Biotecnologie Cellulari

Biotecnologie cellulari

Storia delle colture cellulari

1880 Arnold dimostrò la capacità dei leucociti di dividersi all’esterno di un organismo, lasciandoli nel plasma, capacità di mantenerli in coltura, in sospensione all’interno del plasma.

1885-1903 Roux/Jolly hanno prelevato tessuti da embrioni di pollo (o espianti) ed erano stati mantenuti in diversi sistemi di coltura provando sia il siero (prendi definizione da istologia) che la linfa che l’ascite (essudato prodotto a livello degli organi viscerali, prodotto dai mesoteli), hanno mantenuto in vita tessuti all’esterno del loro organismo in particolari ambienti.

1907-1912 Harrison/Carrel da frammenti di tessuto in coltura si espandono cellule adese al substrato e libere da contaminazioni batteriche (colture primarie perché derivava direttamente dal tessuto di origine), da un espianto sono riusciti a verificare che le cellule sono in grado di replicarsi. Coltura che cresce in adesione, le cellule dovevano sistemare le giunzioni cellulari, per esempio, in un ambiente diverso dal loro.

1943-48 Earle/Sanford possibilità di avere una linea cellulare che si osservò crescere all’infinito, ovvero cellule immortali. Cellule isolate da tessuti, ma a differenza delle altre scoperte prima, queste potevano essere mantenute vive in modo indefinito. Prima linea cellulare L929. Fino ad ora si sono usati le cellule di topo.

1952 Gey prima linea di cellulare da carcinoma umano della cervice: HeLa cell. Linea cellulare immortale.

1975 Kohler/Milstein cellule che furono rese immortali, quindi non casualmente, prendendo una cellula immortale e fondendola con una cella mortale, con la produzione degli ibridomi. Esempio produzione anticorpi monoclonali (riguarda plasmacellule, linfociti B).

1978 Maniatis manipolazione genetica delle cellule in coltura per renderle immortali.

1998 Thomson mettere in coltura cellule staminali embrionali umane.

Applicazioni delle colture cellulari

Si basano sulla conoscenza dei processi intra ed extracellulari (cellula-cellula o cellula-matrice). Ingegneria tissutale con le cellule staminali. Vari ambiti di applicazioni: biologia cellulare, genetica, oncologia, farmacologia.

Vantaggi

• Condizioni fisiche e chimiche piuttosto costanti (T, pH, umidità, quantitativo di O e CO₂ scambiata);
• I sistemi di coltura vengono definiti terreni o medium, la loro composizione è abbastanza standardizzata; riduzioni utilizzo animali;
• Replicabilità dei test biologici e loro validazione (avere una “ricetta casalinga” per effettuare un esperimento in determinate condizioni in tutto il mondo);
• Le linee cellulari in genere sono pure, omogenee, con la possibilità di mantenerle in azoto liquido in un tempo infinito;
• È possibile maneggiare una coltura con tempi di esposizione definiti e con concentrazioni controllate; possibilità di fare i test in batteria (screening) consente di preparare 96 campioni contemporaneamente e permette anche di testare più molecole contemporaneamente con tempo limitato e budget limitato;
• Le cellule sono direttamente a contatto con la sostanza di cui voglio valutare l’effetto.

Svantaggi

• È difficile manipolare una coltura;
• È importante lavorare in sterilità, problemi di contaminazione;
• Sono molto costose, in termini di reagenti e di materiali monouso per coltivare le proprie cellule, costa anche lo smaltimento;
• Colture cellulare sono omogenee e bidimensionali, le interazioni che potrebbero esserci in un tessuto vengono perse;
• Il metabolismo di una coltura cellulare è di tipo glicolitico, quindi usa prevalentemente la glicolisi (anaerobia) e questo tipo di metabolismo non è simile a quello che le cellule usano in vivo, perché è di tipo ossidativo;
• Mancanza di sistemi coinvolti nella regolazione dell’omeostasi, manca tutto il condizionamento dell’ambiente extracellulare anche in termine di segnali ormonali;
• Dedifferenziamento (cellule differenziate in coltura possono regredire in cellule staminali morfologicamente) ed in instabilità genetica.

Nonostante questi limiti le colture rimangono un valido strumento di indagine.

