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Biotecnologie delle produzioni animali

Appunti di Biotecnologie delle produzioni animali basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Terova dell’università degli Studi Insubria Como Varese - Uninsubria, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali - Varese. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biotecnologie delle produzioni animali docente Prof. G. Terova

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Il risultato, almeno per una volta, assicura contemporaneamente risparmio e

tutela dell’ambiente.

Xenotrapianti

Trapianto -> è un intervento chirurgico che prevede la sostituzione di una

componente di un organismo vivente, in quanto malfunzionante, con un’altra

omologa e funzionante, prelevata da un’altra sede. In base alla fonte si parla

di: Autotrapianto -> donatore e ricevente sono la stessa persona, non

 presenta particolare problematiche, se non per un numero attuabile

basso di trapianti

Allotrapianto -> quando il donatore è un individuo diverso, ma della

 stessa specie, trapianto di interi organi, problema del rigetto

Xenotrapianto -> donatore appartenente ad una specie diversa dal

 ricevente

Rigetto: reazione immunitaria che si sviluppa all’interno dell’organismo

ricevente. Il sistema immunitario di un paziente che è stato sottoposto a

trapianto attacca il nuovo organo o tessuto, riconoscendolo come non-self.

Fenomeno controllato geneticamente dal complesso maggiore di

istocompatibilità: geni altamente polimorfici nella popolazione.

Autotrapianto

 Isotrapianto

 Allotrapianto

3 tipi di rigetto:

Iperacuto, insorge entro pochi minuti dal trapianto. È dovuto a lesione

 mediate da immunocomplessi a livelli dell’endotelio dei vasi sanguigni.

Gli ab pre-formati del paziente riconoscono gli antigeni delle cellule

endoteliali dell’organo trapiantato come non-self non appena l’organo

viene riperfuso. Quando il sangue fluisce nell’organo trapiantato

riconosce gli antigeni di membrana delle cellule epiteliali dell’organo

trapiantato come estranei. Attivazione a cascata delle proteine del

complemento che porta alla lisi del cellulare. I danni all’endotelio

causano aggregazione piastrinica (trombosi) e successiva necrosi

dell’organo trapiantato.

Acuto, dopo una decina di giorni, se il paziente non riceve farmaci

 immunosoppressori, in caso contrario il rigetto può causarsi in tempi

lunghi e può portare danni all’organi trapiantato se non è riconosciuto.

65% nei trapianti di rene, 50-60% nei trapianti di fegato. Il sistema

immunitario del paziente viene indotto a produrre ab contro gli antigeni

delle cellule endoteliali dell’organo trapiantato -> rigetto acuto

vascolare, causa il danneggiamento dell’endotelio con conseguente

necrosi. Infiltrazione di linfociti T e B nell’organo trapiantato -> rigetto

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acuto cellulare, causa infiammazione e danno alle cellule del

parenchima con conseguente ischemia dell’organo, necrosi e rigetto

Cronico, fino a 10 anni. Perdita di funzionalità dell’organo trapiantato su

 lungo periodo ed è associato non a danni dell’endotelio ma alla fibrosi dei

vasi sanguigni dell’organo. Può comportare anche alla necessità di un

altro trapianto. Il sistema immunitario del paziente attua una risposta

continua contro l’organo trapiantato, i cui vasi vengono

progressivamente occlusi dal tessuto muscolare liscio (fibrosi). Il processo

di fibrosi porta all’occlusione dei vasi e alla conseguente perdita

dell’organo.

Il problema del rigetto negli allotrapianti si limita con:

Terapie con immunosoppressori. Farmaci con l’azione di impedire la

 risposta immunitaria -> metotrexate o tacrolimus, agiscono a livello del

sistema immunitario inibendolo. Rischiosi poiché lasciano esposto il

paziente ai possibili rischi di un’immunodeficienza. Tuttavia, necessaria

l’assunzione a vita per i riceventi di trapianto per non andare incontro al

rigetto.

Tipizzazione HLA (Human Leukocyte Antigen). Complesso di

 istocompatibilità umano -> un gruppo di geni polimorfici costituito da 30

unità, localizzato sul cromosoma 6. Il sistema HLA è alla base del rigetto

nel trapianto. È possibile individuare donatori e riceventi HLA compatibili.

I prodotti genici tipici del complesso HLA legano frammenti di antigeni,

rendendoli visibili ai recettori dei linfociti T. Se le cellule del tessuto

trapiantato non hanno i medesimi antigeni HLA del ricevete, il tessuto

viene riconosciuto come estraneo e viene rigettato. Per mezzo di un

procedimento detto di tipizzazione tissutale, prima delle operazioni si

accerta che i due soggetti siano HLA compatibili. Tuttavia gli allotrapianti

hanno anche un altro enorme limite: gli individui deceduti da cui si

possono prelevare gli organi non sono sufficienti a scoprire la grande

richiesta di trapianti.

Xenotrapianti

Ricerca biotecnologica per ottenere organi di animali umanizzati, cioè i più

simili possibili a quelli umani e dunque più compatibili per i trapianti. Gli

xenotrapianti sono una valida alternativa perché permettono una fonte

illimitata di organi a cui attingere. Possibili donatori:

Primati, filogeneticamente più simili all’uomo, ciclo vitale lungo, problemi

 etici, alto rischio di zoonosi

Suini, filogeneticamente meno simili all’uomo, organi simili all’uomo, ciclo

 vitale breve, meno problemi etici

Storia degli xenotrapianti

1906 -> il chirurgo francese Jaboulay collega un rene di maiale al braccio

sinistro di un nuovo. Entrambi questi trapianti eterologhi, il primo eseguito con

l’impiego di un rene di maiale e l’altro effettuato utilizzando il rene di una

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capra, furono realizzati collegando il rene animale negli spazi anteriori

dell’ulna. Insuccesso.

1963 -> Hitchcock impianta in una donna indiana il rene destro di un babbuino

maschio. Lo xenoinnesto funzionò per 4 giorni, dopo di che si rese necessario

rimuovere l’organo xenogenico.

1963-1964 -> Starzi, chirurgo americano, realizzò sei xenoinnesti di rene di

babbuino su altrettanti pazienti affetti da uremia in fase terminale. dopo lo

xenoinnesto la sopravvivenza dei malati variò da 19 a 98 giorni. Utilizzò su tutti

i pazienti una terapia immunosoppressiva molto aggressiva dopo l’innesto e gli

immunosoppressori usati favorirono l’azione di agenti infettanti letali nella

maggioranza dei casi.

1984 -> Bailey impianta in una bambina (Baby Fae) di due settimane affetta da

una grave malattia cardiaca il cuore di un babbuino, la bambina è morta dopo

21 giorni.

In totale 55 xenotrapianti e tutti senza successo soprattutto a causa del rigetto.

Gli animali sono una fonte preziosa di organi da trapiantare. Tuttavia la

presenza di ab pre-esistenti nell’organismo ospite umano che si legano agli

epitopi presenti sulla superficie delle cellule dell’organo impiantato, causano

una risposta infiammatoria che porta al rigetto. L’epitopo -> la caratteristica

distintiva della superficie molecolare di un antigene che viene legata ad un ab

(determinante antigenico), la maggior parte degli antigeni può essere legata ad

ab distinti, ciascuno dei quali è specifico per un determinato epitopo.

I suini GTKO

Con lo sviluppo delle biotecnologie il ruolo degli xenotrapianti è sempre più

prominenti soprattutto per la produzione di questi suini che producono geni che

impediscono il rigetto. Questo suini sono knock-out per la α 1,3-

galactosiltransferasi, questi suini non presentano sulla membrana della cellula

alpha-gal (normalmente presente sulla membrana dei suini e non nell’uomo). Il

galattosio alfa 1,3 galattosio, è un disaccaride presente sulla membrana delle

cellule della maggior parte dei mammiferi. L’organismo umano non possiede

questo disaccaride, quindi ha un buon % di ab presenti rivolti a questo

antigene. Per questo motivi gli organi dei suini wt una volta trapiantati

provocano subito il rigetto. I suini GTKO sono suini transgenici coinvolti nella

produzione di questo disaccaride, le cellule di questo suino non producono più il

disaccaride.

Knock-out genico

Due fasi:

Ottenimento di cellule staminali knock-out

 Da queste ottenere animali knock-out

Le cellule staminali vengono prelevate da blastocisti di topo, durante la coltura

avviene la trasfezione con il costrutto -> disegnato in modo che abbia due

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regioni di omologia con le regioni da sostituire, c’è anche il marcatore di

selezione tra le due regioni, invece all’estremità di una delle due regioni c’è un

marcatore di selezione negativo (HSV-tk, è in grado di convertire substrati, è in

grado di convertire la molecola antivirale in analoghi tossici che sopprimono le

cellule). Ci possono essere anche eventi di ricombinazione non omologa. Le

cellule in cui è avvenuta la ricombinazione omologa avranno solo il marcatore

positivo. Una volta selezionate le cellule staminali correttamente trasfettate

vengono iniettate nella blastocisti di topo e posta nell’utero di una madre

surrogata. I cuccioli vengono definiti mosaico (presentano il gene knock-out

solo in alcune cellule dell’organismo). Poi questi topi vengono incrociati con

topi wt e se il knock-out è presente nelle cellule germinali si otterranno topi

eterozigoti.

Nei suini sono stati prelevati i fibroblasti dalle staminali, prelievo di 10

 gruppi di fibroblasti da 10 feti suini della stessa gestante al 33° giorno di

gestazione

Sono stati fatti due costrutti per il knock-out:

 Differivano per il tipo di cellula da cui sono state ricavate le regioni

o di omologia per l’esone 9 del gene alfa 1,3 GT

Contenevano la resistenza alla neomicina come marker di selezione

o all’interno delle regioni omologhe

Contenevano la sequenza di annealing per il primer Neo4425 che è

o stato utilizzato insieme al primer aGTE9A2 (la cui sequenza di

annealing è già presente sul gene endogeno) in una PCR

preliminare per controllare che le cellule fossero effettivamente

trasfettate dopo elettroporazione

Il primer aGTE9A2 usato anche in coppi con il primer aGTE8S (la cui

o sequenza di annealing è già presente sull’esone 8 del gene

endogeno) in una longa range PCR per confermare nuovamente

l’avvenuta trasfezione

Trasfezione dei costrutti nei fibroblasti per l’elettroporazione

 Selezione delle cellule tramite coltivazione su terreno con neomicina

 Selezione dei fibroblasti ko tramite PCR e Long Range PCR

 Trasferimento dei nuclei di fibroblasti knock-out selezionati in oociti

 denucleati di suino (tecnica di trasferimento nucleare)

Trasferimento degli oociti nell’utero di un suino femmina (madre

 surrogata), che porterà a termine la gravidanza: la prole non è a mosaico,

ma ogni loro cellula integrerà il costrutto K.O. dato che si ottiene a tutti

gli effetti uno zigote ricombinante

Analisi dei feti e dei suini neonati

Risultati PCR -> nei 3 controlli negativi non si osserva nessuna banda, invece

solo in 3 colonie si può identificare la banda da 2.4 kb e indica l’inserzione

omologa del costrutto. Nella quarta non si individua nessuna banda, ad

indentificare che non è avvenuta la ricombinazione omologa.

Risultati nella LR PCR -> confermano i dati della prima PCR. 18

Risultati SB -> su 7 feti analizzati solo due non presentano le bande, gli altri

presentano il corretto pattern. Il controllo è pulito. Dei 7 feti uno non arriva a

gravidanza, i 6 nati confermano i risultati ottenuti precedentemente.

Conclusioni

Tessuti: utilizzo relativamente semplice, risultati concreti e tecnologia

affermata.

Organi: riscontrati alcuni problemi (interferenza sistema coagulazione-

anticoagulazione), necessaria ulteriore ricerca.

ZEBRAFISH

È utile per visualizzare direttamente gli organi interni del pesce ed esaminare

diversi processi come ad esempio la crescita tumorale. Appartiene ai pesci

Osteichthyes, alla famiglia delle Cyprinidae, classe dei Actinopterygii, ordine

Cypriniformes, genere Brachidianio.

Zebrafish Danio rerio è un piccolo pesce di acqua dolce, appartiene alla

famiglia dei ciprinidi, fa parte della categoria dei pesci ossei. Habitat -> acque

stagnanti, risaie. Si trova in banchi di almeno 15 esemplari, specie molto attiva,

costantemente in movimento e si muovono a sincrono in superficie. Il corpo

dello zebrafish è affusolato, appiattito nella parte superiore e bocca rivolta

verso l’alto, possiede pinne ampie e due barbigli (organi tattili). Livrea

caratterizzata da colori sgargianti e da striature orizzontali chiare e scure poste

in modo alternato. La coda e la pinna anale sono striate di bianco e di blu, la

pinna dorsale è blu o verde orlata di bianco, le altre pinne sono olivastre. È

onnivoro si nutre di insetti, zooplancton, crostacei e vermi. Nel periodo

riproduttivo la femmina sviluppa una forma notevolmente appesantita dal

numero elevato di uova (300-400) prodotte. Le uova, dopo un vivace

corteggiamento del maschio, sono deposte sulla superficie fogliare ed

immediatamente fecondate dallo sperma del maschio emesso nell’acqua.

Zebrafish è uno degli organismi modello più studiato, genoma completamente

sequenziato e disponibile grazie ad Ensemble, ed è facile da allevare e con

costi ridotti. Ha uno sviluppo molto rapido, gli embrioni sono robusti, resistenti

e trasparenti. Specie utilizzata per studi di genetica. Serve per studiare anche

le tecniche di riproduzione dei pesci che vengono utilizzate anche a livello

industriale. È molto simile ai mammiferi usati come modello, viene usato come

modello animali per studiare lo sviluppo dei tumori direttamente in vivo. Lo

studio delle popolazioni cellulari in vivo è più complesso del vitro ed è per

questo che l’utilizzo di un modello animale adeguato ci consente di

semplificare il lavoro ed ottenere dati attendibili.

