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Biotecnologie Cellulari

Appunti di Biotecnologie cellulari basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Bernardini dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biotecnologie cellulari docente Prof. G. Bernardini

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sonda? Conosco la sequenza, disegno dei primer e amplifico per PCR il prodotto,

inserisco nel plasmide, con questo trasformo cellule competenti (cellule di E. Coli

modificate) e lo faccio riprodurre (voglio un’elevata quantità di plasmide). Linearizzo

plasmide con enzimi di restrizione specifici, serve per controllare la sequenza di

trascritto che ho generato per PCR quindi lo faccio sequenziare, una volta confermata

la sequenza uso l’mRNA retrotrascrivendolo e lo amplifico per PCR utilizzando una

strategia. In fase di duplicazione mediante PCR uso Datp, dGTP e dCTP e uso anche

Dig-UTP, digossigenina. Introduco sonde fluorescenti o biotilinate. È bene avere un

controllo negativo, una sonda che non si deve legare, in modo da escludere immagini

di background, dovrei anche avere un controllo positivo che è un sistema in cui so

esserci questo messaggero che sto cercando, serve anche per vedere se la sonda l’ho

sintetizzata bene. Quando ho a che fare con gli embrioni, al termine dell’esposizione li

prelevo, li metto nella soluzione e poi li fisso e li disidrato e li posso conservare in

metanolo al 100%. Se voglio utilizzarli devo reidratarli passando da MeOH al 75%, poi

50% poi 25% e poi li lavo in tampone fosfato, PBT. Successivamente vengono

sottoposto alla proteinasi K che ha il compito di denaturare tutte le proteine

dell’embrione. Incubare gli embrioni con la sonda e visualizzare la localizzazione della

sonda mediante colorazione colorimetrica. L’ibrido viene rivelato anche mediante

autoradiografia o rivelazione della chemioluminescenza.

mRNA -> sonda marcata con digossigenina -> uso ab per riconoscere la digossigenina

-> con fosfatasi alcalina produco composto colorato (via colorimetrica oppure con

chemioluminescenza). Non è una valutazione strettamente quantitativa.

REAL TIME PCR

Serve per valutare quante molecole di mRNA sono presenti nel mio modello

sperimentale, in un estratto di mRNA del modello sperimentale. Per amplificare mRNA

devo prima convertirlo in una copia del DNA (quindi retrotrascrivo l’mRNA e lo riporto

alla sequenza del gene che ha codificato per questo mRNA), lo faccio con una

trascrittasi inversa enzima DNA polimerasi RNA dipendente. Per far partire la PCR ho

due primer (forward e reverse), ho due possibilità in fase di retrotrascrizione: posso

partire dalla coda di PoliA, quindi un primer è un oligo di T. Quando voglio fare una

valutazione quantitativa è meglio usare una miscela di random primers: esameri

sintetici che garantiscono un’alta efficienza di risoluzione per qualsiasi mRNA, questi si

appaiano in modo casuale lungo l’RNA per generareun pool di cDNA di diverse

lunghezze. Con questo metodo tutti gli RNA presenti in una popolazione costituiscono

un templato per la sintesi di cDNA.

In fase di amplificazione uso dei primers specifici secondo cicli di temperatura ben

definiti, cicli prevedono: denaturazione doppia elica di DNA, i due primers vanno a

sintetizzare la catena di nuova sintesi secondo una temperatura specifica di questi

primers che dipende dalla lunghezza e dal contenuto di CG e vanno disegnati con la

stessa temperatura di Melting, poi c’è una fase di allungamento a 72°C. Le

tempistiche non sono per niente lunghe, circa 90 secondi in totale, e si ripetono n

volte. Nella PCR qualitativa che cosa ottengo? Ottengo il mio amplificato e ce l’ho in

una provetta, questa provetta sarà riferita ad un campione (esempio un estratto di

RNA di un embrione), alla fine dell’amplificazione carico il prodotto della PCR su gel di

agarosio. Io conosco la lunghezza del prodotto, dell’amplicone, per una PCR qualitativa

è bene che l’amplicone non sia più corto di 300 nucleotidi. Carico sul gel anche una

miscela standard di DNA, che contiene frammenti di DNA di diverse paia di basi (uso

come marker). L’intensità della banda (che evidenzio perché all’agarosio aggiungo il

bromuro di etidio) dà idea di come il gene sia diversamente espresso nel campione.

Per fare un’analisi semi-quantitativa devo amplificare un gene endogeno, devo usare

un housekeeping che di solito è un trascritto di actina citoscheletrica -> deve avere

lunghezza molto diversa da quel gene di interesse (ad esempio 600 bp) e deve essere

egualmente espressa in tutti i campioni. Devo avere un sistema di acquisizione del gel

che valuti l’area del mio messaggero rispetto all’area del gene di riferimento:

l’espressione è espressa come rapporto tra l’area de reference diviso l’area del target.

Nella Real Time PCR, chiamata così perché ad ogni ciclo viene registrata la

fluorescenza che è indici di quante molecole di messaggero ho nel campione e questa

valutazione viene fatta in tempo reale di ciclo in ciclo. A differenza delle Real Time

qualitativa gli ampliconi sono sotto le100bp, non c’è necessità di far migrare un

prodotto di PCR su gel di agarosio. Per ogni campione, ogni gene viene costituita una

curva di amplificazione dove viene riportata la fluorescenza in funzione dei cicli, per un

certo numero di cicli l’amplificazione non aumenta. Ad un certo punto diventa

esponenziale e poi va a plateau. La linea di base (threshold) definisce il primo ciclo

utile per la quantizzazione del mio mRNA ed è chiamato CT, sopra la soglia di

Threshold. Ho due possibilità per prerare la sonda:

Sonda TaqMan: le trovo già sintetizzate oppure viene disegnata tramite sintesi

 on demand. Hanno una sonda legata a un fluorocromo e a un quencher (silenzia

fluorescenza), in fase di amplificazione del primer questo fa scalzare la sonda,

questa si stacca dal fluorocromo che si allontana dal quencher ed emette

fluorescenza che aumenta in modo esponenziale

SYBR green: ho i due primers, ma non la sonda, questo amplificato il templato

 intercalando ogni tanto qualche molecola si SYBR green

Posso avere diverse curve per diversi amplificati, perché la Real Time posso preparala

in piastre da 96 pozzetti usando diverse sonde e diverse primers. Quello che devo fare

in più con SYBR green, devo controllare che i primers abbiano amplificato solo la sonda

di interesse. Quindi devo costruire una curva di dissociazione: quantitativo di

fluorescenza rispetto alla temperatura. Ogni messaggero deve mostrare un solo picco

di dissociazione, se ne presenta più di uno vuol dire che uno non è specifico. I valori di

CT possono essere messi su un istogramma in cui controllo la valutazione

dell’espressione.

MICROARRAY di DNA

A seconda di come viene preparato il supporto mediante il quale faccio la valutazione

lo trovo anche sotto il nome di gene chip, chip a DNA o biochip; serve un chip che è

costituito da un insieme di sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro

o plastica formanti array in grado di legare sequenze complementari (cDNA o cRNA)

marcati con una sonda fluorescente. Le molecoe di cDNA devo marcarle con un

fluorocromo e in generep per come si posta un array io vado a confrontare un

campione controllo rispetto ad un campione di interesse. Come tecnica, oltre ad

essere usata per l’espressione genica, ha un vasto impiego nella diagnostica genica e

in questo caso l’espressione di messaggeri di cellule sane viene confrontati con

l’espressione di messaggeri di cellule affette da una certa patologia.

Preparazione dei chips: spotting se sono vetrini di vetro, possono essere preparati

da una dita ed hanno una serie di geni elencati o posso farlo fare io come lo voglio io.

Le sonde vengono fissate con sistemi robotizzati in spot, distanziati e vengono incollai

mediane esposizione ai raggi UV, vengono lavati per eliminare il quantitativo di sonde

in eccesso per ogni spottino e poi sono pronte per la vendita. Poi viene messo nella

macchina (lettore a fluorescenza) e dà il risultato. Le sequenze vanno da 5 a 50bp (5 è

molto rischioso), qualche nucleotide può sfalsare tra sonda e sequenza in esame

quindi se il segmento è breve è più rischioso. Il ricercatore prepara gli estratti di DNA

da due popolazioni cellulari che vuole studiare. Poi si deve coniugare gli RNA a un

fluorocromo che emette a lunghezze d’onda differenti e che dia un colore differente

(CY5 verde e CY5 rosso), uno lo uso per il campione e uno per il controllo. Poi miscelo

le provette con mRNA di interesse, coniugati con fluorocromi, in ogni pozzetto ho una

miscela di mRNA delle due popolazioni. Metto il chip nel lettore e ottengo il risultato.

Cosa può succedere? Avrò alcuni pozzetti dove avrò solo fluorescenza verde (quindi

sono i messaggeri e il gene x) alcuni solo rossi (gene y), senza fluorescenza (gene z),

pozzetti con entrambe le fluorescenze (altro gene). Se ci sono pozzetti neri quel gene

non è espresso in nessuno delle due popolazioni. Se c’è un pozzetto giallo è espresso

in modo simile sia nel campione controllo che in quello trattato, verse solo controllo,

rosso solo trattato. È una valutazione quantitativa? Non proprio, posso dire se è

espresso o no. Va riconfermato tutto tramite Real Time.

Applicazioni:

Diagnostica, uso di sonde specifiche per un numero elevato di patogeni

 Studio dell’espressione di geni, solo una piccola frazione di geni è espressa

 (trascritta in mRNA) in una determinata cellula o tessuto. L’espressione dei geni

viene influenzata da una molteplicità di fattori (fase di sviluppo, ambiente,

trattamenti di varia natura, patogeno, etc.)

Cluster analysis: tecnica di analisi multivariata, basata su particolari algoritmi

attraverso la quale è possibile raggruppare le unità statistiche in modo da minimizzare

la lontananza logica interna a ciascun gruppo e di massimizzare quella tra i gruppi. La

lontananza logica viene quantificata per mezzo di misure di similarità/dissimilarità

definite tra le unità statistiche.

Valutazioni citotossicità: si va a valutare la vitalità di un campione. Ci sono alcuni casi

in cui voglio andare a vedere la proliferazione al di là della vitalità. I test di

proliferazione si basano sul fatto che durante un ciclo cellulare può avvenire una e

solo una duplicazione del DNA e che quindi il raddoppio del contenuto del DNA indica

che la popolazione ha dato luogo alla generazione nuova, raddoppio esponenziale. Se

voglio valutare la proliferazione cellulare posso usare, come abbiamo visto l’MTT, ma

in realtà sarebbe meglio andare a valutare il quantitativo di DNA presente nelle cellule

e lo si faceva andando a valutare l’incorporazione di timidina triziata e poi si va a

valutare la radioattività. Altro metodo è quello del citofluorimetro, usando un

intercalante del DNA vado a valutare la popolazione cellulare in quasi sono in fase G1

o in S. Quando devo preparare un saggio con timidina triziata: ho le popolazioni, le

espongo ad un antimitotico o ad un contaminante, dopo il trattamento metto del

terreno nuovo e al quale aggiungo la timidina triziata, ad ogni duplicazione le cellule

incorporeranno un certo quantitativo di trizio. Devo raccogliere le cellule le deve lisare

e vado a valutare la radioattività proprio depositando un certo volume di questo

estratto cellulare su un supporto di acetato di cellulosa o di carta da filtro. Questo

pezzetto devo metterlo in una bottiglietta di vials dove c’è un liquido di scintillazione.

La conta della radioattività incorporata viene fatta con un β-counter, registrazione dei

risultati come CPM (colpi per minuto), più le cellule si riproducono più replicano il DNA

e più timidina triziata incorporano durante la sintesi. In questo caso voglio vedere

l’influenza del siero, che viene aggiunto nei pozzetti, il 3° giorno vengono aggiunte

percentuali crescenti del siero (0.01-10%), lascio per 24 ore, poi aggiungo timidina

triziata, lascio 24 ore, faccio lisi, metto su carta da filtro e vado a leggere e fare il

grafico. Le cellule senza siero crescono meno rispetto a quelle che contengono il siero.

(CPM su concentrazione di siero nel pozzetto). Posso andare a vedere l’effetto di

mitogeni in coltura cellulare: dopo essere stati isolati dal sangue di un oggetto sano, i

linfociti vengono trattati per 48 ore con la sostanza mitogenica da testare e poi

overnight con timidina triziata, poi lisi e conto. Con PHA si è visto che la proliferazione

aumenta con una determinata concentrazione di questa, oltre a questa

concentrazione non aumenta e si va incontro a plateau; con ConA si ha un picco e poi

la proliferazione peggiora.

RADIOATTIVITA’

Processo che porta al decadimento di un nuclide (singola specie nucleare,

caratterizzata da numero atomico Z, da un numero di massa A e da un particolare

stato energetico) mediante l’emissione di radiazioni α, ϒ e β. I radioisotopi sono in uno

stato energetico instabile e quindi tendono a tornare allo stato fondamentale

emettendo energia sotto forma di radiazioni. Quest’ultime vengono chiamate

ionizzanti. Alcuni elementi sopra al 58 della tavola periodica sono radioattivi

naturalmente, come plutonio e uranio. Gli isotopi radioattivi differiscono per la

presenza di un numero diverso di neutroni quindi varia il loro numero di massa. Il

deuterio non è radioattivo, è idrogeno pesante, mentre il trizio è radioattivo.

Origini radiazioni:

Naturali

 Artificiali

Un nucleo in genere è stabile perché ci sono delle forze interne che non permettono

l’allontanamento dei protoni del nucleo anche se sono carichi positivamente. Nei

composti radioattivi questo equilibrio di forze viene meno, c’è uno sbilanciamento

energetico e questo elemento viene a ripristinare le condizioni fondamentali

emettendo delle “particelle”, dell’energia sotto forma di particelle. Un nucleo viene

definito stabile o instabile in base al rapporto Z/A, numero atomico su numero di

massa. Quando si arriva a Z>82 il nucleo è instabile di suo. Le particelle emesse

possono essere nuclei di elio (raggi alfa), elettroni o positroni (β - e β +) o raggi

gamma che sono radiazioni elettromagnetiche. Durante il processo di stabilizzazione

vengono emesse queste tipologie di particelle, la stabilizzazione avviene per

decadimento radioattivo e questo elemento può trasformarsi in un altro elemento

chimico. Questo prodotto della disintegrazione (decadimento) può essere a sua volta

radioattivo oppure no.

Isotopo è quell’elemento in cui il numero atomico è quello dell’elemento di base (non

radioattivo) varia il numero di massa (quello dei neutroni). Idrogeno (1 protone) ->

deuterio (1 protone, 1 neutrone) -> trizio (1 protone, 2 neutrone, 1 elettrone). Gli

isotopi radioattivi possono essere naturali o artificiali. Il nucleo è fatto di protoni e tanti

protoni tendono a respingersi, la maggior parte dei nuclei della tavola periodica sono

definiti stabili grazie alla forza nucleare che riesce a tenere vicini i protoni. Se nel

nucleo questo forze non sono bilanciate il nucleo può diventare instabile e lo stato di

instabilità non è uno stato che permane nel tempo, è momentaneo e si tende a tornare

nelle condizioni di stabilità, queste condizioni vengono raggiunte emettendo

radiazioni. In genere sono nuclei instabili quelli che hanno numero atomico molto alto

e che non osservano un rapporto numero atomico/numero di massa di circa 1/2.

