Biotecnologie avanzate in medicina

Colorazione delle proteine nel gel

Tuttavia, è tutto trasparente ovviamente e devo evidenziare le proteine per capire che peso molecolare hanno e dove sono nel gel, mentre lo standard come abbiamo già detto è già colorato e visibile addirittura a occhio nudo. Abbiamo gli stessi coloranti che abbiamo visto prima per il dosaggio, si tende a usare il Comassie perché è anche quello meno caro, è in grado di poter legare i residui basici, l'unica cosa è che questo tipo di colorazione, ma anche le altre che abbiamo visto, servono a valutare la concentrazione soprattutto, ma siccome nel pozzetto ce ne mettiamo davvero poche di proteine (10-50µg), abbiamo davvero allora poca risoluzione. Abbiamo allora bisogno di colorazioni anche più sensibili, allora in scala di sensibilità possiamo avere una colorazione in fluorescenza (pg), colorazione argentica (ng) e la meno sensibile è la colorazione di Comassie e le altre, come Lowry ecc... che

risolvono fino a ^µg-mg. Ovviamente la fluorescenza è la tecnica che ha la maggior risoluzione di tutte potendo mettere in evidenza fino a centinaia di volte superiore delle altre. In realtà quindi il gel si applica sopra la miscela della colorazione, facciamo lavaggi e poi un'eventuale fluorescenza la vediamo in uno schermo che eccita il fluorocromo che sarà legato alla proteina, le altre due, colorazione argentica e Comassie emettono sempre luce visibile e anche a occhio nudo. Oltre che a lavorare su proteine intrappolate in gel, possiamo trasferirle su una membrana e possiamo usare Ab specifici sapendo la proteina che vogliamo analizzare, o volendo individuare eventuali modifiche post-traduzionali ecc... potendo usare quindi Western Blot che mi fa proprio fare questo. Infatti, finché la proteina è nel gel di elettroforesi non posso farci nulla. Nel western blot non possiamo usare Ab coniugati a fluorocromi perché questa membrana sucathode, che è la parte negativa, permette alle proteine di migrare verso il foglio di nitrocellulosa. Una volta completato il trasferimento, si procede con il blocco non specifico, che consiste nell'immergere il foglio di nitrocellulosa in una soluzione contenente proteine come albumina o latte scremato, in modo da saturare i siti di legame non specifici. Successivamente si procede con l'incubazione del foglio di nitrocellulosa con gli anticorpi primari specifici per la proteina di interesse. Gli anticorpi primari si legano alle proteine target presenti sul foglio di nitrocellulosa. Dopo un'ulteriore lavaggio per rimuovere gli anticorpi non legati, si procede con l'incubazione degli anticorpi secondari coniugati con un enzima o un fluorocromo. Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari, permettendo così la rivelazione della proteina di interesse. Infine, si esegue la rivelazione utilizzando un substrato specifico per l'enzima o il fluorocromo utilizzato, che emette una fluorescenza o una luce ottica visibile.avvenuta una modifica nella procedura.più difficile e funzionano meno. Quindi, di nuovo possiamo usare un Ab primario direttamente coniugato, oppure uno che viene riconosciuto da Ab secondario e è coniugato lui; quindi, valgono le stesse regole possiamo dire. Importante però che prima di applicare l'Ab primario dobbiamo sempre usare i bloccanti come albumina sierica, o altri sistemi, che in ogni caso sono ad alto contenuto di proteine che bloccano i siti esposti dai diversi antigeni e limitano quindi l'aspecificità dell'Ab che deve a quel punto scalzare il bloccante e lo fa soltanto per gli epitopi altamente specifici a cui è rivolto. Quindi applichiamo il bloccante, facciamo lavaggio, poi mettiamo l'Ab primario, facciamo ancora lavaggio e poi mettiamo il secondario che è sempre coniugato a enzimi per trasformare substrati in prodotti non manifestabili in luce visibile ma in chemiluminescenza che viene detectata da sistemi in analisi che ci fanno vedere a.

Questo punto sulla nitrocellulosa le bande evidenziate la dove si è depositato l'Ab. Ingenere andiamo poi a normalizzare la membrana su una proteina housekeeping che ci dà un'idea se il caricamento è avvenuto bene, separ esempio abbiamo messo le giuste concentrazioni. E possiamo fare rapporto tra proteina di interessa e proteina housekeeping e questo ci fa apprezzare alcune differenze sulla base del trattamento o condizioni sperimentali usate.

Nell'ambito dello studio di interazione tra proteine, una tecnica utile è l'immunoprecipitazione, ovvero si usa un Ab diretto verso la nostra proteina per estrarla dalla soluzione, prima di fare separazione. Quindi estraiamo le proteine come abbiamo visto e poi cerchiamo di estrarre e arricchire la nostra proteina di interesse. Questo si fa prima di fare l'elettroforesi perché spesso le proteine che ci interessano sono anche quelle meno rappresentate e se lisiamo la cellula potrebbero esserci.

