Biotecnologie agro-mediche - Appunti

Biotecnologie agro-mediche

Introduzione e applicazioni

Prof. Busconi M. Si tratta di una applicazione innovativa, è una delle ultime applicazioni delle biotecnologie, in questo settore specifico il miglioramento riguarda la modificazione genetica delle piante per la produzione delle molecole ad elevato valore terapeutico, quindi per la produzione di farmaci. Il corso si basa soprattutto sulla trasformazione delle piante, però anche qualche accenno per gli altri sistemi di espressione eterologhi che sono stati utilizzati nel corso degli anni per la produzione di terapeutici. Vedremo sistemi di produzione batterici e sistemi di espressione eucaristici, in particolare si parlerà dei lieviti e funghi filamentosi, colture di cellule di mammifero per poi passare alle piante, qualche accenno agli animali geneticamente modificati perché anche gli animali sono stati modificati geneticamente per produrre terapeutici.

Molecolar farming

Si parla di molecolar farming, in genere molecolar farming non è settorialmente riferito alla produzione di farmaci, ma si intende la produzione su scala industriale di proteine con un elevato valore economico. Questa produzione avviene in sistemi di espressione eterologhi quindi non viene ristretta la definizione nel tipo di molecola prodotta, si dice soltanto che deve avere un elevato valore commerciale e non viene posta una restrizione al tipo di sistema di espressione eterologo che possono essere batteri, piante o animali. In genere come terminologia, se si considera la produzione di farmaci, si parla di medica molecolar farming, però è una precisazione.

Produzione di insulina

Quindi già la produzione di insulina in cellule batteriche è considerato come molecolar farming. L’insulina è stato il primo farmaco ricombinante per terapia umana ad essere prodotto (1982) in coltura di cellula batteriche. L’insulina è un ormone proteico che viene sintetizzato nelle cellule beta di Langerhans del pancreas e serve per la terapia del diabete. Fino al 1982, come veniva ottenuta l’insulina utilizzata per le terapie? Essenzialmente veniva recuperata dai pancreas di bovini e suini.

Problemi della produzione tradizionale

Questo che conseguenze aveva? Intanto la proteina disponibile, l’ormone era poco e quindi i prezzi erano alti. Inoltre la purificazione della proteina doveva essere fatta benissimo perché altrimenti poteva esserci il rischio di una zoonosi, trasmissione di patologia dal bovino, dal suino all’uomo. Per ultimo, il fatto che comunque veniva usata un'insulina che non era umana per terapia in uomo: e questo che conseguenze aveva? Conseguenze che l’insulina bovina, o comunque insulina animale, poteva essere rifiutata dall’organismo, l’organismo poteva riconoscerla come estranea e non accettarla, quindi la terapia non funzionava. Ci poteva essere il problema di reazioni allergiche, inoltre anche quando funzionava, il funzionamento di insulina animale nel nostro organismo non era mai ottimale.

Vantaggi della produzione ricombinante

Tutto questo è cambiato nei primi anni ‘80 con la produzione dell’insulina in Coli. Che vantaggi aveva la produzione di insulina umana in battere? Ovviamente perché l’insulina è stata anche il primo farmaco ad essere prodotto con questa tecnologia ricombinante? Perché è comunque una proteina semplice, è breve come sequenza amminoacidica, quindi per le conoscenze dei primi anni ‘80 era già molto, e necessita di poche modificazioni post tradizionali.

Caratteristiche dell'insulina ricombinante

Molte delle proteine eucaristiche per il corretto funzionamento necessitano di una serie di modificazioni post tradizionali. Se guardiamo l’insulina, questa è la catena prodotta all’inizio della sintesi proteica e sono 86 aa quindi una catena breve, e viene prodotta come proinsulina e in questa forma la proteina è inattiva. Per essere attivata è necessario della rimozione della porzione amino terminale e due tagli proteolitici. Una certa porzione viene eliminata quindi rimangono due catene tra le quali si formano tre ponti di solfuro per poi arrivare alla forma attiva con la catena A e la catena B legate da due ponti di solfuro e un ponte di solfuro all’interno della catena A. I ponti di solfuro avvengono sempre tra residui amminoacidici della cisteina. Quindi per questo motivo l’insulina aveva delle proprietà che la rendevano idonea a questa sperimentazione: corta catena amminoacidica e poche modificazioni post tradizionali.

