Biotecnologie avanzate in medicina

Biotecnologie avanzate in

medicina

Proff. Luconi, Tani, Liotta

A.A. 2021/2022

Biotecnologie avanzate in

medicina

Luconi

A.A. 2021/2022

Tecniche di studio delle proteine – (prof.ssa Luconi)

I livelli di analisi della cellula e tessuto, per vedere come funzionano, sono diversi, abbiamo il livello genetico, quindi DNA e messaggero e anche

produzione di miRNA, piccoli RNA non codificanti, e poi l’mRNA che corrisponde a geni codificanti viene tradotto in proteine che sono poi loro che

determinano la funzione cellulare e quindi tutti gli studi che si fanno quando analizziamo l’espressione di un gene o altro, ricordiamoci che quello che

fa la funzione nella cellula sono le proteine, quindi per esempio non sempre studiare l’mRNA corrisponde alla vera attività cellulare, perché ci sono

proteine instabili, oppure dipende dalla biodisponibilità e quindi è importante conoscere le tecniche di analisi delle proteine. Altra cosa che possiamo

dire è di non fermarsi mai a fare un’analisi o studio con solo una tecnica di studio, bisogna sempre cercare di dimostrare le stesse cose con più tecniche

perché un livello di analisi soltanto può non rispecchiare del tutto ciò che succede in una cellula. Tornando alle proteine, a seconda della loro funzione

abbiamo anche tecniche diverse per lo studio per una emivita e distribuzione diversa, ci sono le proteine strutturali che determinano configurazione

della cellula o tessuto, e non hanno in genere una grande velocità di ricambio, ci sono poi le proteine enzimatiche che facilitano le trasformazioni

chimiche in una cellula e che poi hanno una regolazione che non è tanto legata alla loro maggiore o minore espressione, ma nella loro attività non si

regola in quantità, ma da proteine regolatrici che ne alterano rapidamente le funzioni, per esempio la fosforilazione, tagli proteolitici, attacco di gruppi

glicolitici ecc… L’attività di queste proteine, ma non solo, anche delle strutturali, viene regolata non solo dalla capacità cellulare di rispondere a uno

stimolo aumentando sintesi o degradazione, ma anche attraverso modifiche post-traduzionali, da proteine regolatrici, quindi aggiungendo elementi

che non sono codificati dal gene di origine, ma gli vengono aggiunte queste modifiche solo dopo la sintesi. Un altro modo per modificare l’azione della

proteina è anche la rilocalizzazione della proteina, per esempio gli spermatozoi sono cellule con DNA estremamente compattato che non fanno sintesi

proteica e in questa sede la regolazione rapida delle proteine avviene proprio per compartimentalizzazione, infatti non possono produrre nuove

proteine e quindi per rispondere a una necessità la regolazione non avviene mediante fosforilazione o quant’altro, ma è importante localizzare una

proteina per dove è importante che venga attivata, per esempio nel mitocondrio, o nel nucleo ecc…

Ora, l’analisi delle proteine in un sistema quindi si basa su quantificazione netta delle proteine, quindi dosaggi, effettivamente la localizzazione delle

proteine, con tecnica d’eccellenza la microscopia che in certi casi ce la fa anche quantificare, poi valutazioni delle modifiche post-traduzionali, per

esempio fosforilazioni ecc…, poi misurazione dell’attività enzimatica della proteina, e poi anche un altro aspetto è lo studio dell’interazione tra

proteine diverse.

Le tecniche che vedremo in questo corso sono:

• Analisi microcitica, quindi studio su cellule con microscopio, con studio sia immuno-citochimica che immuno-istochimica, per vedere la

localizzazione delle proteine con l’uso di Ab direzionati verso un determinante specifico della proteina; quindi, si basa su Ab altamente

sensibili e specifici, con interazioni che si rilevano sia in fluorescenza che in altri modi e poi viene rilevata la positività di questa interazione

e analizzata con opportuno microscopio. Questa analisi ci fa da una parte quantificare, risalendo alla quantità di proteina detectata dall’Ab

con metodiche quantitative dicendo quanta proteina c’è, ma d’altra parte fa localizzare la proteina nel comparto in cui è presente e viene

espressa. Quindi rispetto ad altre tecniche (elettroforesi in primis) ci fa collocare la proteina.

• Autoradiografia, in cui non abbiamo una rilevazione Ab-antigene, ma abbiamo molecole marcate che sono sonde rilevabili localizzando

l’espressione della molecola che interagisce con la sonda che usiamo.

