellule PROLIFERANTI che hanno risposto allo stimolo. Il trattamento con timidina viene fatto per circa 12-16 ore che corrispondono al tempo in cui avviene il ciclo cellulare linfocitario; se la cellula va incontro ad un nuovo ciclo cellulare incorpora concentrazioni maggiori di timidina triziata e quindi il dosaggio viene
SOVRASTIMATO. È importante rispettare i tempi di incubazione. Il DNA delle cellule viene trasferito da un HARVESTER dai pozzetti a un FILTRO; la macchina è dotata di un SISTEMA di LAVAGGIO con ACQUA che consente di SCOPPIARE le cellule in modo da poter trasferire solo il DNA sul filtro. Il filtro viene trasferito in una busta che contiene liquido di SCINTILLAZIONE che permette di mettere maggiormente in evidenza le emissioni beta della timidina, messo in un supporto e letto da un BETA COUNTER che quindi va a valutare le emissioni beta del trizio fornendo le CONTE/MINUTO. Quindi nei vari pozzetti si osservano diverse situazioni: - CONTROLLO NEGATIVO → c'è solo il MEDIUM e quindi l'emissione di timidina è bassa e relativa al livello base di proliferazione dei linfociti T. - CONTROLLO POSITIVO → l'emissione è MASSIMA. - ANTIGENE a concentrazioni SCALARI → emissione PROPORZIONALE alla concentrazione dell'allergene. Per ogni condizione.sperimentale si fanno almeno DUE POZZETTI per avere una ripetibilità del dato da un punto di vista statistico e per essere sicuri del risultato che si OTTIENE. Un parametro importante che viene valutato è l’INDICE di STIMOLAZIONE che è la valutazione della conta al minuto nella coltura stimolata/ conta al minuto coltura NON stimolata. →viene confrontato con un VALORE SOGLIA stabilito a seconda dell’esperimento e se è MAGGIORE, sta ad indicare che si ha una proliferazione. Sulla base di questo parametro e della DOSE dell’antigene, possibile costruire una curva DOSERISPOSTA. Induzione di linee cellulari specifiche. 6 Anche in questo caso si può partire da cellule MONONUCLEATE (1x10 cellule/pozzetto) a cui si aggiunge l’ANTIGENE e dopo 6 giorni di coltura si elimina 1 ml di terreno e si aggiunge l’IL-2(50U/ml) per facilitare la proliferazione dei linfociti T attivati. →i linfociti passano da una forma rotondeggiante ad unapiù allungata
Dopo circa 8 giorni, le cellule T ottenute vengono RECUPERATE e possono essere sottoposte a:
- VERIFICA della SPECIFICITA’ della LINEA → BLASTI T e MNC AUTOLOGHE IRRADIATE + MEDIUM vs BLASTI T + MNC AUTOLOGHE IRRADIATE + ANTIGENE; le cellule sono IRRADIATE per impedire e bloccare la proliferazione cellulare dei linfociti T presenti nelle cellule mononuclate ma non limita l’attività delle APC.
- Dopo tre giorni viene addizionata la TIMIDINA TRIZIATA e dopo 12-16 si fanno le opportune valutazioni.
- Per evitare di usare MNC AUTOLOGHE IRRADIATE si possono anche PURIFICARE le APC dalle MNC del paziente.
ANALISI della caratteristiche
- FENOTIPICHE → i principali fenotipi dei linfociti T sono rappresentati dai Th1, Th2, Th17 ed è possibile studiare i MARCATORI DI MEMBRANA, I FATTORI DI TRASCRIZIONE attraverso metodiche di BIOLOGIA MOLECOLARE, ANALISI DI WESTERN BLOT O CITOFLUORIMETRIA
- FUNZIONALI → stimolazione di 2-6 ore e valutazione delle
CELLULE ASPECIFICHE→PBMC o LINFOCITI separati per FENOTPO
CELLULE SPECIFICHE→BLASTI T specifici per ANTIGENI
In entrambi i casi le cellule sono poi trattate con MITOGENO ed IL-2 e cellule FEEDERALLOGENICHE IRRADIATE; queste sono cellule scarsamente VITALI e NON PROLIFERANTI che derivano da un POOL di cellule mononucleate di donatori diversi e che facilitano l'attivazione e la proliferazione cellulare.