Limitazioni dei sistemi batterici

La proteina è stata prodotta in cellule batteriche. Ovviamente quale è una limitazione della produzione, cioè che problema aveva la proteina prodotta in cellula batteriche? I batteri non effettuano la maggior parte delle modificazioni post tradizionali che sono necessarie affinché una proteina eucaristica funzioni, in particolare le glicosilazioni e la formazione di ponti di solfuro che i batteri non sono in grado di fare. Quindi anche una proteina semplice come l’insulina prodotta in battere deve poi essere processata in vitro per avere funzionalità.

Processamento in vitro

Il battere vi può produrre o la proinsulina intera che poi però deve essere elaborata in vitro altrimenti si può ottenere due linee batteriche: la prima produce la catena A e la seconda la catena B e queste devono essere messe insieme e processate in vitro. Questo è un limite dei sistemi batterici.

Vantaggi dell'insulina umana ricombinante

Comunque che caratteristiche aveva l’insulina umana prodotta in battere rispetto a quella prelevata dagli animali? Poteva essere disponibile in quantità molto maggiori, l’insulina prodotta è insulina umana, quindi non è insulina simile a quella umana, è proprio insulina umana fatta produrre al batterio. Essendo presenti in quantità molto maggiori e necessitando di purificazioni meno spinte rispetto a quelle estratte dagli animali, poteva essere messa sul mercato a costi molto minori, venivano eliminati i rischi di zoonosi in quanto non si partiva più dall’organismo animale. Essendo insulina umana era perfettamente riconosciuta dall’organismo quindi non portava a reazioni allergiche e la terapia funzionava meglio perché la proteina era quella umana quindi esattamente la stessa funzionalità della proteina nativa.

Purificazione e costi

Ovviamente, dopo purificazione del battere, deve essere processata in vitro. Sul costo complessivo della terapia, ovviamente il fatto che era disponibile in grandi quantità significava che più persone potevano accedere alla terapia e questo determinava un netto miglioramento nella qualità di vita del paziente stesso. Ovviamente, la proteina attiva prodotta doveva essere purificata, processata in vitro, sul costo della terapia la fase di purificazione e processamento da battere per l’insulina pesa su circa il 70/75% del costo finale del prodotto.

Sistemi di espressione alternativi

Quindi la possibilità di ottenere un sistema di espressione che mi possa ridurre i costi di processamento e la purificazione determinerebbe una ulteriore riduzione dei costi. Quindi questa è la storia del primo farmaco ricombinante prodotto, da quel momento più tentativi sono stati fatti con diversi sistemi di espressione. Abbiamo parlato di batteri, poi parleremo di colture di cellule di mammifero, utilizzate anche cellule di insetto, piante, anche a livello delle piante si è cercato di vedere le potenzialità sia di piante intere che come colture di cellule e sia nelle piante superiori che anche nelle alghe. In genere come deve essere scelto il sistema di espressione?

Caratteristiche di un sistema di espressione ideale

Quali sono le caratteristiche che deve avere un sistema di espressione ideale? È quello che fornisce la maggior quantità di proteina di alta qualità, ad alta sicurezza e funzionalità con i costi minori possibili. Quindi la scelta del sistema di espressione deve tener conto di una serie di parametri. Essenzialmente il costo complessivo delle operazioni, di tutte le operazioni dalla disponibilità della sequenza genica al prodotto pronto per essere immesso sul mercato. Vedremo poi più avanti quali possono essere i costi di tutta questa serie di operazioni, molti milioni di dollari comunque.

Qualità del prodotto finale

Si deve tener conto della qualità del prodotto finale e vengono considerate in questa voce anche tutte le modificazioni post tradizionali a carico del prodotti finale. Dicevamo nel momento in cui vogliamo fare produrre un terapeutico utilizzabile per una terapia in uomo non dobbiamo commettere degli sbagli. La proteina prodotta deve essere perfettamente funzionale, la perfetta funzionalità della proteina quindi che non abbia reazioni di tipo allergico, che non abbia azioni diversa da quella per cui noi la vogliamo utilizzare, che abbia una certa durata nel circolo sanguigno, sono molto influenzate dalle modificazioni post tradizionale, essenzialmente glicosilazione e ponti di solfuro.