• Laser capture microdissection, è un sistema per cui lavorando in microscopia lavoriamo su fette di tessuto e abbiamo uno strumento che

ci fa disegnare, sotto microscopio, e ritagliare un’area specifica e con una catapulta a pressione lo mettiamo in un contenitore, es unel

tappo di una eppendorf e in questo pezzettino ritagliato facciamo analisi di rilevazione proteica. È importante perché per esempio se

studiamo un tumore, questo non è sempre così ben localizzato; quindi, se dovessimo estrarre tutto il tessuto che abbiamo asportato con

biopsia, avremmo comunque un effetto di diluizione rispetto a tante cellule sane, è quindi importante arricchire il campione e recuperare

solo la parte del tumore, dopo averla vista a microscopio perché o ha una struttura particolare oppure perché marcata in un certo modo.

Quindi è un sistema che ci fa isolare o arricchire zone specifiche di un tessuto, ma anche cellule in vivo.

• Analisi citofluorimetrica (FACS), è un’analisi che ci fa rilevare l’antigene specifico sempre di nuovo con interazione Ab-antigene, avremmo

un Ab marcato che lega il suo corrispettivo antigene, per esempio in una popolazione in sospensione, e rispetto alla microscopia lavoriamo

appunto in sospensione e non ci dice quindi la localizzazione della proteina nella cellula, ma ci fa lavorare su grandissimi numeri rispetto

al microscopio. Esistono anche citofluorimetri che non sono marcano le cellule, ma ci fanno separare le cellule marcate e no e quindi posso

arricchire ancora una volta la nostra popolazione proteica e posso quindi lavorare su grandi numeri.

• Analisi proteomica, mediante elettroforesi, ma anche con western blot, ma anche con tecniche di differential display (DIGE) che mi fa

analizzare in contemporanea più cellule o tessuti diversi. Ma si fa analisi anche con ELISA, spettrometria di massa, profiling e imaging e

infine anche bioplex

• Interazione proteica, ci focalizzeremo su tecniche che richiedono ingegnerizzazione del bersaglio.

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Partendo dall’analisi microcitica in immunocitochimica e immunoistochimica, abbiamo un Ab antigene specifico verso un antigene che lo ritrova su

cellula oppure su tessuto su vetrino. Ci basiamo su due principi, i sistemi che sfruttano la reazione antigene Ab e quindi sviluppiamo un Ab verso

quella proteina che vogliamo, ma poi c’è un insieme di tecniche in cui non sappiamo cosa vogliamo, non abbiamo un Ab, ma separiamo le proteine

per studiare un campione in cui sono più espresse quelle proteine ma che non conosciamo e quindi sfruttiamo delle caratteristiche generali delle

proteine per indagare e poi le andiamo a caratterizzare ma non con reazione antigene Ab, ma usiamo delle tecniche per sfruttare le caratteristiche

generali delle proteine. Tornando alla immunocito/istochimica prepariamo il campione per evidenziarlo con Ab e ci sono una serie di passaggi che

prevedono in primis di avere o cellule o tessuto e dovremmo fissare questa struttura mantenendo la posizione delle proteine; infatti, la microscopia

ci permette di collocare le proteine in compartimenti specifici; quindi, posso congelare le proteine in modo da vederne la posizione esatta. Quindi per

esempio dobbiamo fare fissazione o paraffinandolo o congelandolo per poi dover fare una serie di sezioni, in fatti il preparato deve essere sottile per

poter essere visto e poter esporre gli antigeni che poi possono essere captati dall’Ab. Ovviamente sezioniamo SOLO i tessuti, perché le cellule già sono

un singolo strato. Le sezioni le otteniamo con il microtomo se lavoriamo su tessuto paraffinato, oppure criotomo che il tessuto è congelato,

importante è che quando è abbastanza solido possiamo affettarlo e ottenere fettine sottili. Dopodiché il tessuto deve essere de-paraffinato e poi

iniziano i vari passaggi di somministrazione dell’Ab:

1. Bloccaggio, serve perché l’Ab potrebbe avere una cross-reattività con qualcosa che non è il suo antigene specifico e quindi il bloccaggio fa

rivestire la cellula con questo agente bloccante, tipicamente è siero non immune, e fa bloccare tutti gli antigeni aspecifici che non sono il

target antigenico verso cui è direzionato l’Ab, ma casomai ha una sequenza simile e darebbe lo stesso positività. Questo legame aspecifico

quindi viene bloccato. Infatti, l’agente bloccante viene scalzato dall’Ab solo in corrispondenza del vero antigene, mentre negli altri antigeni

non avviene questo scalzamento e quindi rimane il bloccante.