Organizzazione laboratori di colture cellulari

Laboratori con pressione positiva o negativa, in entrambi i casi si utilizza una precamera che permette di mantenere questo stato di pressione. Quella negativa serve per non far fuoriuscire nulla è voluta se si utilizza materiale umano. Quella positiva si usa per i batteri.

Si utilizza una cappa a flusso laminare, le colture vanno manipolate sotto cappa.

• Serve un incubatore a CO₂.
• Microscopio ottico a contrasto di fase.
• Centrifuga basculante, con il rotore che si chiama swing out, a bracci rotanti.
• Piccola strumentazione (vetreria, pipette, pompa da vuoto, guanti, piaccametro).

Cappa a flusso laminare orizzontale

Aspira l’aria da sotto, la fa passare attraverso un filtro e la fa fuoriuscire a livello della zona di lavoro dopo aver passato un secondo filtro HEPA (lana di vetro, colla e supportato tra due pannelli di metallo). Il sistema con cui viene aspirata l’aria taglia in lamine l’aria, non è un flusso turbolento, deve essere un flusso quieto. L’aria investe l’operatore e la cappa non ha uno schermo di protezione, è sicuro per la sterilità delle colture cellulari ed è un po’ meno sicuro per l’operatore. Non si può usare per tutti i composti perché non protegge l’operatore. È una cappa di classe 2.

Cappa a flusso laminare verticale

È un vetro fisso, vengono lasciati 30 cm per far passare le mani, nel caso non si usi questo spazio viene chiuso e si accendono le luci UV. Anche in questo caso viene prelevata aria da sotto, il filtro HEPA è sul soffitto della cappa dove la ventola spinge il flusso di aria per il 70% all’interno della cappa e il 30% verso il filtro. Flusso sempre laminare, ma non colpisce l’operatore, è parallelo ad esso.

Piano di lavoro

È di acciaio non lavorato, presenta sopra un secondo piano rimovibile che è forato e dà la possibilità all’operatore di lavare entrambi i piani, il piano deve essere facilmente rimovibile e facilmente lavabile. In alto c’è una lampada UV che si accende quando la cappa è chiusa. Per usare la cappa spengo gli UV, accendo il flusso e apro il vetro.

Cappe di sicurezza biologica (classe 3)

Si utilizzano quando si manipolano agenti patogeni, è completamente sigillata ed è mantenuta una pressione negativa. Stessa struttura delle cappe chimiche, flusso dell’aria è laminare. Il lavoro viene svolto con guanti a manica di gomma attaccati alla cappa.

Incubatore a CO₂

Si controllano i vari parametri con i display, sul fondo c’è una bacinella con acqua per atmosfera umidificata.

Centrifuga refrigerata

Pannello digitale su cui si può impostare la velocità espressa in RCF (relative centrifugal force) e i giri sono espressi da rpm (rotazioni per minuto). Con RCF vuol dire svincolarla dal tipo di rotore, sono uguali per tutte le centrifughe perché non dipendono dal raggio del rotore. Normogramma: serve per valutare il raggio del rotore utilizzando la misura in RCF e poi si calcolano gli rpm. Alloggiamenti per provette con diversa capacità.

Microscopia ottica

Limite di risoluzione: minima distanza alla quale si possono vedere due punti (lambda/seno alfa n).

Microscopio a contrasto di fase: si basa sulla presenza, oltre che del condensatore, di un diaframma anulare tra la sorgente luminosa e il condensatore. Il diagramma è formato da due cerchietti concentrici e divide il raggio in due e poi si ricongiunge. Quando il raggio luminoso attraversa un preparato varia la lunghezza d’onda solo di un raggio, con l’obiettivo si divide ancora e poi si ricongiungono e possono non essere più in fase. Sfasamento lunghezza d’onda dei due raggi aumenta il contrasto della figura. Questo microscopio fa in modo di sfalsare i raggi quando passa nel secondo diaframma di fase, lo sfalsa di un quarto della lunghezza d’onda in modo da avere sempre uno sfalsamento. Nomarski: si aggiungono un polarizzatore e un analizzatore.

Microscopio a fluorescenza: si utilizzano i fluorocromi (grosse molecole che hanno elettroni instabili) hanno lunghezza d’onda d’eccitazione e lunghezza d’onda d’emissione. Si può usare una luce visibile o ultravioletta e si utilizza un filtro a barriere che fa passare la componente del fascio di luce interessata, con una determinata lunghezza d’onda. Si mette un altro filtro prima del preparato che è opaco, quindi riflette la luce con quella lunghezza d’onda a fa passare lunghezze d’onda superiori. La luce passa attraverso il preparato con il fluorocromo e diminuisce la sua lunghezza d’onda. DAPI per visualizzare il nucleo, FITC (fluoresceina) e TRITC (tetrametil rodamina).