Quando non viene osservato, non osservato per elementi con numero atomico

superiore a 80, si può avere la formazione di isotopi instabili ed emettono particelle

che a seconda dell’elemento sono di diversa natura. Le più comuni sono le radiazioni

alfa che sono dei nuclei di elio, oppure possono essere radiazioni di tipo β che vengono

distinte a seconda della carica della radiazione stessa in raggi β + o in raggi β – e poi

ci sono i raggi gamma che non sono particelle, ma radiazioni elettromagnetiche. La

stabilizzazione di un elemento radioattivo, avviene mediante il decadimento

radioattivo = disintegrazione. Quindi i radioisotopi vengono definiti in base alle loro

disintegrazioni per minuto. A volta l’elemento in cui cade l’isotopo radioattivo può

essere ancora radioattivo. Oltre al numero di disintegrazione l’altra caratteristica

importante è il tempo di dimezzamento: tempo trascorso il quale metà dei radioisotopi

sono radioattivo (da frazioni di secondi a milioni di anni). Gli elementi naturalmente

radioattivi sono circa 10, quelli artificiali sono molti di più. Quelli che vengono usati nel

campo biologico sono pochi: trizio, carbonio15, fosforo32, zolfo35, e iodio 125, 131,

135. Non sono solo fisicamente diverse le diverse radiazioni anche a seconda di come

sono fatte hanno diverse caratteristiche: contenuto energetico e capacità di

penetrazione. Le particelle alfa, dovute al loro ingombro, sono altamente energetiche,

ma una volta emesse perdono la maggior parte della loro energia e della loro velocità

e risultano essere poco penetranti, possono essere schermate da un foglio di carta. Le

particelle β (positroni o elettroni), sono piccole, meno energetiche ma più veloci e più

penetranti, superano il foglio di carta, possono arrivare al corpo e a seconda del tipo

possono raggiungere qualche mm all’interno del nostro corpo. I raggi gamma vanno

utilizzati con delle protezioni, per schermarle servono lastre di piombo o lastre di

cemento di parecchi cm, hanno elevato potere di penetrazione. La particella alfa è

costituita da un nucleo di elio, quindi ha due protoni e due neutroni, origina da atomi

con Z>85, sono veloci, pensati e poco penetranti, perdono energia cinetica a contatto

con l’aria. In una campo elettrico hanno energia inferiore ai 4 MeV, sono molto

ionizzanti, quindi non vanno introdotte. Le particelle β sono più piccole, viene espulsa

da un nucleo quindi diventa un elettrone (non lo era originariamente), la velocità è

molto alta, il potere penetrante è superiore alle particelle alfa, ma ha potere ionizzante

basso quindi la materia non viene alterata. In genere le sorgenti sono tutte esterne

all’organismo perché sono dei reagenti radiomarcati. Come avviene l’emissione di una

particella β? Il decadimento β – si ha quando il nucleo è instabile per un eccesso di

neutroni, sotto determinate forze questo neutrone emette una particella simile

+ -

all’elettrone e si trasforma in un protone, quindi la reazione è n -> p + β . Numero di

massa rimane costante, numero atomico è n+1. Se ad essere radioattivo è il C14,

quando emette una β – si trasforma in N perché aumenta numero atomico (da 6 a 7). I

più comuni radioisotopi usati in laboratorio decadono secondo il decadimento β -. Nel

decadimento β + che avviene quando il nucleo è instabile per difetto di neutroni, è un

protone che emette un positrone che si trasforma in un neutrone. A questo punto il

numero atomico diventa n-1, il numero di massa è costante. Reazione p+ -> n + β+.

In questo caso se si emissione da parte di Na diventa Ne. Questo tipo di emissione è

usato per la PET in ospedale. Un’emissione di β- viene spinta via dall’elemento perché

si trova vicino alle orbite dove corrono gli elettroni, invece il positrone prende un’altra

posizione perché tende ad essere attratto dal nucleo. Emissione gamma: non sono

particelle, ma sono radiazioni elettromagnetiche, i fotoni sono altamente energetici,

parecchi MeV e molto penetranti (più degli alfa e dei β), ma meno ionizzanti. Vengono

schermate al 50% o da 1 cm di piombo o da 6 cm del cemento.

Grandezze:

Elettronvolt, unità di misura delle radiazioni

 Bequerel, Curie, misurano l’attività del radioisotopo, legata al numero di

 disintegrazioni nucleari, legato anche al tempo di dimezzamento

Rontgen, quantitativo radioattività a cui si è esposti, misura dell’esposizione ad

 una radiazione e permette di individuare il tipo di sorgente radioattiva e la sua

pericolosità -> si usa Coulomb

Rad, indicazione della dose assorbita cioè della quantità di energia che le

 radiazioni ionizzanti cedono per grammo di materia o tessuto biologico. La dose

assorbita dipende sia dal tipo di radiazioni che dalle proprietà del materiale

irradiato -> sostituito dal Gray

Rem, indicazione dell’equivalente di dose, cioè alla quantità di radiazioni

 assorbite dal corpo umano in grado di manifestare un effetto biologico. Si va a

vedere l’effetto delle radiazioni, quindi uniforma le diverse radiazioni > si usa il

Sievert

Efficacia biologica relativa: indica il rapporto fra l’effetto biologico di una daa dose di

radiazioni e quello della stessa dose di una radiazione di riferimento. Si misura in vario

modo: numero di cellule rese incapaci di riprodursi, in una coltura (vede su un tot di

cellule quante hanno perso la capacità di riprodursi), intensità ed estensione

dell’eritema cutaneo, frequenza di mutazioni indotte in un organismo, sopravvivenza

degli animali dopo esposizione totale (queste due si vanno a vedere per gli effetti di

queste radiazioni). Questo parametro valutato in modo relativo si misura facendo dei

test in vitro, su campioni biologici; si crea un pannello di dati in vitro al quale poi si fa

riferimento in merito ai danni di un paziente esposto.

Dose biologica efficace: dose assorbita per l’efficacia biologica relativa, grandezza

protezionistica che quantifica il rischio.

Le valutazioni però le devo misurare, la rilevazione varia in funzione della radiazione

che utilizzo, ma anche del contesto, del sistema che voglio andare a valutare. Le

radiazioni le posso utilizzare per impressionare una lastra fotografica, effetto su

un’emulsione fotografica, oppure la posso usare per andare ad eccitare delle altre

molecole presenti in una soluzione o in un cristallo, se la radiazione è ionizzante posso

usare una camera dove è contenuto un gas che viene ionizzato con il passaggio della

radiazione. Scopi principali: misurazioni analitiche, controllare la dose accumulata da

ciascun individuo, controllare i livelli di irradiazioni nell’ambiente e nelle cose, avere

informazioni sul tipo di sorgente radioattiva.

Possibilità di valutare radiazioni di tipo β.

Un sistema molto usato è il contatore a scintillazione (β counter): valutazione della

radiazione del campione è traferita a liquido o solido che trasforma in altro tipo di

energia, per valutare ad esempio come fluorescenza. Trasferimento: interazione con

materiale scintillante, trasferimento di energia e le molecole passano ad un livello di

eccitazione che le rende instabili, emettendo per fluorescenza dei fotoni

(trasformazione di fluorescenza in fotoni). I fotoni non sono quantizzabili, si inviano a

fotomoltiplicatore con diodi che amplificano il passaggio dei fotoni (rendendo

quantificabile) > proporzionale ad emissione radioattiva del campione. In base a se è

solido o liquido: scintillazione in fase solida o in fase liquida. In fase solida di solito il

cristallo è uno ioduro di sodio; nella fase liquida le molecole scintillanti sono in

soluzione organica insolubile, è analisi qualitativa ed è usata anche per quantitativa.

Quando si fa una valutazione in generale con scintillante c’è un’interazione: se

scintillante è in fase liquida metto il radioattivo all’interno del liquido, in genera non si

mischia il campione con il liquido scintillante in maniera diretta ma deposito il

campione radioattivo su un quadrato (2cm x 2cm) di carta da filtro asciugato con

phon, poi metto nel liquido. Nella scintillazione solida il campione deve essere messo

vicino al cristallo, non c’è contatto o miscelazione, il cristallo non è mai contaminato.

Poi una volta scintillato torna al suo stato fondamentale.

Contatore a scintillazione: scintillante strettamente connesso all’apparato di

fotorilevazione (fotomoltiplicatore serve per aumentare ed amplificazione dei fotoni,

fino ad avere valore di rilevazione accettabile, è comunque proporzionale alla quantità

iniziale) > c’è una camera in cui l’energia di fluorescenza è rilasciata (alloggiamento

per campione) e con scintillante, è emessa fluorescenza rilevata da foto moltiplicatore.

La forma dei cristalli solidi: a cubetto, a parallelepipedo o a cilindro. Spesso lo ioduro di

(drogatura dello scintillante)

sodio è miscelato con altre sostanze per aumentare la

scintillazione.

Caratteristiche di un buon scintillante

Dopo essere stato eccitato poi deve rilasciare l’energia ritenuta in luce di

 scintillazione (poi in fotoni)

Tempo di emissione breve

 Indice di rifrazione (sia nel solido che nel liquido) deve essere simile a quello del

 vetro per avere l’accoppiamento ottico con fotomoltiplicatore

Se solido deve essere resistente ma anche malleabile (lavorabile senza che si

 rompa) e trasparente alla lunghezza d’onda di emissione (deve farla passare e

non deve essere una barriera)

Deve avere una linearità di risposta nella trasmissione di energia da radioattiva

 a fluorescente

Β counter è collegato con computer; ha un coperchio che si alza e dentro c’è una

guida di plastica porta provette (vaials) numerate, poi quando faccio partire la corsa

questa linea si avanza fino ad un compartimento di lettura e poi ogni provetta è

portata nella camera di lettura dove c’è emissione di radioattività, raccolta come

fluorescenza. Risultati come cpm (colpi per minuti) per ogni provetta. Posso decidere

di far fare tre letture consecutive prima di fermarsi. Le vaials inizialmente erano di

vetro, ora di plastica ma ugualmente trasparenti alla lunghezza d’onda di emissione.

Metto prima il liquido scintillante, poi il campione (quadratino), si immerge, si agita un

pochino, si mette nel β counter.

Un parametro è la finestra entro la quale il β counter deve fare scintillazione: la

finestra dipende dall’energia emessa dalla radiazione (posso usare due isotopi con

diverse finestre di energia per fare due letture separate per ciascun radioisotopo ???).

Vantaggi della scintillazione:

Metodo di veloce lettura (è automatizzata)

 Se i radioisotopi sono emettitori β deboli, l’amplificazione permette la

 valutazione del campione con maggiore efficienza

Posso valutare il campione solido (minerale, solido…) che metto nel liquido o

 con cristallo, ma può essere anche gel o sospensioni

Per la lettura il campione ha una preparazione abbastanza semplice

 Si possono valutare più isotopi contemporaneamente

 La lettura è automatica; è molto sensibile

 È versatile (si usa per diverse caratteristiche di campioni) e sono accurati

 (faccio più letture per volta per accurarmi che valore sia effettivo).

Svantaggi:

Costi soprattutto del radioisotopo e anche dell’allestimento del laboratorio

 (pressione negativa, vetreria e materiale dedicati appositamente alla

radiochimica – messo in liquido decontaminante -, monitorazione di ambiente

ed utente, filtri da cambiare…)

Problema con fluorescenza è il quencing = qualcosa interferisce con emissione

 di fluorescenza e conteggio di fotoni > quencing dato per un motivo ottico, cioè

vaials sono sporche oppure quencing colorimetrico (liquido scintillante non è più

incolore perché il campione colorato rilascia il colore anche dopo esser stato

messo sulla carta da filtro) oppure un quencing chimico con molecole che

interagiscono per interferenza

Interferenza dovuta a chemiluminescenza = avvengono vere e proprie reazioni

 chimiche tra campione e liquido scintillante. Si possono mettere delle soglie al

di sotto delle quali non considero il segnale per evitare interferenze. I problemi

di chemiluminescenza possono essere superati con riposo del campione (questo

dice perché è bene fare più di una lettura).

I contatori sono fatti anche per valutare degli ambienti: contatori Geiger, con sondina

su vetreria; ho una scala che indica la radioattività (gracchia) nell’ambiente o su

superfici di lavoro. Sono necessari in laboratorio perché i laboratori ogni settimana

devono essere decontaminati, prima di fare verifica con filtri sul materiale di lavoro

(che poi analizzo per vedere se c’è ancora del residuo).

Bisogna valutare anche un’eventuale dose assorbita dall’operatore: ci sono i dosimetri,

cioè rilevatori posizionati nel taschino del camice o come bracciale; sono piccole

pellicole fotografiche e si basano sull’impressione della lastra fotografica che si

annerisce. Ogni utente ha il suo dosimetro che poi viene analizzato.

I dosimetri possono essere anche elettrostatici (a forma di penna) con dentro una

piccola camera di ionizzazione (con gas che si ionizza).

Embrione di Xenopus Laevis -> viene usato e ha le stesse applicazioni delle colture

cellulari.

Problema con i famarci nuovi è la teratogenesi: problema non di mortalità del

feto/embrione, ma è del fatto che l’embrione nasca e formi un individuo totalmente

anormale. Quando avviene la teratogenesi? Quando il danno non è letale; con un

danno drammatico il problema è l’aborto, questo avviene nel 30% senza che la donna

se ne accorga. Quindi la natura deve fare una specie di controllo. Ci sono possono

essere danni limitati che portano a situazioni in cui la gravidanza arriva a conclusione,

ma il nascituro ha problemi di qualsiasi tipo, normalmente si constatano delle

situazione in cui è modificata la forma. Le sostanze messe in commercio devono

quindi essere controllate: controllo fatto con topo, ratto e coniglio. L’obbligo di 3

specie di 3 origine diverse è dovuto al fatto di un gravissimo incidente avvenuto negli

anni ’60. Un farmaco (blando sedativo) era stato messo in commercio, funzionava

molto bene, tossicità molto bassa; per questo farmaco era stato fatto un test di

teratogenesi che era risultato negativo, quindi è stato considerato sicuro. Ma sono nati

bambini focomelici, con gravi problemi agli arti. Sono stati poi fatti altri test e si è

visto che il coniglio era suscettibile al danno che derivava da questo farmaco. Quindi

per i farmaci i test di questo tipo sono obbligatori, perché il danno “sociale”

considerato in tutto il contesto è elevato. Teratogenesi (dà malformazioni) non

significa embriotossicità (questa dà un aborto). Si sono cercati negli anni anche altri

test di teratogenesi, sui mammiferi sono molto costosi. Si utilizza un numero stabilito

di topi, ratti e conigli. Questi test sono poco espansibili a tutti le molecole, sono stati

limitati esclusivamente ai farmaci. Una trentina di anni fa si è incominciato a trovare

altri nuovi organismi modelli -> quello migliore è l’anfibio-> animale molto usato per

sperimentazione di tipo embriologico, perché non c’è un utero e “fa l’embrione fuori”.