Cromatofori

I colori nei pesci sono prodotti da diversi tipi di cellule pigmentarie ->

cromatofori, cellule del derma modificate di forma irregolare stellata con

prolungamenti e contengono pigmenti. I colori dei pesci si osservano attraverso

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le scaglie solo quando queste sono trasparenti. Le cellule pigmentarie sono

quindi responsabili delle colorazioni spesso vivaci di alcuni pesci e in base a

determinate condizioni ambientali questi animali possono modificare il colore e

anche il disegno. Una delle caratteristiche che riguardano la colorazione è

l’abilità che possiede la maggior parte di questi animali di mimetizzarsi. I

cromatofori si distinguono in:

Melanofori -> colore nero, contenenti melanina, assenti nei pesci albini

 Xantofori -> colore giallo, contenenti xantina, producono pigmenti gialli

 nella forma di carotenoidi

Eritrofori -> colore rosso, contengono carotenoidi e pteridine

 Leucofori -> bianchi, contengono purine, normalmente guanine in forma

 di cristalli piccoli e mobili nel citoplasma

Iridofori -> iridescenti, contengono grossi cristalli di guanine

Leucofori (bianchi) e iridofori (iridescenti)

Quando i cristalli degli iridofori contenenti guanina si illuminano, generano

colori cangianti a causa della diffrazione della luce all’interno di essi.

L’orientamento dei cristalli determina la natura dei colori osservati che spesso

risultano vivaci-blu o vivaci-verdi. La guanina è responsabile dell’aspetto

argenteo dei fianchi di molti pesci. A differenza degli iridofori i leucofori

possiedono cristalli più organizzati che riducono la diffrazione della luce.

Ogni cellula pigmentaria può espandersi o contrarsi e può disperdere i propri

granuli di pigmento su tutta la sua massa, oppure può concentrarli in un unico

punto, facendo sì in questo modo, che predomini l’uno o l’altro.

La ficocianina è un pigmento blu ed è presente nelle alghe blu-verdi. La

capacità del pesce di immagazzinare questi pigmenti tramite la dieta avrà

molta influenza sul loro aspetto e sul loro colore. (astaxantina?)

Melanofori -> cellule dominanti, concentrando o disperdendo il loro pigmento

lasciano trasparire o meno il colore degli altri cromatofori che si trovano più in

profondità. L’aggregazione e dispersione dei pigmenti di colore nei cromatofori

dipende da un controllo neuronale ed ormonale:

In alcuni pesci, gli ormoni sono molto significativi nel determinare la

 pigmentazione

In altri, solo il controllo nervoso influenza l’intensità del colore

 La maggior parte dei pesci combina i due tipi di controllo

 L’ipofisi controlla i melanofori tramite secrezioni ormonali che portano

 all’incremento della produzione di pigmenti durante la vita del pesce,

cambiamenti più evidenti all’inizio della maturità

Alterazioni a livello di alcuni geni portano alla formazione di diversi tipi di

mutanti:

NACRE -> mancata espressione di un gene porta allo sviluppo di cellule

 melanizzate in zone errate dell’organismo. Gli omozigoti perdono i

melanofori durante lo sviluppo, ma presentano un aumento degli iridofori

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ROY -> completa mancanza di iridofori, occhi pigmentati uniformemente,

 melanociti sparsi e una pelle traslucida. Il gene responsabile è ancora

sconosciuto

NACRE/ROY (CASPER) -> completa mancanza di iridofori e melanofori

Zebrafish casper

Viene utilizzato per studiare la crescita dei tumori. Le cellule tumorali per

questo studio sono state prelevate da uno zebrafish adulto e sono state poi

trasferite in Casper. Sono state usate anche cellule tumorali umane rese

fluorescenti (GFP) e iniettate in embrioni di zebrafish di 1/4 giorni, stadio che

corrisponde ad un sistema immunitario non ancora ben sviluppato. Per

analizzare lo sviluppo del tumore è necessario utilizzare delle proteine che

emettono fluorescenza, come ad esempio la GFP. Proteine espresse nelle cellule

tumorale che poi sono state trasferite in Casper. Esperimenti compiuti con

questa metodica hanno dimostrato come già dopo 5 giorni a seguito del

trapianto è possibile visualizzare una massa tumorale con pigmentazioni

evidenti intorno alla zona dove sono state iniettate le cellule tumorali. Queste

risultano GFP positive anche a 10 giorni dal trapianto.

Vantaggi della metodica:

Valutazione dell’andamento del tumore nel tempo

 Il pesce è mantenuto vivo e non c’è bisogno di sacrificare gli animali per

 la ricerca

Strumenti semplici da utilizzare

 Elevata risoluzione delle immagini

 Anali dei tessuti più profondi

Svantaggi:

Mutante casper (due geni mutati) difficili da ottenere

 Aspetti legati alla mutazione del gene roy ancora sconosciuti

 Correlazione del gene roy con insorgere di complicazione a livello

 dell’organismo

Necessari ulteriori sviluppi nelle tecniche di diagnostica per immagini in

 tessuti profondi dello zebrafish

Zebrafish -> unico vertebrato modello in cui è possibile analizzare le metastasi

tumorali e le singole cellule dopo 3-5 giorni dal trapianto contro le 4-5

settimane necessarie negli altri modelli animali utilizzati.

Microscopio confocale a doppio fotone è possibile:

Raggiungere la risoluzione anche di una singola cellula

 Ottenere meno fluorescenza di fondo a maggior rapporto segnale-rumore

Non è necessario usare l’apertura confocale per eliminare la fluorescenza

indesiderata. Altri vantaggi:

Miglioramento della risoluzione sia nelle sezioni che nelle scansioni a tre

 dimensioni 21

Usando radiazioni infrarosse si hanno minori effetti di fototossicità e

 sbiancamento dei tessuti (fotodecadimento)

Riducendosi l'assorbimento della radiazione incidente, si ha la possibilità

 di eseguire scansioni a profondità maggiori

Studio del gene RhoC utilizzando zebrafish trasparenti, gene attivatore del

processo di metastasi nei tumori umani. Un punto cruciale di questo studio ha

riguardato di capire i meccanismi che stanno alla base della formazione e

migrazione delle metastasi e quindi sviluppare nuovi approcci terapeutici per

bloccare l’evolversi della malattia. Le cellule tumorali sono state iniettate nella

cavità peritoneale. Non solo si ha un aumento della massa tumorale c’è anche

una migrazione in altri tessuti. Nella figura B si vede l’invasione delle cellule

tumorali all’interno di altri tessuti. Lo sviluppo del tumore porta ad una grande

vascolarizzazione. Le cellule tumorali necessitano di un grande apporto di

nutrienti, per questo lo sviluppo del tumore porta alla formazione di una ricca

vascolarizzazione attorno alle cellule tumorali grazie all’azione di specifici

fattori di crescita coinvolti direttamente nel processo come ad esempio VEGF.

Correlazione tra le cellule tumorali e vasi sanguigni ed azione dei fattori VEGF

coinvolti nell’angiogenesi.

L’interazione delle cellule tumorali con la superficie dei vasi sanguigni:

L’azione di RhoC combinata con VEGF permette l’ingresso delle cellule

 tumorali all’interno del circolo sanguigno

Per l’interazione con i vasi sanguigni -> le cellule tumorali interagiscono

 e penetrano all’interno dei vasi, in modo tale da potersi distribuire in altri

tessuti dell’organismo

L’uso di inibitori specifici per i recettori con attività chinasica leganti i

 fattori VEGF blocca la loro azione angiogenica

Conclusioni

1. L’utilizzo della variante Casper negli studi in vivo compiuti su animali

adulti costituisce un modello molto importante per lo studio dei tumori.

Consente di evidenziare la crescita, la localizzazione, le metastasi, con un

grado di risoluzione non paragonabile a nessun altro modello animale

fino ad oggi utilizzato

2. Zebrafish è un ottimo modello, facile da allevare e poco costoso, il suo

successo nello studio dei tumori è dovuto anche ad altri fattori:

a. Il ciclo cellulare del tumore nel pesce è molto simile a quello

nell’uomo

b. Alcuni soppressori dei tumori, protooncogeni e fattori angiogenici,

elementi in comune con la specie umana

SLA

Patologia che compare nella maggior parte dei casi dopo i 50 anni e porta ad

una degenerazione dei moto neuroni. Malattia neurodegenerativa progressiva

che colpisce i motoneuroni: cellule nervose cerebrali e del midollo spinale che

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controllano i movimenti della muscolatura volontaria. Caratterizzata dalla

sofferenza sia del primo che del secondo motoneurone. Il primo costituito da

neuroni localizzati nella corteccia cerebrale che trasportano i segnali nervosi

dal cervello al midollo spinale. Il secondo è formato da cellule nervose che

trasportano il segnale dal midollo spinale ai muscoli.

I primi segni della malattia compaiono quando la perdita progressiva dei

motoneuroni supera la capacità di compenso dei motoneuroni superstiti fino ad

arrivare ad una progressiva paralisi, ma con risparmio delle funzioni cognitive,

sensoriali, sessuali e sfinteriali (vescicali ed intestinali).

Ci sono delle eccezioni del decorso della malattia (nell’arco di 2/3 anni porta

alla morte del collasso respiratorio) -> Stephen Hawking, unico caso di

sopravvivenza a questa patologia.

La malattia è sporadica, sulle cause non c’è ancora certezza. Il 5-10% dei casi

sono di SLA familiare. La diagnosi viene eseguita vedendo i sintomi e il loro

progresso. Per cercare di ridurre la malattia si usa il riluzolo, favorisce il rilascio

del glutammato. Altri trattamenti invece sono mirati a rendere meno gravi i

sintomi e a rendere migliori le condizioni di vita dei malati.

Nel 75% dei casi i sintomi iniziali sono brevi contrazioni muscolari, crampi

oppure una certa rigidità dei muscoli, debolezza dei muscoli che influisce sul

funzionamento di un arto e voce indistinta (esordio bulbare) -> se viene

colpito il primo motoneurone che si trova a livello della corteccia cerebrale. Nel

restante 25% si manifesta con difficoltà nella parola fino alla perdita della

capacità di comunicare verbalmente e difficoltà di deglutizione (esordio

spinale) -> se viene colpito il secondo motoneurone che si trova a livello del

tronco encefalico e del midollo spinale.

La diagnosi di SLA viene fatta in maniera sintomatica, si marcano i marcatori,

serve un anno per diagnosticarla. 3 proteine che nei malati di SLA hanno

concentrazione minore rispetto alla media nel liquor cerebro-spinale.

Cause di SLA

Mutazione del gene SOD1 -> superossido dismutasi rame-zinco, ha il

 ruolo di pulire da un determinato radicale tossico, se invece si ha una

mutazione si ha l’accumulo di questo radicale libero. Le mutazioni di

SOD1 provocano mutazioni nella stabilità di SOD1. Anche l’ambiente

gioca un ruolo, tra i fattori ambientali c’è il contatto con agenti inquinanti

oppure i trami frequenti alla testa (chiaramente nelle persone

geneticamente predisposte). Le SOD rappresentano una famiglia di

enzimi, esercitano un’azione antiossidante e protettiva in tutte le cellule,

per questo sono attualmente conservate dai batteri agli esseri umani. La

dismutazione reazione di ossidoriduzione, nella quale un’unica sostanza

in parte si ossida e in parte si riduce. Anione superossido -> ossigeno

molecolare e acqua ossigenata. Ci sono 3 SOD:

SOD1 -> omodimero che funziona solo nel citosol, cofattore Zn e Cu.

 Codifica per un enzima citosolico caratterizzato da un centro Cu-Zn. Sono

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state identificate più di 150 mutazioni, tra cui anche mutazioni

dominanti. La mutazione più diffusa è la G93A (glicina in posizione 93 con

alanina). GUARDA SU INTERNET L’attività della variante G93A di SOD1

possa essere alla base della patogenesi della SLA andando a causare uno

stress ossidativo e infiammatorio a livello cellulare. La mutazione di SOD1

potrebbe essere collegata a numerosi fenomeni -> sovraproduzione di

ROS, sovraproduzione di RNS. Questa variante può causare anche un

aumento del glutammato nel liquido cefalorachidiano.

SOD2 -> Omotetramero con cofattore Mn e funziona solo nei mitocondri

 SOD3 -> Omotetramerico Zn come cofattore ed è extracellulare

Modelli animali per la SLA

Offrono una buona opportunità per lo studio di questa patologia, sia dal punto

di vista clinico che patologico. I modelli animali sono stati utilizzati per lo studio

del meccanismo molecolare e insorgenza della patologia. I più utilizzati sono

quelli esprimenti la mutazione G93A, 4 tipi di animali maggiormente usati:

topo, ratto, zebrafish e suino. Viene mantenuta integra la rete di

interconnessione tra i vari organi, compartimenti e tessuti, perché lo studio si

in vivo.

effettua Sono state prodotte due linee di topi transgenici esprimenti

G93A e A4V (alanina va a sostituire la valina). Il topo viene spesso utilizzato

come animale modello (costa poco, facilmente manipolabile e ha una buona

espressione di geni eterologhi). Per la produzione del topo G93A è stata usata

la tecnica di microiniezione pronucleare, si basa sull’introduzione di sequenze

di DNA all’interno di un uovo fecondato. Per fare questa applicazione serve uno

zigote, la prima cosa da fare è ottenere uno zigote a partire da oociti maturi e

spermatozoi. Si usa la tecnica della fecondazione in vitro, iniezione

intraplasmatica dello sperma in uno oocita. Poi il costrutto deve integrarsi nel

genoma pronucleare, senza determinare morte cellulare oppure una

mutagenesi inserzionale. Limiti della tecnica: imprevedibilità dello stadio della

divisione cellulare al quale il costrutto verrà integrato. Se avviene in seguito si

avrà la formazione del mosaico, la cosa migliore è che si inserisca a livello

germinale. Topi transgenici selezionati tramite PCR e sono stati screenati

tramite il saggio EIA -> ha rilevato sequenza di SOD1 umano in topi G93A e

A4V.

