Biotecnologie cellulari

Biotecnologie cellulari

18/02/20 5 cfu frontale + 1 cfu laboratorio Slide + Alberts Esame orale

Definizione di biotecnologie

Disciplina che studia i processi biologici, organismi, cellule e componenti cellulari per sviluppare nuove tecnologie in ambito medico, industriale e ambientale. Tecniche biotecnologiche sono usate per ingegnerizzare il genoma di animali per migliorare la loro idoneità per applicazioni industriali, farmaceutiche o agricole. Le biotecnologie sono usate anche in immunologia applicata per sostenere o sviluppare terapie geniche. Una vasta gamma di metodi sperimentali viene utilizzata per misurare la quantità o l'attività di una sostanza come un farmaco, su un tipo di cellula o di un componente cellulare.

Idee e invenzioni sono fondamentali per le aziende biotech. La proprietà intellettuale include brevetti, marchi depositati e copyright. Inoltre, sempre legata alla produzione di molecole biotech c'è tutta la questione dell'etica, che riguarda divieti come il divieto di produrre armi chimiche, di clonare l'uomo, di modificare i geni della linea germinale dell'uomo, ecc...

La cellula è l'unità morfofunzionale degli organismi viventi, la più piccola struttura ad essere identificata come vivente (10-20 um).

Capitoli del corso

• Tecniche di visualizzazione delle cellule: microscopia, citofluorimetria. Una lezione sul trascrittoma a singola cellula. Single cell RNA-seq: inizialmente fatto prendendo una parte di tessuto tumorale, in cui c'è grande variabilità genetica. Le cellule prelevate vengono sequenziate individualmente e vengono analizzati tutti i geni da loro espressi. Si confrontano i geni espressi da queste cellule (che non saranno ovviamente tutti uguali).
• Colture cellulari. Tutti gli organismi viventi sono costituiti da cellule e ogni cellula deriva da un'altra cellula. Come si fanno le colture di cellule eucariotiche, soprattutto mammiferi. Le cellule possono essere messe in coltura direttamente dopo l'estrazione dal tessuto (colture primarie), ma ovviamente non possono sopravvivere in eterno. La storia delle colture cellulari è relativamente recente.

- Nel 1902 un patologo, Leo Loeb impiantò frammenti di pelle di embrioni di una cavia in agar e siero: le cellule sopravvivevano quando reimpiantate in cavie adulte - Nel 1907 Ross Harrison scoprì come far crescere le cellule (frammento di midollo spinale di un embrione di rana in un coagulo di linfa) - Alexis Carrel, Premio Nobel nel 1912 per la Medicina e la Fisiologia, dimostrò che si potevano crescere le cellule in colture di estratti tissutali ed embrionali, in condizioni di sterilità. - Negli anni Cinquanta Harry Eagle diede un notevole impulso studiando le sostanze nutritive necessarie alle cellule in coltura. Dimostrò che le cellule animali potevano crescere in un cocktail di sostanze a composizione chimica definita in presenza di siero.

Una cellula messa in un ambiente controllato può essere studiata più facilmente, grazie ad una coltura cellulare è anche possibile ottenere linee cellulari omogenee. Con le colture si possono studiare gli effetti tossici su vari tipi cellulari, i quali possono essere esposti direttamente alle sostanze da saggiare e permettono di ottenere risultati in tempi brevi. Usando le colture cellulari si eliminano tutti i problemi etici legati all'uso di animali (regola delle 3 R).

Tuttavia ci sono dei limiti anche nelle colture cellulari:

• Differenze fra un sistema sperimentale costituito da cellule isolate tra loro non comunicanti e la complessa organizzazione di un organismo nella sua interezza e complessità funzionale e strutturale.
• Alterazioni metaboliche e aneuploidia di molte linee stabilizzate, che possono presentare corredo cromosomico diverso dalle cellule di origine.
• Preparazione ed esperienza dell'operatore.