Perché si usa lo Xenopus Laevis? (xenopus -> piede strano, perché ha delle unghiette

che in realtà hanno origine nei rettili) è nella famiglia dei pipidi e non delle rane, i

pipidi sono in Africa, ma gli altri si trovano in Sud America -> fenomeno di speciazione

geografica; l’antenato di Pipa Pipa (Sud America) e Xenopus Laevis Tropicalis (Africa)

si sono trovati in due zone di terra che si andavano allontanando e quindi c’è stato un

isolamento geografico. Si è preso come modello perché essendo comodo per la

biologia dello sviluppo ha delle caratteristiche la rana non ha: questa è stagionale, si

riproduce un paio di volte all’anno (principalmente d’estate). A livello del Tropico e

dell’Equatore il concetto di estate e inverno non è che esista proprio quindi lo Xenopus

è un animale che si accoppia anche in altri mesi, quindi va bene come organismo

modello perché non è un animale pretenzioso. Il suo uso principe è che ha precorso

molto i tempi nei periodi in cui non c’erano gli anticorpi monoclonali adsorbe (nessun

sistema di ELISA, nessun sistema per sapere se ci siano gravidanze o no). Questo

animale iniettato nella sacche perilinfatiche ovulano, perché stimolano le cellule

follicolari che danno progesterone che viene fornito all’uovo che va incontro alla

meiosi. L’organismo modello acquisiva sempre più importanza ed è comodo da

studiare tutti lo studiano quindi diventa ancora più noto. Usare questo organismo per i

test di teratogenesi è molto più conveniente a livello economico e a livello statistico; il

fatto che non sia un mammifero è meno regolamentato rispetto alle sperimentazioni

sui mammiferi. Però c’è una maggiore distanza rispetto all’uomo, anche se molti

meccanismi molecolari per quello che riguarda la biologia dello sviluppo sono simili in

tutti i vertebrati (lo stadio filotipico, tutti i geni che controllano e regolano il bodyplan,

etc).

TEST = FETAX

Test di teratogenesi che fa uso di embrioni di Xenopus Laevis, femmina più grande

mentre maschio più piccolo. Come si fa? Fecondazioni in vitro o fecondazione indotta,

poi vengono prodotti degli embrioni che vengono selezionati, vengono trattati, si

raccolgono i dati e si analizzano. Per ottenere le uova? Si prende la rana e si inietta

nella sacca perilinfatica posteriore della gonadotropina, si aggiunge un po’ d’acqua di

stagno e poi si ottiene lo zigote che si divide e si vede il solco di cleavage. La gelatine

tiene i gruppi di uova attaccati in modo che non si disperdano. Per prendere gli

spermatozoi si apre il ranocchio dato che ha i testicoli interni, si fa una sospensione, si

gocciola e si aspetta la fecondazione in vitro. Se no si convince il maschio ad

accoppiarsi con una serie di iniezioni; nella fecondazione in vitro lo sviluppo degli

embrioni è sincrona. Morula: prende il nome dalla morfologia. Si selezionano gli

embrioni e si mettono in trattamento con diverse concentrazioni. Trovare le

concentrazioni non è sempre facile, si fa un pre-test con concentrazione 0 e poi con

concentrazioni crescenti in scala logaritmica. Si mette un certo numero di embrioni

per una piastra di Petri, la cosa si fa n volte per avere ripetizione dell’esperimento. Poi

si vede che succede: dopo 1 giorno ne muoio un po’, dopo il secondo giorno ne

muoiono altri e si può vedere la malformazione in alcuni, si rimuovono quelli morti e si

mantengono quelli malformati. Dal quinto giorni si recuperano un certo numero di

esperimenti. Poi si fa una data collection: per avere tanti dati serve meno tempo

rispetto a quanto ne servirebbe per fare lo stesso esperimento nei mammiferi. I dati

possono essere tanti perché gli embrioni sono molti. La notevole quantità di dati

permette una analisi dei dati statistica abbastanza semplice. Come viene fatta

quest’analisi? Con uno di questi testi: probit, logit, complementary log-log, anova. Se

si vuole fare un grafico all’inizio non succede niente, poi c’è un aumento esponenziale

fino al raggiungimento di un plateau. Mettendo in grafico l’effetto del farmaco si

ottiene una gaussiana. Il picco della gaussiana rappresenta la media, dove c’è il

maggior numero di morti. Esperimento: si aumentano le concentrazioni di qualcosa

che fa morire tutti: all’inizio niente, poi aumento esponenziale, si arriva al plateau che

corrisponde ad un punto in cui sono tutti morti. Quindi non si possono valutare i

malformati, quindi il farmaco è embriotossico. Con un altro farmaco cresce subito la

malformazione e non c’è praticamente mortalità, quindi questo farmaco è

estremamente teratogeno. Più distanti sono le due curve maggiore è la teratogenicità

del farmaco. Con questi test si possono vedere anomalie nella crescita. Molti farmaci

che creano teratogenesi hanno un momento all’inizio a basse concentrazioni che

causa una riduzione dello sviluppo. Bisogna capire se l’inizio sia un ritardo dello

sviluppo oppure no -> test diventa maggiormente sensibile. A che cosa serve questo

test? È stato proposto come un metodo rapido e poco costoso per valutare il

potenziale teratogeno ed embriotossico di sostanze, miscele di sostanze e di campioni

ambientali. Esempio di esperimento: valutazione erbicida (MCPA) -> molecola

interessante perché è estremamente utilizzato ed è “spacciato” come ormone per la

crescita delle piante, però la parte della foglia viene soffocata da tutta la parte che

non fa fotosintesi, porta alla malformazione delle erbe e non fanno più fotosintesi.

Pesticida sintetizzato partendo dal fenolo, vengono aggiunti CH e Cl e poi si arriva

3

all’MCPA. Il risultato è che questa molecola è estremamente tossica. Grazie a questo

tipo di test e grazie al fatto che gli esperimenti non tornavano mai utilizzando prodotti

che venivano da aziende diverse si è purificata questa molecola che ha tossicità

bassissima, mentre gli inquinanti del prodotto (dovuti a delle reazioni incomplete fatte

a livello industriale) sono 100-1000 volte più tossici. Ogni campione è stato analizzato

per l’embriotossicità e si è analizzata anche la teratogenicità; il fetax non è un buon

esempio come test per la teratogenicità perché le curve sono quasi insieme. Questo

composto anche se è assolutamente embriotossico non è teratogeno. Altra

applicazione: ecotossicologia, si può valutare l’inquinamento dei terreni. Il sistema si

monta su un retino, invece di mettere gli embrioni in soluzione li mettiamo insieme ad

un contenitore con un terreno di cui non conosciamo la composizione, ma ci interessa

avere un’idea della sua pericolosità. Si fanno dei test per vedere come cambiano i

campioni prima e dopo la bonifica; la malformazione è ancora più sensibile e si nota

nei vari siti differenti.

Vantaggi:

Poco costoso

 Facile

 Veloce

 Statisticamente robusto

 3 end point: mortalità, malformazione e crescita ritardata

Svantaggi:

Non mammifero

 Non considera il metabolismo materno, la sostanza non viene processata dal

 fegato della madre. A volte ci sono processi metabolici a livello del fegato che

producono sostanze tossiche. La sostanza che testo passa o non passa la

placenta? Non si può sapere, servono dei test alternativi.

Le sostanze da testare devono essere solubili in acqua, possono essere studiate

 anche sostanze poco solubili

Il genere Xenopus appartiene alla classe degli anfibi, all’ordine degli anuri e alla

famiglia dei pipidi. Non considera il metabolismo materno, ma si può prendere un

metabolic acivation system e con questo si tratta la sostanza e si può risomministrare

la sostanza così trattata al test. Vantaggio -> bioetica, gli animalisti non fanno storie.

L’organogenesi è altamente conservata in tutti i vertebrati, è un’estrapolazione non è

un sicuro effetto che si ha nei mammiferi. Vantaggio di usare organismi modello è

perché possono essere utilizzati anche per ricerca di base: biologia dello sviluppo,

biochimica, biologia molecolare, ad esempio analisi del proteoma (elettroforesi

bidimensionale delle proteine). Oltre che per la biologia dello sviluppo, per il quale è

nato il fetax, ha collegamenti con biochimica e biologia molecolare e fisiologia.

Triadimefon è un fungicida, derivato triazolico, agisce bloccando la formazione della

parete della cellula fungina, utilizzato soprattutto in agricoltura contro muffa e

ruggine. È stato sottoposto a test fetax: valutazione embrioletalità e teratogenicità, ha

un rischio teratogeno elevato. Passo successivo: si valuta il tipo di malformazione, si

vanno valutazione di embrioni nel controllo e nei trattati. Si inizia uno studio della

struttura cartilaginea della larva, si colora bene con il blu di metilene e si vanno a

vedere le cartilagini facciali, si va a vedere la sua distribuzione; si nota anche una

diversa distribuzione degli archi branchiali. Questa valutazione si può fare sia

sull’embrione intero sia dopo aver fatto delle sezioni (o affetto embrione colorato o

faccio delle fettine e lo coloro dopo). Passo successivo? Si va a vedere quali sono i

geni coinvolti in questa malformazione o disorganizzazione del tessuto cartilagineo. Si

va a fare una PCR semi-quantitativa, quando si conduce questo tipo di PCR occorre

avere un gene di riconoscimento (housekeeping, ben espresso e che non varia la sua

espressione) e poi si vedono altri geni quali: β-actina, HSP70, XCRABP, CYP26. In

questo caso sono stati valutati 3 stadi di sviluppo: CYP 26 più espresso nei trattati

rispetto che nei controlli. Faccio trattamento nel fetax agli stadi che ho stabilito,

raccolgo gli embrioni rimasti si omogenizzano e si estrae l’RNA e dopo di che è come

se parlassi di una coltura cellulare -> valutazione dei messaggeri. Posso andare a

vedere oltre all’espressione anche la localizzazione dei geni (ibridazione in situ):

prendo sequenza cyp26, si prende una sonda l’ho marcata con colorante,

l’espressione del cyp26 nei controlli e nei trattati, il cyp26 è più espresso nei trattati

che nei controlli. Lavoro fatto anche per gli altri geni di interesse. Ibridazione in situ

fatta su embrioni interi. Il coinvolgimento della cartilagine porta ad embrioni che

hanno malformazioni e rischiano di non potersi nutrire quindi possono andare incontro

a morte. Collegamenti con fisiologia: si prelevano oociti dall’ovidutto della rana (non si

fa il fetax). Perché viene utilizzato l’oocita di Xenopsu? Cellula che si vede ad occhio

nudo, poi perché posso misurare il passaggio di corrente nell’oocita. Questo presente

pochissimi canali; si può trasfectare con un messaggero di mio interesse che vada ad

esprimere in membrana un canale che non c’è. Si va a vedere come il cobalto

metallico piuttosto che il metallo ossido possano passare attraverso la membrana in

forma di nanoparticelle. Non ci sono traslocatori nella membrana dell’oocita, quindi il

passaggio deve essere per forza attraverso la membrana. L’oocita viene trasfettato

con trasportatori cationici o non trasfettato, nel primo caso se passa della corrente

vuol dire che funziona, se passa della corrente col cobalto metallico vuol dire che

questo è stato ionizzato. Nell’oocita non trasfettato non si vede trasporto per il cobalto

metallico né per il cobalto ossido. Si può ipotizzare che la maggior parte del cobalto

metallico si ionizza e diventa cobalto ione. Il dato dell’avvenuta internalizzazione si

può avere facendo microscopia ottica. Proteina che aiuta vescicola di endocitosi a

chiudersi e a staccarsi dalla membrana, si inietta dinamina e si inibisce endocitosi. Le

prove possono essere fatte con molecola fluorescente che è la calceina, può entrare

nella membrana dell’oocita, una volta entrata si metila quindi non può più uscire ed

emette fluorescenza. Abbiamo immagini nel tempo di CoCl2, Co3O4, Co, Co3O4 con

BSA. Il cobalto ossido quencha la calceina. Se il cobalto ossido lo mettiamo a contatto

con la BSA crea un ingombro sterico e quindi non può diffondere attraverso la

membrana, l’unico sistema sarebbe l’endocitosi, ma l’oocita non la fa. Una volta

dentro si può pensare che si sia sciolto e sia andato a formare ioni cobalto che si sono

sciolti nella quenching.

Lo Xenopus è stato sostituito con lo Zebrafish. Cos’ha di particolare questo

organismo? E’ più comodo, è piccolo, si riproduce più facilmente e ci mette molto

meno tempo nel suo ciclo vitale (Xenopus ci mette un paio d’anni per raggiungere lo

stadio adulto). Torna il concetto che l’organismo modello non viene scelto per ragioni

“filosofiche”, ma semplicemente per comodità. Anche Drosophila era stata

“abbandonata” poi era stata recuperata con certa difficoltà dai biologi molecolari.

Usando le urine delle donne incinta lo Xenopus inizia ad ovulare (correlazione tra

Xenopus e test di gravidanza). Dov’è la sacca perilinfatica dove inietto la

gonadotropina? Cos’è un sacca perilinfatica? Nei pressi del circolo linfatico, si trova a

livello del dorso. Lo Xenopus si prende, lo si ferma e con ago da insulina si inietta la

gonadotropina e si entra sotto cute (cute più spessa della nostra). Due modalità

fecondazione: accoppiamento naturale (anche maschio va stimolato con

gonadotropina) la femmina ovula esternamente e maschio copre con sperma le uova

espulse, servono una vasca e due retine; quando avviene fecondazione maschio

feconda e oocita cadono dalla prima rete alla seconda, problema che l’ovulazione non

è costante, gli embrioni non sono sincroni e poi ci sono molti oociti non fecondati.

L’altra modalità di fecondazione: si opera il maschio (muore), si asportano il testicoli,

si fa sospensione di sperma, la femmina con massaggi sulla schiena è indotta ad

ovulare e si questi ovuli viene messo sopra lo sperma, al massimo nel giro di un’ora si

sono fatte migliaia di fecondazioni.

Com’è strutturato un test fetax? Maschio e femmina indotti ad ovulare, ho raccolto

uova in piastra Petri, le ho fecondate e dopo un’ora e mezza faccio la selezione degli

embrioni. Quando vedo il primo solco di cleavaggio -> faccio la selezione con

microscopio stereo. Il fetax in totale dalla fecondazione alla fine dura 120 ore (5

giorni). La soluzione con il test, dopo che hanno perso la membrana vitellina e

sgusciano, cominciano a rilasciare delle scorie quindi la soluzione va cambiata tutti i

giorni. Il trattamento (5/6 ore dopo la fecondazione) si fa allo stadio di morula e la

raccolta dei dati comincia il giorno successivo. Non si parla di ore, ma di stadi che

sono indipendenti dalla temperatura in cui si tengono gli embrioni. L’embrione esce

dal guscio ad un certo punto e poi arriva ad essere una larva a tutti gli effetti.

