Biotecnologie cellulari - Appunti

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Introduzione alle Biotecnologie Cellulari

Per Biotecnologie si intende ogni tecnologia che utilizza cellule di

organismi viventi ( procarioti, eucarioti vegetali e animali ) o loro

componenti subcellulari per ottenere quantità commerciali di prodotti

utili come proteina, DNA, componente cellulare speci ca x scopi di

ricerca.

Esse si possono suddividere in 2 tipologie:

- Biotecnologie tradizionali -> lievito per il pane, fermentazione

dell’orzo o del latte.

- Biotecnologie innovative -> manipolazione genica, trasferimento di

materiale genetico ( gene ) da un organismo all’altro per permette lo

Biotecnologie

sviluppo di proteine di interesse ( 1973 Cohen e Boyer ).

Produzione Insulina

La Biotecnologia può essere considerata l’industria della vita: essa

torva applicazioni in varie

Espressione dell’insulina in cellule batteriche linee di ricerca come

evoluzione molecolare,

biologia dello sviluppo,

biologia cellulare e diversi

settori industriali come

l’industria farmaceutica,

vaccini, terapia genica,

diagnostica, test clinici,

agricoltura zootecnica,

piante fertilizzanti e pesticidi.

Inoltre l’applicazione può interessare anche il biorisanamento,

rendimento massimale nei processi industriali ( modi cazione

enzimatica per donare termo-resistenza ).

È importante sapere che il rilascio di organismi geneticamente

modi cati, farmaci ottenuti con la tecnologia del DNA ricombinante e i

cibi geneticamente modi cati seguono la stessa regolamentazione per

farmaci, cibi e dispositivi

clinici della FDA ( Food and

Drug Administration ) : 1 -

analisi pre-cliniche su colture

cellulari e cavie da laboratorio;

2 - analisi sulla tossicità del

farmaco ( ES se sono presenti

attivatori genici ci potrebbe

essere interferenza tra linee di

attivazione ); 3 - analisi sui

fi fi fi fi

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bene ci del farmaco; 4 - test su migliaia di persone con speci co

disturbo e che abbino miglioramenti con il farmaco in questione

( Durata Pluriannuale ). Inoltre è importante tener conto di alcuni fattori

negativi come i rischi per ambiente e salute umana a lungo termine

( dovremmo

aspettare per

saperlo, ma

aspettando

probabilmente non

avremmo più

bisogno di quello

speci co farmaco/

cibo; problemi etici

ed economici in

quanto non sono processi gratuiti o autonomi; riduzione della

biodiversità in quanto nel settore alimentare si aumenterebbe la

produzione di monocolture -> per questo ci sono 2 linee di pensiero,

PRO o CONTRO. I primi imbattono in questi fattori negativi, ma evitano

la contaminazione ambientale dovuta a prodotti chimici che controllino

l’agricoltura in maniera massiccia e incontrollata; i secondi evitano

queste problematiche elencate ma hanno bisogno di molti prodotti

chimici per mantenere una produzione adeguata ai loro obiettivi

aziendali.

Controllare e vedere -> Contaminazione genetica Citotossicologia.

fi fi fi

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Ciclo cellulare

Il Ciclo cellulare è il periodo che intercorre tra la nascita di una cellula,

2. Ciclo cellulare

derivante da una divisione cellulare, e la

divisione cellulare della stessa. Essa è

Il ciclo cellulare è il periodo che intercorre fra l’origine di una 11 h

cellula da una precedente divisione e il momento in cui questa

composta da 4 fasi denominate G1, S, G2, M

a sua volta si divide.

( descrizione in seguito ). Le prime 3 sono

Consiste di quattro fasi: G1, S, G2, M. Le prime tre

costituiscono l’intercinesi o interfase.

raggruppate nella fase “Interfase”, mentre 8 h

Prendiamo come esempio (riferito alle tempistiche

dell’immagine) un fibroblasto.

l’ultima è la divisione cellulare. In base alla 1 h

A seconda delle cellule la durata del ciclo va da alcune ore a

tipologia di cellulare possiamo avere delle

qualche giorno, una cellula umana in 24h si divide. Se la cellula

non ha tutti i nutrienti di cui ha bisogno non va in contro a

caratterizzazioni speci che dei ciclo cellulare: le

divisione, si ferma in fase G1 che diventa la fase G0. La 4 h

divisione è un evento che richiede tanta energia.