Importanza del tempo di produzione

È importante il tempo necessario per arrivare dal gene al prodotto finito. Ovviamente non è che più tempo sia richiesto per arrivare al prodotto finito e automaticamente anche il costo delle operazioni aumenta. Può essere a volte che sistemi più brevi risultano essere più costosi che sistemi che abbiano tempi più lunghi. Comunque è importante anche il tempo perché, ad esempio, sono iniziati dei progetti per la produzione di anticorpi monoclonali per le terapie tumorali costruite specificamente sulla persona senza tutti i problemi di incompatibilità che possono esserci.

Terapie personalizzate e velocità di produzione

Ovviamente quanto trattiamo con persone affette con patologie terminali come può essere un tumore, non abbiamo tutto il tempo per poter costruire una pianta GM che produca il tuo anticorpo che puoi usare per la tua terapia. In un paio d'anni, questa persona può essere morta. Il tempo richiesto deve essere il più breve possibile, allora per questo non si utilizza tanto la trasformazione stabile delle piante, ma quella transiente, cioè utilizzando dei vettori virali si riescono ad ottenere in tempi molto più brevi livelli di proteine utilizzabili per questo tipo di terapia, di applicazione quindi tempi compatibili con l'aspettativa di vita del paziente.

Accettazione e costi dei sistemi di espressione

Ovviamente altre voci che non bisogna sottovalutare: l’intermediario necessario affinché il sistema di espressione che voi proponete per la produzione di un certo farmaco venga accettato e da questo punto di vista le piante risultano essere svantaggiate rispetto agli altri sistemi. Volendo vedere anche se la manipolazione dell’animale ha comunque più implicazioni di tipo etico che non la trasformazione vegetale, però sono anche più accettate in quanto il transgene nell’animale non incute gli stessi timori di diffusione nell’ambiente che può avere il transgene nelle piante.

Royalties e accessibilità economica

E poi si devono considerare le royalties che possono essere associate alla produzione di una proteina ricombinante in un dato ospite. Molto spesso molti sistemi di espressione sono stati brevettati, quindi sono coperti da royalties e questo grava molto sul prezzo finale del prodotto. Per esempio, per le terapie in paesi poveri, molto spesso questi prodotti non possono essere distribuiti a tutta la popolazione che potrebbe averne bisogno per costi eccessivi legati alle royalties. Poco fa hanno annunciato la produzione del primo farmaco contro la malaria libero da brevetto, questo potrebbe essere un passo avanti per allargare a tutti la possibilità di poter accedere a una cura.

Vantaggi e svantaggi dei batteri come sistema di espressione

Quindi questi sono tutti fattori che devono essere presi in considerazione per la scelta del sistema di espressione. Stavamo parlando dei batteri, i batteri rappresentano il sistema di espressione eterologo classico. I batteri possiedono infatti una serie di vantaggi: è un sistema di espressione relativamente economico, essenzialmente nell’utilizzo dell’applicazione industriale di un sistema batterico i costi maggiori non sono tanto legati alla crescita e alla coltivazione del batterio in sé quanto la strumentazione necessaria, quindi fermentatori, laboratori necessari per la lavorazione, personale con adeguata preparazione.

Vantaggi pratici e limiti dei batteri

Di per sé la manipolazione genetica del batterio fino ad arrivare per fare esprimere una certa proteina, così come anche un allargamento della coltivazione del batterio a quella industriale, è comunque un processo relativamente poco costoso. I batteri possono essere manipolati geneticamente con facilità, la genetica di molti batteri è completamente nota, di Coli si usa praticamente tutti. Inoltre, sono in grado di crescere ad alta densità di cellule cioè all’interno del fermentatore il passaggio da una produzione in laboratorio a una produzione industriale può avvenire tranquillamente senza costi eccessivi e permette la produzione di grandi quantità di proteine.

Esigenze nutritive e crescita dei batteri

Un altro fattore che incide sui bassi costi è che comunque i batteri non hanno particolari esigenze nutritive dei terreni di crescita, sono capaci di crescere anche su terreni poco costosi, fonti di carbonio molto semplici a differenza delle cellule animali in cui il terreno di crescita è molto più costoso perché più lavorato. Un altro vantaggio molto importante dei batteri è che sono in grado di crescere ad un’alta densità di cellule, arrivano ad occupare anche il 30% del volume del fermentatore, invece le cellule eucaristiche in generale attualmente non superano il 4/5% del volume totale e questa crescita è molto rapida che permette di ottenere un rapido accumulo di biomassa quindi una elevata produzione di proteine.