Importanza di avere un controllo che non presenta la sostanza da testare e poi

campioni in cui la sostanza aumenta di concentrazioni. In ogni Petri ho messo tot

ovine fecondate. Non possono valutare sostanze che non siano idrofiliche se uso il test

fetax, ma si può usare il dimetilsolfossido (DMSO) (composto affine ai composti

liposolubili), quindi per testare sostanze idrosolubili è di sciogliere in dimetilsolfossido

e poi aggiungerle al fetax. Il controllo deve essere doppio quindi, ma non si deve

superare un certo livello perché il dimetilsolfossido è tossico. Non si feconda una sola

femmina, sacrifico un maschio solo, di solito si trattano 6 femmine per cercare di

avere uova da almeno 4 femmine, perché avere i dati da una sola femmina può

essere troppo soggettivo e il risultato finale potrebbe non essere oggettivo o veritiero.

Quindi le uova devono arrivare da almeno 4 femmine. Dopo aver aggiunto la sostanza

di interessa l fetax si comincia a fare la valutazione almeno 12 ore dopo e si inizia a

fare una valutazione per esempio della mortalità: rilevo che nei controlli ho avuto ogni

tanto dei morti, una mortalità entro il 20% è accettata, invece all’aumentare delle

concentrazioni aumenta la mortalità e la rilevazione della mortalità si fa per tutti e 5 i

giorni di trattamento. Al secondo giorno noto che oltre alla mortalità comincio ad

avere degli embrioni malformati (sono due parametri rilevati di pari passo) e vado

avanti fino al 5 giorno dove è possibile che non ci siano neanche più embrioni. Posso

esprimere risultato in modi diversi: mortalità giornaliera. Si possono definire poi i tipi

di malformazioni. Poi si va a valutare il ritardo dello sviluppo (elemento da tenere in

considerazione). I dati poi vengono riportati graficamente. Questo test si usa per

valutare il potenziale teratogeno della sostanza. Grafico: sia sostanza di partenza che

sostanza usata come erbicida si sovrappongo, tranne che per MCPA ha più basse

concentrazioni; prima di malformarsi questi muoiono. Vantaggio fetax: viene

impiegato per studiare la speciazione -> uno stesso elemento può avere diverso

effetto a seconda della molecola in cui si trova. L’arsenico sotto forma di arsenato o

arsenito è molto tossico, se è sotto forma di βina non è tossico. Mortalità cloruro di

mercurio e mortalità del metilmercurio, quello con la curva a sinistra è più tossico. Tra

le due specie il mercurio in forma di metilmercurio è più malformante anche nell’altro

grafico.

MORTE CELLULARE – SAGGI DI VALUTAZIONE DI VITALITA’, PROLIFERAZIONE E

MORTALITA’

Parlare di morte cellulare è molto generale: le cellule vanno incontro a morte ma in

maniera diversa

- Per necrosi

- Per apoptosi

- Per autofagia

Necrosi e apoptosi portano alla morte una volta che sono iniziate; con l’autofagia fino

ad un certo punto si ha condizione reversibile nel caso in cui siano ripristinate le

condizioni iniziali.

Apoptosi: morte cellulare programmata, in seguito ad eventi patologici o fisiologici

perdita > esempi: coda nei girini; interdigitalizzazione delle dita nel feto; omeostati

tissutale come nell’epitelio intestinale; eliminazione di cellule non più utili, come i

linfociti dopo l’interazione con antigene (interazione cellula-mediata = è a carico dei

linfociti T con antigene processato o è presente su cellule riconosciute come estranee,

come nei trapianti, e si ha un’interazione tra le due cellule, poi linfociti T sono eliminati

/ umorale = con linfociti B che si differenziano in plasmacellule per formazione di

immunoglobuline); selezione di cellule in attiva proliferazione; selezione negativa nel

sistema immunitario (quando linfocita non si riesce a specializzare e quindi sono

inutili); in risposta ad agenti tossici = con chemioterapia devo mandare a morte una

certa popolazione cellulare e non tutte (non va bene necrosi perché distrugge anche

tessuto circostante); anche per eventi patologici, come un danno al DNA non riparabile

o come per infezioni virali o autoimmuni (artrite reumatoide). Ci sono anche dei

meccanismi che disattivano l’apoptosi: le cellule modificate attivano dei sistemi per

cui diventano resistenti all’attivazione dell’apoptosi; le cellule diventano facilmente

resistenti anche ai chemioterapici perché disattivano l’apoptosi.

La necrosi è un evento di morte che avviene solo in condizioni patologiche e

irreversibili: si ha morte cellulare in seguito a lesione tissutale come trauma, ischemia,

deplezione di ATP -> ATP ha emivita molto breve (in 30minuti la quantità dimezza)

quindi se cellula non produce più ATP, muore.

L’autofagia si attiva in situazioni particolari come mancanza di nutrienti = si forma

autofagosoma che racchiude organelli o parte di organelli che si fondono con lisosomi.

Durante il ricambio di organelli vecchi si usano più metodologie insieme.

Apoptosi indotta durante la formazione delle cellule -> durante formazione dita è

indotta la proteina BMP che attiva l’apoptosi = cellule con apoptosi sono più

fluorescenti; perdita della coda dei girini indotta da ormoni tiroidei.

La formazione dell’autofagosoma avviene con meccanismi complicati: piccole porzioni

di membrana si organizzano per fare autofagosoma intorno a sostanza da dismettere.

Posso anche dismettere alcuni organuli anche se sono ancora funzionali, ma le

condizioni necessitano un risparmio. L’apoptosi NON scatena una risposta

infiammatoria a differenze della necrosi, ma è un fenomeno legato a cellula o a gruppo

di cellule. Una cellula che fa apoptosi mantiene la funzione della membrana fino ad un

determinato stadio > poi cellula perde acqua, il DNA si spezza per azione di alcune

endonucleasi che taglia il DNA tra due nucleosomi (ottameri istonico più DNA di circa

200bp) = è un taglio ordinato; c’è disintegrazione dell’involucro nucleare; poi

membrana si chiude intorno ai frammenti di DNA = corpi apoptotici. Con la necrosi la

cellula sembra gonfiarsi fino alla distruzione della membrana con rovesciamento dei

contenuti cellulare = scatena risposta infiammatoria perché coinvolge tessuti

adiacenti. Dal punto di vista istologico nell’apoptosi può colpire cellule isolate, no

infiammazione e non coinvolgimento di cellule vicine / nella necrosi muore un gruppo

di cellule e c’è infiammazione.

Dal punto di vista morfologico nell’apoptosi c’è coartazione (perdita acqua), poi si

frammenta, DNA frammentato regolarmente / nella necrosi c’è rigonfiamento e

rovesciamento degli organuli compresi i lisosomi (ma comunque non funzionano per

pH diverso da 5) e il DNA degrada con strutture grossolane. Permeabilità membrana

mantenuta fino ad un certo punto nell’apoptosi / persa subito nella necrosi. Elementi

biochimici nell’apoptosi non c’è presenza di calcio; si rilascia citocromo c / nella

necrosi c’è aumento di calcio citoplasmatica. Per la formazione dei corpi apoptotici se

si osserva con microscopio a scansione: vedo gemme che si staccano = corpi

apoptotici > valutazione morfologica dà possibilità di vedere apoptosi piuttosto che

necrosi. Anche la morfologia interna può discriminare necrosi da apoptosi: nella

necrosi c’è dilatazione dell’involucro nucleare ma anche nei mitocondri (sono alterate

anche le strutture degli organuli).

Dal punto di vista biochimico: frammentazione DNA, rilascio citocromo c e rilascio di

enzimi specifici = caspasi, normalmente presenti nel citoplasma come pro-caspasi;

hanno domino N-terminale e C-terminale e in seguito all’attivazione del processo

apoptotici, le molecole sono tagliate in due punti perdendo N-terminale e si associano

in dimeri, raggiungendo la conformazione attiva. L’attivazione delle caspasi è un

meccanismo a cascata > non si ferma quando è attivato e ci sono diverse fasi: una

molecola ne attiva 10 con diversi target = fenomeno è amplificato.

Caspasi iniziatrici: nella prima fase apoptotica; fanno enzimi proteolitici di

 enzimi caspasi effettrici che hanno poi diversi target su cui agire

- Segnali apoptotici possono essere esterni: perdita di adesione cellulare,

mancanza fattori crescita/sopravvivenza, citotossicità di linfociti T. Attivano

caspasi iniziatrici 8 o 10.

- Segnali interni: danno al DNA o ai mitocondri: attivano delle caspasi iniziatrici 9.

Caspasi esecutrici (o effettrici): sono le stesse indipendentemente dal segnale,

 sono la 3, la 6 e la 7.

Vanno ad attivare le endonucleasi per frammento di DNA, oppure attivano

proteasi di citoscheletro inducendo formazione di corpi apoptotici. Può esporre

residui saccaridici (glicosidici) esterni per dire di fagocitare.

Fattore esterno dato da riconoscimento di antigeni di membrana da linfociti T, attiva

gli enzimi per idrolisi di pro-caspasi 8 che agisce su caspasi 3 che agisce su diversi

target. Se stimolo è interno attiva pro-caspasi 9 che attivata agisce su pro-caspasi 3

con stessi target di quella attivata per via estrinseca. Si chiamano caspasi perché

tagliano dopo acido aspartico e sono molto evolute.

Substrati delle caspasi effettrici:

Caspasi 6 taglia le lamine (proteine di famiglia di filamenti intermedi che stanno

 nel citoscheletro nucleari = favorisce destabilizzazione involucro nucleari)

Caspasi 3 -> su α-codrina di citoscheletro (che è destabilizzato), su ICAD che è

 inibitore di enzima che attiva endonucleasi, PARP1 (via metabolica di riparo del

DNA) = se taglio questa impedisco il processo di riparazione del DNA. (Queste

ultime due servono per frammentazione)

Modifiche morfologiche

Valutazioni morfologiche: gemme apopt-rigonfiamenti

 Modifica di distribuzione di fosfolipidi di membrana

 Fosfatidilserina di solito nel citoplasma, ma con apoptosi si porta nella faccia

 esterna: scramblasi, porta fosfatidilserina fuori nel foglietto extracellulare, non

nella morte per necrosi; flippasi, preferenza per residui carici

Variazione del potenziale nella membrana

 Rilascio del citocromo c per attività caspasi (test vedono presenza)

 DNA frammentato regolare apopt/irregolare in necrosi

 Quando uso sistemi per valutazione con fluorocromo:

 citofluorimetro/microscopio a fluorescenza o con lettore di piastre

Valutazione morfologica con TEM, SEM o colorante per vedere

 compattezza/disgregazione nucleo

Elettroforesi dice come si è frammentato DNA

 Saggio di TUNEL

 Sistema che sfrutta perdita simmetria membrana sfruttando legami tra

 fosfatidilserina e ??

Saggi attivazione caspasi

Causa di apoptosi: perdita di adesione con proprio substrato -> valuto se cresce in

sospensione, se ci sono tutte. Se saggio è su piastra e c’è morte per apoptosi ho una

sottostima di cellule morte (devo stare attenta a non buttare le cellule staccate). Chi

ha citofluorimetro valuta 2 componenti di luce (diretta o deviata). I segnali raccolti

vengono messi in citogrammi con le due componenti di luce -> componente forward

prevale su side (con granulazione e basso nucleo/citoplasma) in cellule normali diverse

in apoptosi aumenta la luce deviata (side) -> c’è una diversa disposizione di nuvola tra

cellule normali e in apoptosi. Posso fare un’aggiunta, oltre alle 2 componenti, di luce

trattando prima con ioduro di propidio (apoptosi porta a diversa permeabilità di

membrana a uno stadio) = escluso nelle vie, entra nelle morte -> discrimino:

Vive, no fluorescenza

 Morte per apoptosi

 Alterazione di membrana per permeabilità di ioduro, morte per necrosi

Valuto la condensazione della frammentazione del DNA colorando con DAPI

(fluorocromo che si lega con DNA) -> vedo stadi cromatina del DNA = vedo quanti

nuclei sono apoptotici; DAPI permea la membrana con detergente per inserirlo.

Valuto frammentazione DNA -> raccolgo le cellule, estraggo DNA, faccio

elettroforesi: endonucleasi taglia in multipli di 200, controllo -> DNA non si muove da

pozzetto, DNA con calore = smear, induzione apoptosi = frammentazione regolare dei

frammenti.

Valutazione con metodo TUNEL

Si una terminaltransferasi che lega nucleotidi a catena DNA senza stampo:

DNA deve essere frammentato da endonucleasi per avere tanti 3’

 Attacca desossinucleotidi (UTP) con biotina -> può essere riconosciuta perché

 affine a streptavidina coniugata con fluorocromo

Nuclei con fluorescenza hanno DNA frammenti

 Strept + perossidasi = nuclei bruni sono dove si sono attaccate le estremità

 2+

Modificazione della membrana plasmatica. Anexina in presenza di Ca lega la

membrana plasmatica, dove è rivolta verso il citoplasma non legherà anexina V,

mentre quelli rivolti verso l’esterno la legheranno. Usando lo ioduro di propidio entra in

cellule già morte per necrosi e non apoptosi. Lo ioduro di propidio (colorante) si lega

all’anexina V. guardiamo la fluorescenza emessa da ioduro di propidio -> le cellule ad

elevato contenuto di ioduro di propidio sono già morte. Cellule positive per anexina V e

negative per PI sono cellule apoptotiche, doppio negativo sono cellule vive. La caduta

del potenziale di membrana mitocondriale è uno degli eventi precoci della cascata

apoptotica ed è un evento reversibile. Questo fenomeno causa un aumento della

permeabilità della membrana con conseguente rilascio di molecole, quali CytC.

Quando la funzionalità del mitocondrio è persa c’è la caduta della differenza di

potenziale esercitata dal CytC; viene sfruttato un fluorocromo cationico e lipofilico ->

nome del colorante JC-1. In forma aggregata la fluorescenza cade nel rosso (circa

590nm). Uno spostamento di emissione dal rosso al verde indica che la funzionalità del

mitocondrio è andata perduta -> no fluorescenza rossa (vuol dire che non c’è più

colorante nel mitocondrio) -> valutazione microscopica. Nelle cellule vitali con elevato

potenziale di membrana JC-1 si localizza a livello della membrana mitocondriale sotto

forma di aggregati che danno fluorescenza rossa. Nelle cellule dove è avvenuta una

caduta di potenziale di membrana il colorante rimane in forma monomerica a livello

citoplasmatico dando una fluorescenza verde diffusa. Posso accoppiare la valutazione

microscopia con associazione ad un citofluorimetro; la fluorescenza rossa persa

quando viene soggetta a più tempo di esposizione ad agente che induce apoptosi.

Centrifugazione differenziale per separare mitocondri e citosol e si usa una proteina

come controllo (es GAPDH).

Analisi dell’attivazione delle caspasi: utilizzo un kit dove al suo interno c’è un

substrato legato a un fluorocromo per la caspasi 3 e 7 (effettrici). Preparo le multywell,

semino, lascio 24 ore prima del trattamento poi aggiungo il reagente per le caspasi,

incubazione, leggo la fluorescenza di ogni pozzetto. La quantità di fluorescenza

generata è proporzionale all’attività delle caspasi presenti nel campione.

