Biotecnologie Cellulari

METODICI CHIMICI

In genere utilizzano molecole positive che sono in grado di legarsi ai gruppi P del DNA

che è una molecola carica negativamente; il complesso molecola carrier-DNA viene

fatto gocciolare sulla coltura cellulare utilizzando un reagente un po’ in eccesso

(facilita la permeazione della membrana del complesso).

TRASFEZIONE CON DESTRANO

Quando uso un agente chimico devo poi, a seconda dell’agente, facilitare l’ingresso in

membrana. Il destrano è un polimero abbastanza ingombrante e per facilitare il suo

ingresso in membrana utilizzo due reagenti che si utilizzano anche nella

crioconservazione (entrano all’interno della cellula) che sono glicerolo al 15% e DMSO

al 10%, importante la percentuale. Sistema semplice, economico anche se non molto

efficiente.

TRASFEZIONE CON CALCIO FOSFATO

Possono preparare una soluzione di DNA in cloruro di calcio, questo sistema viene

messo con una soluzione contenente fosfato che va a sostituirsi al calcio e diventa un

complesso insolubile. Il DNA legato al fosfato probabilmente viene endocitato.

Problemi: è dentro una vescicola e non nel citoplasma, in genere una vescicola di

endocitosi può essere considerata carica di materiale da eliminare e quindi può essere

fusa con un lisosoma ed eliminata. Il pH influisce sulle dimensione del precipitato il

quale deve essere ultrafine e quindi bisogna stare molto attenti alle condizioni. Se la

cellula non fa endocitosi è difficile da utilizzare. Probabilmente oltre alla scarsa

efficienza è presente anche un’elevata citotossicità da parte del calcio. Metodo

semplice e piuttosto economico.

TRASFEZIONE CON POLIPEPTIDI CATIONICI

Oltre ad essere in grado di legare di DNA grazie a cariche positive hanno anche

sequenze riconosciute dalla linea cellulare che sto utilizzando. Le molecole di DNA

vengono chiuse dai polipeptidici, grazie a particolare sequenze si avvicinano alla

membrana e vengono portate dentro tramite endocitosi (comunque stessi problemi di

prima). Sfruttando sequenze riconosciute da proteine l’efficienza varia da tipologia

cellulare. Posso ovviare alla via che porta la vescicola al lisosoma tamponando il pH

della vescicola endosomiale e mantenendolo ad un pH tale da non attivare gli enzimi

lisosomiali, ma è comunque difficile far raggiungere il nucleo.

TRASFEZIONE CON LIPIDI CATIONICI (LIPOFEZIONE)

Sistema molto utilizzato. Una delle molecole più comuni è la lipofectamina che è in

grado di provocare piccoli buchi nel doppio strato fosfolipidico ed è anche in grado di

legare molecole di DNA e attraversando il doppio strato fosfolipidico se le porta dietro.

No endocitosi quindi DNA rilasciato direttamente nel citoplasma.

TRASFEZIONE MEDIANTE LIPOSOMI (LIPOFEZIONE)

I lipidi utilizzati sono in parte neutri e in parte cationici, la parte cationica viene

lasciata sul foglietto extracellulare, il DNA non viene internalizzato (non è un vettore

che racchiude il DNA), la parte cationica fa sì che le molecole di DNA si associno al

liposoma all’esterno. Molecola internalizzata attraverso il doppio strato fosfolipidico

della cellula. I liposomi sono abbastanza indicati quando la molecola di DNA è lunga ed

ingombranti, i liposomi non presentano tossicità. Preparare i liposomi in laboratorio è

costoso.

I liposomi li posso anche preparare e il DNA posso metterlo all’interno. Il liposoma si

fonde con la membrana cellulare e rilascia il DNA direttamente nel citoplasma. Oltre

agli stessi svantaggi di prima, un altro passaggio critico è l’incapsulare il DNA dentro il

liposoma.

METODI FISICI

Cerco di internalizzare il DNA direttamente nella cellula senza utilizzare dei carrier,

quindi vado a modificare le caratteristiche della membrana in un determinato punto

per facilitare l’ingresso delle molecole di DNA.

ELETTROPORAZIONE

Sottopongo le cellule ad un campo elettrico ad alto voltaggio il quale produce dei pori

transitori, deve essere ben settata l’intensità ed il tempo se no provoco la morte

cellulare. Il fattore limitante è quello di avere sufficiente DNA per preparare una

sospensione con una densità di DNA omogenea. È la prima tecnica per cui abbiamo

bisogno di una strumentazione vera e propria, c’è un sistema che fornisce corrente a

due piccoli elettrodi. Vantaggio: può essere usata anche su animali vivi.

MICROINIEZIONE

Tecnica che viene utilizzata per esempio anche nelle tecniche di fecondazione in vitro

in cui si prende un oocita, si prende il DNA dello spermatozoo e con un sistema di

microaghi sotto ad un microscopio inserisco il DNA nella cellula uovo. La tecnica è

difficile da fare. L’efficienza è alta, il problema è che posso microiniettare una cellula

alla volta quindi non posso farlo per linee cellulari, ma per cellule singole. Con questo

sistema posso scegliere dove incorporare il DNA.

MICROPROIETTILI

Si basa sull’impiego di microproiettili che sono dei carrier di metallo (oro, tungsteno)

rivestiti di DNA, sistema che presenta i microproiettili in una camera contente gas

inerte ad elevata pressione. Posso usarla anche per animali in vivo, posso scegliere io

il tessuto o l’organo sul quale intervenire. È una tecnica abbastanza impegnativa e

costosa.