Con l’utilizzo di questi topo è stato dimostrato che le mutazioni di SOD1 trovate

nella familiar SLA (di origine genetica) alterano l’attività dell’enzima. La G93A

ha avuto un piccolo effetto sull’attività SOD1, mentre a4V ah ridotto

drasticamente l’attività di SOD1. Hanno sviluppato una sindrome da

danneggiamento dei motoneuroni, a 3-4 mesi i topi iniziarono a mostrare segni

di debolezza negli arti inferiori, con perdita di peso, pelo e tremori, segni di

affaticamento sempre più progressivi. Dopo altre 2 settimane i topi rimasero

paralizzati e poi dopo 5 mesi (150 giorni) furono soppressi, per evitare

sofferenze. L’insorgenza della patologia è avvenuta come nell’uomo, dipende

dall’età dell’individuo e dalle copie del gene (ne servono 25 copie del gene da

iniettare nel pronucleo maschile). 24

Grafici: iniezione nel pronucleo maschile, è stata scelta la prima linea perché

aveva numero dei trascritti più alto rispetto agli altri topi nella tabella. Questi

topi poi sono stati osservati durante l svolgimento della vita del topo, i primi

segni clinici della patologia si sono sviluppati dopo i primi 2/3 mesi di vita. Il

numero dei sopravvissuti è ridotto man mano che si va avanti con l’età. Stride

= lunghezza del passo, si riduce progressivamente fino a che non si ha la totale

paralisi. Questo conferma che la mutazione porta al manifestarsi della

patologia e i sintomi sono molto simili a quelli che si verificano nell’uomo.

Sono stati fatti esami isto-patologici, hanno analizzato motoneuroni, con

elevata perdita di questi, perdita di formazioni di aggregati, di assoni mielinici,

di neurofilamenti. Cellule della glia (DEFINIZIONE). Microglia costituita da

macrofagi in grado di fare la fagocitosi. Si è vista una notevole riduzione dello

strato mielinico intorno agli assoni dei motoneuroni dell’assone spinale.

Notevole diminuzione nel numero di innervazioni.

La produzione dei topi con questa mutazione ha permesso id individuare che la

causa che porta alla patologia è un’acquisizione di una funzione tossica

dell’enzima. I topi transgenici hanno permesso dei passai avanti nella

comprensione della SLA. I topi hanno anche degli svantaggi: alcuni tipi di

manipolazione sono difficili nel topo a causa delle loro piccole dimensioni, ad

esempio è difficile prelevare il liquido cerebro-spinale.

Sono stati sviluppati ratti transgenici per delle variazioni nella mutazione di

SOD1. Il primo ratto è stato sviluppato da Nagai et al., hanno sviluppato un

modello murino di SLA, ratto transgenico. Con principali caratteristiche

fenotipiche della SLA umana, ma ha più vantaggi. Consentono il prelievo del

liquido cerebrospinale e la pronta valutazione, permettono anche l’impianto di

pompe di infusione per farmaci intratecali -> si mettono i farmaci direttamente

nel liquido cerebrospinale. Anche in questo caso è stata usata la tecnica della

microiniezione pronucleare, delle cassette geniche contenenti il SOD1 mutato.

Gli embrioni sono stati trasferiti nell’utero del ratto in condizioni di

pseudogravidanza. Sono state scelte due mutazioni: G93A e H46R (sostituzione

di istidine con arginina in posizione 46 che coinvolge un residuo del sito

cataliatoc9. Queste mutazioni hanno influenzato SOD1. H46R producono SOD1

con insufficiente attività dismutasica, fa sì che il Cu non venga legato al sito

attivo. Primo sintomo: ridotta capacità di movimento, poi perdita di peso,

paralisi agli arti.

Istogrammi bianchi: WT, gli altri sono le linee transgeniche. Percentuale dei

sopravvissuti. Il primo segno della patologia delle linee sovraesprimenti di

SOD1 è la riduzione della capacità di muoversi, di camminare, atrofia, perdita

di peso, poi paralisi delle zampe. Sono risultati alterati i livelli di glutammina.

Zebrafish: eccellente modello organismo per patologie neurodegenerative e

per lo studio di tumori. La microiniezione è il metodo migliore per inserire

DNA/RNA in zebrafish, è stato inserito nell’embrione ed è stato incubato per lo

sviluppo. L’overespressione di G93A ha indotto delle anomalie negli assoni

motori. Hanno mostrato alterate le capacità motorie. In questo caso non si è

25

vista la lunghezza del passo, si valutano i parametri di nuoto, sono state viste

le traiettorie di movimento. In ogni acquario è stato messo un pesce di età

diversa. Con il progredire dell’età il tempo di percorrenza della vasca aumenta

notevolmente perché devono riposare. Si presenta quindi il tempo di nuoto e il

tempo di riposo. I tempi di nuoto vengono alternati con tempi sempre più

lunghi di riposo.

Suini: modello animale molto studiato. Modello suino G93A, metodo diverso:

trasferimento nucleare (stesso metodo di clonazione di Dolly). Somatic cell

nuclear transfer: trasferimento di nucleo cellula somatica dopo aver inattivato

nucleo oocita.

1. Coltivazione dei fibroblasti da biopsia cutanea dell’orecchio

2. Trasfezione con hSOD1-G93A dei fibroblasti

3. Selezione dei fibroblasti come donatori del nucleo

4. Trasferimento del nucleo dei fibroblasti in cellule uovo senza nucleo

5. Sviluppo dell’embrione

6. Trasferimento in utero di una madre adottiva

Aumento della produttività di animali domestici: mutazioni naturali

Obiettivo di tutti gli allevatori -> ottenere la stessa quantità di prodotto con

minor spesa. L’aumento della massa muscolare e la diminuzione della porzione

grassa nel bestiame perseguita a lungo con incroci selettivi. Due razze di

bovini: la Belga Blu e la Piemontese. Gli allevatori di bestiame europei

osservarono che alcuni dei loro capi erano più muscolosi di altri. Tale

condizione fu considerata ereditaria e nel 1929 Wiredt ipotizzò che la sindrome

era dovuta al difetto di un singolo gene. Incroci selettivi di questi capi per

aumentare la stirpe con questa caratteristica, sviluppate due razze di bestiame

che mostrano tipicamente un incremento della massa muscolare rispetto alle

altre razze. Nel 1997 un gruppo di scienziati guidati da McPherron e Lee

scoprirono questa anomalia, dovuta ad una mutazione naturale del gene

miostatina. Gene che codifica una proteina coinvolta nell’inibizione della

crescita muscolare -> porta ad una muscolatura raddoppiata, aumenta

quantità e qualità della carne di manzo.

Miostatina: proteina inibitrice della crescita muscolare, membro della

superfamiglia dei fattori di crescita trasformanti β (TGF-β), questi fattori sono in

forma inattiva, l’attivazione non è completamente conosciuta ma sembra che

coinvolga una serie di attivazioni proteolitiche. La miostatina è il sottotipo GDF-

8, coinvolto nella crescita e differenziazione. Differenza tra fattori di crescita ed

ormoni: ormoni sono molecole di segnalazione ad ampio raggio (sono molecole

endocrine), sono messe in circolazione attraverso il sangue, sono molto potenti

e sono presenti in bassissime concentrazioni nel sangue; i fattori invece sono

meno potenti e non vengono secreti nel sangue, sono i determinanti della

crescita, della mobilità e responsabili di come un gruppo di cellule agisce su un

determinato tessuto. 26

Si scoprì lavorando in topo:

1. Analisi dell’mRNA di diverse specie animali sia con il fenotipo “doppio

muscolo” sia non per identificare il gene mutato

2. Produzione di topi knock-out per il gene della miostatina per conoscere la

funzione biologica

Dalle analisi si è capito che una mutazione naturale del gene della miostatina

era alla base di questo fenomeno di muscolatura raddoppiata. Mutazione:

delezione di 11 bp nella Belga Blu e una mutazione di senso errato nella

Piemontese. Mutazioni di senso errato: quando un codone viene sostituito da

uno che codifica per un aa diverso. Le mutazioni sono a carico della parte C-

terminale, parte che in seguito a taglio proteolitico svolge in forma dimerica

come regolatore negativo della crescita regolare, il taglio proteolitico è la prima

forma di controllo della miostatina.

Dal 1998 al 2000 furono scoperte altre 5 mutazioni che portano alla perdita

della funzione della miostatina. NT 419 delezione di 7 bp e la loro sostituzione

con altri nucleotidi; Q204X mutazione puntiforme di tipo transizione

(sostituzione di una pirimidina con un’altra pirimidina, in questo caso C con T);

E226X, scambio di pirimidina con una purina (G con T), mt821 delezione di 11

bp nella posizione 821 dopo il codone di inizio, E291X trasversione (G con T),

c313y transizione, mutazione a sostituzione di G con A, purina con purina.

Animali doppia muscolatura: aumento massa muscolare del 20% a causa

dell’iperplasia del muscolo scheletro e, in minore misura, dell’ipertrofia. Questo

avviene durante lo sviluppo intrauterino. C’è una quantità significativamente

ridotta del tessuto connettivo, strutturalmente diverso dal collagene normale

(percentuale minore di legami incrociati stabili e non riducibili). Queste

(iperplasia e ipertrofia) non sono distribuite uniformemente sul corpo, ma si

presentano intorno al collo in minima parte e aumentano gradualmente verso

la parte posteriore dove raggiungono il massimo.

Caratteristiche dei bovini deficienti in miostatina

Scheletro:

La massa ossea, 10% inferiore a quella dei bovini normali

 Ossa lunghe più corte, più sottili e di minore densità

 La ridotta massa ossea porta ad un rapporto muscolo/massa ossea

 significativamente più alto nel bestiame con muscolatura doppia

Grassi:

Tessuto adiposo poco sviluppato: riduzione del volume delle cellule

 adipose, piuttosto che una riduzione del loro numero

Non solo il contenuto totale di grassi ridotto, ma la sua composizione è

 diversa, con una percentuale molto più elevata di grassi polinsaturi (11%

contro il 5% nei bovini normali)

Fisiologia: 27

Durante l’esercizio fisico, segni di stanchezza prima dei bovini normali:

 ridotta capacità di attività metabolica aerobica

Ridotta tolleranza allo stress termico, probabilmente dovuto alla

 maggiore produzione di calore associato alla maggiore massa muscolare

Riproduzione, la sindrome di doppia muscolatura è associato a un numero di

problemi riproduttivi:

Ritardi nella pubertà

 Ridotta fertilità a causa di una maggiore incidenza di mortalità in

 embrioni

Aumentata incidenza di distocia (parto difficile con pericolo di vite per il

 vitello)

Ridotta produzione di latte

 Aumento della mortalità dei vitelli

la maggior parte dei vitelli con doppia muscolatura:

Peso alla nascita più elevato e maggiore tasso di crescita pre-

 svezzamento rispetto ai coetanei normali

Post-svezzamento il tasso di crescita scende rispetto ai coetanei normale

 Maggiore aumento di peso muscolare per unità (kg) di mangime

 consumato migliore fattore di conversione rispetto ai bovini normali

Meccanismo di azione molecolare: la miostatina sembra essere mirata contro il

ciclo cellulare dei mioblasti, dovrebbero interrompere a livello del sito di

controllo della fase G0 o G1 (quando la cellula esegue i controlli per passare

alla fase S). effetto molecolare: aumenta fattori in grado di inibire le CDK come

P53 o P21, mantiene i mioblasti in quiescenze impendendo quindi la

differenziazione. La miostatina agisce in modalità autocrina e anche paracrina,

viene prodotta dalle cellule satellite. Esercita due tipi di azione: dipende se si

tratta di tessuti sani o danneggiati. Nei sani impedisce la formazione di fibre

muscolari aggiuntive, in quelli danneggiati vengono attivate le cellule satellite

che provvedono alla riparazione del danno (nel caso di danno tissutale i

mioblasti diventano miociti grazie alla proteina Smart3). Miostatina è prodotta

come precursore, presente il peptide segnale nell’N-terminale, C-terminale

rappresenta il ligando. Il processo proteolitico (cleavage) tra il propeptide e il C-

terminale rilascia la miostatina matura attiva in forma dimerica. Il propeptide e

la miostatina matura rimangono legati insieme in modo non covalente

formando dimeri inattivi. Circa il 70% della miostatina si trova nel sangue

legata al suo propeptide-complesso latente. Il primo livello di regolazione -> il

taglio proteolitico del dimero. La prima proteina inibitore della miostatina è

quindi il propeptide N.

Gli altri meccanismi di regolazione agiscono sul peptide o sulla sua secrezione,

sono note altre proteine che agiscono sulla forma attiva della miostatina, tipo la

follistatina, una glicoproteina autocrina, che impedisce il legame della

miostatina con il suo recettore inibendola. 28

Il propeptide N si lega alla miostatina matura e si forma il dimero, complesso

latente. Quando questo complesso arriva al sito di attivazione della miostatina

avviene la proteolisi che stacca il propeptide N e si attiva la miostatina -> inizia

la sua azione fisiologica legandosi al suo recettore ACVR2B. poi FLGR si lega

alla miostatina inibendola.

GASP-1 proteina molto espressa a livello dei muscoli scheletrici che agisce

come inibire della miostatina. È una proteina di 571 aa che contiene una

sequenza segnale di secrezione di 29 aa e diversi domini, tra cui ci sono anche

quelli per i polistatinici.

I topo privi di GASP-1 e GASP-2 portavano ad una riduzione della massa

muscolare, porta ad una iperattivazione della miostatina.

Applicazioni

Bovini, ovini, cani e pesci. Viene usata anche come target di alcuni farmaci e

alcuni ab.

Bovini: razze con mutazioni sono state ampiamente studiate, per il vantaggio

economico di avere più carne per il consumo. Sono stati svolti molti studi per

avere altri animali con le caratteristiche desiderate. La Piemontese è la razza

dei bovini da carne più rappresentata in Italia, diffusa in quasi tutti il Piemonte,

molto docile.