2. Incubazioni con Ab primario e secondario, l’Ab primario è quello legato all’antigene e non porta il sistema di rilevazione, lega solo

l’antigene, mentre il secondario porta il sistema di rilevazione, e non è diretto verso l’antigene, ma una struttura portante, ovvero la

struttura Fc dell’Ab primario specifico per l’antigene. È improtante fare questa distinzione tra anticorpi perché il primario in realtà può

portare anche direttamente il sistema di rilevazione, però usando questo sistema abbiamo sicuramente un rapporto di detezione di tipo

1:1, ovvero un antigene è rilevato da un singolo Ab. Ma se uso un anticorpo secondario, l’ab primario può essere rilevato da tante più

molecole di Ab secondario, perché il frammento Fc può essere legato da più Ab secondari e si crea un castello di amplificazione del segnale.

Quindi si formano dei complessi di Ab secondari sull’unica molecola di Ab primario legato sull’antigene. Avendo però un doppio sistema di

Ab, avremo anche per contro un aumento del problema dell’aspecificità; infatti, per un solo Ab il massimo dell’aspecificità è dove si lega

impropriamente l’ab primario, ma se ho anche un Ab secondario si aggiunge l’aspecificità del secondario che anzi, è anche più comune

perché è diretto al frammento Fc dell’Ab primario ma è un frammento abbastanza comune e ubiquitario e non così specifico. Un vantaggio

però, ancora, dell’uso del secondario, è quello che se dobbiamo analizzare tanti antigeni e quindi avere tanti Ab primari, ognuno diretto

verso l’antigene relativo, tutti gli Ab primari marcati implicano un rilevatore diverso, e questo significa anche un costo elevato, perché

quello che costa è proprio il marcatore solitamente. Ma se usiamo un Ab secondario, visto che i primari sono prodotti in specie diverse,

come topo, coniglio, capra ecc…, possiamo far si che basta un Ab secondario che lega l’Fc di qualsiasi Ab primario prodotto in ogni specie,

quindi in modo specie specifico. Quindi se mi doto di Ab primari diretti verso antigeni diversi, ma prodotti nello stesso animale, posso

usare un solo Ab secondario risparmiando economicamente sulla marcatura e è importantissimo in sede di marcature multiple.

3. Lavaggi tra incubazioni di Ab primario e secondario.

4. Rilevazione del segnale, l’Ab è legato a un sistema di detection che ci permette, tramite emissione legata a quel sistema, di localizzare

dove si è formato questo sandwich Ab-antigene. Il segnale, sia che sia portato dal primario in reazioni dirette, che da secondario nella

reazione indiretta, sono di due tipi, da una parte rilevazioni in colorimetria rilevabili a microscopio ottico, usando quindi un enzima che si

applica alla coda dell’Ab, o del primario o secondario, e questo enzima, una volta che avviene la reazione e le varie incubazioni, questo

enzima è attivato dalla somministrazione del substrato del relativo enzima, quindi questo lo trasforma da substrato a prodotto e avviene

solo là dove si è formato il complesso Ab-antigene e a microscopio ottico vedremo il risultato. Gli enzimi più usati sono perossidasi o la

fosfatasi alcalina e la sensibilità di questo sistema diciamo che non è elevata, ma molto più elevata lo è la rilevazione in fluorescenza,

ovvero anziché avere un enzima, l’Ab ha un fluorocromo, che se messo in condizioni di essere eccitato, viene emessa una colorazione che

poi viene detectata dal microscopio. E questo permette di detectare an he quantità minime di Ab. Mentre quindi la fluorescenza la

possiamo usare in metodica diretta o indiretta, se lavoriamo con l’enzima, in microscopia ottica, è necessario lavorare con l’Ab secondario,

altrimenti la sensibilità sarebbe minima qualora l’enzima fosse legato all’Ab primario e non al secondario. La fluorescenza prevede due

microscopi diversi, uno che permette di detectare la fluorescenza in epifluorescenza e microscopi che lavorano in confocale. Nel primo

caso significa che il preparato emette, dopo essere stato eccitato, in toto, ovvero che si eccita il preparato e tutto il preparato riemette e

questa cosa può essere un problema perché non possiamo capire in che parte dello spessore del preparato abbiamo il nostro Ab marcato,