cellule perenni che non svolgono il ciclo

cellulare sono ferme in fase G1 che diviene per

2.1 Regolazione del ciclo cellulare

Saccharomyces Cerevisiae loro la

I primi studi vennero fatti su Saccharomyces Cerevisiae. In

questo lievito si era visto che il passaggio tra una fase e l’altra era regolato da delle proteine

fase G0 ( o quando la

chinasi ciclino-dipendenti che si legano a delle cicline. In fase G1 viene prodotta la p34, poi viene

inseriamo in terreno di coltura

prodotta una ciclica G1. Quando la ciclina aumenta di concentrazione si lega alla chinasi ciclina

dipendente, quando si forma il legame non si può più retrocedere e si entra in fase S. Appena si

con pochi nutrienti ); le cellule

duplica il DNA, al ciclina G1 viene distrutta. Si entra in fase G2, viene prodotta la p34, che si lega

alla ciclina mitotica (M), la ciclina M forma il fattore di promozione della mitosi (MPF) che porta alla

stabili che svolgono il ciclo

divisione della cellula. Alla fine della fase M la ciclina si disgrega.

MPF, il fattore di promozione della mitosi, va a fosforilare le lamine, che si trovano sotto l’involucro

cellulare solo se stimolate da

nucleare e può disgregarsi, può agire inoltre sugli istoni H1, in

fattori esterni che sono ferme

modo che si venga a condensare il DNA, frammenta il Golgi e il

RE, formazione del fuso. in una fase del ciclo ma

Uomo possono continuarlo in base

Tra i fattori che agiscono sul ciclo cellulare: interazione di

allo stimolo speci co; le cellule

ormoni con le proteine di membrana, fattori di crescita, volume

cellulare, inibizione da contatto. labili che svolgono il ciclo

- cdk 4-6 (chinasi ciclina dipendente) si legano alla ciclina G1,

e la cellula si trova così in fase G1; cellulare normalmente e che

- legame cdk2 ciclina G1/S, agisce sulla formazione del

hanno una durata speci ca in

complesso prereplicativo, un insieme di proteine al quale

viene aggiunta una proteina regolatrice cdc6 (+ DNA elicasi),

base al fenotipo cellulare ( ES

e attivato da S/cdk2;

- L’attivazione di cdk2/S fa iniziare la sintesi e subito dopo fa

una cellula umana in 24h si

staccare cdc6 dal complesso prereplicativo per impedire una

ulteriore sintesi di DNA. divide - vedi gura ).

- ciclina M si lega al cdk1 (chinasi ciclina dipendente 1), e

consente l’ingresso in fase M, promuovendo la mitosi, si va a

disgregare a metà del complesso mitotico, cdk1 cioè è

Fasi del ciclo cellulare

arrivato dal cdc25;

- Entra in gioco l’APC, processo di promozione dell’anafase

- G1 = Nel corso della fase G1 il DNA nucleare trascrive vari tipi di

che viene attivato dal cdc20. L’APC stacca la securina e

libera la separasi che degrada le coesione e così i cromatidi si

RNA alcuni dei quali dopo processing

separano APC disattiva MCdk1 e la cellula esce dalla mitosi.

nucleare passano al citoplasma per la sintesi

Fattori che modificano il ciclo cellulare: SINTESI DEL DNA

proteica. In questa fase la cellula cresce di

- interazione degli ormoni e fattori di crescita con recettori di membrana;

- Inibizione da contatto;

volume e di materiale cellulare ( Sintesi di

- Alterazione del trasporto di ioni;

-

molecole, macromolecole ed organuli ).

pH;

- proteine istoniche e non istoniche;

-

- poliammine.

S = Duplicazione del DNA attraverso i

processi di replicazione ( DNA polimerasi, 6

forca replicativa, elicasi, primasi, proteine

SBS, sliding clamp, RNAsi H ). In questa fase

avviene la duplicazione anche del diplosoma/

centriolo.

fi fi fi fi

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- G2 = Fase che promuove la preparazione alla fase successiva, la

divisione cellulare. Avviene la sintesi delle proteine del fuso mitotico

( struttura microtubolari ), proteine per la spiralizzazione/

condensazione del DNA, ciclica mitotica e nuovi componenti di

membrana. ( Nel frattempo potrebbe anche promuovere la sintesi di

proteine per funzioni generali della cellulare ).

- M = divisione cellulare, che per le cellule somatiche si tratta di mitosi,

divisione che da una cellula madre si otterranno 2 cellule glie

genotipicamente uguali alla cellula madre. Essa è composta da varie

PROFASE fasi:

Involucro nucleare integro, la cromatina inizia a spiralizzarsi in cromosomi, formazione

Profase -> La cromatina inizia a

• degli aster dai diplosomi che si sono duplicati in S/G2, formazione del fuso continuo

spiralizzarsi/condensarsi in

cromosomi e si inizia a formare il

fuso mitotico: esso è composto

da 2 centrosomi ( duplicati in S/

G2 ), chiamati anche diplosoma

( in quanto contenente 2

centrioli ), composti ognuno da

una coppia di centrioli ( struttura

proteica con 9 triplette di

microtubuli annessi l’uno

all’altro ), bre astrali composte

da microtubuli ( Asterl e Fibre del

fuso ) e materiale pericentriolare.

