Biotecnologie cellulari

Tecnologie transgeniche

La genetica classica studia i mutanti spontanei per scoprire i geni responsabili della mutazione, la genetica inversa invece parte dal gene esogeno di interesse, lo si clona dentro un vettore e lo trasferisce nella cellula per studiarne la funzione.

La funzione di un gene codificante si può studiare:

• Alterando la sua sequenza
• Aggiungendo un gene: produrre un eccesso di proteina. Serve per far produrre una proteina in una cellula che normalmente non la esprime, oppure per produrre una proteina in un momento diverso dal normale (anticipare o posticipare la produzione nella proteina)
• Rimuovere un gene: non produrre più la proteina

Si possono scoprire le funzioni di un gene con diverse tecniche:

1. Gene replacement: sostituzione di un gene con un'altra sequenza modificata
2. Gene knock out: eliminazione di un gene
3. Gene addition: aggiunta di una nuova versione del gene a quella endogena
4. Nock-down genico

Un gene è trascritto in un messaggero.

se elimino il messaggero non avremo può ilprodotto genico. Il knock-down è proprio il silenziamento post-trascrizionale, vieneeliminato l’mRNA.

RNA antisenso: se alle cellule viene fornito un RNA antisenso complementare all’mRNA prodotto, si ha un appaiamento che impedisce la sintesi dellaproteina. Gli oligonucleotidi usati come RNA antisenso non sono molto lunghi. Cisono degli svantaggi perché spesso l’antisenso è instabile e viene degradatosubito nella cellula, quindi servono grandi quantità, le quali devono essereprodotte dalla cellula (serve un vettore interno).

Morfolino: molecola sintetica ottenuta a partire dalla sequenza genica di interesse. Il deossi-ribosio è sostituito dal morfolino, la molecola si legastabilmente alla sequenza complementare e non viene distrutta dalle proteasi. Le molecole di morfolino sono lunghe circa 25 nt, sono solubili e si leganoprincipalmente al 5’ del trascritto endogeno.

Impedendo la sintesi proteica (ingombro sterico). Tuttavia le sequenze di morfolino non sono permeabili alla membrana plasmatica e devono essere iniettate nelle cellule, questo ne limita l'utilizzo su larga scala. Sono stati usati su animali (Xenopus). Questo sistema è anche utilizzato anche per modificare la sequenza di splicing. Per esempio in un embrione viene introdotto il morfolino, tramite microiniezione, che riconosce il target. L'embrione modificato viene comparato con un embrione normale o con uno a cui è stato iniettato qualcosa di aspecifico (sequenza senza target specifico).

RNAi (RNA interference): L'RNA non è solo un effettore dal processo di trascrizione a quello di traduzione, ma alcune sue forma hanno attività catalitica (alcune forme hanno la capacità di scissione del legame fosfodiesterici). Con questa tecnica si intende in knock-down svolto da molecole di RNA a doppio filamento. Questo fenomeno si trova in natura in piante,

funghi e animali e si pensa che si un meccanismo di difesa contro l'ingresso di acidi nucleici esterni. Ha un ruolo fisiologico nella sintesi di molti RNA endogeni cellulari e nella regolazione dell'espressione genica. Negli anni '80 i ricercatori stavano lavorando sulla produzione di petunie con un colore più vivace, in particolare iniettarono nelle piante un enzima (chalacone syntase), che avrebbe dovuto rendere più colorati i fiori, in realtà le petunie osservate erano bianche. Questo fenomeno è stato chiamato co-soppressione dell'espressione genica, ma il meccanismo molecolare rimaneva ignoto. Le idee erano due, il silenziamento genico poteva avvenire in modo pre-trascrizionale o in modo post-trascrizionale. Nel 1995 gli stessi scienziati studiavano il gene par-1 in C.elegans, il quale permette la divisione dello zigote. Essi sintetizzarono e iniettarono anche l'RNA antisenso per par-1 nelle cellule, creando mutanti per questo gene. Fu testata

Anche l'iniezione dell'RNA senso per par-1 e anche qui si trovarono dei mutanti simili ai precedenti, anche se in teoria non sarebbe dovuto succedere. Partendo da questa informazione, nel 1998 fu pubblicato un lavoro che dimostra che anche l'RNA senso ha un effetto, in particolare molecole a doppio filamento sono ancora più efficaci di quelle a singolo. Gli autori dissero nel loro lavoro: "Abbiamo cercato di verificare la possibilità che questo effetto rifletta una differenza di fondo nella struttura dell'RNA. Le popolazioni di RNA da iniettare sono generalmente preparate con RNA polimerasi fagiche. Queste polimerasi, sebbene altamente specifiche, producono alcune trascrizioni casuali di RNA aberranti. Abbiamo ipotizzato che le popolazioni di RNA interferenti potessero includere alcune molecole con un doppio filamento". Poche molecole di doppio filamento di RNA sono sufficienti ad interferire e questa interferenza può propagarsi nelle

cellule vicine a quella in cui è stato inserito.