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proprio perché in modo sincrono emette tutto il preparato e avremo un’immagine che è la proiezione della fluorescenza sul preparato e

quindi non potremmo capire bene la localizzazione di queste proteine. Immaginiamo di fare una doppia analisi per due target diversi, e

potremmo vedere le emissioni che identificano le due proteine sono completamente sovrapponibili e non siamo in grado di capire se

questa sovrapposizione è però data dalla presenza di uno dei due marcatori in un punto del campion o in un altro; infatti, il sistema

schiaccia le emissioni e poi rende tutto in un’unica dimensione. In epifluorescenza quindi si proietta su un piano l’emissione di due strutture

che magari non sono sullo stesso piano dello spessore, però questo non lo potremmo mai capire in epifluorescenza. Se invece analizziamo

lo stesso preparato (stesso tipo di incubazione e metodica) in un sistema confocale, ci fa identificare questa differenza, infatti, questo

microscopio scannerizza il preparato su piano diversi, come una TAC, e analizza via via ogni piano diverso e su ogni piano analizza

l’emissione delle fluorescenze che ho e quindi questo mi fa capire se la sovrapposizione delle emissioni sono davvero date da fluorescenza

contemporanea dei due marcatori oppure invece no. Tanto che la microscopia confocale mi fa vedere quando abbiamo marcatura in

contemporanea di più proteine. Nell’immagine, la figura A è il sistema epifluorescente, mentre B è confocale.

Sempre in caso di più fluorescenze diverse, qualitativamente e quantitativamente, non sempre il preparato risulta molto definito e risoluto,

dove la definizione è una proprietà fisica che permette di avvertire come separate due fonti, maggiore è la risoluzione e maggiore è la

distanza percepita tra due punti separati. Se non abbiamo buona risoluzione, avremmo un’immagine a microscopio non definita, ma

abbiamo una tecnica detta microscopia a deconvoluzione con una serie di algoritmi che permette di lavorare e “ripulire” l’immagine fino

a ottenere un’immagine definita, ma non è legata alla bontà del preparato, sono una serie di analisi che partono dopo la marcatura e

permette, quando dobbiamo localizzare bene la positività della proteina, di lavorare e distinguere bene la localizzazione della proteina.

Passando ora all’autoradiografia, un tempo si usavano marcatori del tipo isotopi radioattivi, oggi invece in genere usiamo sempre fluorescenza e

quindi sistemi di detezioni delle molecole in cui diamo al preparato, o anche all’animale, la molecola marcata che si distribuisce, cerca il proprio target,

che potrebbe essere un recettore se usiamo un ligando marcato, e poi osserviamo a microscopio la localizzazione della positività. E il sistema non è

assolutamente però Ab-antigene, può essere un ligando, un recettore, un enzima, un substrato ecc… Questa tecnica permette di vere e quantificare

la sonda usata nel sistema. L’uso dell’autoradiografia ci permette di vedere la localizzazione anatomica dei ligandi marcati e visualizzare e quantificare

i recettori in un tessuto; quindi, si può usare direttamente in vivo. Ad esempio, su questa tecnica nell’uomo si basa la così detta PET, che avviene

somministrando il fluoro-deossiglucosio; quindi, glucosio marcato che emette come radionuclide grazie al fluoro, il glucosio quindi si localizza nei

tessuti ad alta attività metabolica, quindi per esempio nel cuore, ma soprattutto nei tumori. in realtà è possibile fare questa tecnica anche in vitro

ovviamente ma si usa molto meno ad oggi.

Parliamo adesso dell’analisi proteomica, abbiamo visto due tecniche legate alla microscopia, mentre l’analisi della proteomica ci permette lo studio

nel complesso delle proteine anziché la singola proteina come visto finora. La proteina effettivamente possiamo studiarla in diversi livelli che vanno

a corrispondere alla struttura della proteina, con la sequenza primaria, secondaria, poi la terziaria e quaternaria. Questi sono i 4 livelli in cui possiamo

lavorare nell’indagine proteica. L’altra considerazione da fare è di non lavorare nella struttura nativa in cui non si rompono legami che fanno stare la

struttura quaternaria e terziaria, ma vogliamo lavorare solo sulla sequenza proteica, analizzando per esempio con Ab la sequenza che rappresenta

l’antigene verso cui è realizzato l’Ab e lavoriamo in ambiente denaturante. È importante perché dobbiamo subito sapere, quando estraiamo le

proteine, se siamo in condizioni che conservano la condizione nativa oppure in condizioni denaturanti. Quando si fa estrazione delle proteine presenti

in un campione, si fanno le seguenti fasi:

1. Preparazione del campione, e avevamo visto che in microscopia si fissavano i campioni, ma in questa tecnica si estraggono le proteine con

buffer e strumenti che frammentano la