Biotecnologie agro-mediche - Appunti

Avevamo visto che attualmente nei sistemi eucaristici non sono ancora in grado di effettuare una

ricombinazione sito specifica quindi il transgene può inserirsi random lungo tutto il genoma e in

genere per ogni cellula gli eventi di trasformazione possono essere anche multipli e questo può

significare che a seconda di dove il transgene venga inserito avremo linee cellulari con performance

diverse nel senso che si i transgeni si inseriscono in posizioni di cromatina inattiva, questi non

vengono espressi e quindi la nostra cellula avrà livelli di espressione bassa, si può cercando di

risolvere questo problema mettendo vicino al nostro gene degli elementi di attivazione della

cromatina, oppure se il nostro transgene si inserisce all’interno di un gruppo di geni in una zona che

è importante per avere una crescita veloce delle cellule queste cellule avranno una crescita + lenta,

quindi per questo motivo una volta fatte le trasformazioni devono essere selezionate le linee

cellulari migliori, si parte selezionando le singole cellule cercando di coltivarle ottenendo linee

cellulari con alte performance. Una volta che si sono ottenute le linee cellulari di interesse in parte

devono essere conservate perché una linea cellulare con le caratteristiche volute deve essere

mantenuta anche perché poi quando si vuole cercare di produrre un farmaco quella linea di interesse

sarà quella che dovrà essere certificata, caratterizzata, se qualcuno la vuole utilizzare deve ricevere

esattamente quel materiale non un altro quindi si deve cercare di conservarle. Una volta che si è

visto che la linea cellulare ha buone performance e che produce molto si può provare a passare dalla

scala di laboratorio a quella industriale, queste linee cellulari devono essere coltivate all’interno di

fermentatori, si utilizzano fermentatori simili a quelli usati per i batteri, non hanno richieste

particolare, poi in questo punto si entra nella fase che prende il nome complessivamente di down

street processing cioè riguarda il processamento delle linee cellulari per recuperare la proteina di

interesse, si può andare in 2 direzioni, direzioni a seconda che la linea cellulare sia stata modificata

o per secernere la proteina nei mezzi di coltura o per ottenerla al suo interno, nel caso che le linee

cellulari siano state trasformate per secernere nel mezzo di coltura la prima fase è molto + semplice

in quanto è sufficiente centrifugare per eliminare le cellule e recuperare il surnatante dal terreno di

coltura, nel secondo caso c’è un passaggio in più: quello ovviamente di omogeneizzazione perché

dobbiamo ottenere un lisato cellulare a cui deve seriore sempre un passaggio di centrifugazione di

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frazione tenendo conto che in questo caso devono essere + spinte che non nel caso in cui vogliamo

separare delle cellule intere dal surnatante, cellule intere tendono a precipitare a un certo G di

numero di G o numero di rotazioni per minuto per un certo periodo, frammenti di cellule

necessitano di centrifugazione + spinta per separarle, allo stesso modo la filtrazione, in questo modo

per rimuovere eventuali cellule che sono rimaste in sospensione dal surnatante dato che una cellula

ha certe dimensioni è necessaria una certa filtrazione, per cercare di rimuovere frammenti cellulari

in questo caso la filtrazione deve essere + spinta, in ogni caso al termine di questi passaggi noi

abbiamo un surnatante o un omogenato senza frammenti di cellule e su questo possiamo procedere

per purificare il prodotto di interesse, qui si parla di cromatografia, la cromatografia è una

possibilità, in genere tutti gli anticorpi vengono purificati per cromatografia di affinità, esistono

però anche altri sistemi che vedremo. Una volta ottenuto il prodotto di interesse si può provare a

cercare di produrre una proteina che deve però soddisfare certi requisiti, requisiti in termini di qlt,

devono essere effettuati controlli di qlt e così via; nel caso di linee cellulari quali sono i promotori +

utilizzati? I livelli di produzione dipendono anche dal costrutto cellulare, quello utilizzato

maggiormente è il 35S, anche se esistono tutta una serie di altri promotori sia costitutivi che

inducibili, tra i costitutivi viene utilizzato abbastanza anche il promotore delle ubiquitine, tra gli

indicibili esistono dei promotori per le amilasi, in generale cmq quello + usate è il 35S, dicevamo

che qui abbiamo 2 possibilità e ognuna delle 2 possibilità ha i suoi pro e i suoi contro, un vantaggio

della possibilità di esprimere la proteina nel mezzo di coltura è che ci facilita la purificazione,

questo sistema ha anche lo svantaggio che in genere la stessa proteina quindi utilizzando stessa

linea cellulare e stessa proteina se viene trasformata o per secernere o per ritenere la proteina al suo

interno per esempio nel reticolo endoplasmatico si ha che nel caso che le cellule sono trasformate

per ritenere la proteina al loro interno si raggiungono livelli produttivi anche 100 volte superiori

rispetto alla trasformazione con secrezione nel mezzo di coltura, questo di preciso non si sa per

quale motivo, è stato visto che nel mezzo di coltura si ha una degradazione della proteina anche se

non si capisce che cosa determini questa degradazione, comunque in questo caso la proteina è molto