• Trasferimento genico: principali metodologie di trasfezione, vettori e shuttle.
• Gene targeting: come si porta un gene ad una situazione Knock-down grazie all'interferenza degli RNA, o attraverso il sistema CRE-loxP. La reverse genetics studia la funzione di un gene in un organismo attraverso la manipolazione del genoma e lo studio dei fenotipi prodotti, sfrutta strumenti come la modifica di un gene, togliendo un gene o aggiungendolo. Ad esempio, il cre-loxp permette di eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare dello sviluppo.
• Modificare e manipolare la sequenza genica con ZFN, TALEN e CRISPR/Cas9. Fino a pochi anni fa si usavano le zinc finger, poi le talen, ad oggi si usa CRISPR. Il CRISPR si basa sull'utilizzo di sequenze scelte.
• Cellule staminali: caratteristiche, metodi di derivazione, protocolli di differenziamento in vitro ecc... Totipotenti: sono in grado di generare un intero organismo; Pluripotenti: possono differenziarsi in qualsiasi tessuto, ma non sono in grado di generare un intero organismo; Multipotente: possono differenziarsi in tipi cellulari diversi, ma con precursori comuni; Unipotenti: si differenziano in un solo tipo cellulare. Le cellule staminali della massa cellulare interna della blastocisti possono dare origine ad ogni tipo cellulare che troviamo nel nostro corpo.
• Riprogrammazione somatica: applicazione delle cellule pluripotenti indotte (iPS), applicazione nella terapia cellulare sostitutiva.
• Sistemi innovativi di coltura cellulare.

Tecniche microscopiche applicate alla biotecnologia

21/02/20

Migliaia di anni fa l'uomo iniziò ad usare inconsapevolmente i microorganismi per produrre cibi e bevande e a modificare piante e animali attraverso una graduale selezione dei caratteri desiderati. Già nel 500 a.C in Cina grumi di semi ammuffiti rappresentavano. Nel 1855 Pasteur individua il lievito come microrganismo, nel 1863 Mendel stipula le prime leggi della genetica, nel 1855 viene scoperto E.Coli. Nei 1950 Watson e Crick rivelano la struttura del DNA, ecc.

Le biotecnologie si dividono in tradizionali (produttive utilizzate da millenni, quali agricoltura, zootecnia e le attività fermentative dei microrganismi) e innovative (tecniche che permettono di identificare, isolare, e trasferire artificialmente un gene da un organismo ad un altro). Ogm: organismo geneticamente modificato animale o pianta o microrganismo.

Il primo contributo all'osservazione microscopica si può datare nel 1590 quando Janssen inventò il primo "microscopio", nel 1670 Hooke perfeziona le lenti, ecc... Leeuwenhoek fu il primo a creare un vero e proprio microscopio in grado di rilevare i batteri. 0,2 mm risoluzione massima ad occhio nudo (una cellula eucariotica è circa 20 um). Il microscopio ottico ha un potere che arriva a 0,2 um (non riusciamo ad osservare virus e complessi macromolecolari come proteine), microscopia elettronica ha un potere di risoluzione di 0,2 nm.

Microscopio ottico

È un sistema diottrico che permette di ingrandire circa 1000 volte, con un potere di risoluzione che non può superare 0,2 um. Usa luce con lunghezza d'onda nel visibile. La sorgente luminosa è solitamente una lampada bianca, il condensatore serve per indirizzare tale luce sul campione, che la devia verso l'obiettivo. Dall'obiettivo la luce viene captata dagli oculari.

L'ingrandimento ottico (I) è il rapporto tra la misura apparente y_i (o la dimensione in un'immagine) e la misura reale di un oggetto y_o: I = y_i/y_o. Il potere risolutivo dello strumento determina il livello di dettaglio contenuto nell'immagine. L'ingrandimento non determina un aumento di risoluzione delle immagini.

Potere di risoluzione: capacità di distinguere come separati due punti adiacenti. L'obiettivo ha il compito di captare la luce che esce dal condensatore. Il potere risolutivo di un microscopio dipende dalla lunghezza d'onda della luce e dall'apertura numerica del sistema di lenti (principio di Abbe). La risoluzione è pari a: 0,61 x lunghezza d'onda / (n x seno dell'angolo teta) L'operatore può lavorare sull'indice di rifrazione n che separa il campione dall'obiettivo, quindi sul denominatore, per poi aumentare la risoluzione. È possibile selezionare obiettivi che hanno l'apertura numerica più alta possibile (denominatore). Per lenti ad olio si arriva ad un'apertura di 1,4 che è il massimo possibile, mentre per le lenti ad aria non può essere superiore.