Ovini: uno studio ha evidenziato come le mutazioni non sono solo una

caratteristica dei bovini ma anche negli ovini. Nella razza Texel presenta

un’elevata produzione di carne, sostituzione G con A, sostituzione che crea un

sito riconosciuta da miRNA 1 e 206 al

3’UTR (regione non tradotta) del

gene che codifica per la miostatina in

questa razza. Questa sostituzione

porta al silenziamento del gene e

produce l’ipertrofia.

RNAi: processo altamente specifico

attraverso il quale un RNA a doppio

filamento interferisce con l’espressione genica, sia inducendo la degradazione

dell’RNA complementare e bloccando la produzione dell’RNA. Le cellule hanno

questi meccanismi per bloccare eventuali infezioni da virus a doppio RNA.

Quando queste molecole di dsRNA entrano nella cellula vengono riconosciute

da RNAsi III, un enzima dimerico -> dicer. Dicer frammenta le doppie eliche di

RNA in porzioni più piccole di circa 20 bp, siRNA. I siRNA inducono il

silenziamento indotto, molecole riconosciute dal complesso proteico RISC che

le processa, RISC dispone di un’attività elicasica ATP-dipendente che separa il

dsRNA in modo che si possa associare solo con il filamento antisenso. Evento

che può essere potenziata da RNA polimerasi-RNA dipendete che permette di

creare altri siRNA ed attivare di nuovo RISC. Non viene usato dalla cellula solo

per rispondere ai patogeni ma anche per la regolazione dell’espressione

genica. 29

miRNA: sintetizzati dall’organismo stesso a partire dai geni MIR. Regolazione

molto importante.

RNAi sta avendo un aumento nell’applicazione genetica, si parla di knock-down

(silenziamento dell’espressione). Le cassette geniche sono costruite in modo da

simulare un gene MIR che silenzi il bersaglio desiderato e a valle del promotore

ci sono le sequenze senso ed antisenso che sono complementari al gene da

silenziare, sequenze separate da uno spaziatore. Con un costrutto di questo

tipo, una volta avvenuta l’integrazione nel genoma vengono prodotto degli RNA

palindromi, possono assumere la forma a forcina, essere processati dal dicer e

indurre la cascata di silenziamento sul gene bersaglio. Vantaggi rispetto al

knock out: non è richiesta ricombinazione omologa e non è necessario

raggiungere l’omozigosi.

Ovini: il meccanismo di silenziamento della miostatina è diverso da quello dei

bovini. Per identificare i geni è stata fatta una scansione dell’intero genoma, è

stata fatta poi una mappatura che mette in relazione i dati fenotipici e quelli

genotipici (marker) -> QTL. I loci responsabili della tenerezza di questa carne si

trova sul chr 2, è stata dimostrata una transizione (purina con purina, G con A)

che ha creato un sito riconosciuto da miRNA (1 e 206). Questa mutazione

provoca inibizione trasduzionale della miostatina e porta all’ipertrofia

muscolare.

Cani: studi sull’omozigosità dei Levrieri consiste in una delezione di 2 bp e

porta ad una proteina tronca e questo produce un fenotipo caratteristico con

ridotte abilità di corsa, con aumento della massa muscolare -> i cani diventano

segugi. Studi su altre razze non hanno portato ad evidenze nelle mutazioni.

Pesci: test per verificare modificazione nella miostatina e per avere possibili

applicazioni dei farmaci. Sono stati prodotti pesci con massa muscolare

aumentata e hanno usato il metodo della sovraespressione dei geni per la

polistatina, applicazioni di grandi prospettive nell’allevamento.

Zebrafish: animale modello e gli studi su questo animale hanno permesso di

ottenere dati interessanti. Studi fatti post-natale con la GFP, hanno permesso di

localizzare l’espressione nel cervello e nelle fibre muscolari. Facendo test con

miRNA hanno prodotto fenotipi giganti.

Applicazioni terapeutiche: sono stati sviluppati diversi ab che hanno come

target la miostatina per trattare diverse malattie -> ad esempio per la distrofia

muscolare di Duchenne. Atrofia muscolare: diminuzione massa muscolare con

parziale o completa perdita di funzione -> si ha la debolezza muscolare. Altra

terapia: somministrazione degli analoghi solubili del recettore ACVR2B. questo

farmaco compete con il recettore endogeno prevenendo il legame con la

miostatina.

Ab: JA16, usato sia su topi adulti che individui giovani. È stato utilizzato in topi

in cui è stata indotta la DMD, osservando un aumento di massa muscolare e

una minor degenerazione (possibili futuri approcci nelle terapie differenti da

30

quelle geniche). È anche usato per il controllo della miostatina in pazienti con

AIDS, in cui si è riscontrato un aumento della concentrazione della proteina.

Ab: MYO-029, progettato per legare ed inibire l’attività della miostatina

portando ad un aumento della massa muscolare. Anticorpo umano

ricombinante per legare ed inibire l’attività della miostatina. Testato sui tipo in

cui è stata indotta la DMD: buoni risultati e nessuna controindicazione.

APPARATO GENITALE DEGLI ANIMALI DOMESTICI

Gonadi -> producono gameti, spermatozoi nel maschio e ovuli nella

 femmina

Condotti di transito

 Organi copulatori + utero nella femmina (destinato a nutrire e

 contenere il feto nella femmina)

Apparato maschile

Testicoli

 Epididimo (uno per ciascun testicolo, serbatoio degli spermatozoi) ->

 testa e coda dell’epididimo

Dotti deferenti (fanno seguito a ciascun epididimo e portano gli

 spermatozoi nell’uretra)

Uretra

 Pene

 Ghiandole annesse: vescicole seminali, prostata e ghiandole bulbo-

 uretrali

Un margine del testicolo è in rapporto con l’epididimo, mentre l’altro è libero. I

testicoli sono organi pari, sono dentro allo scroto. Struttura sacciforme derivata

dalla cute e dalle fasce della parete addominale. L’asse maggiore del testicolo

potrebbe essere verticale (toro e ariete), orizzontale (stallone e verro).

Qualsiasi posizione anatomica viene definita da 3 piani:

Sagitale, decorre in posizione anteroposteriore, dividendo il corpo in due

 parti simmetriche dette antimeri

Dorsale, perpendicolare al piano sagitale che si estende da un lato

 all’altro

Trasversale, craniale (verso la testa) e caudale (verso la coda)

 Mediale verso o relativamente vicino al piano mediale/sagitale

 Prossimale verso il corpo centrale

 Distale significa perifericamente

Nel toro il testicolo è ovoidale e il suo asse maggiore è verticale, l’estremità

capitata (vicino alla testa dell’epididimo) è in posizione dorsale, la parte del

testicolo vicino all’epididimo è caudo-mediale. Nello stallone è il testicolo è

ovoidale, l’asse maggiore è verticale, l’estremità capitata è dorsale, il margine

epididimale è caudo-mediale. 31

Nello stallone il testicolo è ovoidale, l’asse maggiore è verticale, l’estremità

capitata è craniale, il margine epididimale è dorsale.

Nel verro il testicolo è ellittico, l’asse maggiore è obliquo, l’estremità caudata è

vicino all’apertura anale, l’estremità capitata è in posizione ventro-cranio-

mediale, il margine epididimale è cranio-dorsale.

Testicolo

Il testicolo ha un colore bianco-bluastro lucente ed è rivestito da una lamina

trasparente chiamato foglietto viscerale della tonaca vaginale. Asportando

questo foglietto si presenta la tonaca albuginea, lamina fibrosa ispessita,

pochissimo elastica e tiene compresso il parenchima. La fascia spermatica

esterna è una prosecuzione del muscolo obliquo dell’addome che forma una

sottile copertura sui funicoli spermatici e testicoli. Il termine cremastere vuol

dire ciò che tiene sollevato.

La fascia di Dartos è uno strato di fibra muscolare lisca libera dal grasso che è

situata esteriormente alla fascia cremasterica ma sotto la pelle, lo scroto ha

un’apparenza rugosa che è dovuta a questo strato. Questa fascia ha una

funzione importante nel regolare la temperatura dei testicoli che promuove o

inibisce la spermatogenesi. Questa regolazione è resa possibile dalla

contrazione o estensione di questa fascia -> causa maggiore o minore

raggrinzimento dello scroto. La contrazione riduce l’area di superficie

disponibile per dissipare il calore, riscaldando i testicoli. L’estensione, aumenta

l’area superficiale, promuovendo il rilascio di calore e raffreddando i testicoli. Il

muscolo di Dartos lavora insieme al muscolo cremastere per elevare i testicoli.

Sono alloggiati nello scroto, estroflessione della cute e del sottocute

dell’addome. Dartos (sottocute) è composto da tessuto muscolare liscio e

connettivo elastico. Il setto scrotale si fissa alla sinfisi ischio-pubica. Durante lo

sviluppo prenatale i testicoli si sviluppano nella cavità addominali, poi la

gonade migra nella posizione caudale della cavità addominale e poi si

completa la migrazione all’interno dello scroto. Si parla di criptorchidismo

quando i testicoli non scendono nello scroto. Ernia scrotale particolarmente

frequente nella specie suina.

Termoregolazione del testicolo

I testicoli, nei mammiferi, devono essere mantenuti a una temperatura inferiore

a quella corporea. Recettori termici localizzati sulla cute dello scroto, risposte

che tendono ad abbassare la temperatura dell’intero organismo (sudorazione e

aumento della frequenza respiratoria). Sulla cute dello scroto sono presenti

ghiandole sudoripare adrenergiche + la componente muscolare (dartos) ->

modificazione dello spessore e superficie esterna. Nello stallone quando la

temperatura della muscolatura lisca si contrae, testicoli sollevati, parete

scrotale si raggrinza o si ispessisce; quando la temperatura aumenta la

muscolatura si rilascia, i testicoli scendono all’interno dello scroto pendulo. 32

Una particolare disposizione dell’arteria testicolare con andamento circonvoluto

a forma di cono la cui base localizzata in corrispondenza del polo craniale o

dorsale del testicolo. Meccanismo di contro corrente: il sangue arterioso che

entra nel testicolo viene raffreddato da quello venoso refluo.

Nell’ariete, la temperatura ematica a livello dell’arteria testicolare si abbassa di

4°C nel corso del passaggio del sangue dell’anello inguinale esterno alla

superficie del testicolo. Nel verro lo scroto è meno pendulo e il processo di

sudorazione è meno efficiente per cui minor differenza tra temperatura scrotale

e rettale (3.2°C).

Struttura interna del testicolo

Dalla faccia interna dell’albuginea partono numerosi setti che dividono il

parenchima testicolare in logge (lobuli) piramidali che confluiscono verso il

mediastino o corpo di Higmoro. Tubuli seminiferi contorti (sede di formazione

degli spermatozoi) immersi in uno stroma connettivale di sostengo. Cellule

interstiziali o di Leyidig con funzione endocrina.

Tubuli seminiferi: sono composti da una membrana basale che li separa dal

liquido interstiziale sul quale poggia un epitelio caratterizzato da due tipi di

cellule.

1. Le cellule di sostegno o del Sertoli (funzione nutritiva)

2. Cellule germinali (distribuite in più strati):

a. Spermatogoni di tipo A e B (indifferenziati)

b. Spermatogoni di tipo A (cellule staminali si dividono in 1/2 di tipo A

e 1/2 di tipo B)

c. Spermatogoni di tipo B:

i. Mitosi

ii. Spermatociti di 1° ordine (2 per ogni spermatogonio) ->

meiosi

iii. Spermatociti di 2° ordine (2 per ogni spermatociti di 1°

ordine) -> meiosi

iv. Spermatidi (2 per ogni spermatocita di 2° ordine) -> senza

ulteriori divisioni si trasformano in spermatozoi (si ritrovano

verso la parte più interna dei tubuli seminiferi)

Spermatogenesi -> processo attraverso il quale da spermatogoni si passa a

spermatozoi.

Spermatozoo:

Testa: comprende nucleo e acrosoma (contiene enzimi litici, acrosina

 PH20 enzima di penetrazione della corona radiata dell’oocita quando

questa è presente), può essere rivestito da una membrana acrosomiale

esterna. Quando l’acrosoma si forma dopo la seconda meiosi, gli istoni

delle fibre cromatiniche vengono rimpiazzati da un altro istone, le

protamine, ricche di arginina al contrario gli altri istoni sono ricchi di

lisina, si ottiene la condensazione della cromatina con notevole riduzione

delle dimensioni nucleare dlelo spermatozoo -> ottimo per facilitare il

33

movimento dello spermatozoo. Altro vantaggio: rendono il DNA inerte dal

punto di vista metabolico e trascrizionale. Questo DNA non può fungere

da stampo né per la sintesi di nuovo DNA e né per la trascrizione,

processo di disattivazione dello spermatozoo. Quando però la testa dello

spermatozoo penetra nell’oocita il nucleo perde la membrana e quindi il

contenuto dello spermatozoo si mescola con il citoplasma del gamete

femminile. Il DNA viene reso di nuovo attivo e quindi lo spermatozoo

torna a funzionare.

Collo, molto breve e stretto ed unisce la testa alla coda

 Coda, detta anche flagello, si compone di tre tratto: intermedio,

 principale e terminale. Il costituente principale della coda è l’assonema

che si estende fino al segmento terminale. L’assonema è costituto da

una membrana che racchiude 9 coppie di microtuboli rettilinei + 2

microtubuli non accoppiati al centro, si trova in tutte le forme di ciglia e

flagelli. La coda contribuisce ai movimenti dello spermatozoo e l’energia

necessaria viene fornita dai mitocondri che si trovano nel tratto

intermedio.

