Biotecnlogie molecolari

Amplificazione del DNA

Sintesi chimica del DNA: La capacità di sintetizzare economicamente e velocemente piccole porzioni di DNA ha avuto un impatto incredibile sulle metodologie connesse con le tecniche del DNA ricombinante. Noi sappiamo che la DNA polimerasi è un enzima fondamentale per effettuare copie di DNA. Per effettuare la sintesi chimica di DNA ci avvaliamo di una sequenza di opportuni "inneschi", primer, detti costituiti da brevi sequenze di DNA (chiamate oligonucleotidi, costituiti da circa 50 nucleotidi) complementari alle estremità 5' e 3' dei due filamenti del segmento da riprodurre. Gli oligonucleotidi sono sintetizzati chimicamente e possono servire ad assemblare geni interi o frammenti genici, ad amplificare frammenti di DNA tramite la tecnica della PCR oppure a introdurre mutazioni specifiche entro DNA isolati. Tuttavia possono essere utili anche come sonde di DNA (per vedere il legame dell'oligonucleotide ad una colonia tramite...

Un nucleotide alla volta, sempre rispettando la regola della complementarietà delle basi, il nuovo filamento si allunga fino a quando sono aggiunti nucleotidi normali. Tuttavia, quando viene inserito un nucleotide modificato, la sintesi si arresta. La mancanza del gruppo ossidrile impedisce infatti la formazione di un legame con il nucleotide successivo e provoca il distacco della DNA polimerasi.

Il risultato di questa fase è la formazione di un frammento di DNA a doppio filamento che ha l'ultimo nucleotide marcato. L'interruzione della sintesi è l'elemento cruciale del metodo di Sanger, che per questo motivo è chiamato metodo di terminazione di catena.

L'inserimento di un nucleotide modificato è dovuto al caso, quindi la lunghezza del filamento sintetizzato risulta casuale. Grazie alle copie prodotte con la PCR, avremo filamenti di tutte le lunghezze possibili, che possono essere composti da poche basi o essere lunghi quanto l'intera porzione di DNA.

DNA da sequenziare. Nella fase successiva si denatura nuovamente il DNA. I singoli filamenti vengono quindi sottoposti ad elettroforesi capillare. Con questa tecnica la miscela è inserita in un capillare a cui è applicato un campo elettrico i frammenti di DNA. Grazie alle loro cariche negative cominciano a migrare verso il polo positivo. I più corti migrano più velocemente quindi possiamo confrontare la lunghezza dei frammenti in base alla loro velocità. Al termine della corsa elettroforetica un laser eccita i marcatori fluorescenti legate ai nucleotidi modificati e un rivelatore registra il tipo di luce emessa. Abbiamo così tutti gli elementi per ricostruire la sequenza, a ciascuno dei quattro colori corrisponde una diversa base azotata. La sequenza così ottenuta è complementare alla sequenza che si voleva conoscere. Lo stesso procedimento può essere usato per ottenere la sequenza di un intero genoma. Per far ciò il genoma

è prima frammentato e il sequenziamento eseguito su singoli frammenti. I risultati sono elaborati da un software che trova i punti di sovrapposizione e ricostruisce la sequenza completa. Anche in questo caso la sequenza che si ottiene è complementare alla sequenza ricercata. In questo modo gli scienziati sono riusciti a sequenziare il genoma umano oltre a quello di molti altri organismi. Nel corso degli anni sono stati messi a punto nuovi metodi di sequenziamento più veloci ed economici, molti dei quali però si basano ancora sul metodo inventato da Sanger.

Fasi della PCR:

È un procedimento efficace per produrre in vitro grandi quantità di una determinata sequenza di DNA. Questo processo di amplificazione del DNA avviene in 3 fasi:

• Denaturazione: avviene per riscaldamento in provetta per uno o più minuti a 94-96°C per separare il DNA nei suoi due filamenti. La provetta conterrà, oltre al DNA di partenza, anche una DNA polimerasi.

termostabile come ad esempio la DNA Taq polimerasi, isolata dal batterio Thermus aquaticus e i quattro deossiribonucleotidi.