Questi elementi sono assolutamente necessarie nelle fasi INIZIALI della CLONAZIONE e svolgono la funzione di RIEMPIMENTO del POZZETTO.
La tecnica
Per fare delle diluzioni limite si parte CONTANDO le CELLULE e portando le cellule ad una concentrazione di 5x105/ml; queste vengono ricontate più volte e da persone diverse→si fa una diluizione di 1:10 portando le cellule a 5x104/ml.→si conta ancora; in genere si contano tutti i quadrati e si divide per 9 e si moltiplica per 10. →è l’ULTIMA conta e quindi la più IMPORTANTE.
OTTENUTI→si possono discriminare i pozzetti con ilclone rispetto a quelle in cui è localizzato solo il feeder.
5.Espianto dei cloni ottenuti e loro espansione→duplicazione settimanale del clone con medium6fresco + cellule feeder 1 x 10 /ml in micro piastre; dopo 3-4 settimane l’espansione viene fatta in6piastra a 24 pozzetti a fondo piatto con PHA 0.1%, rIL-2 50 U/ml e cellule Feeder 1x10 /ml in 2 mlvolume finale per 5-7 giorni.
7 8Infine si ha espansione con sola rIL-2 50 U/ml con o senza cellule feeder fino a raggiungere 10 -10CELLULE.
I cloni generati possono essere sottoposti ad ANALISI FENOTIPICA mediante CITOFLUORIMETRIAper antigeni di superficie e produzione di citochine o ANALISI FUNZIONALE.
6.Analisi e/o congelamento-CONGELAMENTOCELLULE DENDRITICHEPer sviluppare una risposta antigene-specifica non è sufficiente la presenza dei linfociti T edell’antigene ma è necessario avere anche le cellule presentanti l’ANTIGENE che
sonorappresentate dai MONOCITI/MACROFAGI, CELLULE DENDRITICHE, LINFOCITI B e CELLULE di LANGHERANS. Gli antigeni entrano in contatto con al cellula DENDRITICA stimolando recettori di membrana che aloro volta comportano la produzione di CITOCHINE e MOLECOLE di CO-STIMOLO; l'antigene può però anche essere CATTURATO e PROCESSATO e presentato sulle MHC ai linfociti T che presentano il TCR specifico. →le interazioni fondamentali in questo processo sono quelle tra CD-40 e CD40L e quella tra CD80/86 e CD28; queste permettono di realizzare la SINAPSI IMMUNOLOGICA che garantisce l'associazione tra questi due elementi. Le cellule dendritiche possono essere distinte in DUE LINEE differenti per le molecole che ESPRIMONO e per le FUNZIONI svolte → MIELOIDE o DC1 e LINFOIDE o DC2. Le cellule derivano da un PRECURSORE COMUNE HPC CD34+ localizzato nel midollo osseo, sangue di cordone ombelicale e periferico e che si differenzia nella linea MIELOIDE e LINFOIDE; la linea mieloide.genera MONOCITI(CD14+) e localizzati nel sangue periferico mentre quella LINFOIDE genera la cellula PLASMOCITOIDE(CD123+BCDA2+CD4+) e localizzata nel sangue periferico, timo, tonsille, linfonodi. Infine sempre dallo stesso elemento si genera HPC CD34+ localizzate nel midollo osseo, sangue di cordone ombelicale e periferico. In vitro le cellule dendritiche possono essere ottenute dai MONOCITI e dalla CELLULA PLASMOCITOIDE che generano elementi IMMATURI che vengono indotti in vitro a MATURARE; dal precursore CD34+ si possono ottenere le DC1 e 2 immature ma anche le cellule di LANGHERANS, passando attraverso un precursore INTERMEDIO che esprime bassi livelli di CD34 e CLA+. Metodiche per la generazione di DC1 in vitro secondo protocolli approvati per applicazioni cliniche. Le cellule DC1 sono le più semplici da ottenere e quindi le più USATE; possono essere generate a partire da: - CELLULE MONONUCLEATE di SANGUE PERIFERICO tramite selezione delle cellule aderenti → imonociti aderi
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