Barriera ematotesticolare

Le cellule di sostegno o nutritizie del Sertoli: alte e dal contorno irregolare,

lunghi prolungamenti che raggiungono quelli di altre cellule dello stesso tipo,

nucleo ovoidale, voluminoso nucleolo. Secretano metaboliti energetici utilizzati

dalle cellule germinali, riducono il testosterone prodotto dalle cellule

interstiziali a diidrotestosterone e a estrogeni, producono inibina che controlla

la liberazione di FSH.

Tra le facce laterali delle cellule del Sertoli ci sono delle giunzioni occludenti,

che costituiscono la barriera ematotesticolare (BET). BET ha il compito di

mantenere costante la composizione del liquido del tubulo seminifero secreto

dalle stesse cellule del Sertoli. Le giunzioni occludenti bloccano il passaggio dei

fluidi fra cellule perché formano una sorta di cintura attorno al perimetro

cellulare.

Funzione di bloccare i passaggi dei fluidi nelle cellule, ha il compito di

mantenere costante la composizione del liquido del tubulo seminifero che viene

secreto dalle stesse cellule del Sertoli.

I tubuli seminiferi contorti, nella parte terminale presentano un decorso

rettilineo e vengono perciò chiamati tubuli retti. I tubuli retti anastomizzano tra

di loro a formare la rete testis, presenta un epitelio cubico, talvolta anche

bistratificato. Tra i tubuli seminiferi si trova anche il tessuto connettivo e anche

le cellule di Leydig -> formano la ghiandola interstiziale, producono il

testosterone. Dalla rete testis partono 10-20 canalicoli (cono vascolosi) che

formano la testa dell’epididimo.

Epididimo 34

Lungo condotto, posizionato sul margine epididimale del testicolo, tra rete

testis e dotto deferente. Tra epididimo e margine epididimale si viene a formare

una lunga insenatura detta seno dell’epididimo.

Si compone di

Testa -> voluminosa, copre buona parte dell’estremità capitata del

 testicolo. Deriva dalla convergenza dei piccoli condotti efferenti, 12-19,

prendono origine dalla rete testis. Dentro il testicolo presentano un

decorso rettilineo, mentre quando hanno attraversato l’albuginea

assumono dapprima un decorso ondulato e poi spiralato tanto da

assomigliare ad un cono con l’apice rivolto il mediastino. Estremità

dorsale

Parte intermedia o corpo -> costeggia il margine epididimale del

 testicolo. Estremità caudale

Coda -> più voluminosa della testa e non è in continuità anatomica con il

 testicolo. In corrispondenza dell’estremità ventrale

Il condottino efferente che ha formato il cono si incurva e, nel procedere lungo

la testa dell’epididimo, riceve uno dopo l’altro i condottini dei successivi coni. Si

viene a formare un unico condotto collettore: il canale dell’epididimo. Questo

presenta un decorso lungo e complicato, avvolgendosi ripetutamente su se

stesso. La parte iniziale del canale dell’epididimo, compreso lo sbocco dei

condottini efferenti, corrisponde alla testa dell’epididimo, mentre la restante

parte coinvolta forma il corpo e la coda dell’epididimo. Il condotto oppure vaso

deferente rappresenta la continuazione del canale dell’epididimo che lo

connette all’uretra. A livello della testa epididimale si accompagna a nervi e

fasi testicolare. La parte preterminale del dotto deferente si presenta più

ispessito nel toro e forma l’ampolla del tratto deferente. L’ampolla però manca

nel verro, c’è nello stallone, caratterizzata da una mucosa di tipo ghiandolare.

Ghiandole annesse

Ghiandole il cui secreto contribuisce alla formazione dello sperma, sono

posizionato verso il tratto dell’uretra e per questo vengono definite anche

ghiandole annesse all’uretra, sono 3:

Vescicolari, sono pari

 Prostata

 Bulbo-uretrali

Nei ruminanti le vescicole seminali sono voluminose e di forma ovoidale e

hanno aspetto lobulato. Ciascuna ghiandola è situata dorsalmente al collo della

vescicola urinaria ed è addossata al corpo della prostata. Nello stallone è molto

voluminosa e presenta una grande cavità. Sia nei ruminanti che nello stallone il

dotto escretore delle ghiandole vescicolari terminano in maniera distinta in

vicina dello sbocco del dotto deferente in una depressione della mucosa del

colliculus seminalis. Nel verro la ghiandola vescicolare è molto voluminosa con

una lunghezza che può raggiungere i 15 cm. Sulla superficie è ben evidente la

struttura lobulata. Ha una forma piramidale triangolare e struttura lobulata. Si

35

addossa alla faccia dorsale della vescica urinaria (bladder) che, in questa

specie, è completamente addominale. Il secreto rappresenta il 20-25% del

liquido spermatico ed è ricco di fruttosio (la fonte energetica per gli

spermatozoi).

Prostata: si compone di un corpo e/o di una parte disseminata. Nel toro e nel

verro, il corpo è molto piccolo, la parte disseminata è molto sviluppata. La

prostata produce un liquido vischioso ed è molto ricco di sostanze nutritive,

funzione principale è favorire la motilità degli spermatozoi. Nello stallone il

corpo della prostata è formato da due lobi, destro e sinistro, che sono molto

sviluppati e riuniti da un istmo. Nel verro manca la parte disseminata, la

prostata è una ghiandola tubulo-alveolare composta e i dotti sboccano ai lati

del colliculus seminalis.

Le ghiandole bulbo-uretrali o di Cowper: sono ghiandole pari, sono situate

dorsalmente al tratto più caudale dell’uretra pelvica. Si trovano sotto la

prostata e producono un liquido denso e viscoso emesso prima

dell’eiaculazione (funzione lubrificante, pH alcalino, ridurre acidità dell’uretra

causata dalle urine). Nel verro la lunghezza è di 15-20 cm e hanno una forma

cilindrica, si addossano l’una all’altra e con la loro estremità craniale

raggiungono la ghiandola vescicolare. Nello stallone hanno forma ovoidale,

ciascuna ghiandola possiede 6-8 dotti escretori distinti, che sboccano

nell’uretra. Nei ruminanti come il toro hanno forma ellittica, ciascuna ghiandola

ha un unico dotto escretore, che sbocca nell’uretra.

Liquido seminale

Rappresenta il prodotto dell’attività dei testicoli e delle ghiandole annesse.

Comprende:

Parte liquida (plasma seminale) secreta dalle vie genitali e ghiandole

 annesse

Parte corpuscolata: spermatozoi e un numero scarso di cellule immature

 provenienti dalla spermiogenesi, linfociti e cellule epiteliali di

sfaldamento.

Plasma seminale essenziale per la vita degli spermatozoi e per la

sopravvivenza dopo l'eiaculazione attraverso l'uretra. Spermatozoi sintetizzati

all'interno dei tubuli seminiferi dei testicoli contribuiscono del 2-5% al volume

complessivo dello sperma. Il plasma prodotto dalle vescicole seminali

(contributo del 60-70% al volume spermatico), dalla prostata (20/30%) e dalle

ghiandole bulbo-uretrali (< 1% del volume spermatico). Composizione del

plasma seminale: fruttosio, sorbitolo, glicerolo, fosfatidilcolina, acido lattico,

acidi grassi, aminoacidi, prostaglandine, ormoni, acido citrico, vitamina C, una

grande varietà di enzimi, zinco, carnitina, ect.

Fruttosio e carnitina: importanti nel metabolismo e nella motilità degli

 spermatozoi; 36

Enzimi proteolitici -responsabili della liquefazione del coagulo seminale

 liquido seminale liquefarsi

(non appena emesso il coagula per poi

nuovamente dopo 30 –60 minuti).

L'acido citrico interviene nel processo di coagulazione-liquefazione dello

 sperma;

Lipidi -possono rappresentare una fonte addizionale di energia +

 stabilizzano le membrane degli spermatozoi, proteggendole dagli insulti

termici ed ambientali.

Lo zinco-funzione battericida diretta e indiretta + stabilizza la cromatina

 degli spermatozoi;

I bicarbonati del liquido seminale hanno capacità tampone, utile per

 neutralizzare l'acidità dell'ambiente vaginale;

Il muco aumenta la mobilità degli spermatozoi nell'apparato riproduttivo

 femminile; crea dei canalicoli all'interno dello sperma, lungo i quali gli

spermatozoi possono avanzare senza disperdersi;

Le prostaglandine sono coinvolte nella soppressione della risposta

 immunitaria femminile contro gli spermatozoi del maschio.

Il fruttosio, prodotto principalmente dalle vescicole seminifere

 L'acido citrico prodotto principalmente nella prostata.

 Carnitina prodotta principalmente a livello dell’epididimo

Uretra

Un piccolo condotto che inizia dal polo inferiore della vescica urinaria (bladder)

e termina nell’estremità craniale del pene (glande). È un dotto escretore

comune dell’apparato urinario e genitale. L’uretere è un condotto che collega il

rene con la vescica urinaria. Esistono due

ureteri, uno per ogni rene; funzione ->

convogliare l’urina, prodotta dal rene,

all’interno della vescica urinaria. Nella

prima porzione riceve gli sbocchi delle

ghiandole accessorie: vescicolare,

prostata e bulbo-uretrali. Nella femmina

ha la sola funzione di permettere il

passaggio dell’urina, nel maschio serve

anche per il passaggio dello sperma

poiché in essa si immettono i condotti eiaculatori. L’uretra del maschio si divide

in due parti: pelvica e peniena.

Pene

Organo copulatore maschile composto da:

Uretra spongiosa o peniena

 Corpi cavernosi

 Corpo cavernoso del glande

La porzione terminale contenuta in una tasca chiamata prepuzio posto qualche

cm dietro l’ombelico. Nel toro a livello della regione scrotale presenta una

37

curvatura ad S detta inflessione sigmoide. L’uretra spongiosa è una

continuazione della parte pelvica dell’uretra. Si chiama spongiosa perché la sua

parete contiene uno strato di tessuto erettile, trama fibroelastica, entro le

maglie vengono accolti i vasi sanguigni fortemente dilatati, conferiscono alla

parete un aspetto spugnoso. Nel suo insieme questo tessuto forma il corpo

spongioso del pene. L’uretra spongiosa si apre all’esterno mediante l’ostio

esterno dell’uretra, che nei ruminanti e nel cavallo è a carico di un breve

prolungamento, detto processo uretrale. I corpi cavernosi del pene, uno per

lato, formano un’asta erettile che sostiene gli altri costituenti penieni. Prepuzio:

involucro cutaneo che accoglie la parte libera del pene quando questo non è in

erezione. Nei ruminanti e nel maiale è stretto e poco rilevato in superficie.

L’estremità caudale è in continuità con lo scroto, l’estremità craniale presenta

un orificio, l’ostio prepuziale. Il prepuzio è formato da due lamine cutanee, una

interna ed una esterna che si uniscono a livello dell’ostio prepuziale; tra le due

è presente del connettivo lasso di aspetto lamellare ricco di fibre elastiche.

APPARATO GENITALE FEMMINILE

Ovaio

 Ovidutti (salpinge)

 Utero

 Cervice

 Vagina

 Vulva

Le ovaie sono organi pari appesi alla regione lombare all’estremità craniale del

legame largo dell’utero. Nei ruminanti le ovaie si rilevano in vicinanza del pube,

mentre nella cavalla rimangono 10 cm lontani dal collo dei reni. L’ovaio varia

per forma da specie a specie, nei ruminanti è ovale appiattito da un lato

all’altro, siile ad una mandorla. Nella cavalla assomiglia ad un piccolo rene,

presenta nel margine libero la fossetta di ovulazione, poi tutta la superficie

dell’ovaio è ricoperto dal peritoneo, la gonade è bianca madreperlacea ->

l’ovulazione non può avvenire sull’ovaio, si verifica solo a livello della fossetta.

Nella scrofa assomiglia ad una mora per la presenza di numerosi follicoli e corpi

lutei. Il mesovario si estende dal margine mesovarico dell’ovaio, è una delle

formazioni peritoneali legamentose. In ciascun ovaio si distinguono due

estremità: tubarica, dà inserzione alla fimbria che la collega alla tuba uterina;

estremità uterina dà attacco al legamento proprio dell’ovaio (largo) che la

unisce all’utero. Altre formazioni peritoneali legamentose che mantengono in

situ l’ovaio sono il legame sospensore dell’ovaio e si trova sul margine craniale

del mesovario e si porta fino alla regione lombare in vicinanza del rene.

Un’altra formazione è il legamento proprio dell’ovaio e questo va dall’estremità

uterina dell’ovaio (vicina all’utero) all’estremità del corno uterino

corrispondente. L’altra formazione è il mesosalpinge sostiene la tube uterina

lateralmente all’ovaio, è unito anche alla fimbria ovarica, questa è una frangia

dell’infundibolo uterina, serve per forma la borsa ovarica -> sdoppiamento più

38

o meno profondo del legamento largo dell’utero. Lo sviluppo del mesosalpgine

condiziona l’ampiezza della borsa. Nella borsa ovarica si apre anche

l’infundibolo della tuba uterina. La borsa ovarica è l’equivalente del seno

epididimale nel maschio.

Struttura ovaio: due parti -> esterna o corticale e interna o midollare. Nella

cavalla invece la corticale prevale sulla midollare, occupa quasi tutta la parte

interna dell’organo raggiungendo la periferia solo a livello della fossetta di

ovulazione, la midollare è a livello solo dell’albuginea, quindi in periferia. Sulla

superficie esterna si osserva un epitelio cubico monostratificato, sopra si trova

uno strato di connettivo denso di colore biancastro detto tunica albuginea.