• Anealing: Abbassamento della temperatura per uno o più minuti a temperatura uguale o inferiore a 72°C per permettere l'appaiamento dei primers al DNA.
• Estensione: Innalzamento della temperatura per uno o più minuti a 72°C durante i quali la DNA polimerasi si lega al DNA in corrispondenza dei primers e sintetizza il filamento corrispondente all'estremità ossidrilica in posizione 3' di ciascun primer.

Applicazioni PCR:

• Medicina: diagnostica molecolare (quantità minime di DNA templato)
• Ingegneria genetica: Produzione di grande quantità di DNA da poche copie, Mutagenesi
• Paleontologia: studio di esseri viventi estinti
• Investigazioni: rilevazione presenza/assenza di DNA di soggetti sottoposti ad investigazioni.
• Test Prenatali E Di Paternità

4. MANIPOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE NEI

• Forza di legame per il ribosoma
• Numero di copie del gene clonato
• Localizzazione cellulare della proteina
• Rendimento della traduzione della cellula
• Stabilità proteina

lac produce gli enzimi necessari per l'utilizzazione del lattosio da parte del batterio E. coli: tali enzimi vengono codificati da tre geni strutturali adiacenti: LacZ, LacY e LacA. Più semplicemente, E. coli può utilizzare come fonte di carbonio sia il glucosio che il lattosio. Tuttavia, lo zucchero più adatto al suo metabolismo è il glucosio, tanto che se il batterio cresce in un substrato che presenta entrambi gli zuccheri, utilizza dapprima unicamente il glucosio, e solo successivamente il lattosio. Tuttavia, se il batterio si trova a crescere in un ambiente in cui è presente unicamente il lattosio, immediatamente sintetizza gli enzimi necessari per metabolizzarlo. Il batterio possiede quindi un meccanismo di controllo che consente l'espressione di alcuni geni solo quando ne avverte il bisogno, e impedisce la produzione di enzimi e proteine non strettamente necessarie.

Rendimento della traduzione della cellula:

Nelle

cellule ospite le proteine possono esprimersi a bassi livelli. Ciò può derivare:

1. Dalla degradazione della proteina
2. Solubilità della proteina

Per questo motivo si fa ricorso alle cosiddette proteine di fusione.

Proteine di fusione:

Uno dei modi di risolvere il problema di degradazione della proteina consiste nell'utilizzo di proteine di fusione. Questo si basa sull'unione covalente tra il prodotto del gene clonato a una proteina stabile dell'ospite per migliorarne la stabilità. Le proteine di fusione effettuano quindi una saldatura tra la proteina di interesse presente nella cellula ospite e una proteina che utilizzo per aumentare la stabilità e la funzione della proteina di interesse. Lo scopo è di proteggere il prodotto del gene clonato dalle proteasi della cellula ospite. Le proteasi (come la trombina) in generale tagliano le proteine in corrispondenza di sequenze specifiche. Esse possono essere utilizzate anche per tagliare.

Le stesse proteine di fusione dalla proteina di interesse dopo il processo di purificazione, quindi nella fase finale.

Estrazione e purificazione della proteina ricombinante:

La sintesi della proteina è immediatamente evidente. La nostra YFP (Yellow fluorescent protein) ha infatti un colore giallo brillante che diventa evidente quando è illuminata con luce ultravioletta; i batteri che la producono, quindi, assumeranno le stesse caratteristiche.

Purificazione:

La purificazione prevede, nella sua prima fase, l'estrazione della proteina mediante lisi dei batteri, favorita da una sequenza di congelamenti e scongelamenti. Eliminati i detriti per centrifugazione (organelli e membrane), la YFP (Yellow fluorescent protein) verrà a trovarsi nel sopranatante (frazione solubile) con una miriade di altre proteine batteriche dalle quali dovrà