TRANSINFEZIONE VIRALE

Usare un virus come vettore significa usare un sistema molto specializzato. Occorre

sapere le caratteristiche della sequenza di geni da trasfettare e delle cellule in cui

voglio trasfettarlo. I più usati sono: retrovirus, herpesvirus e adenovirus. Possono

esserci trasfezioni transienti (adenovirus e herpes virus); i retrovirus a RNA sono usati

per le trasfezioni stabili. È un sistema per immortalizzare le cellule partendo da linea

cellulare finale. I retrovirus usati possono interagire con alcuni geni (Rb, p53) che

tolgono i blocchi alla proliferazione cellulare, diminuendo la sorveglianza sulla qualità

di DNA duplicato (un controllo nella fase M è la corretta duplicazione del DNA). Alcune

duplicazioni per cellule neoplastiche sono spontanee. I virus subiscono delle

modificazioni per essere usati: è necessaria una sequenza di DNA ricombinante, in cui

il gene che voglio trasfettare sia messo sotto un promotore forte (caratteristiche!); per

rendere innocuo il virus usato come vettore devo togliergli la possibilità di andare a

sintetizzare le proteine (es. del capside) che danno la possibilità al virus di avere una

minima autonomia e di lisare la cellula per infettarne altre = devo modificare il

genoma del virus, che non porta più a termine tutti i suoi processi > per far

linee di packaging

moltiplicare il vettore uso cellule particolari: che presentano nel loro

DNA la possibilità di sintetizzare alcune proteine virali; oppure sempre per replicare il

virus, anziché il packaging faccio una coinfezione con i virus helper: ciò che non fa un

virus, lo fa l’altro. Dopo raccolgo il virus nel brodo di coltura perché si trova qui dopo

aver lisato le cellule infettate. Voglio togliere la possibilità di lisare per infettare perché

voglio controllare il virus: uso vettore virale perché ha un’efficienza del 100%.

Genoma del virus: gene d’interesse sotto un promotore forte ed inserito in cellule

che hanno la possibilità di sintetizzare il capside (io non lo voglio nelle cellule da

infettare). Oppure coinfetto con virus helper a cui sono resi innocui i geni della sua

replicazione = non utilizza il meccanismo della cellula per replicarsi, ha solo i geni

tardivi.

Ci sono più possibilità nel modo per eseguire la trasfezione cellulare

Prendo il DNA e lo incorporo nel genoma virale togliendo alcuni geni non

 indispensabili al virus

Aggiungo direttamente al genoma già completo



Se il gene d’interesse è aggiunto o sostituisce dei geni non essenziali per il ciclo posso

avere dei vettori già COMPETENTI per la replicazione (evito di infettare con virus

helper o di usare le cellule packaging): è una strategia un po’ pericolosa perché devo

controllare bene la viralità del virus. Si preferisce usare i virus DIFETTIVI che non

possono sintetizzare le proteine del capside. Nel caso dell’immortalizzazione con

Simian virus (SV40): DNA circolare, fa trascrizione, sono inibiti i geni tardivi cioè viene

a meno la capacità del virus di organizzarsi il capside e di fare la lisi.

Adenovirus: per clonare gene molto grande. Non tutti i virus vanno bene per

 tutte le linee cellulari, ma gli adenovirus possono infettare diversi tipi cellulare.

Il limite degli adenovirus è che la trasfezione è transiente.

Herpesvirus: persiste nella cellula senza integrarsi = in forma episomiale, non

 dà trasfezione stabile ed è un vettore a doppio filamento di DNA. In vivo lo

svantaggio è che è neurotropo: ha come cellule di delezione per l’infezione

quelle neuronali; in vitro quando è usato come vettore va bene per diverse linee

cellulari.

Retrovirus: a RNA = molecola a singola catena; deve usare la trascrittasi

 inversa per sintetizzare una copia di DNA usando come stampo l’RNA > sullo

stampo di DNA viene prodotta la seconda catena di DNA, ma il DNA a doppia

elica non esce dai pori nucleari = integrazione si ha solo durante la divisione

cellulare della cellula infettata (si perde involucro nucleare). Quando DNA è

inserito nel genoma della cellula, questa sintetizza i prodotti genici del virus che

allora può ricostituirsi e lisare la cellula. Il vantaggio è che anche se non è

controllato, non provoca infezioni nell’organismo umano, non accende la

risposta immunitaria; è utilizzato per avere trasfezioni stabili; va bene per molte

linee cellulari; avendo un meccanismo di sintesi di DNA a livello citoplasmatico,

la cellula deve dividersi. Il problema è che la lunghezza del gene da inserire non

può essere grande (< 8 kb).

Con alcuni vettori virali posso decidere la zona in cui inserire il gene d’interesse, con

altri vettori no: ad esempio con retrovirus l’integrazione nell’ospite è casuale

(svantaggio), quindi può portare a mutagenesi e a sviluppo in vivo di neoplasie.

Alta efficienza di trasfezione è valida per tutte le tipologie di virus; lo svantaggio è che

si possono avere delle ricombinazioni tra virus inaspettate, per le trasfezioni transienti

si può avere la trasformazione delle cellule in neoplastiche, la lunghezza di DNA non è

illimitata, possono esserci delle reazioni del sistema immunitario e il grosso svantaggio

sono i costi.

La trasfezione sia con vettori virali o con altri sistemi può avere diverse applicazioni:

Posso studiare la funzione di una proteina

 Modifico inserendo gene reporter per studiare l