Nella cavalla l’albuginea p molto ispessita e rivestita da peritoneo. La parte

corticale dell’ovaio si compone di connettivo e di follicoli primordiali -> questi

sono formati da oociti di primo ordine, la cui divisione meiotica rimane bloccata

fino a poche ore prima dell’ovulazione e l’oocita è circondato da cellule

follicolari appiattite. I follicoli primordiali non sono in numero uguale nelle varie

specie e cambia il numero dalla nascita allo sviluppo. Alla nascita sono milioni

nella scrofa, invece in altre specie sono alcune centinaia. Dopo la nascita molti

follicoli primordiali degenerano e scompaiono -> potrebbe essere dovuto ad un

risveglio indipendente dagli ormoni, ma influenzato dai fattori di crescita. Tutti i

follicoli primordiali raggiunti dall’ormone FSH, ma solo quelli in cui le cellule

follicolari sono nella fase finale della quiescenza rispondono all’ormone, si

attivano cominciando a sintetizzare estrogeni. Il follicolo primordiale attivato

rappresenta il punto di partenza di una serie di stadi evolutivi che portano

all’evoluzione del follicolo maturo che porta alla libera dell’oocita.

Follicologenesi:

1. Follicolo primario -> le cellule follicolari che circondano l’oocita di

primo ordine disposte in un unico strato. L’oocita presenta la zona

pellucida (glicoproteine e proteoglicani) che lo separa dalle cellule

follicolari

2. Follicolo secondario -> più voluminoso dovuto al grande aumento delle

cellule follicolari che si dispongono su più strati e costituiscono la

granulosa. La zona pellucida si presenta più ispessita e si comincia a

formare uno strato di spazio perivitellino

3. Follicolo terziario -> si ha un accrescimento dell’oocita e la

dissociazione di buona parte delle cellule follicolari che cominciano a

secernere il liquido follicolare che si raccoglie in un’ampia cavità centrale

o antro. Nell’altro si forma un ammasso di cellule follicolari avvolgenti

l’oocita: il cumulo ooforo. Le cellule di questo disposte attorno alla zona

pellucida costituiscono la corona radiata. Il connettivo che contorna la

granulosa si trasforma nella teca interna e secerne steroidi. La teca

interna, ricca rete di capillari, non invade la granulosa, separata dalla

granulosa da una membrana basale. Il connettivo a ridosso della teca

interna denominato teca esterna

4. Follicolo maturo (Graaf) -> follicolo al suo massimo sviluppo e si

prepara all’ovulazione. Il cumulo ooforo si fa ancora più sporgente perché

39

si ulteriormente ampliato. Scompaiono le giunzioni comunicanti tra le

cellule follicolari e tra queste e l’oocita. Inizia la conversione luteinica

delle cellule follicolari (secrezione progesterone)

Ovulazione

È la rottura o deiscenza del follicolo e la liberazione dell’oocita con in

quest’ultimo periodo si è trasformato da 1° a 2° ordine. Viene rimosso il blocco

meiotico su cui si trovava l’oocita di 1° ordine fin dallo stadio di follicolo

primordiale. L’oocita di 1° ordine -> meiosi -> formazione di due cellule:

1. L’oocita di 2° ordine (aploide)

2. Una cellula abortiva, il globulo polare o polocita -> degenera quasi subito

Prima dell’ovulazione il follicolo forma una salienza conica sulla superficie

ovarica che rapidamente diventa pallida e si chiama stigma. Qui si ha la rottura

o deiscenza del follicolo -> si forma un orificio e il liquido follicolare defluisce

lentamente. Nella cavalla e nella scrofa il liquido trascina l’oocita e il cumulo

ooforo. Nei ruminanti solo l’oocita di secondo ordine non contornato da cellule

del cumulo ooforo. La rottura della parete del follicolo, azione della collagenasi

prodotte dalla teca esterna e della granulosa adiacenti allo stigma, sotto lo

stimolo di prostaglandine presenti nel liquido follicolare.

Dopo la deiscenza ciò che rimane del follicolo è una specie di cratere, con

dimensioni diversi in animali diversi, contiene materiale amorfo coagulato e in

breve tempo si comincia la rapida proliferazione delle cellule della granulosa

che cominciano a riempiere questo cratere. A livello della teca interna si ha

un’intensa formazione di capillari sanguigni -> il coagulo viene invaso da

sangue che fuoriesce dal capillare, motivo per cui diventa rosso scuro e si

chiama copro emorragico. Poi l’intera cavità viene occupata dalle cellule

luteiniche, si forma così il corpo luteo. La luteina, abbondante nei luteociti delle

bovine e della cavalla, nei piccoli ruminanti e nella scrofa il pigmento è di

colore ardesia chiaro. Nelle bovine il corpo luteo sporge sulla superficie

dell’ovaio, facilmente percepito per via rettale. Nella cavalla il corpo luteo è

voluminoso ma non in rilievo sulla superficie, si trova a livello della fossetta di

ovulazione. Nella scrofa i corpi lutei sono tanti quanti i follicoli che sono andati

incontro a deiscenza. Il corpo luteo: autentica ghiandola endocrina che prepara

l’utero alla gravidanza.

Se la fecondazione non avviene il corpo luteo regredisce rapidamente e diventa

corpo luteo ciclico o albicante. Se la fecondazione avviene la ghiandola

permane e diventa corpo luteo gravidico. In alcuni casi il corpo luteo persiste

anche e non c’è stata fecondazione, come se fosse gravida.

Ovidutti/tube uterine/salpingi/trombe di Falloppio

Due sottili condotti che ricevono dalla borsa ovarica l'oocita di 2°ordine e lo

trasferiscono nell'utero se non è stato fecondato. In ciascuna tuba uterina si

distinguono: 40

L’infundibolo: si apre nella borsa ovarica. Allargato ad imbuto; il

 margine libero frastagliato per la presenza di pieghe, le fimbrie

L'ampolla: dilatata soltanto nella Cavalla

 L'istmo: Ruminanti e Scrofa, stesso diametro dell’ampolla

La parte uterina-breve, penetra nell'estremità craniale del corno uterino

mediante l‘ostio uterino. La tuba uterina misura 30 cm nelle Bovine e nella

Cavalla, 20 cm nella Scrofa. flessuosità che interessano l'ampolla e

Numerose

l'istmo. Costituiscono:

Sede della fecondazione (ampolla)

 Tratto dove ha luogo la ricapacitazionedello spermatozoo

 Le cellule della mucosa tubarica, secernono sostanze che

o rimuovono i «fattori decapacitanti» acquisiti nel liquido seminale

Le ciglia delle tube fanno progredire l'oocita di II ordine o lo zigote

o verso l'utero

Lo zigote inizia subito la segmentazione con la formazione dei blastomeri

(morula). Nelle Bovine e nella Scrofa, il transito -periodo breve (due giorni)

-nell'utero perviene una morula; Nella Cavalla–il transito-periodo più lungo (8-

10 giorni) -nell'utero arriva una blastocisti.

Utero

Parte dell’apparato genitale femminile compresa tra le tube uterine e la vagina,

costituito da due corna -> corpo e cervice. La forma e costituzione variano da

specie a specie -> bicorne e bipartito.

Bicorne: il corpo è ben sviluppato e lungo quasi quanto le corna, come ad

esempio nella cavalla. Bipartito: il corpo è breve e le corna si accollano per un

tratto senza fondersi, determinando all’interno la formazione di un setto

uterino, sagittale e mediano, bovine e scrofa. Nell’utero bipartito

l’accollamento delle due corna per un tratto, segnato all’interno della cavità

uterina da un setto uterino molto sviluppato. Nell’utero bicorne il corpo è ben

sviluppato e lungo quasi quanto le corna, mancanza del setto uterino.

Cavalla: utero bicorne, le corna uterino hanno una lunghezza dai 20 ai 25 cm, il

corpo dell’utero è molto sviluppato e ha una lunghezza di 20 cm.

Ruminanti: utero bicorne, corna uterino di 15-20 cm, in continuazione con gli

ovidutti, sono inizialmente sottili, poi si allargano e si affiancano a formare il

corpo dell’utero.

Scrofa: utero bipartito, le corna uterine sono molto lunghe 50-60 cm, disposte a

formare anse simili a quelle dell’intestino, il corpo utero è lungo circa 5 cm.

Cervice

Al corpo fa seguito il collo dell’utero o cervice di 10-15 cm di lunghezza.

Presenta una parete molto ispessita che delimita una cavità molto stretta, il

canale cervicale che comunica da una parte con il corpo dell’utero e dall’altra

parte sbocca all’estremità craniale della vagina. La funzione del legamento

largo è di sostegno nonché di bilanciamento delle corna uterine durante il parto

41

e la gravidanza. L’utero attaccato sulla parete dorsale della cavità addominale

e pelvica per via di due legamenti larghi (ampie formazioni peritoneali

ispessite, contenenti tessuto connettivo). I legamenti larghi sostengono non

soltanto l’utero ma anche le ovaie e nel loro insieme formano una V con il

vertice in corrispondenza dell’utero.

Pareti uterine

Dall’esterno all’interno:

Perimetrio: costituito da tessuto connettivo denso + fibre elastiche.

 Nella parte profonda è ricco di vasi e nervi dell'utero.

superficiale,

Miometrio:si compone di tre strati: costituito da fasci di

 medio,

cellule muscolari lisce; molto ricco di vasi e, infine, strato

profondo, molto sviluppato, con fasci muscolari circolari.

Endometrio (mucosa uterina): si compone di un epitelio prismatico e

 prevalentemente monostrato(nei Ruminanti e nella Scrofa può

presentarsi a tratti anche a più file) e di una lamina propria bene

sviluppata ed è formata da connettivo denso ricco di cellule leucocitarie.

Nello spessore della lamina propria si trovano ghiandole uterine e nella

bovina, le caruncole uterine.

Utero: costituito di tre parti:

Cervice: è aperta poco quando l’animale è in calore e del tutto durante il

 parto; presenta molte pieghe (nella bovina) o avvitamenti a spirale (nella

scrofa). Produce due tipi di secrezioni: il muco cervicale (durante l’estro)

e il tappo mucoso (durante la gravidanza)

Corpo: è una piccola parte di passaggio

 Corno: è la zona in cui si svolge la gravidanza; per poter ospitare i feti

 può allungarsi ed allargarsi molto. Al momento del parto si contrae

spingendo fuori il feto. Nei ruminanti le corna sono provviste di

caruncole per consentire lo sviluppo della placenta cotiledonare,

il latte uterino,

tipica di questo gruppo di animali. Il corno produce

sostanza zuccherina che mantiene in vita l’embrione fino alla formazione

della placenta.

Caruncole uterine caruncole (placentomi)

Nei ruminanti le corna uterine sono provviste di per

consentire lo sviluppo della placenta cotiledonare, tipica di questo gruppo di

animali. L'endometrio o mucosa uterina in questi animali si ispessisce a tratti e

si arricchisce di vasi determinando la formazione delle caruncole. Caruncole

(placentomi) uterine: piccole formazioni sferiche disposte su più file nelle

corna e nel corpo nei ruminanti. Durante la gravidanza prendono rapporto con

alcune aree del sacco coriale dell’embrione (i cotiledoni). Assenti nella cavalla e

nella scrofa per consentire lo sviluppo della placenta cotiledonare, tipica di

questo gruppo di animali.

Vagina-vestibolo-vulva 42

La vagina segue all’utero e si estende fino al vestibolo vaginale (punto di

connessione tra vagina e vulva). Il canale cilindroide molto dilatabile è formato:

Tonaca muscolare all’esterno

 Tonaca mucosa interna formata da epitelio pavimentoso stratificato

 provvista di pieghe longitudinali e priva di ghiandole

Il vestibolo vaginale (punto di connessione tra vagina e vulva) è un canale di

circa 10 cm. Nella parte craniale del suo pavimento sbocca l’uretra. La mucosa

del vestibolo è ricca di ghiandole: le ghiandole vestibolari minori e le ghiandole

vestibolari maggiori.

La vulva rappresenta la parte più esterna dell’apparato genitale. Nella

commensura ventrale delle labbra si trova il clitoride (organo erettile simile al

pene del maschio).

Le loro funzioni sono queste:

Vulva: la terminazione esterna dell’apparato genitale femminile; chiude

 verso l’esterno l’apparato riproduttivo, impedendo che entri dello sporco

Vagina: l’organo che serve all’accoppiamento. Nella vagina viene

 deposto lo sperma, ad eccezione della Cavalla nella quale l'eiaculazione

avviene nel canale cervicale dell'utero.

Clitoride: un pene in miniatura; si compone di due pilastri del clitoride,

 ciascuno dei quali prende attacco sul lato corrispondente dell'arcata

ischiatica;

Mammelle

Ghiandole cutanee specializzate nella produzione lattea. Evolvono rapidamente

nella femmina a partire dalla maturità sessuale; il massimo sviluppo alla fine di

una gravidanza e immediatamente dopo il parto. Dopo il periodo di

adattamento, il tessuto ghiandolare regredisce e le mammelle riprendono il loro

normale volume. La funzione mammaria completa quella dell’apparato genitale

femminile, particolarmente in quelle specie in cui il neonato deve acquisire gli

anticorpi dal colostro in quando la placenta non permette il passaggio delle

immunoglobuline.

Rilievi sulla superficie cutanea di forma e topografia diverse a seconda della

specie. Sulla sommità vi è un prolungamento cilindroide: la papilla o il

capezzolo. L’estremità libera del capezzolo porta uno o più osti papillari: 2 osti

per capezzolo nella cavalla, 1 nei ruminanti e 2-3 nella scrofa. A seconda delle

caratteristiche di specie e del numero dei nati ad ogni parto: mammelle

toraciche, addominali ed inguinali. Nella cavalla, pecora, capra: 2 mammelle

inguinali, nelle bovine due paia, nella scrofa 6-7 paia (1-2 paia toraciche, 4

addominali, 1 inguinale). Le mammelle dei due lati sono divise da un solco

intermammario, più o meno largo e profondo a seconda della specie. Quando

sono presenti più paia di mammelle si ha la presenza di solchi trasversali che

separano nettamente le singole ghiandole. La pelle che riveste le mammelle è

sottile, morbida ed elastica, provvista di ghiandole sudoripare e sebacee. I peli

43

generalmente sono radi e fini, ma possono anche mancare come ad esempio

nelle bovine e scrofe. Sono mantenute in situ da un apparato di sospensione. È

formato da connettivo elastico in continuità con il derma cutaneo e con lo

stroma della ghiandola. Indispensabile in quanto nelle bovine lattifere il

complesso mammario può raggiungere 25 kg in soggetti ad elevata attitudine

con produzione giornaliera di 50 L durante il picco di lattazione.