In questa fase si irradia in tutte le

direzioni dai centrioli l’aster,

ovvero microtubuli astrali che

vanno a legarsi con la membrana Inizio disgregazione dell’

cromosomi a massima s

PROMETAFASE 1

plasmatica per rendere saldo il

fuso mitotico, distanziando i Fuso mitotico: -f

centrosomi ai poli della cellula. -f

Prometafase -> in questa fase è

• I micro

imporatante de nire le bre del pericen

cineto

fuso: esse sono microtubuli che cinetoc

originano dal materiale loro sov

microt

pericentriolare del centrosoma e

che si dividono in microtubuli

cinetocorici ( fuso discontinuo ), i

quali si legheranno con il

cinetocore ( placca proteica

legata alla zona del cromosoma

fi fi fi fi

microtubuli astrali si estendono verso la periferia

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chiamata centromero ) e

microtubuli polari che si

localizzano sovrapposti al

centro della cellula ( fuso

continuo ) Questa fase è

divisa in 2 momenti: PROMETASFASE 2

A. Prometafase 1 -

L’involucro nucleare Disgregazione completa dell’involucro nucleare, attacc

inizia a degradarsi, le

bre del fuso entrano

nel nucleo ( sopratutto

microtubuli cinetocorici

) e il DNA è

completamento

spiralizzato/

condensato.

B. Prometafase 2 -

Disgregazione METAFASE

completa dell’involucro Disposizione dei cromosomi al centro del fuso mitotico (piastra equatoriale)

nucleare e unione del

fuso discontinuo ai

cinetocori nei

cromosomi.

Metafase -> Disposizione dei

• cromosomi al centro del fuso

mitotico (piastra equatoriale o

metafasica).

Anafase -> in questa fase

• avviene la separazione dei ANAFASE

cromatidi fratelli e Separazione dei cromatidi e migrazione ai poli del fuso

l’allontanamento degli stessi ai Proteine motrici

poli della cellula attraverso legate alla mem

e ai i microtubul

meccanismi messi in atto dal allontanare i cen

fuso mitotico. Anche questa

fase può essere suddivisa in 2

parti:

A. Anafase A - Avviene la Proteine motric

chinesinae fann

depolimerizzazione dei allontanare

i microtubuli po

microtubuli cinetocorici

e la contemporanea

azione delle proteine

tipo dineina ( + -> - )

fi ANAFASE A

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che muovono il Consiste nel movimento dei cromosomi verso i poli

del fuso attraverso la depolimerizzazione e proteine

motrici ( -)

cinetocore al quale Proteina motrice (cfr. dineina)

sono unite dal Plus -

End ( cinetocore ) al

Minus End

( centrosoma ).

Questa fase permette -

la separazione dei

cromatidi fratelli.

B. Anafase B - Avviene

la polimerizzazione dei

ANAFASE B

microtubuli polari e lo Si riferisce alla separazione di poli del fuso grazie all’allungamento dei microtubu

scorrimento ad opera

delle proteine Chinesine

-I microtubuli sovrapposti

scivolano l’uno sull’altro grazie a proteine motrici +

( - -> + )dei microtubuli

-I poli del fuso sono tirati verso la parte opposta da proteine motrici –

che si legano

sovrapposti. Con questo

ai microtubuli dell’aster

movimento si promuove

l’allontanamento ai poli

della cellula dei 2

centrosomi. Questo

evento è inoltre aiutato

dalla depolimerizzazione

dei microtubuli astrali e

da proteine motrice tipo

dineina ( + -> - ) che

tirano questi microtubuli

verso la membrana plasmatica.

Telofase -> Il fuso si disgrega, i cromosomi despiralizzano, si

• riforma l’involucro nucleare e si ripristina il nucleolo.