Autofagia: può essere un processo fisiologico. Attivata in caso di mancanza di

nutrienti; autofagosomi racchiudono organelli o parte di essi quindi si fondono con i

lisosomi. Quando una cellula si trova in condizioni di nutrienti, membrane isolate

appaiono nel citoplasma. Successivamente, la membrana si estende intorno a

componenti presenti nel citoplasma (mitocondri e altri organelli di grandi dimensioni).

Le estremità si fondono a comporre un autofagosoma; quando l’autofagosoma si fonde

con un lisosoma, i suoi contenuti sono degradati. Gli aa acquisiti attraverso

autodigestione sono utilizzati come fonte di nutrienti. Una forma citosolica di LC3 (LC3-

I) è coniugata alla fosfatidiletanolamina per formare LC3-fosfatidiletanolamina (LC3-II),

che viene reclutata nella membrana dell’autofagosoma. LC3 è una proteina MAP, è

caratterizzata da catene leggere ed è presente in forma libera o associata alla

fosfatidiletanolamina. Si usa un kit che si basa su metodo fluorescente che va bene

per cellule in adesione e in sospensione e questi agenti legano molecole presenti nei

vacuoli autofagici. La fluorescenza viene messe ad un pH particolare che è indicazione

che il lisosoma si è legato all’autofagosoma. Sono state messe le cellule in terreno

privo di siero; controllo: clorochina e clorochina prive di siero e si sono visti gli effetti:

LC3B saggio: ab che riconosce LC3 uno coniugato con il rosso e un altro con il verde ->

quando lisosoma si fonde con l’autofagosoma si vede solo una LC3 -> guardo prima

con il verde e poi con il rosso, sovrapponendoli e solo dove avrò sovrapposizione si

sarà formato l’atuofagosoma.

ANTICORPI E CONTAMINAZIONE

I terreni e soluzioni devono essere sterili ed essere aperti solo sotto cappa. Penicillina

e streptomicina sono usati per evitare contaminazioni da batteri, mentre anfotericina B

contro i miceti (funghi). Vetreria autoclavata, cappa a flusso laminare pulita con alcol e

H O. Si usano i pipettoni elettrici. Filtri controllati periodicamente e incubatori puliti

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periodicamente. La contaminazione generalmente è visibile e l’agente va a provocare

una variazione del pH e intorbidimento del terreno. Virus e micoplasmi -> più difficili

da vedere. Controlli periodici: per vedere se c’è contaminazione o meno. Micoplasma

-> difficile da individuare perché non dà un effetto macroscopico. Se si vede che il

campione è soggetto a contaminazione questo è da buttare. Cambiamenti:

pH e torbidità nel medium di coltura

 Cambiamenti morfologici

 Presenza di strutture granulari o filamentose

Metodi per vedere micoplasma:

Crescita colonie

 PCR

 WB

 Colorazioni fluorescenti

MICOPLASMA

Famiglia numerosa, chiamate cellule minime perché formano un cromosoma,

membrana e ribosomi; gli antibiotici non funzionano perché non c’è la parete. Hanno

forma diversa e dimensioni molto piccole. L’indicazione di usare un pipettatore

elettrico è perché il maggior rischio è dato dall’operatore di contaminazione. Vanno a

filtrare su film con maglia 0.2 micron -> micoplasmi sono più piccoli quindi non

vengono filtrati. Linee continue -> maggiore contaminazione. Colture primarie ->

minore contaminazione.

Effetti sulle colture: la contaminazione da micoplasma compete con le cellule per lo

sostanze nel terreno e a seconda del micoplasma e la linea l’effetto è diverso. Il

numero supera di 1000 volte il numero di cellule in coltura. Si nota la presenza di

detriti fino alla morte delle cellule in coltura. La crescita delle colonie avviene in brodo

o in agar (sospensione o adesione); PCR; colorante che si intercala nel DNA. Metodi di

coltura per micoplasma:

Agar -> prelevo della coltura da esaminare -> incubazione per 21 giorni -> si

 vedono “uova al tegamino” -> metodo abbandonato perché è troppo lungo

PCR -> kit con coppie di primer che amplificano l’RNA ribosomiale 16S -> si

 accerta la presenza di molti micoplasmi

Brodo di coltura -> PCR -> carico il prodotto di PCR in gel con uno standard e

 controllo positivo -> presenta banda = contaminazione da micoplasma

NESTED PCR -> nella prima coppia di primer amplifico un trascritto che mi dà

 un prodotto che potrebbe non essere visibile quindi riamplifico con prime che

sono stati disegnati internamente al trascritto che penso di ottenere

DNA stain -> uso di un colorante che si intercala a livello del DNA e in questo

 caso il DNA del micoplasma appare all’interno delle cellule fluorescente

La PCR è più veloce e ha sensibilità maggiore; DNA stain ha una sensibilità

 media e individua tutti i micoplasmi

ANTICORPI

Glicoproteine prodotte da linfociti B che si sono differenziati in plasmacellule e

riversate nell’ambiente extracellulare a formare il complesso ag-ab + attività

tumorale. Una molecola per essere antigenica deve essere grossa ed estranea ad un

organismo e va a stimolare la risposta immunitaria.

IMMUNOGLOBULINE

Formate da due catene pesanti e due catene leggere con ponti disolfuro; sono formate

da una porzione costante nelle catene pesanti e una porzione variabile nelle catene

leggere; la parte variabile è quella che serve per il riconoscimento e il legame con

l’antigene.

ANTICORPI POLICLONALI: miscele di Ig che riconoscono parti diverse dello stesso

ag -> prodotti da plasmacellule diverse.

ANTICORPI MONOCLONALI: derivano da un clone cellulare e riconoscono lo stesso

epitopo.

Diverse classi di Ig: IgA, IgG, IgE, IgM, IgD.

ANTICORPI UMANIZZATI

Ig fatte produrre da una specie diversa dall’uomo, dove sono state tolte parti per farle

“accettare meglio” dall’individuo che le usa per trattamento immunitario -> bisogna

ingegnalizzarle.

POLICLONALI: in vivo sono più efficienti. Un ag può avere diverse parti che stimolano

gli ab. Come si ottengono? Immunizzazione di un animale (topo, coniglio, etc.) e dopo

qualche settimana raccolgo il siero ed ho ottenuto la miscela di ab -> devo sottoporli

ad un processo di purificazione facendoli ad esempio precipiatare e isolare

(cromatografia su colonna/affinità). Il siero deve essere addizionato con stabilizzanti e

conservanti e deve essere valutato il titolo degli ab. È possibile anche liofilizzarlo e

conservarlo sotto polvere.

MONOCLONALI: più recenti e isolati di Kholere e Milstein; non può essere fatto in vivo.

Coltivazione in vitro: il problema è che i linfociti B non vivono a lungo. Soluzione

(ibridomi): i linfociti B vengono fusi con le cellule immortalizzate di mieloma. Quando si

fondono mettono insieme il patrimonio genetico formando l’eterocariotipo -> i due

nuclei entrano in mitosi insieme e cromosomi ugualmente ripartiti nelle cellule figlie

con nucleo comprendente lo stesso patrimonio. Fattori di crescita necessari. Se una

cellula in fase S si fonde con una cellula in fase G quest’ultima duplica il suo DNA. La

cellula in fase S contiene fattori che inducono la replicazione del DNA nella cellula in

fase G. A seconda delle fasi il cariotipo è differente. I fattori sono fase-specifici. Se

voglio preparare un ibrido devo stimolare la fusione attraverso un fusogeno come PEG

o il virus di Sendai inattivato agli UV. Una volta costituito l’ibrido devo isolarlo dalle

cellule non ibridate usando un terreno selettivo (HAT: ipoxantina, timidina,

aminopterina) dove può crescere l’ibridoma e non solo linfociti B o mieloma.

Immunizzo il topo -> raccolgo il siero -> produco ibridoma -> produzione continua di

ab monoclonali. (Ogni plasmacellula produce un solo tipo di ab).

La linea di mieloma è deficitaria per gli enzimi GPRT e timidina chinasi necessari per la

sintesi di nucleotidi -> non crescono su terreno HAT. L’aminopterina blocca la sintesi

endogena di purine e pirimidine. I linfociti B muoiono per conto loro mentre il mieloma

non avendo i due enzimi di base non riesce a crescere. Ibridomi diversi a seconda di

quale linfocita B si è fusa con quale mieloma.

Cellula ibride -> bloccata la sintesi ex novo dei nucleotidi -> attivata la via di

salvataggio aggiungendo il substrato per i due enzimi permettendo così agli ibridomi

di crescere.

Titolo anticorpale basso: nuova immunizzazione. Titolo anticorpale alto: propagazione

ibridomi.

Verifico ab di interesse nelle piastre dopo la diluizione per il clonaggio -> metodo

ELISA. Produzione di ab monoclonali. Il clone di interesse viene espanso per la

produzione di ab in vivo. Provoco infiammazione ed inietto gli ibridomi. L’ab va

purificato in quanto è una glicoproteina che viene secreta nel terreno di coltura: si

rimuovono le cellule attraverso cromatografie e aggiunta di conservanti -> filtrazione

+ polvere se liofilizzati. Selezione dell’ab desiderato e valutazione del titolo. Il titolo è

l’inverso della più bassa concentrazione e la sua attività può essere rilevata mediante

ELISA, WB, saggi immunologici.

Saggio di diagnostica che va a valutare il complemento come fattore embriotossico

(via classica e via alternativa). Si attua una diagnostica traslazionale: si va a studiare

la letteratura, ricca di info scientifiche, molte volte si pubblica il lavoro e poi si

abbandona, molte pubblicazioni importanti sono degli anni ’80. Quindi si analizza una

pubblicazione, si fa ricerca e sviluppo per provare a ricreare quella ricerca, se funziona

si può provare se il saggio ha una tipologia di protocollo sperimentale si fanno due

passi: validazione scientifica (ha senso fare quel saggio? Se ha rilevanza a livello

diagnostico) e rilevanza clinica. Si va ad analizzare, si va a tentare di capire dove si

possa agire, esempio: infertilità, si fanno dei saggi che non hanno una rilevanza

scientifica in questo caso. 15% di infertilità idiopatica (quando non si ha una causa

vera e propria): dopo due anni di controlli non si hanno più idee. Potenziali cause di

questa infertilità: immunologiche, endocrinologiche e genetiche, quelle immunologiche

non si considerano più.

Fattore embriotossico: potrebbe esistere all’interno del siero qualcosa che inibisse

l’impianto dell’embrione. Il saggio che era stato fatto nel 1983 (Oksenberg) era un

saggio molto complicato: saggio in vivo con topi, vengono ingravidati, si aspetta che la

gravidanza andasse avanti, circa 30 embrioni, si mettono in coltura e vengono trattati

con il siero della paziente: alcuni sieri inibivano completamente la crescita degli

embrioni in vitro. Quindi si andò avanti a fare studi e si arriva alla conclusione dell’ETF:

ipotesi della natura di questo o presenza di alcuni Ig o di alcuni citochine, l’utilizzo del

modello di tipo era ideale all’epoca perché poteva simulare esattamente quello che

succedeva. Ma c’è un fattore non controllabile: questi embrioni venivano espiantati

dall’utero poi messi in coltura e trattati col siero, quello che non si controllava era il

fatto che l’embrione viene espiantato. Quindi bisogna valutare le eventuali

problematiche e la funzionalità. Alcuni degli embrioni potevano portare modificazioni

genetiche che per attività paracrina portavano alla morte degli altri embrioni. Bisogna

assolutamente analizzare il modello. Si prendeva il siero e si attua la

scomplementazione: si sospende il siero della paziente, per eliminare il complemento

che può indurre una proliferazione non desiderata, si fa per 30 minuti a 50°C, solo le

proteine del complemento vengono disattivate. Ma le proteine del complemento del

siero di queste pazienti rimanevano. Oksenberg aveva creato un saggio diagnostico

per la valutazione del fattore embriotossico.

Modello alternativo: anche se l’idea di fondo razionale e scientifica è ottima. Modello

alternativo -> ZEBRAFISH! Nell’arco di 2/3 mesi sono adulti, quindi è modello molto

veloce, dal punto di vista filogenetico non sono molto lontani da noi soprattutto dal

punto di vista immunitario, da altri punti di vista filogenetici sono molto diversi da noi.

Dal punto di vista dei recettori (proinfiammatorie o antinfiammatorie TH1 o TH2)

zebrafish non è in grado di recepire e trasferire il segnale delle TH1 e TH2. In 72 ore

schiudono, perfettamente natanti, vantaggio grosso è che non è controllato dagli

animalisti. Sotto le 72 ore è considerato materiale biologico, non rientra nella

sperimentazione animale, è un saggio in vivo ma dal punto di vista normativo è quasi

un saggio in vitro.

Procedura: si hanno strain di zebrafish con pedigree, si lavora su particolari cloni, la

progenie avrà le stesse caratteristiche genetiche. Vengono messi 5 maschi e 5

femmine, fanno circa 600 uova alla settimana, le uova cadono sotto la retina, non

vengono indotti per la fecondazione, nel momento in cui vanno in bassa acqua in

condizioni di buio fanno le uova, stessa cosa di quando sono in natura. L’operatore e il

sistema devono essere il meno perturbati possibili. L’uovo è un modello perfetto

perché è nel suo stato fisiologico, passa dall’acqua ad una coltura con una

concentrazione piccolissima di antibiotici e antifungini. Il corion serve per difendere in

tutti i modi possibili l’embrione quindi è difficile lavorare sull’embrione a 24 ore. Si può

decorionare l’uovo a mano, non si fa chimicamente perché potrebbe deteriorare

l’embrione. Dopo la decorionazione rimane col sacco vitellino, poi si fa il protocollo

lungo: piastra da coltura cellulare, n embrioni in n pozzetti. Si trattano 10 embrioni in

triplicato (per creare deviazione standard) con il siero della paziente, si mette il 25% di

siero della paziente (valore di riferimento), percentuale che permette di avere il vero

positivo e il falso positivo. La maggior parte degli uomini risultano negativi, cambiava

qualcosa con i referti idiopatici. Prima fase: fare un test generale. Seconda fase: pochi

uomini erano positivi. Terza fase: si fa sulle donne, popolazione di controllo contro

popolazione di infertilità per trovare un valore di riferimento. Quando si è positivi e

quando si è negativi? 65 controlli e 300 casi, si vanno a vedere le differenze tra infertili

idiopatiche e donne che non avevano mai avuto eventi abortivi, avevano portato

almeno una gravidanza a termine e non avevano patologie autoimmuni. A questi

controlli si è fatto il pannello anticorpale. 98,9% di valore positivo predittivo. C’erano

controllo che uccidevano tutti gli embrioni nell’arco di un tempo predeterminato. Dov’è

il cut-off? È il 30 dove non ho i controlli, ma ho solo i casi, dove ho il 70% di mortalità.

Anche i controlli che erano risultati parzialmente positivi: una con problematica

immunologica, una aveva un’infiammazione cronica e sospeso il trattamento con il

farmaco era recidiva.