Il complesso mammario delle bovine: quattro mammelle o quarti, ognuno con

un capezzolo lungo 6-8 cm e largo 2-3 cm. Le fasce dell’apparato sospensore

sono particolarmente sviluppate e robuste e forano un vero e proprio

legamento sospensore del complesso mammario. Istologicamente sono un

epitelio ghiandolare esocrino; filogeneticamente ghiandole sudoripare

modificate; classificazione: ghiandola tubulo-alveolare (acinosa) composta. La

mammella formata dalle ghiandole mammarie + tessuto adiposo e + tessuto

connettivo. Nell'intervallo tra due lattazioni, fase chiamata «in asciuta» il

parenchima regredisce, gli alveoli perdono il lume o scompaiono ma persistono

più a lungo le vie di escrezione del latte; il connettivo estremamente

abbondante. La ghiandola rimane quiescente fino a una successiva gravidanza

quando riprenderà un nuovo ciclo secretivo. Quando la ghiandola è in attività il

connettivo forma sottili setti che separano i lobi in lobuli formati da gruppi di

adenomeri (alveoli) provvisti di epitelio prismatico semplice, la cui altezza varia

a seconda dei momenti funzionali.

L'adenomero: unità secernente della ghiandola endocrina o esocrina formato

da cellule che elaborano il prodotto di secrezione. È una struttura a cavità

centrale, nella quale si riversa il secreto delle cellule che compongono

l'adenomero. Cavità direttamente collegata con il dotto escretore. Durante i

picchi di attività funzionale il lume degli adenomeri è ampio; non tutti gli

adenomeri possono essere contemporaneamente funzionali.

Via di escrezione del latte

Il tessuto ghiandolare mammario è organizzato in lobi che contengono diversi

lobuli. I lobuli sono gruppi di alveoli, ciascun lobulo è circondato da tessuto

connettivale. Gli alveoli: strutture a forma di sacco acinoso (0.1-0.3 mm) dove il

latte è sintetizzato e secreto. Considerati come un’unità produttiva. Il “lume”

dell’alveolo contornato da un singolo strato di tessuto epiteliale secretorio e

questo è coperto da cellule mioepiteliali contrattili (che rispondono

all’ossitocina). Gli adenomeri (alveoli) di uno stesso lobulo fanno a capo a un

dotto intralobulare, questi condotti confluiscono poi nei dotti interlobulari che

decorrono nei setti connettivali. Il latte viene poi raccolto dai dotti lattiferi,

con lo stesso epitelio dei precedenti ma dotati di una guaina fibroelastica e di

uno strato più consistente di muscolatura liscia. I dotti lattiferi si aprono nel

seno lattifero che è divisibile in una parte ghiandolare, posta nel corpo

della ghiandola alla base della papilla, e in una parte papillare situata nella

papilla stessa e che comunica con l’esterno mediante il dotto papillare

(teatorifice).

Ciclo ha una durata di 28 giorni, la fase di mestruazione dura circa 5 giorni. Il

ciclo ovarico è sotto il controllo dell’adenoipofisi che rilascia gli ormoni FSH e

44

LH. Adenoipofisi controllata dalle gonadotropine che è il prodotto delle cellule

dell’ipotalamo. Ci sono anche gli estrogeni e il progesterone che promuovono i

cambiamenti ciclici nella struttura e nella funzione dell’endometrio (ciclo

uterino). Ipofisi influenzata anche dagli estrogeni prodotti dagli oociti. Alte

concentrazioni di estrogeni e progesterone inibiscono l’ipotalamo.

Fase follicolare: dal 1° all’11° giorno:

Aumento graduale di entrambe le gonadotropine, crescita e maturazione

 follicolare, aumento dell’LH posticipato 2-3 rispetto all’FHS. 6-7 giorni

prima dell’ovulazione si ha un aumento di estrogeni. Si ha un decremento

di FHS -> selezione del follicolo dominanti. Aumento costante di LH. Il

picco di estrogeni precede e induce il picco dell’LH che a sua volta induce

e precede di 16/32 ore l’ovulazione.

Fase luteale: dal 16° al 28° giorno.

Elevata produzione di progesterone per 3-4 giorni. Decremento di

 progesterone

Reazione acrosomiale vs capacitazione -> sono due cose diverse. domanda

Patologie dell’ovaio: alcuni fattori di infertilità: genetici, congeniti, acquisiti o

correlati all’età. Monosomie o trisomie dei cromosomi sessuali, traslocazioni dei

cromosomi (aneuploidie embrionali), mutazioni del gene della fibrosi cistica,

mutazioni del cromosoma Y, polimorfismi e mutazioni di androgeni, FSH, LH,

GnRH o mutazioni nei fattori coagulazione.

Fattori congeniti: fenomeni come l’endometriosi, fibromi, varicocele

(nell’uomo), patologie di tipo anatomico come agenesia, criptorchidismo,

malformazioni uterine.

Fattori acquisiti: infezioni batteriche o virali, interventi chirurgici che

compromettono la fertilità, terapie oncologiche, trattamenti medici,

contraccettivi.

Stile di vita, fattori ambientali e fattori alimentari, anche l’età.

La tendenza attuale a programmare la prima gravidanza in età più avanzata ha

fatto aumentare sensibilmente le dimensioni del problema. Il fattore età agisce

più sensibilmente sulla fertilità femminile attraverso modificazioni ormonali che

determinano la comparsa di cicli anovulatori. Si verifica il peggioramento della

qualità ovocitaria. Col passare del tempo aumenta l’incidenza delle aneuploidie

dovute ad errori nella divisione meiotica

Laboratorio di fecondazione assistita

Qualsiasi materiale deve essere validato prima di entrare in laboratorio. IVF 45

Cappa con il filtro HEPA -> ha il piano riscaldato, perché le piastre di

 coltura devono avere una temperatura di 37°C, bisogna mimare quello

che succede in natura

Microscopi collegati anche con il monitor

 Incubatore all’interno della cappa

 Sistema di controllo al di sotto della cappa, permette di controllare tutte

 le relative temperature

Tutti gli strumenti hanno la possibilità di essere collegati con il pc al fine

 di raccogliere i dati e fare analisi statistiche

ICSI Stazione di micro manipolazione

 Sempre uno o due monitor

 Tutto riscaldato

 Ci deve essere un piano antivibrante

 Ci sono strumenti che permettono di vedere la temperatura dei piani

 riscaldati

Per le colture cellulari vengono usati degli incubatori con camicie ad acqua,

hanno una serie di filtri sempre HEPA di diverse grandezze. I parametri

importanti sono temperatura, CO e O .

2 2

Un altro incubatore si chiama planner: si mettono le piastre all’interno, si apre

da sopra ed è molto più comodo per spostare, pulire. A livello di funzionamento

usa un altro tipo di gas, non la CO ma un gas premiscelato. Sempre collegato

2

con il pc al fine di raccogliere i dati.

Un altro incubatore si chiama time-lapse: ha la telecamera all’interno quindi

possiamo immagazzinare immagini e video che permettono di vedere dalla

genesi fino all’ultimo giorno; altro vantaggio è anche il fatto che si dà un

disturbo minimo all’embrione, perché permette di non aprire l’incubatore. Si ha

un pozzetto per il singolo embrione.

I filtri per la pulizia dell’aria sono importanti -> è indispensabile avere una

qualità dell’aria molto più pulita rispetto agli ambienti normali. Sul soffitto ci

sono filtri e sistemi di circolazione dell’aria. C’è un sistema di sicurezza della

CO : c’è una rampa con due bombole, c’è uno switch automatico. Bisogna

2

mantenere costante anche la pressione.

UPS: importante per qualsiasi problema.

Si utilizzano anche altri strumenti per misurare i parametri fondamentali, per

essere ancora più sicuri.

Particle counter: strumento per misurare le particelle presenti nell’aria, si

misura prima e durante l’attività per verificare l’assenza di fattori inquinanti

nell’aria. C’è anche l’analizzatore VOC. C’è anche il bioluminometro per

controllare la carica di batteri nel piano di lavoro. È importante anche il

pHmetro perché i batteri hanno un pH prestabilito. C’è anche un termometro ad

alta precisione in modo da fare un doppio controllo delle temperature. Si

46

controllano anche i livelli di azoto liquido, all’interno di questo si congela tutto il

materiale genetico.

Per quanto riguarda i dati bisogna controllare la qualità dell’input dei dati e si

deve controllare anche la qualità del processamento. Si utilizzano dei software

specifici per valutare questi aspetti.

È importante basarci sulle linee guida delle clean room, il procedimento non

deve essere troppo complesso. La coltura deve essere il meno stressata

possibile. È importante assicurarsi dell’aspetto più pratico dei pazienti, di come

si approcciano alla clinica. Servono anche dei certificati si sicurezza. Tutto

questo lavoro è un lavoro fatto da tanti piccoli dettagli, da tante variabili ed è

importante che tutto sia ben coordinato e sincronizzato.

La strumentazione del laboratorio di seminologia

Cappa a flusso laminare

 Microscopio ottico a contrasto di fase

 Termoblock

 Centrifuga

 Strumenti per la crioconservazione: termosaldatrice, pompa a

 caricamento, paillettes

Materiale monouso sterile: provette per centrifuga, provette per la

 preprazione di liquido seminale, pipette sierologiche monouso sterili per

la preparazione del liquido seminale

Vetrini

 Cartine tornasole

 Manutenzione strumenti

Valutazione del materiale seminale

Due scopi:

Diagnostico

 Tecnologico-commerciale, per miglioramento delle razze

Valutazione del riproduttore

Sviluppo corporeo

 Stato di nutrizione e gestione

 Corretta conformazione in relazione alla razza ed età

Metodiche di preparazione dei campioni seminali

Swim-up: si usano diversi gradienti di terreno, con diverse concentrazione e in

fondo si hanno gli spermatozoi più mobili e più puliti -> sono lavaggi

eccezionali per avere il materiale più pulito possibile.

MESA: si usa per l’azospermia ostruttiva. Si fa una biopsia, si a un’aspirazione

dell’epididimo e si vanno a valutare gli spermatozoi perché potrebbe essere

una costrizione.

TESE: si fa nel caso di azospermia non ostruttiva. 47

Genetica applicata alla riproduzione

Infertilità:

Squilibri ormonali

Sapere un paio di sindromi per l’esame.

Prima analisi che si fa è l’analisi del cariotipo ad entrambi i partner per vedere

se ci sono delle anomalie.

È importante ricordare l’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi.

Ipogonadismo maschile: diminuzione della funzione delle gonadi maschili. I

livelli di testosterone sono al di sotto dei 10nmol/L.

Biotecnologie per l’agricoltura animale

Il progresso nel settore dell’agricoltura animale è legato a quello delle

biotecnologie che sono in grado di fornire nuove possibilità per migliorare la

salute degli animali e aumentare la produttività. Questo è legato a progressi

nei sistemi di diagnosi e disponibilità dei farmaci e vaccini. Le malattie degli

animali costa all’agricoltura, per cui piccoli miglioramenti nella diagnosi, cura e

prevenzione delle patologie animali possono avere notevole impatto

economico. Anche in veterinaria vengono usati gli anticorpi monoclonali per

diagnosticare le patologie del bestiame. Per l’uso degli ab monoclonali vali lo

stesso principio della salute umana, grazie alla loro specificità sono più veloci,

accurati e più sensibili di quelli tradizionali. Inoltre molti di questi metodi per la

diagnosi delle patologie sono anche trasportabili, strumentazione abbastanza

semplice e permette ai veterinari di diagnosticare malattie direttamente sul

campo. Una diagnosi precoce accurata permette una scelta immediata e

appropriata della cura della malattia, in questo modo si previene l’espansione

della patologia. Alcune delle malattie infettive che i veterinari possono

diagnosticare con i metodi forniti dalle biotecnologie: la brucellosi, la

pseudorabbia, la dissenteria, la malattia della bocca e del piede, la trichinosi.

Brucellosi: aborto epizootico o malattia di Bang (nei bovini) o febbre

mediterranea, è una zoonosi, malattia che può colpire gli animali. Il decorso di

questa patologia è di tipo cronico e i sintomi si manifestano negli organi

genitali, con diversi effetti gravi, tra cui l’aborto. È causata da un gruppo di

batteri, dalle brucelle, ed è trasmissibile all’uomo. Nell’essere umano il decorso

è acuto con una tipica febbre alta ad intermittenza. La maggior parte dei

batteri presenti nei cani infetti da brucellosi canina sono secreti nel liquido

seminale e nelle secrezioni vaginali, ma il batterio potrebbe essere presente

anche a livello del latte, delle urine e della saliva. I segni clinici sono variabili, di

solito i cani possono mostrare segni moderati, ma anche addirittura nessun

segno clinico. La terapia è a base di antibiotici che riduce tutto, sintomatologia,

patologia ed evita ricadute. Tra i vari farmaci che vengono utilizzati ci sono la

doxociclina con rifampicina e streptomicina. La scelta dei farmaci si basa

48

sull’età, condizioni generali e le varie complicazioni. Nell’uomo non esistono

vaccini efficaci, quindi è importante mettere in atto tutte le strategie

preventive possibili: vaccinazione degli animali, utilizzo di guanti protettivi ed

evitare consumo di prodotti non pastorizzati, nel caso dei bovini.

trichinella spiralis.

Trichinellosi: infezione parassitaria, dovuta al nematode

Può infettare dall’uomo agli uccelli e in alcuni casi anche i rettili. Nell’uomo la

malattia è causata da consumo di carne poco cotta contenente cisti con questo

microrganismo. Gli animali selvatici, carnivori e onnivori, possono essere

considerati una possibile fonte della malattia. Le carni di animali da

allevamento possono essere considerate sicure.