TELOFASE

Citodieresi -> Essa

• Il fuso si disgrega, i cromosomi si despiralizzano, si riforma l’involucro nucleare,

ripristino del nucleolo

avviene attraverso

l’anello contrattile

( miosina e actina )

che strozza la cellula

nella pozione della

piastra equatoriale/

metafasica, per

assicurare la

separazione dei

cromatici fratelli ad

ogni cellula glia.

fi

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Regolazione del ciclo cellulare

Lo studio della regolazione del ciclo cellulare è iniziata con il lievito

Saccaromycetes cerevisiae. In questo organismo la regolazione è

a data a delle chinasi ciclino-dipendenti e dai rispettivi substrati

( cicline ). Il processo è adibito alla proteina chinasi ciclina-dipendente

chiamata p34 che rimane sempre presente nel susseguirsi delle fasi e a

cambiare sono i relativi substrati. Quando nella fase G1 viene prodotta

abbondantemente la ciclina G1, regolata dalle attività cellulari, essa si

lega alla p34 che promuove il passaggio in fase S per poi, una volta

terminata la duplicazione, rilasciare la ciclina che si degraderà. A

questo punto nella fase G2 si produrrà la ciclina M ( ciclina mitotica ) la

quale ad una certa concentrazione nel mezzo acquoso si legherà alla

p34 e promuoverà l’inizio della fase M: questo è dovuto principalmente

all’attivazione della

REGOLAZIONE DEL CICLO chinasi che viene

MPF= Fattore di promozione chiamata in questa fase

della mitosi (fosforila le lamine che si disgregano

e gli H1 che condensano la cromatina, frammen

tazione del Golgi e RE, formazione del fuso) MPF, fattore di

Protein chinasi ciclina-dipendente

II° passaggio promozione della mitosi

Ciclina mitotica il quale fosforilerà le

Fattore di promozione

della mitosi lamìne dell’involucro

nucleare e gli istoni H1

p34= che condenseranno la

Protein chinasi

ciclina dipendente

(sempre presente) cromatina. Inoltre

promuoverà anche la

rottura del Golgi e del

I° passaggio chiave RE e la formazione del

Ciclina G1 sintetizzata in fase G1 fuso mitotico.

Negli organismi eucarioti superiori, come l’uomo, la regolazione avviene

tramite una serie aggiuntiva di checkpoint:

1. In fase G1 troviamo la chinasi ciclina-dipendente 4/6 che si lega alla

ciclina G1. In questo momento si mantiene lo status di G1.

2. Con l’accrescimento cellulare e la produzione in fase G1, si

sintetizza la ciclica G1/S la quale si lega alla chinasi ciclica

dipendente 2. Questo complesso permette la sintesi della ciclica S,

la quale andrà a sostituire la ciclica G1/S: la sostituzione avviene

per perdita di a nità della ciclina G1/ e legame con la ciclina S. Il

complesso CDK2-Ciclina G1/S permette di stimolare la formazione

del complesso pre-replicativo: complesso di riconoscimento

dell’origine di replicazione; DNA elicasi; proteina regolatrice CDC6

che promuove l’inattivazione del complesso ( Punto di controllo ). Il

successivo legame tra CDK2-ciclina S attiva il complesso pre-

ffi ffi

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replicativo ( entrata in fase S ) e stacca la proteina regolatrice cdc6

per evitare una nuova sintesi del DNA.

3. La CDK2-Ciclina S rimane unita no all’inizio della mitosi e nella

fase G2 promuove la sintesi della ciclina M e della chinasi ciclica-

dipendente 1. Queste 2 ultime molecole formano il fattore di

promozione della mitosi ( MPF ), il quale si attiva se viene rimosso il

gruppo fosfato. L’attivazione avviene ad opera di una proteina

regolatrice fosfatasi chiamata CDC25: questa proteina viene attivata

a sua volta dalla terminazione della replicazione del DNA ( punto di

controllo ). Quando avviene la duplicazione de nitiva; si attiva

CDC25 che defosforila CDK1-Ciclina M e dissocia CDK2-Ciclina S

-> inizia la divisione cellulare.

4. Nella fase M entrerà in gioco l’APC, ovvero il processo di

promozione dell’anafase, il quale viene attivato da CDC20. Quando i

cinetocori sono uniti dai microtubuli, viene rilasciato CDC20 la

quale, unendosi all’APC, promuove il distacco della securina dalla

separasi, la quale degrada la coesione tra cromatidi fratelli e

permette il distacco di questi ultimi nella divisione cellulare. Inoltre

APC promuove la disattivazione della chinasi ciclina dipendente 1 e

della ciclina M, disaccoppiamento che provoca l’uscita dalla fase M

e rigenerazione delle condizioni per la fase G1 nelle glie.

CICLINE E CHINASI DIPENDENTI DA CICLINE NEGLI EUCARIOTI SUPERIORI

I complessi dopo aver svolto la loro funzione

vengono degradati dall’ubiquitina e

Attivato dalla fosfatasi Cdc25 da enzimi proteolitici noti come SCF

Controlla anche il fuso mitotico

Cdk1/CycB