+ diluita e quindi questo fa si che per ottenere lo stesso in questo primo caso bisogna partire da

volumi molto grandi per ottenere un certo livello di proteina, hanno visto che la proteina viene

degradata poi è chiaro che dipende molto anche dall’efficienza del sistema di secrezione di quella

linea cellulare. Nel caso in cui la proteina viene fatta secernere nel reticolo endoplasmatico si

raggiungono livelli produttivi anche 100 volte superiori però in questo caso ci può essere

degradazione della proteina infatti hanno visto che aggiungendo il PVP (polivinilpirovidone) o il

dimetil sulfossido o l’ ABSA al surnatante diminuivano questi livelli di degradazione ottenendo un

recupero di proteina maggiore però dicevamo che dipende anche dal sistema di secrezione della

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cellula perché se il sistema di secrezione è molto buono la cellula produce e secerne tutto, se si tiene

dentro un po’ di proteina dal momento che noi centrifughiamo per allontanare le cellule un po’ di

proteina noi la perdiamo. Attualmente un altro limite di queste cellule che è abbastanza

condivisibile con l’utilizzo delle piante, è che abbiamo dei livelli di produzione abbastanza bassi,

abbiamo visto che per rendere il tutto appetibile per una produzione industriale la proteina dovrebbe

essere prodotta almeno in qnt circa l’1% delle proteina solubili, in questo caso a volte siamo ancora

sotto l’1% e difficilmente si supera un 4/5% del totale delle proteine solubili, quindi si deve cercare

di incrementare i livelli produttivi. Poi un altro limite di questi sistemi che è però anche un limite

presente per le piante è che manca una regolamentazione effettiva per la produzione a livello

industriale per la successiva commercializzazione.

Come avevamo visto per le cellule di mammifero anche in questo caso miglioramenti a livelli

produttivi non vengono soltanto da una sempre migliore conoscenza genetica della linea cellulare,

ma sono importanti anche sia le modifiche tecnologiche quindi dei sistemi di produzione, ma anche

dei terreni di coltura, ad esempio in questo caso modifiche per migliorare il terreno di coltura,

dicevamo l’aggiunta di ABSA hanno determinato un incremento dell’accumulo della proteina

prodotta di 35 volte, in questo caso con ABSA e NaCl si è avuto un incremento della produzione

del 100% utilizzando ABSA e 50% utilizzando NaCl, quindi non si deve tenere in considerazione

solo la genetica delle cellule, ma come si può modificare sia il terreno di coltura e anche per

esempio i fermentatori, in questo caso in questo sistema di produzione si sono ottenuti

concentrazioni costante del raccolto, oppure si sono ottenuti incrementi dei livelli di produttività,

quindi utilizzando linee cellulari è complesso che richiede + approcci per cercare di aumentare i

livelli di produzione e non si deve tenere in considerazione solo gli aspetti genetici, ma anche gli

aspetti tecnologici sono importanti, avevamo visto che le linee cellulari di mammifero con utilizzo

di terreni di coltura particolari si è riusciti a passare dalla coltivazione delle cellule adese alle pareti

del fermentatore alla coltivazione in sospensione, l’utilizzo della coltivazione in sospensione

risultano essere migliori rispetto a se le cellule tendono ad aderire alle pareti del fermentatore in

quanto si determinano livelli di produzione maggiori perché le cellule possono crescere di + quindi

mi danno una massa produttiva maggiore. Qui c’è un confronto fra alcuni dei sistemi di espressione

che abbiamo visto: si parla di piante transgeniche, virus vegetali, lieviti, batteri, cellule di coltura di

mammifero e animali transgenici: costo e immagazzinamento: le piante sono relativamente poco

costose e la conservazione del prodotto può avvenire a T ambiente nel caso in cui decidiamo di

trasformare il seme, per trasformare una pianta perché produca la proteina nel seme, in quanto il

seme è una struttura metabolicamente inerte visto la bassa concentrazione d’acqua, di umidità

relativa, quindi la proteina può mantenersi anche a T ambiente per un periodo di tempo abbastanza

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lungo, tutti gli altri sistemi indipendentemente dal fatto che siano siatemi di produzione in se poco

costosi però necessitano di particolari condizione di conservazione, nel caso dei virus a –20, lieviti e

batteri a –20, linee cellulari di mammifero in azoto liquido, animali transgenici si possono

conservare anche loro a T ambiente però risulta essere + costoso, gli animali necessitano dio una

cura, le piante una volta che le abbiamo seminate è sufficiente un po’ d’acqua e la luce del sole, gli

animali necessitano delle cure e poi per gli animali non è possibile questa conservazione del seme a

T ambiente, gli animali nella maggior parte dei casi si fa produrre loro nel latte, quindi l’animale

produce a ciclo continuo e la proteina una volta secreta nel latte deve essere immediatamente

lavorata perché non ha la stressa stabilità come può avere nel seme, poi avevamo visto sempre uno

svantaggio degli animali transgenici è che dal momento in cui la richiesta di mercato non è + la

stessa cosa faccio con questi animali? Se li teniamo in vista di un aumento della proteina comunque

questi animali consumano e non producono, oppure la produzione di proteina non mi serve,

possiamo decidere di macellarli però se li macelliamo nel momento in cui avrò un aumento di

richiesta per ottenere gli stessi livelli produttivi passa del tempo, invece con le piante non abbiamo

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