Afta epizootica: malattia infettiva altamente contagiosa dei ruminanti e del

bovino, lesioni ulcerosi nella bocca e alle estremità distali degli arti. È un virus

privo di envelope, di piccolissime dimensioni, è molto resistente alle alte

temperature, ai solventi dei lipidi, alle condizioni ambientali, e il virus è molto

trasportabile attraverso le correnti d’aria. Una volta introdotto in un gruppo di

animali, la malattia si diffonde rapidamente, il periodo di incubazione va fino a

6 giorni -> febbre oltre i 40°C e drastico calo della montata lattea, dopo

compaiono delle lesioni vescicolose nella bocca e nello spazio interungueale

della zampa. Le specie domestiche sensibili alla malattia comprendono animali

artiodattili, a unghia fessurata, bovini, ovini, caprini e suini. Nell’uomo sono

stati riscontrati rari casi di formazioni di lesioni vescicolosi, normalmente si

guarisce velocemente. Per gli animali ci sono dei vaccini, ma visto che ci sono

diversi ceppi di virus potrebbero non funzionare. Non c’è alcuna cura per l’afta.

L’immunità che l’animale ottiene dopo il vaccino non è di lunga durata, quindi

devono essere vaccinati 2 volte all’anno se non di più, costo elevato quindi non

si fa in realtà due volte all’anno. I suini non rispondono bene alla vaccinazione

ed alcuni rimangono esposti alla malattia.

Terapie e prevenzione

L’ingegneria genetica per produrre quantità sufficienti di proteine endogene

terapeutiche presenti negli animali: l’interferone e l’interleuchina 2, proteine

del sistema immunitario contro i virus. I geni per queste proteine sono clonati

ed inseriti in batteri per una produzione su larga scala. L’iniezione di queste

molecole abbassa l’incidenza della febbre da trasporto del bestiame. Notevoli

progressi nella prevenzione delle malattie degli animali. La medicina

veterinaria applica le stesse tecniche usate per migliorare i vaccini umani.

Disponibili vaccini per diverse malattie e parassiti: pseudorabbia, malattia della

bocca e del piede, malattie trasmesse dalle zecche, tenia.

Pseudorabbia: morbo di Aujeszky, il virus è a DNA, con envelope, appartiene

alla famiglia degli Herpesvirus, stabilisce negli animali un’infezione a livello dei

gangli sensoriali e a livello delle tonsille. Il maiale è l’unico ospite e bersaglio

naturale del virus, ma può essere trasmesso anche ad altri animali.

Sintomatologia: nervosa, dovuta ad una grave encefalite, osservata nei giovani

che manifestano un prurito devastante fino ad arrivare all’automutilazione, altri

sintomi molto simili a quelli che sono dati dai virus della rabbia. Ma a differenza

49

del virus della rabbia questo non causa aggressività; si manifestano tremori,

non coordinazione dei movimenti e ipersalivazione.

La coccidosi del pollame: malattia parassitaria, sviluppo e moltiplicazione

dei coccidi in cellule epiteliali dell’intestino. Rottura dell’equilibrio tra parassiti,

ospite e ambiente. Nei polli adulti si perde l’appetito, i giovani risultano più

voraci del solito. Comporta ad un rapido dimagrimento e paralisi delle ali e

degli altri. L’andamento della malattia è qualche volta acuto, la morte

sopravviene dopo 4-5 giorni, altre volte 20 giorni, potrebbe anche diventare

cronica.

Altra via di prevenzione: produrre bestiame resistente, come nelle piante.

Naturalmente alcune razze sono resistenti ad alcune malattia, come ad

esempio alla mastite.

Mastite: infezione della ghiandola mammaria, patologia infettiva, condizionata

da fattori legati in parte all’animale (razza, ordine di parto, stadio di lattazione,

livello produttivo) e in parte alle condizioni di allevamento (mungitura). I

microrganismi che possono causare la mastite sono moltissimi, più di 140 e

sono rappresentati in massima parte da batteri. I batteri vivono sull’animale,

nella mammella, ma sono presenti anche nell’ambiente e penetrano nella

ghiandola mammaria attraverso il canale del capezzolo. In risposta

all’invasione e alla moltiplicazione batterica i leucociti passano dal circolo

sanguigno alla mammella e al latte per combattere l’infezione. Questo

costituisce la risposta infiammatoria che porta a cambiamenti chimici,

batteriologici e fisici nel latte.

Bovini OGM resistenti alla mastite a sostegno del settore

agroalimentare

La mastite rappresenta uno dei principali problemi degli allevamenti dei bovini

da latte, una bovina su due denuncia problemi mammari. La percentuale di

animali soppressi per gravi problemi di questo tipo è di 5-6%. Le mastiti

rappresentano la più importante voce della spesa sanitaria negli allevamenti

bovini da latte. La patologia è condiziona da due principali gruppi di fattori:

Le condizioni di allevamento (livello di managerialità, igiene

 dell’allevamento, presenza di lettiera, condizioni e manutenzione della

mungitrice, corretta esecuzione della mungitura, alimentazione)

Le caratteristiche dell’animale (razza, ordine di parto, stadio di lattazione,

 livello produttivo, caratteristiche morfologiche)

Gli agenti eziologici più comuni sono:

Streptococcus agalactiae

 Streptococcus disgalactiae

 Streptococcus uberis

 Staphylococcus aureus

 Staphylococcus epidermidis

 Escherichia coli

 50

S. aureus è il patogeno responsabile del 30% delle mastiti. I microrganismi che

vivono sulla mammella e nell’ambiente, entrano all’interno della ghiandola

mammaria attraverso il canale del capezzolo colonizzandola.

Conseguenze delle mastiti

La riduzione della produzione lattea -> intorno al 6% sull’intera lattazione. La

riduzione produttiva dipende dal grado di infiammazione, il quale può essere

stimato a partire dalla conta di cellule somatiche nel latte. All’aumentare del

numero di cellule somatiche (SCC) si riscontrano riduzioni crescenti della

produzione lattea e quindi si hanno perdite economiche. Negli alveoli della

ghiandola mammaria affetta da mastite si notano delle cellule. La mastite

determina un0alterazione della composizione del latte, che ne insidia la qualità,

sia come prodotto di consumo immediato che come materia prima per la

produzione di latticini. La perdita economica è determinata dalla mancata

vendita del latte e dei latticini, dai costi per le spese veterinarie, eventuali costi

per l’abbattimento del bestiame infetto. Il latte mastitico pone problemi per la

salute umana: alcuni batteri coinvolti nelle mastiti possono causare patologie

Staphylococcus aureus

anche gravi all’uomo, alcuni ceppi di possono produrre

enterotossine resistenti al calore della pastorizzazione; l’eventuale presenza di

residui di antibiotici nel latte.

Diagnostica delle mastiti

Esame fisico della mammella, si palpa al fine di riscontrare indurimento o

 aumento di temperatura, anche un rigonfiamento

California mastitis test: molto utile per identificare il latte anormale anche

 in assenza di sintomi di mastite clinica, il reagente del test interagendo

con le cellule somatiche presenti nel latte forma un gel, alla reazione

viene attribuito un punteggio in base alla quantità di gel formatosi

Strip test: raccogliere e osservare i primi spruzzi di latte munto, il latte

 mastitico mostra alterazioni della colorazione, coaguli, fiocchi e altre

anomalie, effettuato prima di ogni mungitura per consentire

l’individuazione delle mastiti cliniche

Test di laboratorio: diversi indicatori o mediatori dell’infiammazione come

 le cellule somatiche, impiegati per individuare le mastiti specialmente le

forme sub-cliniche

Combattere la mastite:

Norme igienico-sanitarie: la disinfezione delle stelle e della sala

 mungitura, la corretta sterilizzazione della mungitrice, la corretta pulizia

della ghiandola mammaria dell’animale prima e dopo la mungitura

mediante la disinfezione dei capezzoli e l’asciugatura dei capezzoli

Terapia in lattazione: la terapia antibiotica, limitata ai casi di mastite

 clinica. Il trattamento può essere locale per infusione intramammaria

oppure sistemico. Nei casi più gravi si possono combinare entrambe le

terapie, in caso di mastite acuta si munge l’animale più volte al giorno

per favorire la rimozione dei microrganismi infettanti 51

Terapia in asciutta: trattamento antibiotico intramammario al termine

 della lattazione con antibiotici a lento rilascio.

Nei casi più gravi si possono somministrare entrambe le malattie.

Soluzione biotecnologica: bovini OGM resistenti alla mastite stafilococcica.

Produzione di bovini OGM resistenti alla mastite, ci sono molte pubblicazioni

riguardanti ciò. Sono stati prodotti prima dei topi transgenici capaci di

secernere nel latte una proteina antimicrobica chiamata lisostafina -> idrolasi

Staphylococcus simulans.

piccola, con attività battericida, è stata isolata da È

in grado di scindere i ponti pentaglicinici presenti nei legami trasversali

presenti nel peptidoglicano. Concentrazione minima inibente intorno ai 0.004

microgrammi/mL. La lisostafina ha particolare attività battericida verso il

Staphylococcus

genere risultando efficace anche contro S. aureus e S. aureus

meticillina-resistente (MRSA). Possiede scarsa efficacia su altri generi di

Staphylococcus che possono anch’essi causare mastite bovina.

Costrutti:

A. Ottenuto aggiungendo una sequenza di Kozak (corta sequenza interna

del messaggero) alla porzione matura del gene lisostafina. Il complesso

di pre-inizio riconosce il sito di Kozak, solo dopo il legame tra subunità

ribosomiale 46S e la sequenza di Kozak, la subunità ribosomiale

maggiore potrebbe completare il complesso di inizio permettendo l’avvia

della sintesi proteica. Nella sequenza di Kozak c’è il codone di inizio, AUG.

Il primo costrutto è stato prodotto attaccando il sito di Kozak,

codificherebbe per una proteina inattiva, che rimane nel citoplasma visto

che manca il peptide di segnale, da qui il nome Cyto-lys, ma a noi serve

che la lisostafina esca dalla cellula. Questa proteine inoltre dovrebbe

avere un peso molecole uguale a quello della lisostafina matura.

B. Possiede il peptide segnale (atg) per l’escrezione, questo costrutto

codifica per una proteina che viene secreta, questa possiede un peso

molecolare superiore a quella batterica perché sarà glicosilata nelle

cellule eucariotiche. Considerando tutto questo il nome di questo

costrutto si chiama Sec-Lys.

C. Codifica per una proteina che viene secreta (ha il peptide segnale), ma

ha un peso molecolare uguale alla proteina batterica. Mediante

52

ingegneria proteica sono stati sostituiti i redisui di asparagina (125 e 132)

con glutammina e questo fa in modo che la proteina non sia glicosilata. Si

chiama Sec-Gln-Lys

Sono state fatte delle prove di espressione nelle cellule COS-7, sono state

trasfettate con i costrutti ed è stato fatto un WB sui vari estratti grezzi e su vari

mezzi di coltura, per capire se la proteina viene sintetizzata correttamente e se

viene secreta. Si nota che il costrutto A che è stato caricato nel pozzetto 3

presenta un peso molecolare alla proteina batterica caricata nel pozzetto 1. Il

costrutto B codifica per una proteina che viene secreta e si trova nel terreno di

coltura e non più nelle cellule.

Valutazione dell’attività battericida della lisostafina eucariote -> gli estratti

cellulari e i diversi terreni di coltura contenenti la proteina ricombinante sono

stati testati su colture di S. aureus per valutarne l’attività battericida.

Topi transgenici: microiniezione del transgene nel pronucleo maschile. Il

costrutto Sec-Gln-Lys (C) è stato posto sotto il controllo del promotore della

beta-lattoglobulina per espressione solo nella ghiandola mammaria. Il gene

fuso BLG-Lys (lisostafina) è stato poi utilizzato per generare topi transgenici.

Immagini

Dove c’è l’alone vuol dire che la lisostafina ha funzionato.

Il costrutto C è il migliore ed è stato utilizzato per produrre i topi transgenici, è

stato posto sotto il controllo del promotore β-lattoglobulina -> il costrutto viene

espresso solo a livello della ghiandola mammaria e solo nel latte. Il gene

prodotto dalla fusione del costrutto e dalla β-lattoglobulina è di 7.5 kb, è stato

utilizzato per produrre il topo transgenico. Ci sono varie tecniche per produrre

animali transgenici: iniezione nel pronucleo maschile -> sono nati 8 topi

transgenici, accoppiati poi con topi wt per capire se l’integrazione del

transgene fosse nella linea somatica o germinale. Questi topi fondatori sono

stati identificati tramite SB. 2 dei topi transgenici non hanno trasmesso il

transgene alla progenie, quindi era nelle cellule somatiche. Gli altri 6 hanno

trasmesso il transgene alla prole e la prole femmina di 3 di questi fondatori ha

secreto la lisostafina nel latte a concentrazioni molto basse. Gli altri 3 founders

sono stati usati per stabilire altre generazioni di topi transgenici. Sono state

ottenute 3 linee differenti: a bassa espressione, ad espressione media e ad alta

espressione.

Il latte prodotto dalla progenie femmina ottenuta dal primo fondatore ha una

concentrazione di lisostafina per a 0.06 ± 0.01 mg/mL, linea di bassa

espressione. Tipo rappresentativi della seconda linea secernono nel latte la

proteina ricombinante ad una concentrazione pari a 0.13 ± 0.03 mg/mL, linea

medio esprimente. Un topo rappresentativo della terza linea ha prodotto 1.3

mg/mL, linea ad alta espressione

È stata eseguita anche l’analisi NB su RNA estratto da diversi tessuti dei tipo

transgenici, l’espressione del transgene era quasi limitata alla ghiandola

53


PAGINE

87

PESO

2.21 MB

AUTORE

elaisa9

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biotecnologie molecolari e industriali
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher elaisa9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biotecnologie delle produzioni animali e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Insubria Como Varese - Uninsubria o del prof Terova Genciana.

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