Valutazione: si comincia a categorizzare a seconda del tempo, dopo di che si

trasferisce con protocollo statistico in un saggio, quindi la paziente risultava abbinata

ad un determinato valore. Le citochine non sono il nostro target, il saggio da cui si è

preso spunto scomplementava il siero e si vedeva l’effetto. Quindi si è deciso di

scomplementare anche in questo caso, si è visto che la via classica non era un

problema in quanto i pesci hanno alcuni geni che hanno un deficit sulla via classica,

ma non sulla via alternativa. Quindi si ipotizza che si è sulla via alternativa e si va a

provare questo: si prendono 20 sieri positivi, 80% alto, 10% moderato, 10% basso; si

fa scomplementazione fisica a 56°C per 30 minuti, tutti i positivi sono diventati

negativi, assoluta certezza scientifica che quello che andiamo a vedere come effetto

positivo è mediato dal complemento. Altra metodica per scomplementare il siero? Si

aggiungono 10mM di EDTA all’interno del siero, è anche esagerata come

concentrazione. Con questo metodo però solo il 33,3% si è negativizzato mentre il

66,6% ha un effetto basso. Perché non si è riusciti a invertire l’effetto del

complemento? Perché si ha un’iperattivazione del complemento, idea della

motivazione fisiologica per cui quelle pazienti ha un’iperattivazione del complemento.

Questo 33% deriva dal basso, dal moderato e da un alto. L’infertilità si ha dopo 12

mesi che una donna non riesce ad avere una gravidanza dopo rapporti non protetti

mirati a questo scopo.

Saggio CAT(F): studi su 260 casi campioni appartenenti a pazienti infertili idiopatiche

reclutate da delle cliniche, 64 controlli appartenenti a 46 donne gravide, 7 uomini. Le

infertili: 65% positive, contro il 35% -> rilevanza scientifica elevata, rilevanza anche

clinica. Di queste 65% poi si categorizzano, alcuni sono basse, altre alte. Embrioni di

zebrafish: tessuto complesso, non è il classico saggio, è un tessuto organizzato con la

sua fisiologia e le sue risposte. Il saggio CAT rappresenta l’unico saggio per la

valutazione in vivo dell’attività del complemento. Il siero di donne inferitili idiopatiche

mostra sugli embrioni di zebrafish una tossicità maggiore. Nell’infertilità femminile ci

sono dei problemi clinici, ci sono dei grossi buchi: lo stress, fumo, patologie,

inquinamento, nutrizione inappropriata, sistema immunitario. Il valore di TSH varia da

Nord a Sud Italia (non si sa per quale motivo). La presenza di anticorpi fosfolipidi

induce la fertilità e abbassandoli si ha la poliabortività anche se potenzialmente fertili.

Biomarcatori identificati:

CATF, complement activity toxic factor

 TNFα, tumor necrosis factor, citochina 1 secreta da un tipo di cellule, ma in

 situ, nel siero non deve essere presente

TOS, stato ossidativo totale, marcatore che è a monte di tutti, interfaccia tra

 noi e l’ambiente esterno, ciò che si ripercuote in un valore biologico reale,

perossidazione lipidica, danno cellulare vero

GLY, glicodelina, proteina che ha la facoltà di sopprimere l’endometrio della

 mamma nel momento in cui si attacca l’embrione

49% positiva al CATF, 18% positiva al TNF, 20,2% positiva al GLY e altra % positiva

al TOS.

Immunox: pannello che include i 4 marcatori.

Overall pregnancy rate: n=47 pazienti, 18 positive a uno dei marcatori -> 2 incinta,

16 non incinta, 11,1%. 29 negative, 5 incinta, 24 non incinta -> 17,2%. Facendo

una deviazione standard la paziente che risulta positiva ad almeno dei marcatori ha

il 36% di probabilità in meno di rimanere incinta. Trattamento con NOFLAMOX:

antiossidante, estratto di papaya fermentato con curcuma, questa non viene

assorbita; anti-infiammatori, bromelina (parte interna dura dell’ananas); estratto di

pepe nero -> si aumenta la biodisponibilità ed aumentandola si evita che la

sostanza passa dal fegato. Efficienza farmacologica: quando si trattano si ha la

totale negativizzazione di TNF, CATF 100% si negativizzano, TOS 80% (metodo per

controllare il TOS è il saggio ELISA). Sopra un valore di TOS di 1069 c’è lo 0% di

probabilità di rimanere incinta, se scende sotto i 500 la probabilità di rimanere

incinta aumenta esponenzialmente.

RRIS = rischio relativo di immuno-fertilità

Colture cellulari per anticorpi monoclonali e policlonali, quelli monoclonali sono più

specifici, la risposta si controlla meglio. Si utilizzano per diversi fini: malattie

autoimmuni, per trapianti (per abbassare la possibilità di rigetto), per diagnosi di

tumore e metastasi, per valutazione (dosaggio quantitativo) prodotti presenti in una

bassa quantità. Gli ab policlonali sono un metodo che l’organismo ha sviluppato per

rispondere a presenze estranee.

Tecniche raffinate che mediante tecniche di DNA ricombinante si ha la produzione di

un anticorpo di cui si conoscono benissimo le caratteristiche -> produzione molecola

con caratteristiche predefinite. Qualunque sia lo scopo (potenziare risposta

immunitaria, usarle in clinica o laboratorio ricercar) è importante conoscere come l’ab

interagisce con ag (legame ab-ag). Produzione: la prima applicazione a cui viene

applicato ab-ag è la valutazione del titolo anticorpale (sfrutto l’ag per vedere

l’efficienza della produzione), le caratteristiche sono quelle di essere specifiche >

mono riconosce un pezzo ben definito dell’ag = l’epitopo e lo lega con alta affinità.

Condizione necessaria per ab-ag è la reversibilità, principio che deve essere vero

soprattutto per fare valutazioni quantitative. Dato il principio del metodo, la

valutazione dipende dalle conoscenze e dalle attrezzature presenti in laboratorio,

valuto tramite: citometria a flusso, cromatografia ad affinità, test RIA ed ELISA,

immunolocalizzazioni (quando si parla della possibilità di valutare l’espressione di una

proteina a livello del compartimento subcellulare, si produce ab per proteina e poi si

coniuga con fluorocromo per vedere la localizzazione).

Cromatografia affinità [Riguarda metodologie]

Durante processo cromatografico si ha a che fare con una fase stazionaria e una fase

mobile. In questo caso la fase stazionaria, che a seconda dei tipi di cromatografia può

essere liquida o solida, è solida e deve avere determinate caratteristiche: insolubile,

stabile e deve avere la possibilità di legare la sostanza che mi interessa isolare nel

contesto di una miscela, ma come si lega? Deve legare in modo affine, specifico, ma

reversibile; inoltre la dimensione delle particelle della matrice devono essere tali da

avere una velocità di flusso adeguata. In genere il recupero di una miscela, dopo il

legame della molecola interessata con delle parti della fase stazionaria, avviene per

esempio per variazione del pH. La reversibilità ab-ag può variare a seconda del pH o

della forza ionica, quindi il legame può essere abbastanza forte a pH vicino alla

neutralità poi abbassando il pH la molecola si stacca. Vantaggio: se alla matrice lego la

molecola che mi interessa in una sola tappa posso isolare questa molecola.

Saggio ELISA

Enzima che si lega secondo il principio della reazione ag-ab e permette la valutazione

quantitativa di una molecola di interesse, unisce la specificità dell’ab con la sensibilità

di un dosaggio enzimatico. Spesso e volentieri la reazione enzimatica trasforma un

substrato incolore in un prodotto colorato, a questo punto se ho un lettore di piastre

(spettrofotometro) posso legare l’intensità dell’assorbanza dovuta al colore alla

quantità di molecola da determinare. Due metodi:

Diretto: la presenza della molecola che voglio valutare (ag) viene riconosciuta

 da un ab primario in genere monoclonale che può essere coniugato ad un

enzima o ad un flurocromo

Indiretto: c’è la presenza di un ab primario che riconosce ag, questo ab

 primario funziona da ag nei confronti di un secondo ab (secondario) che è

coniugato ad un fluorocromo o ad un enzima. Vantaggi: l’ab monoclonale (il

primo) posso usarlo in forma nativa (non devo modificarlo coniugandolo) e

avendo due passaggi viene attivato il processo a cascata (ab primario può

essere riconosciuto da più ab secondari che di solito sono policlonali,

amplificazione della risposta)

Quali sono gli enzimi che più spesso vengono coniugati all’ab? La fosfatasi alcalina e la

perossidasi (enzimi già visti nell’apoptosi); il prodotto è colorato e viene letto in una

lunghezza d’onda tra i 400 e 410nm (di solito colore sul giallo-marrone). La perossidasi

può avere diversi substrati e uno di questi emette luce blu, sopra i 600nm.

Confronto tra metodo semplice e sandwich.

Nel diretto: ag che è stato fissato su un substrato solido (piastra pozzetto ad

esempio), l’ab riconosce l’ag ed è già associato ad un enzima, quindi l’aggiunta del

substrato di questo enzima produce un prodotto colorato e solubile (anche reagente

deve essere solubile).

Indiretto: ag fissato sul substrato, riconosciuto da ab primario nativo, dopo di che l’ab

primario viene riconosciuto da un ab secondario che è coniugato con enzima che a

contatto con substrato produce colore. Ab primario viene legato ad un supporto solido,

a questo supporto solido (substrato piastra multipla) aggiungo soluzione che contiene

ag, lascio a temperatura ambiente o a 37°C per un determinato tempo così che

avvenga la reazione, faccio un lavaggio per eliminare ag che non si è legato e poi uso

ab secondario che è legato ad un enzima. Quindi l’aggiunta di un substrato specifico

per quell’enzima sviluppa un prodotto colorato. Ciò che è importante conoscere sono

gli epitopi che vengono coinvolti nelle reazione di ab primario e ab secondario, bisogna

evitare che l’ab mono riconosca uno degli epitopi che vengono riconosciuti da ab poli,

quindi ag deve avere diversi epitopi per ab primario e ab secondario. Se il metodo è

quantitativo devo costruire una curva standard in cui ho delle diluizioni seriali dell’ag

(lascio dei pozzetti apposta per questo) -> l’assorbanza di questi pozzetti mi dà la

possibilità di costruire una curva di valutazione, l’assorbanza è direttamente correlata

con la concentrazione dell’ag che voglio valutare. A questo punto se ho la curva

standard (equazione di una retta) ad ogni valore di assorbanza Y potrò calcolare la

concentrazione di ag X. Se invece voglio valutare il titolo anticorpale di un fluido, per

esempio prelievo di sangue per vaccino, fisso l’ag che viene legato alla piastra, si

aggiunge il campione da valutare (siero o plasma) si forma il legame ag-ab, vado a

legare l’ag secondario legato ad un enzima, aggiungo substrato, si colora la soluzione

che valuto allo spettrofotometro; vado a valutare la quantità facendo una curva di

taratura precedentemente costruita lasciando degli appositi pozzetti.

IMMUNOFLUORESCENZA

Se la valutazione la faccio in microscopia, il principio è lo stesso del metodo ELISA:

Diretto: la molecola di interesse è legata ad ab con fluorocromo

 Indiretto: la proteina da valutare viene riconosciuta da ab, che viene a sua volta

 riconosciuto da un ab secondario legato ad un fluorocromo

Tecnica di indagine condotta mediante ab, diretti con gli ag di cui si vuole vagliare la

presenza e legati con sostanze fluorescenti che rendono visibili gli immunocomplessi

ag-ab. La fluorescenza mediata strumenti appositi quali spettrofluorimetri,

citofluorimetri.

Classico metodo di applicazione del metodo ELISA è il test di gravidanza: si valuta

nella presenza delle urine della gonadotropina corionica umana dopo 8 giorni della

presunta fecondazione. Come funziona? Deposito campione di urina sulla parte distale

del filtro e l’urina per capillarità sale sullo stick o filtro, dove si individuano 3 zone:

Zona di reazione: depositato ab mono contro la gonadotropina, è già

 coniugato con un enzima

Zona test: quella che dice se si colora è perché lo stick ha funzionato in

 maniera corretta, c’è un ab poli contro la gonadotropina che la riconosce con un

epitopo diverso dall’ab mono, ab mono legato ad enzima, è depositato anche

substrato per ab mono

Zona controllo: ab contro ab primario, ma non contro gonadotropina corionica,

 presenza anche del substrato per l’enzima

Deposito campione che inizia a salire, che succede? Se non c’è la gonadotropina, il

flusso sposta ab primario verso le altre zone fino a che non arriva alla zona controllo

dove si colora in quanto viene riconosciuto, il test è negativo. Se test positivo: c’è la

gonadotropina, l’urina sale, la gonadotropina si lega al primo ab, il complesso sale fino

alla zona in cui c’è ab contro ab primario e si colora e si colora anche la zona in cui c’è

ab contro gonadotropina.

Saggio radioimmunologico RIA

Se, invece di coniugare ab con enzima o fluorocromo, lo coniugo con radioisotopo. In

questo caso l’ag di interesse deve essere disponibile anche in forma marcata o

marcabile in modo radioattivo. Non serve un metodo indiretto, perché la rilevazione

della radioattività è talmente bassa che unita alla specificità ho un segnale valutabile

con un metodo indiretto. In genere in questo caso ho: un ab (Ig) che è specifico per ag

che voglio determinare, l’ag che voglio determinare devo poterlo ottenere anche in

forma marcata e poi ho il campione in cui voglio valutare il quantitativo dell’ag di

interesse.

Ci sono diversi sistemi, quello più utilizzato: dosaggio per competizioni di legame

all’equilibrio. L’ag marcato e non marcato vengono incubati simultaneamente, in

termini di volume l’ag non marcato (voglio valutare) è in una quantità nota; mettendoli

simultaneamente la marcatura non interferisce con l’affinità di legame dell’ag per l’ab,

quindi gli ag competono per lo stesso ab, a seconda di quello che è più presente si

legherà o più ag marcato o più ag non marcato, di conseguenza la radioattività è

inversamente proporzionale alla quantità di ag non marcato presente nel campione.

Se voglio quantizzazione assoluta devo fare una curva standard, la radioattività

scende con l’aumentare della quantità di ag non marcato. Come valuto la

radioattività? Con un filtrino che metodo nel liquido scintillante, uso un β-counter.

Dosaggio per competizione di legame o spiazzamento: aggiungo prima ag marcato in

quantità nota, poi aggiungo soluzione con ag non marcato da determinare che spiazza

l’ag marcato. (Metodo che non si utilizza quasi più perché allunga il test di un

passaggio)

Posso fissare sulla piastra o l’ab o l’ag, come per ELISA. In questo caso marco ab e lo

aggiungo insieme alla soluzione in cui voglio determinare l’ag. L’ab marcato si lega in

modo casuale o con ag fissato (nel pozzetto) o con ag presente nella soluzione da

valutare. Più ag ho nella soluzione da valutare meno sarà l’ab marcato che rimane

fissato all’ag sul pozzetto, se faccio lavaggio dopo reazione il complesso ab-ag

marcato non fissato viene rimosso, quindi la radioattività presente è dovuta solo all’ag

che ho fissato. La radioattività è inversamente proporzionale alla quantità di ag

presente nel campione. Per quantificazione assoluta: costruire una curva standard

utilizzando una quantità nota di ab marcato e quantità note e crescenti di ag solubile;

la quantità di ag presente nel campione si determina mediante la curva standard.