Tipi di colture

• Colture di organo (embrioni di animali), no proliferazione cellulare
• Piccolo espianto, metterlo in colture e alcune popolazioni cellulari possono proliferare.

Co-colture: prendo un pozzetto, metto una popolazione cellulare, un setto e un’altra popolazione cellulare. Può simulare tessuti presenti in un organo. Derivano da un pezzettino di tessuto frammento che poi è stato messo in coltura originando prima la coltura primaria e poi linea cellulare.

Metodi di preparazione delle colture (qualcosa che metto in vitro) cellulari in generale. (Non è possibile fare una vera e propria divisione distinta dei tipi di colture in quanto possono sovrapporsi)

Tipi di coltura

• Colture di organi, la tecnica consiste nell’asportare un piccolo organo nella sua totalità (organo di embrione di specie piccola), anche frammenti di organo adulto (in realtà si può rientrare nella coltura dell’espianto). Vantaggio: vengono mantenute le strutture che vanno a costituire la morfologia di quell’organo, viene anche mantenuta l’integrità della superficie, coltura definita tridimensionale. Svantaggio: posso mantenerlo in coltura con diversi sistemi, ma non si propaga, eventualmente le cellule possono differenziarsi, ma non possono dividersi (nel caso di embrioni). Con questa coltura si va a vedere un processo più o meno complesso senza le influenze del contorno e di eventuali interferenze da parte di altre vie metaboliche di altri organi o altri tessuti. Sono impiegate per fare ricerche embriologiche di sviluppo. Non è possibile avere repliche che provengono dalla stessa fonte, dovendo utilizzare diverse fonti c’è un problema nella variazione dei dati che è intrinseca nella diversa fonte del campione che sto preparando. Di solito si cerca di ottimizzare la resa quindi si vanno a visualizzare più parametri all’interno dello stesso campione. Le colture di organo si possono fare in piastre da circa 6 pozzetti. L’organo viene posto in un recipiente idoneo su un filtro poroso sostenuto da un retino di acciaio (supporto). La coltura viene mantenuta in medium di coltura che garantisce la sopravvivenza con l’aggiunta di estratto embrionale in termostato a 37°C. in tali condizioni l’organo embrionale può mantenersi in vita per molti giorni e si sviluppa e si differenzia secondo modalità simili a quelle che si verificano nell’embrione intero. È importante mantenere il livello del medium che garantisca una corretta interfaccia gas-liquido (condizione necessaria per mantenere la geometria dell’espianto).
• Colture di espianti, coltura primaria; differenza con coltura di organo: nell’espianto c’è la propagazione delle cellule periferiche, queste possono dividersi e poi si può prelevare quella parte e si può preparare un campione molto simile a quello precedente quindi si possono avere n repliche. Coltura primaria: si intende una coltura le cui cellule derivano direttamente dal tessuto che ho prelevato da un organismo, può essere sacrificato un animale o si può utilizzare anche una semplice biopsia; derivano da frammenti di tessuto che può essere pretrattato o no con enzimi o può essere trattato meccanicamente con un bisturi. A seconda del tessuto diverse tipologie di colture: se ho prelevato un tessuto connettivo adiposo sarà coltura di adipociti; prevalentemente si prova a fare una coltura omogenea, ma è difficile. Questo tipo di coltura si può propagare ed è la premessa per definire quella che può diventare la linea cellulare.
• Colture di dissociazione, se prendo il pezzettino di tessuto e lo frammento posso avere una coltura che si chiama “coltura di cellule dissociate”, dopo aver messo tutti i pezzettini in sospensione, sono chiamate subcolture
• Colture organotipiche, sono complesse, si cerca di replicare mettendo in coltura le popolazioni cellulari presenti in un organo, sono formate da due popolazioni distinte e vengono chiamate anche co-colture; per andare a formare una coltura dell’epidermide si prendono due popolazioni cellulari che vengono separate da un filtro in modo che le cellule non possono né migrare né mischiarsi, ma possono comunicare le une con le altre, è importante che sia garantita la superficie dello scambio gas-liquido delle due popolazioni cellulari. Nel giro di 10 giorni si può avere l’epidermide/derma che si è andata a creare. (Secondo quali modalità posso avere le colture? Colture di organi, primarie, subcolture, linee cellulari)