Problemi dei batteri come sistema di espressione

Quindi questi aspetti potrebbero rendere i batteri un sistema di espressione ideale, problema è che i batteri hanno anche delle limitazioni che sono da tenere in considerazione: i batteri non sono in grado di effettuare le modificazioni post tradizionali che sono richieste per il funzionamento della proteina, una proteina deve fondarsi, ripiegarsi strutturalmente per avere una certa funzione e a volte non è sufficiente questo, a volte le proteine devono associarsi da loro e dare complessi multi subunità, i batteri non sono in grado di farlo con le proteine eterologhe che noi vogliamo farli esprimere.

Limitazioni nella produzione di proteine complesse

Quindi già solo l’insulina che è una proteina semplice che richiede poche modificazioni unicamente due tagli proteolitici e tre ponti di solfuro, quindi non necessita di glicosilazioni varie, i batteri non sono in grado di darcela già elaborata. Da questo punto di vista, quindi, bisogna tener conto di come i batteri possono essere utilizzati. La convenienza nell’utilizzo dei batteri è soprattutto per quelle proteine o non necessitano di eccessive modificazioni post tradizionali per cui il processamento in vitro può avvenire senza costi particolarmente elevati, oppure per quelle proteine che non necessitano affatto di modificazioni tradizionali e in genere sono poche.

Rischi ed effetti collaterali

Poi non sempre i batteri utilizzati sono degli organismi GRAS cioè generalmente riconosciuti come sicuri, soltanto Coli che è uno di quelli più utilizzati non è assolutamente un GRAS, Coli è anche un patogeno per l’uomo, esistono dei ceppi di Coli che sono letali per l’uomo. Problema che Coli con il suo metabolismo è in grado di produrre delle tossine che devono essere accuratamente rimosse perché non dobbiamo correre il rischio che insieme al farmaco introduciamo anche la tossina, ovviamente una purificazione elevata determina un incremento dei costi di produzione.

Complessità della produzione batterica

Un altro problema è che non solo non sono in grado di modificarla, ma se la mia proteina con un anticorpo necessita di avere quattro subunità proteiche legate insieme tra di loro i batteri non sono in grado di farlo, i batteri possono sintetizzare le quattro catene separatamente e poi me le devo assemblare io. Inoltre si può avere la formazione di corpi di inclusione che sono degli aggregati di proteine caratterizzate da un folding non corretto e quindi possono essere o proteine non folded o proteine folded male che interagiscono tra di loro mediante superfici reattive che in genere sono regioni ricche di aa idrofobici che tendono ad interagire tra di loro e formano questi aggregati cellulari.

Formazione di corpi di inclusione

Aggregati proteici che tendono a precipitare, il corpo di inclusione a volte è anche cercato quando ad esempio la proteina prodotta è tossica per il batterio. Se la proteina prodotta è tossica per il batterio, il fatto che questa possa aggregarsi in corpi di inclusione quindi non si foldi completamente riduce l’effetto tossico sul batterio stesso. Inoltre, può essere cercato anche per proteine che non necessitano di eccessive modificazioni post tradizionali in quanto il corpo di inclusione ha una composizione per circa il 90/95% della vostra proteina quindi comunque è caratterizzato da una elevata quantità di proteina quindi molto pura. Quindi a volte la formazione del corpo di inclusione può essere voluta.

Modifiche batteriche per uso terapeutico

Tutti questi sono problemi che si devono tenere in considerazione quando si utilizzano i sistemi batterici, alcuni tentativi di modificare i batteri per riuscire a produrre terapeutici utilizzabili per l’uomo sono stati fatti. In generale, queste modificazioni possono riguardare o il meccanismo che guida il folding delle proteine, quindi incrementare la possibilità che quella proteina prodotta possa essere folded correttamente, quindi per ridurre la formazione di corpi di inclusione quando questa non è voluta, o si può agire sulla proteolisi, si è cercato di vedere se si potevano ottenere dei batteri modificati che potessero una delle modificazioni post tradizionali che a noi servivano, il tutto per cercare di utilizzare i batteri anche in campo umano.