Microscopio ottico invertito: si usa normalmente per guardare le cellule. Le cellule vive disturbano la luce che le attraversa, assorbendo (se colorate) determinate λ, tuttavia le cellule normali non sono colorate e non assorbono quindi determinate λ. Ci sono vari metodi: microscopia in chiaro, a contrasto di fase, in campo scuro e a contrasto interferenziale (DIC). Il contrasto è definito come la differenza tra un punto osservato e il rumore di fondo. Il contrasto percepito dal nostro occhio deve essere almeno del 10% nel microscopio a campo chiaro le cellule non sono visibili, ma bisogna aumentare il contrasto aggiungendo una piastra specifica che sforma uno sfasamento nella λ della luce. In questo modo si ha uno sfasamento di un quarto di λ. Normalmente una cellula di per sé crea uno sfasamento di un quarto di λ, se non aggiungiamo la piastra di contrasto arriviamo ad un mezzo di λ di contrasto.

Il contrasto di fase si basa su un concetto preciso, ovvero il phase plate che fa passare la luce solo attraverso un anello. L'operatore deve inserire il disco di contrasto per selezionare la luce in modo da avere questo sfasamento. La polarizzazione serve per sfruttare la microscopia a contrasto differenziale interferenziale in cui ci sono due filtri polarizzatori. Questa tecnica sfrutta la birifrangenza generata da una coppia di prismi (capacità di dividere la luce in un raggio ordinario e uno straordinario con lunghezze d'onda diverse. I due raggi vengono poi ricombinati in modo da ottenere un contrasto molto forte dovuto alla differenza del cammino di questi raggi.

La microscopia in campo oscuro ha un sistema di illuminazione modificato che raggiunge il preparato lateralmente: l'unica luce che raggiunge l'obiettivo è quella diffratta dal campione, che appare quindi chiaro su un campo scuro. È una tecnica di contrasto usata per rivelare piccole strutture che normalmente potrebbero sfuggire all'osservazione. Se la luce non fosse deviata dal campione noi non potremmo vedere nulla. Microscopio elettronico a trasmissione TEM e a scansione SEM (Vedi Alberts).

Colorazioni

Esame a fresco è l'osservazione diretta di cellule e tessuti vivi. Difficoltà nel mantenere le cellule in vita e la possibilità di colorazione è limitata dalle caratteristiche cellulari o della struttura che si vuole colorare (coloranti acidi, basici e neutri).

• Acidi: Alizarina, trypan blue, blu pirrolo, rosso congo, inchiostro di china, litiocarminio, carminato di ammonio.
• Basici: Blu di metilene, blu di toluidina, azzurro di metilene, solfato di blu di Nilo, bruno di Bismarck, blu di cresile brillante, verde Janus.
• Indifferenti: rosso neutro.

Fissazione

Hanno lo scopo di bloccare la lisi cellulare e dei tessuti e di preservarne la struttura. I fissativi devono alterare il meno possibile la reale struttura delle cellule, preservare dalla crescita di batteri e funghi e preservare la consistenza della cellula per renderla resistente ai trattamenti successivi. Requisiti della fissazione: precocità, dimensione minima del campione, scelta idonea del mezzo di fissazione e abbondanza del mezzo fissativo. La fissazione può avvenire con metodi fisici o chimici. Il freddo non è un agente fissativo in senso stretto, ma piuttosto un agente conservante. Il trattamento deve essere quanto più rapido possibile. Per ottenere un rapido congelamento si devono trattare campioni molto piccoli con isopentano, isopropanolo (-80°C) o azoto liquido (-196°C). Solo così si evita la formazione di grossi cristalli di ghiaccio, capaci di alterare profondamente la struttura del campione (tessuti). Un congelamento particolarmente rapido può impedire del tutto la cristallizzazione dell'acqua, stabilizzandola in uno stato solido amorfo, come il vetro (vetrificazione dell'acqua). I cristalli possono essere fatti sublimare per disidratazione sottovuoto a temperature fra -60°C e -30°C.

I fissativi chimici possono essere aldeidi, alcoli, acidi organici e minerali e sali di metalli pesanti.

• Fissativi coagulanti o precipitanti (acido picrico, alcol etilico, metanolo, acido acetico...) denaturano le proteine; NO per indagini di citochimica enzimatica ed immunoistochimica.
• Fissativi non coagulanti (bicromato di potassio, aldeidi reattive come formaldeide...) legano fra di loro le proteine che formano un reticolato che intrappola tutte le costituenti protoplasmatiche. L'attività enzimatica è conservata. SI per immunocitochimica, attività enzimatiche.

Le aldeidi reattive fissano il tessuto introducendo cross-links fra diverse componenti (proteine, acidi nucleici, lipidi) in modo proporzionale al tempo di fissazione.