Proteine che coprono la proteina di interesse, la cosa migliore quindi è, se abbiamo già idea di dove sta e in che concentrazioni è la nostra proteina, arricchire il campione, ovvero concentrare il campione arricchendolo con la proteina che ci interessa. Se cerchiamo quindi una proteina nucleare, per esempio, è inutile che estraiamo tutta la cellula e lavoriamo su tutte le proteine, di membrana, citosoliche, nucleari ecc... mentre è più efficace arricchire le proteine con quelle che vogliamo e sappiamo voler analizzare. Quindi faremo un arricchimento in fare pre-analitica, ovvero di estrazione, estraendo solo i nuclei. Si fa andando a lisare solo la membrana plasmatica, per esempio, e non il nucleo, potremmo infatti usare detergenti a bassa concentrazione specifici solo per la membrana plasmatica e in sospensione avremo pezzi di membrana, citosol e nuclei. Allora potremmo arricchire e concentrare i nuclei e su quel lisato studiare le proteine.

che saranno arricchite, perché a parità di contenuto proteico, avere 100µg di lisato totale rispetto a 100µg di solo nuclei, ovviamente in quest'ultimo caso la proteina sarà molto più presente. E per separare i nuclei basta fare una centrifugazione e infatti i nuclei sono più pesanti e quindi saranno nel pellet dopo centrifugazione. Dovesse interessarci una proteina citosolica o di membrana fo il contrario, butto via il pellet e prelevo soltanto il surnatante. Inoltre, potrei fare immuno-precipitazione, infatti invece di separare sempre tutte le proteine in elettroforesi, pesco in sospensione la nostra proteina, metto quindi il nostro Ab specifico, per esempio legato a un sistema di uptake, ovvero una biglia magnetica, per esempio, e mettendo la provetta in magnete, il complesso proteina target+Ab+biglia potrà estrarla. Ovviamente farà tanti lavaggi. Anche in questo caso posso fare un sistema a sandwich di Ab indiretti, ma sipreferisce che l'Ab di estrazione sia quello che venga estratto, quindi si lavora spesso in modo diretto, quindi l'Ab che uso per riconoscere la proteina è anche già legato al sistema di uptake. Una volta ottenuto il pellet o surnatante, rimuovo la biglia e l'Ab a questo punto posso fare un'analisi con elettroforesi come abbiamo visto. Spesso non avrò soltanto la proteina che mi interessa, però è sicuramente arricchita. Spesso però posso anche usare Ab non proteina-specifici ma per esempio specifici per un dominio proteico che può essere in comune a tante proteine, per esempio domini di Tyr-chinasi e quindi andrò a arricchire la soluzione con tutte le proteine Tyr chinasiche. Sappiamo però che in separazione elettroforetiche, siccome anche l'Ab è una proteina, avremmo anche un residuo di Ab; infatti, per quanto usi metodi per rimuovere legame antigene-anticorpo, spesso pezzi di Ab.

Rimangono attaccate alle proteine da analizzare, spesso le catene leggere e a questo punto possono coprire le proteine che hanno lo stesso peso molecolare (30KDa le catene leggere e 50KDa le catene pesanti). Dopo aver fatto immunoprecipitazione lo step successivo è la co-immunoprecipitazione sfruttando il legame dell'Ab con la proteina di interesse, ma ci interessa anche studiare con quali altre proteine del sistema la proteina interagisce, è un metodo per esempio per studiare la proteina a valle di recettori; infatti, usando il ligando stimola il recettore, ma non so il signaling a valle, in questo modo posso farlo con la co-immunoprecipitazione. Infatti, io so quale è il recettore di cui voglio conoscere l'interazione, uso l'Ab diretto verso la proteina e uso questo sistema per estrarre il recettore e anche tutte le proteine che si associano a lui. Devo lavorare in quelle condizioni in cui si mantiene questa interazione, ovvero condizioni non riducenti.

Non devorompere le interazioni che avvengono durante le vie di signaling. Quindi nel nostro buffer di lisi non avremo messo agenti riducenti che rompono i legami disolfuro che si creano nell'interazione delle proteine. Quindi uso l'Ab diretto verso la proteina di cui voglio studiare le cascate di signaling, per tirar giù tutto. Nel pellet quindi in cui ho messo l'Ab con la biglia magnetica, a quella proteina saranno automaticamente tirate giù tutte le proteine che saranno legate alla proteina "esca" nella situazione di studio. Per esempio, do insulina al sistema, che lega il recettore e vi si attaccano una serie di proteine che mediano il signaling intracellulare, allora se uso l'Ab diretto verso il recettore dell'insulina, tiro su tutto questo pathway di proteine. Allora a questo punto prendo il pellet, dopo aver staccato biglia e Ab metto in elettroforesi e vedo la banda del recettore e poi vedo tutte le altre bande corrispondenti.

alle proteine di signaling. A questo punto, avendo visto la separazione MD, vediamo l'elettroforesi 2D che usa anche il punto isoelettrico, quel pH al quale la caricanetta delle proteine è neutra. Nell'elettroforesi 2D si fa prima una separazione del nostro miscuglio proteico per punto isoelettrico, e poi in una seconda dimensione per peso molecolare sempre. La prima dimensione consiste nell'usare delle striscine di poliacrilamide in cui sono i