CELLULE STAMINALI

Il nome deriva da “stamen” che significa filo della vita, è l’inizio della vita della cellula,

è una cellula non specializzata e ha capacità di differenziarsi in differenti tipi cellulari

(Immagine al SEM). Caratteristiche:

Autorinnovamento (Self renewal): sono in grado di differenziarsi in teoria in

 modo illimitato mantenendo un parco di cellule non differenziate, al medesimo

stato differenziativo mediante mitosi asimmetrica -> da una cellula staminale se

ne ottiene una staminale indifferenziata e una che si differenzia, geneticamente

le due cellule figlie sono identiche però cosa si è ripartito in modo asimmetrico?

Il citoplasma.

Capacità di differenziarsi in diverse linee cellulari: la cellula staminale dopo

 qualche passaggio di mitosi asimmetrica prende un cammino “senza ritorno”

diventa una cellula commissionata, nel senso che sa in cosa deve differenziarsi

e da quel punto non è più in grado di tornare indietro. Da questa cellula si passa

al progenitore e poi al precursore, gradi di differenziamento diversi.

Hanno un tempo generazionale ridotto, a differenza delle cellule differenziate

 non necessitano di segnali esterni o di caratteristiche particolari della cellula per

iniziare una nuova mitosi.

Per quanto riguarda la specie umana sono diploidi e hanno un cariotipo stabile.

A livello di fonte di approvvigionamento le cellule staminali si distinguono in:

Embrionali: derivano dai tessuti embrionali, in genere vengono isolate

 dall’embrioblasto a livello di blastocisti

Adulte: derivano da tessuti adulti, da meno di 20 anni si sa che tutti i tessuti

 adulti contengono cellule staminali: nel cordone ombelicale, nel midollo osseo

emopoietico, nel tessuto adiposo, cellule satelliti della muscolatura striata,

epidermide

Pluripotenti indotte: si induce un de-differenziamento, passaggio inverso, i

 fibroblasti vengono sottoposti a manipolazioni per cui vengono riportati a cellule

staminali in grado di tornare ad uno stato di pluripotenza per acquisire

caratteristiche delle cellule staminali. Una delle caratteristiche delle cellule

staminali è l’attività della telomerasi (enzima che si prende carico di allungare

l’estremità del DNA a livello dei telomeri del cromosoma per mantenere integra

l’estremità senza perdere funzionalità), non si sa bene se in queste pluripotenti

indotte l’attività della telomerasi sia quelle delle staminali embrionali o della

staminali adulte (probabilmente di quest’ultime).

Staminali di origine embrionale

Possono differenziarsi in modo illimitato sia in vivo che in vitro. Queste cellule se prese

a livello degli embrioblasti possono differenziarsi nei 3 foglietti embrionali (endoderma,

mesoderma e ectoderma) e anche in cellule germinali. Però le cellule embrionali

possono provvedere in modo limitato a fornire cellule staminali, non si conoscono bene

e neanche i fenomeni che regolano l’attività cellulare di queste cellule. Difficoltà nel

reperimento, nella regolazione cellulare, questioni di ordine etico e politico e questioni

di immunocompatibilità. Come si ottengono? In vitro si può ottenere una cellula uovo

fecondata, unica cellula staminale totipotente, fino a livello della blastocisti dove si

possono riconoscere due formazioni: trofoblasto e embrioblasto. Il trofoblasto presiede

nell’annidamento in utero, da esso originano il cordone ombelicale e la placenta. Da

embrioblasto origina il feto.

A livello di pubblicazioni scientifiche: nel 1981 iniziarono ad uscire le prima

pubblicazioni delle prime cellule staminali ottenute da blastocisti murine. Per quanto

riguarda l’uomo bisogna aspettare fino al 1998, furono pubblicati sia lavori in cui era

stato preso l’embrioblasto dalla blastocisti sia lavori sulla messa in coltura una morula

disaggregata (stadio ancora più precoce).

Come si coltivano? Sono delicate e particolari. Vengono coltivate su un feeder layer di

fibroblasti embrionali di topi trattati con mitomicina-c o con radiazioni per bloccare le

mitosi dei fibroblasti, ma non la produzione dei fattori di crescita indispensabili per la

crescita delle cellule staminali. La presenza del feeder layer assicura alle cellule

staminali la possibilità di dividersi senza differenziarsi; ma potrebbero esserci problemi

di inquinamento da parte dei fibroblasti. Di passaggio in passaggio devo valutare la

differenziazione delle cellule staminali, è importante che l’equilibrio tra cellule

staminali e quelle differenziate rimanga costante.

Marker che prendo in considerazione per valutare la staminalità delle cellule? SSEA-3 e

SSEA-4 e Oct-4, steage specific embryonic antigen. Si valuta o con realtime-PCR o con

citofluorimetro. Ci sono altri due test, ma che sono più lunghi. Si eseguono test per

valutare se le cellule così ottenute siano effettivamente pluripotenti:

Capacità di originare in vitro corpi embrioidi, aggregati sferoidali in seno ai quali

 le cellule cominciano dopo alcuni giorni a differenziarsi spontaneamente in linee

cellulari appartenenti ai 3 foglietti embrionali

Formazione di teratomi (in vivo), dopo impianto delle cellule in un topo

 immunosoppresso; troppe cellule staminali a diversi stadi di differenziamento

possono sviluppare un tumore. Questi teratomi assomigliano alla nascita di una

neoplasia, nuova formazione in un contesto tissutale già ben caratterizzato, il

problema grosso della cura delle neoplasia è che le cellule tumorali staminali

rimangono anche dopo la chemioterapia.

I primi ricercatori diedero come prova del fatto che le cellule fossero embrionali

staminali la capacità di queste cellule di andare incontro alla formazione di strutture

sferoidi = corpi embrioidi che si differenziano nei 3 foglietti embrionali.

Staminali di origine adulta

Il loro ruolo fisiologico è quello di mantenere il normale turnover cellulare (epitelio

intestinale) o sostituire le cellule del tessuto danneggiate (fegato). Facilmente

reperibili, sono state isolate praticamente da ogni tessuto:

Placenta

 Sangue del cordone ombelicale

 Liquido amniotico

 Tessuti di feti abortiti spontaneamente (?), problemi etici

Nessun problema di ordine etico, nessun problema di immunocompatibilità,

possiedono molte caratteristiche delle embryonic stem cells.

Nel 1961 si scoprì che nel tessuto muscolare scheletrico c’erano delle cellule staminali,

le cellule satelliti. Nel 1963 si scoprì la presenza delle cellule staminali nel midollo

osseo emopoietico. 1978 si ha la prova che le cellula staminali siano presenti a livello

del sangue del cordone ombelicale. Nel 2001 si scoprì che anche nel tessuto adiposo

sono presenti le cellule staminali di origine mesodermica (come tutti i tessuti

connettivi). Successivamente si provò che le cellule staminali possono differenziare

anche in tessuti non di origine mesodermica.

Potenzialità delle cellule staminali adulte coltivate in vitro per il trattamento ad

esempio delle leucemie e per l’ingegneria tissutale in generale, con riferimento alla

cute artificiale. Si fanno test di citotossicità perché serve per sapere come trattare in

modo alternativo per avere più contributi per debellare la proliferazione. Identificare

nuove molecole per un determinato target.

In vitro che cosa si è fatto? Differenziarle in:

Cellule nervose

 Cellule β del pancreas secernenti insulina

 Cardiomiociti (muscolo cardiaco)

 Cellule emopoietiche (midollo osseo)

 Cellule endoteliali (vasi)

 Osteoblasti (osso)

 Epatociti (fegato)

Cellule staminali embrionali

Problema etico nell’utilizzo e problema di approvvigionamento.

Fecondazioni in vitro con trasferimento di embrione -> tecnica della FIVET.

FIVET -> metodologia prevede di asportare da donna un certo numero di oociti, quelli

che superano test qualitativo, vengono fecondati. La legge prevede di impiantarne

massimo 4, gli altri invece vengono congelati. Quelli congelati sono fonte di

approvvigionamento di cellule staminali.

Secondo metodo -> clonazione -> produrre embrioni da portare a stadio di blastociti

da cui si isolano cellule staminali.

Clonazione:

Riprodurre individui biologicamente identici a individuo che fornisce patrimonio

 genetico -> riproduzione asessuata/agamica.

Per organismi superiori non esistono due individui geneticamente identici,

 tranne in un caso, quello dei gemelli omozigoti. Il loro sviluppo inizia dal fatto

che embrione fecondato, nelle prime fasi si divide e le due divisioni continuano

la crescita in modo separato.

Tecnica di embryo splitting -> embrione separato meccanicamente

 Tecnica di nucleo transfer -> prendo cellula uovo e in questo oocita viene

 trasferito il nucleo di cellula con corredo completo -> nascita di pecora dolly ->

preso nucleo di cellula somatica e viene impiantato in cellula uovo.

Clonazione può avere aspetto riproduttivo. Clonazione può avere aspetto terapeutico

(arrivo a stato di blastocisti perché ho bisogno di cellule staminali embrionali con

caratteristiche di pluripotenza, migliori di quelle adulte).

Problemi etici

È lecito produrre o utilizzare embrioni umani per produzione di cellule staminali?

SI -> embrione non è individuo umano, deve essere reso disponibile per progresso e

conoscenze. Da questo materiale le cellule staminali embrionali sono estraibili

facilmente. Si possono utilizzare per curare malattie inguaribili.

NO -> embrione è uomo e ha diritto alla vita, non può essere utilizzato per progresso

scientifico. Utilizzo porta a morte per cui il fine è inaccettabile.

ALTERNATIVE: scienza può andare avanti utilizzando anche cellule staminali adulte.

Cellule staminali adulte: sono presenti in tutti gli organi di un individuo. Ruolo

fisiologico: mantenere turnover cellulare e sostituire cellule danneggiate. Ogni cellula

ha proprio ciclo vitale. Capacità di autorinnovamento e della capacità di differenziarsi

a dare cellule specializzate dell’organo o del tessuto. Durante le prime fasi di

differenziamento le cellule vanno incontro a mitosi asimmetrica (=le due cellule figlie

sono geneticamente identiche tra loro e alla madre, ma cambiano alcune proteine cito

e della membrana in modo da rispondere in modo diverso al microambiente -> solo

una subisce differenziazione andando incontro a differenziamento). Le cellule staminali

adulte possono essere multipotenti e unipotenti. Prova data da esperimenti che

certificano capacità di cellula di differenziarsi in diversi tipi cellulari.

Capacità di differenziarsi in cellule di tessuto differente da quello da cui originano.

Studi condotti su cellule di tessuto emopoietico o adiposo. Cellule di origine

mesenchimale che in determinate condizioni possono differenziarsi anche in cellule

simili a neuroni (differenziamento in VITRO).

Già da cellula mesenchimale posso ottenere cellule del mesotelio, di connettivo

propriamente detto, del tessuto adiposo etc.

Cellule staminali emopoietiche: possono differenziare in tutte le famiglie cellulari che

troviamo nel sangue, passando attraverso diversi gradi di differenziamento passando

da linea mieloide e linfoide. Isolate a midollo osseo emopoietico (femore, omero,

scatola crenica, sterno, costole, corpo vertebrale, creste eliache). A livello di midollo

osseo emopoietico troviamo 1 cellula su 10mila, dal cordone ombelicale 1 su 100mila.

Queste cellule staminali sono caratterizzate da mitosi asimmetrica, la cui capacità di

questa mitosi diminuisce con il progredire del differenziamento. Quando si arriva a

precursori abbiamo mitosi simmetriche.

Trapianto di midollo osseo emopoietico -> anemia, β talassemie, leucemie e linfomi

(tumori del sangue). Midollo osseo irradiato e sostituito con cellule staminali sane e

questo in un tempo breve è in grado di generare le cellule del sangue e ripristinare le

funzioni. Trapianto fatto se possibile secondo sistema autologo (=paziente è lo stesso

che dona le cellule staminali), lo si può fare nel caso di trattamento di leucemie e

linfomi. In questo caso non abbiamo problemi di rigetti. Alternativa: trapianto

allogenico (=da donatore compatibile).

Prelievo del midollo osseo: prelevato midollo osseo emopoietico con punture a livello

di creste iliache. Prelievo di 30-45 minuti. Si arriva fino a livello di tessuto osseo

spugnoso e si preleva midollo osseo.

Trapianto: midollo osseo prelevato viene trattato e infuso nel ricevente (dopo cura

radioterapica che ha fatto fuori il suo midollo osseo). Leucemici monitorati nel temo,

attraverso PCR si vede la malattia residua. Cellule staminali infuse mediante la via

endovenosa. Pare che le cellule sappiano dove andare per replicarsi. In quelle sedi

danno origine a midollo osseo. Paziente immunodepresso e viene tenuto sotto

controllo in una camera sterile.

Per cellule isolate da cordone ombelicale, possono essere amplificate in laboratorio e

poi impiantate. A livello legislativo è una modalità più complessa. Cellule staminali in

cordone, una volta che partorisco posso conservare sangue del cordone ombelicale ->

nascita di banche di cellule staminali da cordone ombelicale.

La legge vieta la costituzione di banche private per cellule staminali che derivano da

cordone ombelicale. Sono ammesse banche pubbliche dove puoi donare il cordone per

usi futuri e non solo per persone del tuo nucleo famigliare. In Italia sono vietate,

all’estero no.

Dal cordone ombelicale viene prelevato sangue, raccolto in provetta, lo centrifugo,

separo cellule staminali e procedo a conservazione.

Oltre a cura di linfomi e leucemie, posso utilizzare cellule emopoietiche per la β

talassemia. Ricavate cellule staminali da cordone di due gemelline originate da

fecondazione FIVET. Sono state selezionate per vedere chi era compatibile per il

trapianto di midollo per il fratello.

Presenti in tessuto epiteliale, epidermali e neuronali (?).

Problema delle cellule staminali: in vitro le cellule staminali si differenziano, ma una

volta in vivo non si garantisce microambiente che abbiamo in vitro. Le cellule staminali

in vivo non resistono tanto, vanno incontro a morte e non si riproducono. Si punta su

sistema paracrino -> meglio inserire fattori secreti da queste cellule e che inducano

serie di segnali che favoriscono vascolarizzazione di tessuto compromesso e con

queste molecole a effetto paracrino vadano a migliorare e stimolare le cellule

sopravvissute e portino a proliferazione di cellule che sono rimaste vive. Problema:

mantenimento di effetto nel tempo.

Cellule staminali sono efficaci per malattie che riguardano pelle, cornea, trapianto di

midollo osseo emopoietico, il resto è a livello sperimentale (in fasi precoci).

Applicazioni:

In laboratorio si può costruire della pelle che viene trapiantata. Sistema che va bene

per i grandi ustionati o per persone affetta da psoriasi o per pelfico burroso (pelle si

lacera provocando ulcerazioni). Cheratinociti messi in coltura e si producono foglietti.

Altro vantaggio: fare prove di cosmetici o di prodotti chimici su pelle costruita in

laboratorio. Epidermide -> epitelio piatto pluristratificato, con andamento che forma

invaginazioni che si separa da derma attraverso membrana basale. Pelle fatta in

laboratorio non è elastica come quella normale. Pelle totalmente glabra. Adagiata

sopra e si integra col derma.