Ci sono diverse modalità di crescita in vitro

• Possibilità di preparare colture di frammenti di strutture cellulari e mantenerli in vitro usando le metodiche dell’organocoltura, comunque chiamate espianto di organo perché prelevo solo un pezzetto di cervello
• Da una popolazione cellulare in determinate condizioni le cellule possono riassociarsi e quindi instaurare delle giunzioni ad esempio cellule-cellula dando origine agli sferoidi. Cellule adipose dopo averle differenziate in condroblasti crescono in sospensione formando sferoidi e producendo matrice extracellulare (coltura 3D)
• Polarizzazione cellulare (la diversa ripartizione delle proteine di membrana tra lo strato apicale e quello basolaterale che vengono mantenute in sede grazie alle giunzioni occludenti): si fanno crescere le cellule in presenza di componenti della matrice extracellulare, le cellule si orientano con la parte basale verso la componente della matrice e la parte apicale verso il lume o il monostrato
• Produzione pelle artificiale utilizzando condroblasti, cheratoniciti, utilizzando un filtro biodegradabile

Le cellule possono essere coltivate

• In adesione, cellule derivanti da tessuti solidi crescono aderendo alla superficie delle piastre da coltura, facendo strati bidimensionali con solo uno strato di cellule
• Sferoidi (3D), possono essere istotipica (1 solo tipo cellulare) o organotipica (più tipi cellulari)
• In sospensione, devono essere mantenute in sospensione come ad esempio le cellule emopoietiche

Influenza delle condizioni ambientali

• Se le cellule crescono in adesione devo scegliere una superficie di adesione che sia ottimale per la mia popolazione cellulare, questa superficie può essere: solida (plastica, vetro), liquida (per cellule in sospensione) o sotto forma di gel (supporto con certa deformabilità, malleabilità)
• La natura della superficie di adesione influenza poi le interazioni cellula-cellula o cellula-matrice
• Ogni popolazione cellulare avrà delle preferenze per il sistema che la circonda, quindi è importante anche il terreno o medium di coltura con caratteristiche generali che vadano bene per n popolazioni di cellule, mentre alcune cellule hanno bisogno di condizioni di terreni di coltura particolari
• Sono importanti gli scambi tra la fase gassosa del medium e la superficie cellulare
• Osmolarità (si intende il contenuto di sali che conferiscono determinate caratteristiche all’ambiente extracellulare) deve essere ottimale e compatibile con le caratteristiche del sistema cellulare
• Temperatura di incubazione in base al tipo cellulare (da 37°C per colture cellulari mammifero a 24°C per colture di pesci)

Crescita in sospensione: l’importante è che il materiale sia sterile, in sospensione le cellule crescono bene all’interno dell’organismo, soprattutto quelle del sangue, è importante anche garantire una certa agitazione per contrastare la gravità. Alcune tipologie di cellule inizialmente tenute in sospensione sono quelle che possono andare a costituire lo sferoide (si usano le Eppendorf da 500 microlitri fino ai 2mL). Importante -> le colture 3D sono il ponte che collegano la coltura cellulare tipica e il tessuto in vivo.

Superfici di adesione

Un tempo venivano usano contenitori di vetro se il supporto doveva essere solido, adesso si usa esclusivamente la plastica (polistirene o PVC), anche se la maggior parte dei contenitori (quelle in sospensione principalmente) sono fatte di policarbonato. Lo svantaggio del supporto plastico è la carica superficiale che serve ad alcuni tipi di cellule data la presenza dei fosfolipidi che possono avere una piccola carica, quindi la superficie della plastica va trattata anche perché è idrofobica, viene trattata con i raggi gamma (garantisce anche un certo grado di sterilità) in modo da renderla carica e idrofila. Trattamento superfici con poli-D-lisina o poli-L-lisina in modo da migliorare l’adesione delle cellule e l’adsorbimento proteico attraverso la variazione delle cariche superficiali delle piastre. Si possono utilizzare anche dei supporti che si solidificano: non messi nei contenitori chiusi (che hanno fondo pretrattato). Quelle più usate sono la gelatine e l’agar.