Funzionamento di RNAi

Questo meccanismo si basa su una cascata molecolare determinata che parte da un enzima che processa RNA a doppio filamento detto DICER, una RNAasi 3 con attività endonucleasica. Gli RNA a doppio filamento vengono tagliati dall'enzima DICER, responsabile della formazione di siRNA (molecole a doppio filamento di circa 23nt). A questo punto agisce il complesso RISK, questo complesso ha un'attività elicasica che svolge questo doppio filamento e usa la sequenza come stampo per riconoscere l'mRNA target complementare da degradare. Di questo complesso fa parte anche Argonauta. L'altra attività di RISK è dovuta dominio piwi ed è endonucleasica e serve per degradare questo target. In molti organismi avviene la sintesi di un nuovo dsRNA da parte di una RNA-polimerasi RNA dipendente. I siRNA servono da stampo per queste polimerasi, si trovano nelle piante ma non sono

presenti negli animali.Accanto al silenziamento mediato dai siRNA, più recentemente sono stati scoperti imiRNA, molecole di RNA lunghe circa 20 nt già presenti nel genoma del soggetto.L'azione dei due RNA è molto simile. Queste molecole miRNA sono prodotteendogenamente dal genoma e derivano da un trascritto precursore pri-miRNA. Questotrascritto forma una struttura secondaria molto particolare e viene prima processatoda DROSHA che ne elimina una sequenza a 3' e una a 5'. A questo punto è detto pre-miRNA e viene portato nel citoplasma, dove è riconosciuto da DICER che lo processaesattamente come i siRNA.I miRNA regolano l'espressione genica a livello della traduzione. Se lacomplementarietà tra miRNA e mRNA target non è perfetta, avviene un blocco dellatraduzione (avviene nell'uomo), a livello delle piante si ha anche una degradazionedell'RNA. I miRNA di solito si legano a sequenza al 3'

dell'RNA target. Di solito agiscono in modo combinatorio perché possono legarsi a più sequenze dell'mRNA target. Questo meccanismo è usato anche per regolare temporalmente la traduzione delle proteine.

I primi tentativi usavano duplex lunghi (>30 bp) e sono falliti per l'attivazione dellarisposta anti-virale mediata da interferone e la conseguente inibizione della sintesi proteica. In realtà si è visto che la lunghezza ottimale è di circa 21 nt e questi oligonucleotidi sono appunto i siRNA. È possibile disegnare subito questi oligonucleotidi e dopo averli disegnati ci si assicura che queste sequenze siano specifiche solo per il target che vogliamo raggiungere. I siRNA possono essere prodotti sinteticamente, trasportati attraverso vettori o creati in vitro (dipende dal target, dal tipo cellulare e dal tempo per cui vogliamo silenziare il gene).

401. La siRNA sintetizzata è introdotta nella cellula e viene subito

Riconosciuta daDICER. Queste sequenze sono state migliorate introducendo modificazionichimiche che abbassano ancora di più la risposta immunitaria e prendono il nome di Stealth RNAi. Queste molecole possono essere inserite attraverso la lipofezione, microiniezione (più usata per il morfolino che per cellule singole) ed elettroporazione.

Vettori per RNAi: servono per rendere più efficacie il sistema. Nel vettore è inserita una sequenza di DNA precursore del siRNA, che verrà trascritta dando come prodotto le shRNA, precursori del siRNA. DICER li riconosce e li taglia. Il plasmide può essere inserito in modo transiente, oppure essere integrato e dare knock-down a lungo termine.

In vitro: si sintetizzano le molecole a doppio filamento, che vengono processate con DICER in vitro. Il prodotto è somministrato nelle cellule. Le molecole a doppio filamento possono essere somministrati in molti modi. Se il soggetto è giovane possiamo iniettarla

Con la microiniezione, se il soggetto è un embrione, si possono introdurre molecole direttamente nel suo nucleo. Se invece il soggetto è adulto, ci sono diversi approcci. L'organismo adulto può essere posto in un terreno di crescita contenente queste molecole, che verranno poi assorbite dal soggetto, oppure si possono nutrire direttamente questi soggetti con le molecole.

In un mammifero si possono utilizzare anche vettori retrovirali con un 5' e un 3' LTR, oppure vettori plasmidici contenenti la sequenza per il siRNA. Questo vettore viene utilizzato per fare una trasduzione nelle cellule, oppure una trasfezione se si tratta di un vettore plasmidico. Il gene può essere silenziato a breve o a lungo termine.

Oggi si è arrivati ad avere la prima molecola di RNA antisenso per la cura dell'atrofia spinomuscolare (SMA). La molecola SPINRAZA è un oligonucleotide antisenso che ha come bersaglio un gene mutato in questa sindrome. Nei soggetti affetti da SMA si verifica una degenerazione nervosa, che porta alla degenerazione dei muscoli fino alla morte dell'individuo.