La produzione di pelle è stata modificata e si è andata a prendere cellule staminali da

tessuto adiposo. Per i cheratinociti è stata presa della cute addominale che ha fornito

anche i fibroblasti. 3 componenti in grado di costituire epidermide, derma e ipoderma.

Mettere in coltura popolazioni cellulari, unisco componenti (cheraticnici e fibroblasti)

con componenti di tessuto adiposo. La lamina di cheratinociti viene integrata con

lamina di connettivo e di tessuto adiposo -> ottengo i 3 strati. Diverse combinazioni di

queste componenti e vedo che tipo di sostituto dermico potessero dare. Prove fatte su

topi nudi e si va a vedere come i componenti si comportano su lesioni del topino.

Cheratinociti ricostruiscono giunzioni cellula matrice.

No grandi differenze tra i 3 modelli di sostituto cutaneo.

 Evitare derma artificiale.

 Sostituto più verosimile a epidermide nostra.

Trapianto di cornea

Cornea: membrana che sta davanti alla camera anteriore dell’occhio e attorno alla

cornea c’è un anello limbare dove pare risiedano cellule staminali che danno origine

alla cornea (cellule staminali unipotenti = rigenerano solo epitelio corneale).

Cellule staminali limbari prelevate da occhio sano di stesso paziente o da donatore

compatibile. Reale impiego che lo si poteva fare tramite la donazione della cornea.

Se non posso usufruire di un allotrapianto, il problema di staminali da soggetto che

non sia paziente, può provocare stimoli di rigetto. Crisi di rigetto provocata anche da

organi che arrivano da donatore compatibile.

Trachea (cartilagine ialina non vascolarizzata, anelli cartilaginei + muscolatura

 liscia). Organo è stato trattato per eliminare tutte le cellule lasciando solo anelli

di cartilagine. Messi in bioreattore con cellule staminali di midollo osseo di

ricevente. Cellule hanno originato parti mancanti. Si è arrivati ad avere trachea

con solo anelli tracheali che arrivano da donatore, tutto il resto fatto da cellule

staminali del ricevente -> non venne fatta la terapia immunosoppressore.

Si studia per cercare di utilizzare cellule staminali per curare le patologie cardiache

dovute a scorretta vascolarizzazione, formazione di valvole etc. due possibilità: cellule

staminali che si possono differenziare in cardiomiociti che s contraggono, si possono

iniettare nella vena causale che possono andare a livello di organo compromesso e

indurre una nuova vascolarizzazione. Cellule staminali inducono nuova

vascolarizzazione. Se aumento la vascolarizzazione rendo più efficiente la zona sana e

bilancio quella colpita da infarto.

Cellule iniettate a livello di lesione cardiaca. Cellule staminali a contatto con lesione, si

differenziano in cellule cardiache funzionanti. Iniettate a livello della lesione non si sa

che riescono a differenziarsi.

Terapia genica

Prendere gene che voglio correggere, lo inserisco in un vettore e trasfetto le cellule,

sostituendo le cellule malate con quelle sane. Non metto vettore a livello di cellule che

voglio trasfettare. Trasfetto in vitro e poi le inietto, sperando che le cellule staminali si

differenzino in cellule del tessuto danneggiato. Anche questa modalità non è arrivata

nella terapia clinica.

Cellule staminali di tessuto adiposo. Tessuto facilmente reperibile. Interventi di

chirurgia estetica (liposuzione, mastoplastica riduttiva). Cellule staminali in tessuto

adiposo sono maggiori di quelle nel tessuto emopoietico. Hanno le stesse possibilità

differenziative.

Prendo pezzetto di grasso e lo tratto per estrarre cellule. Prelevo tessuto adiposo, lavo

con soluzione fisiologica, tessuto viene sminuzzato e poi si mette a contatto con la

collagenasi contenente glucosio per almeno 30 minuti a 37°C sotto agitazione. Il

digerito si filtra attraverso setacci che trattengono quello che non m interessa, viene

centrifugato a bassa velocità, scarto la parte sopra, prelevo il pellet e lo metto in un

buffer di lisi e ricentrifugo. Sospendo pellet ottenuto da centrifugazione in terreno

completo e le semino su una piastra. Dopo 6h cambio il terreno, sfruttando la diversa

capacità adesiva alla piastra. Faccio una pre-selezione. Se le cellule devono essere

usate per trapianto, devono essere selezionale. E attraverso agenti differenziati si

portano le cellule al differenziamento. Si sfrutta diversa adesione cellulare, quindi si

parla di adesione differenziale. Cellule staminali epidermali piastrate su collagene e

fibronectina.

Devo caratterizzare cellule usando la citometria a flusso. Uso marcatori che dipendono

da popolazione cellulare che voglio differenziare. Altra possibilità è la diluizione seriale

delle cellule e le risemino fino a che in ogni pozzetto ho un certo numero di cellule. E

so di aver ottenuto la mia popolazione pura.

CD44 / CD90 / CD45 (meno rappresentato degli altri due) -> sono i marcatori della

citometria.

In clinica vengono usate per trattamento di ustioni, trattamento di lipoatrofia facciale,

aumento e simmetrizzazione di mammelle, miglioramento di perfusione del lembo

ischemico, guarigione di ferite cutanee etc. Cellule non amplificate. Nell’impiego con

matrici dermiche si ha passaggio di cellule in laboratorio.

Lipoiniezione (lipofilling) -> trattamento con problemi perché c’è riassorbimento di

cellule di adiposo che ho iniettato, perché va incontro a una specie di necrosi.

Arricchisco la frazione da iniettare e riducendo componente di adipociti maturi.

Trattamento alternatico con buoni risultati -> tessuto adiposo potenziato in cellule

staminali viene riassorbito in modo più contenuto.

Prendo lipoaspirato, lo arricchisco di cellule staminali e viene reiniettato. Se non voglio

complicazioni, le cellule staminali le ottengo da centrifugazioni.

Trattamento usato per guarigione di ferite dovute a traumi, ulcere diabetiche,

radiodermiti, ustioni e ferite.

Ustioni -> si usano sostituti epidermici. Solo con cheratinociti -> scarsa elasticità e

poca pienezza.

Trattamenti presentano problemi se sono anziani, perché anche se non diminuisce la

quantità, la funzionalità delle staminali decresce. Ragione che ha portato ad utilizzare

le ASC con le matrici dermiche artificiali, ovvero con supporti su cui depositare le

staminali, impedendo il movimento delle staminali.

Sostituti dermici chiamati SCAFFOLD su cui deposito le staminali. Per esempio uno

scaffold è l’INTEGRA (collagene e GAG).

Quando la ferita è grossa posso mettere la pelle ricostruita, ma se il buco è profondo

dovrò usare uno scaffold. Da soli li scaffold ricreano reticolo strutturale che favoriscono

ricreazione di tessuto. Utilizzo di scaffold anche senza cellule è vantaggioso per

rimarginazione ferite.

Unione di cellule a scaffold tridimensionali. Bisogna studiare in questo trattamento la

distruzione della matrice nel tempo, riassorbimento di tessuto adiposo e

vascolarizzazione.

Obiettivi:

Vedere se ASC possono essere impiegate in ingegneria tissutale

 Vedere se si riesce a ricostruire morfogenesi di tessuto in questione

 Vedere se posso avere la possibilità di avere derma + epidermide

Impiego di scafold: presa integra lamina e scaffold liquido. Topino nudo + 4 incisioni.

Controllo: lamina senza e con cellule. Controllo: liquido con e senza cellule. Topino

operato. Messa lamina con o senza cellule. 30 gg dopo innesto -> senza le cellule, la

vascolarizzazione aggira lo scaffold -> no presenza di vada

In presenza di ASC presenza di vada all’interno dello scaffold.

Scaffold analizzato in microscopia ottica ed elettronica -> si sono visti vasi sanguigni

con eritrociti -> nuova vascolarizzazione a livello di innesco. Presenza nello scaffold di

adipociti.

Voglio aiutare tessuto distrutto a rigenerarsi da se con la presenza di

vascolarizzazione.

Possibili meccanismi per spiegare plasticità di cellule staminali:

transdifferenziamento.

Concetto di metaplasia -> in determinate situazioni un epitelio poteva cambiare

caratteristiche morfologiche. Alcuni ricercatori prendono fibroblasti e li fanno regredire

-> cellula perde caratteristiche di cellula differenziata e torna ad essere cellula

staminale. Processo comune in anfibi e vegetali.

Attività di telomerasi -> caratteristica di cellule staminali.

RIPRODUZIONE

Riproduzione: capacità di creare copie di sé; non è necessario l’atto sessuale. Le

singole cellule trasmettono i caratteri genetici parentali in maniera fedele attraverso la

mitosi; nel caso di organismi che si riproducono con gemmazione si ha la formazione

di protuberanze.

La riproduzione asessuata offre dei vantaggi

Risparmio energetico (non serve cercare partner né mantenimento del sistema

 che produce gameti)

Con la mitosi si ha una rapida colonizzazione dell’ambiente: se arriva un nuovo

 individuo può fare una nuova colonia (non è possibile nella sessuata)

Ci sono anche svantaggi

Omogeneità genetica: mitosi fa cellule completamente identiche (tranne in caso

 di mutazioni), la mitosi è una limitazione evolutiva > evoluzione è basata su

selezione e variabilità (non c’è selezione senza variabilità)

Mitosi è praticata da molte specie che sono evolutivamente semplici e primitivi,

 che però hanno anche la possibilità di “fare sesso”, come i batteri che possono

scambiarsi parti del DNA con i micropili -> se le cose vanno bene c’è asessuata,

se no cercano di scambiarsi il materiale in altro modo.

Riproduzione sessuata: due organismi diploidi dedicano una parte delle loro cellule

alla riproduzione, cioè cellule diploidi che vanno incontro alla meiosi; formano i gameti

(maschile e femminile) che si uniscono nella fecondazione; si forma zigote che è

soggetto a mitosi che riportano l’organismo a diploide.

La natura ha esplorato varie condizioni

Riproduzione senza sesso

 Rimescolamento genico in seconda sede

 Organismo grande aploide > creano una cellula diploide germinale > poi questa

 con meiosi farebbe individui grandi aploidi (in realtà avviene il contrario)

Organismo grande diploide > gamete poi è aploide > si unisce con l’altro >

 danno origine di nuovo a organismo diploide (questo è il caso dell’uomo)

Ci sono organismi (molto strani) adulti aploidi che fanno mating, hanno zigote diploide

e poi con meiosi fanno molte cellule aploidi.

Riproduzione sessuata: la cellula diploide crea per meiosi cellule aploidi che si

incontrano fondendosi con altre cellule aploidi che derivano da altri organismi.

Meiosi: c’è il rimescolamento genico. Si prendono i geni del patrimonio e si cerca di

ricombinarli non per avere nuovi geni ma per avere nuove combinazioni geniche, cioè

si crea una variabilità partendo da due patrimoni genetici (madre e padre). Questa

crossing-over

ricombinazione si ha con i quando si forma la tetrade: c’è uno scambio

di una parte del cromosoma con la corrispondete parte del cromosoma dell’altro

genitore, cioè si ha lo scambio degli stessi geni (tranne nel caso di errori), in modo da

conservare la stessa sequenza genica.

C’è un altro sistema di ricombinazione che è quello dei cromosomi: considerando 3

cromosomi, una serie materna e una paterna > i cromosomi sono omologhi a due a

due (ne abbiamo 6 in totale) > con la meiosi si possono avere un tot di ricombinazioni

(2 elevato alla n, dove n = 23 nell’uomo > 8 milioni di gameti diversi senza crossing-

over!!!). Per crossing-over e per la ricombinazione dei cromosomi non si hanno

praticamente mai degli individui identici (tranne nei gemelli omozigoti).

Oogenesi e spermatogenesi

L’uovo è una cellula grossa, quindi le due divisioni meiotiche che avvengono sono

asimmetriche: da una parte rimane l’uovo 2C, dall’altra rimane il citoplasma (primo

corpo polare 2C) che è eliminato; nella seconda divisione si forma sempre l’uovo 1C e

l’altro corpo polare 1C.

Il maschio invece non fa corpi polari ma fa due divisioni meiotiche simmetriche per

dare origine a 4 spermatozoi. In questo caso all’inizio ci sono cellule

fondamentalmente staminali (sono gli spermatogoni): si suddividono in due > una

rimane come cellula staminale (che riorigina gli spermatogoni) e l’altra si differenzia e

prosegue con la meiosi per formare gli spermatozoi; i 4 spermatozoi non si staccano

ma rimangano legati insieme con ponti intracellulare (si hanno degli insiemi di 16

spermatozoi).

La meiosi non è infallibile, ci possono essere dei fenomeni anomali: non disgiunzione

che porta a formazione di embrioni anormali che non si sviluppano. Quando ci sono

danni poco gravi che però non portano ad aborti immediati o che non fanno non

funzionare spermatozoo o oocita è più pericoloso perché un danno grave elimina

completamente il problema impedendo la fecondazione: uno di questi danni minori è

la sindrome di Down.

Nei vertebrati ci sono uova di tipi diversi, più o meno grosse, con più o meno tuorlo

con più o meno simmetria del tuorlo (uovo umano ha diametro di 60-70µm); le uova

differiscono in base all’ambiente in cui vanno a crescere:

In acqua

 Sulla terra (la rana no perché per riproduzione torna in acqua; dai rettili) si ha

 produzione di uovo grosso con tuorlo e strutture per tenere l’uovo in posizione

centrale (calaze, membrana vitellina e membrane testacee che sono due e si

scollano dove c’è camera d’aria) > questo perché l’uovo è deposto fuori

dall’acqua e quindi il bianco dell’uovo serve per umidificare il sistema (oltre che

proteggerlo)

Nel caso del mammifero si ha invece si torna a produzione interna grazie alla

 presenza della placenta -> l’uovo non ha necessità di tanto tuorlo (uovo è più

piccolo) perché si forma struttura per scambio nutritivo con la madre in maniera

indiretta dal fegato.

Gli spermatozoi invece sono abbastanza simili anche se ci sono delle differenze che

sono specie specifiche (lunghezza flagello, teste diverse…): sono quasi tutti piccoli con

quasi sempre un flagello con assonema, hanno quasi tutti dei mitocondri nel midpiece

(collo), hanno pochissimo citoplasma, hanno nuclei con sopra vescicola di origine dal

Golgi con enzimi di membrana > gli spermatozoi sono degli shuttles per il trasporto

del nucleo; il nucleo è molto denso e non è nemmeno penetrabile dagli elettroni

(elettrondenso), infatti anche gli istoni sono sostituiti da delle proteine specifiche per

impaccare ancora di più il cromosoma rispetto la normale cromatina; lo spermatozoo

necessita un motore cioè il flagello, che funziona grazie ai mitocondri; alla base del

flagello c’è il centriolo (corpo centrale distale/prossimale) e poi ci sono dei filamenti

intermedi per collegare flagello al resto del sistema.

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elaisa9

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Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie molecolari e industriali
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I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie cellulari e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Bernardini Giovanni.

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