Fluorescenza

25/02/20

La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze di riemettere a frequenza più bassa le radiazioni ricevute. La fluorescenza permette di evidenziare dettagli che altrimenti non sarebbero visibili in microscopia. I fluorofori sono solitamente composti organici eterociclici. La fluorescenza ha tempi molto veloci, al contrario della fosforescenza che è un fenomeno molto simile ma con tempi più lunghi.

I fluorofori (o fluorocromi) vengono sfruttati perché possono essere legati ad altre molecole che funzionano da sonde. Durante un processo di fluorescenza la luce eccita gli atomi della molecola fluorescente facendo saltare gli elettroni in un orbitale più esterno. Subito dopo gli elettroni tornano allo stato fondamentale emettendo luce di lunghezza d'onda maggiore, cioè ad energia minore (spostamento di Stokes). Esistono moltissimi fluorofori naturali ognuno dei quali è caratterizzato da un proprio spettro di assorbimento e uno di emissione, ciò significa che un determinato fluoroforo emetterà sempre nel suo spettro di emissione che non cambia in funzione della luce usata per eccitarlo. Se eccito a lunghezze d'onda diverse uno stesso fluoroforo otterrò sempre uno spettro di emissione.

Quando si fanno esperimenti bisogna utilizzare fluorofori con emissione e assorbimento diversi, altrimenti possono esserci sovrapposizioni dei rispettivi spettri. È importante che gli spettri non si disturbino l'uno con l'altro. Questi elementi possono essere usati nella microscopia a fluorescenza.

Nel microscopio a fluorescenza esiste una sorgente di luce bianca che deve essere selezionata a seconda della lunghezza d'onda necessaria al nostro fluoroforo (la selezione è fatta grazie a filtri). Uno specchio dicroico è un filtro di vetro ricoperto da un film di alluminio che si comporta sia da specchio riflettendo la luce blu, ma consente il passaggio di altre lunghezze d'onda. La luce che passa lo specchio dicroico arriva agli oculari. Il campione viene illuminato da sopra e solo quella ottenuta dall'eccitazione viene intercettata dall'obiettivo. Questo tipo di microscopio viene detto ad epifluorescenza.

Lo specchio dicroico riflette la luce blu sul fluoroforo, il quale emette luce verde che torna indietro e viene fatta passare dallo specchio dicroico, fino ad arrivare un secondo filtro che seleziona solo le lunghezze d'onda scelte. Tutte le molecole di fluoroforo del campione sono eccitate, anche quelle fuori dal piano focale. Si può avere bleaching (sbiancamento) per la quale i fluorofori se eccitati per troppo tempo perdono la capacità di emettere. Può verificarsi anche fototossicità con la produzione di radicali liberi. Poiché si sta eccitando tutto il campione la luce viene anche dagli altri piani confocali e non solo dal piano di fuoco dell'obiettivo.

La sorgente d'eccitazione deve avere una buona emissione nella zona UV-blu del visibile, deve avere un'alta brillanza costante nel tempo. In genere si usa una lampada ai vapori di mercurio, oppure lampada a vapori di Xenon o laser. La sorgente di emissione ha una vita media di 100-300 ore. Il campione può essere una cellula fissata o viva, oppure sezioni di tessuto. Le cellule devono essere lavate prima di essere osservate perché il terreno di coltura potrebbe avere componenti fluorescenti, inoltre le cellule morte rilasciano fluorofori nel mezzo per cui si aumenta l'emissione di fondo. È necessario utilizzare vetrini non fluorescenti.

I charge coupled device sono array di elementi fotosensibili lineari o bidimensionali. I fotoni incidenti nei ccd generano elettroni che vengono accumulati in regioni dette pixel. Questi fotoelettroni vengono qui intrappolati grazie ad un campo elettrico locale, infatti la presenza di elettrodi permette di spostare i fotoelettroni sul ccd. L'intensità dei pixel è proporzionale al numero di fotoelettroni prodotti, ovvero all'energia rilasciata dalla luce. I ccd sono generalmente in bianco e nero, in questo caso si usa una scala di grigi in cui il livello di grigio in ogni punto è proporzionale all'intensità luminosa. Alcuni ccd sono a colori ma questa soluzione è meno efficiente perché non ha una sensibilità e una risoluzione spaziale alta come l'altra. L'emissione a colori viene filtrata da un filtro passa banda che seleziona una specifica lunghezza d'onda, questa luce colpisce la ccd che la trasformerà in una scala di grigi dall'intensità proporzionale alla lunghezza d'onda della luce incidente.