Biotecnlogie molecolari

Biotecnologie molecolari

Introduzione

Cosa intendiamo per “biotecnologie molecolari”? È l’applicazione dei principi scientifici e dell’ingegneria al trattamento dei materiali mediante agenti biologici, al fine di ricavare merci o servizi.

• Diagnosi di patologie
• Aumento quantità/qualità colture (piante resistenti allo stress ambientale o microbico)
• Sviluppo di sostanze chimiche, antibiotici, aminoacidi, enzimi commercialmente rilevanti
• Biocorrezione (eliminazione materiali inquinanti o di rifiuto)

Procarioti ed eucarioti

Gli organismi viventi si dividono in questi due gruppi fondamentali. La principale differenza tra questi due gruppi è rappresentata:

• Dalla assenza/presenza di un nucleo delimitato da una membrana nucleare
• Dalla composizione della parete cellulare
• Dalla presenza di organelli intracellulari (mitocondri, lisosomi, cloroplasti, vescicole di Golgi)

Infatti, nei procarioti, a differenza degli eucarioti, il DNA cromosomiale si trova a diretto contatto con la membrana cellulare. Inoltre, la parete cellulare è rigida e contiene peptidoglicano ma mai chitina o cellulosa e, come detto in precedenza, sono sprovvisti di organuli intracellulari.

Gram positivi e gram negativi

Si dividono in Gram positivi o negativi in base a come si colorano in seguito a un test di laboratorio noto come colorazione di gram. La differenza nella capacità di trattenere il colorante basico è data dalla quantità di peptidoglicano contenuto nella parete cellulare: i Gram-positivi presentano aminozuccheri, ai quali sono legate corte catene di aminoacidi; i Gram-negativi presentano invece una parete più sottile, ricca di lipopolisaccaridi e lipoproteine.

Tecnologia del DNA ricombinante

Termine generico che descrive i protocolli sperimentali che portano al trasferimento di informazione genica da un organismo ad un altro.

Si eseguono generalmente i seguenti passaggi:

1. Si estrae il DNA dall’organismo donatore, lo si taglia (lo si digerisce) enzimaticamente e lo si unisce con un’altra molecola di DNA chiamata vettore di clonazione formando così una nuova molecola di DNA ricombinato chiamata costrutto di DNA.
2. Questo costrutto viene quindi trasferito all’interno di una cellula ospite e questa operazione viene chiamata trasformazione.
3. A questo punto si identificano e si selezionano (quindi si separano, isolano) le cellule ospiti che hanno assunto il costrutto di DNA (cellule trasformate) da quelle che non lo hanno assunto.

Le endonucleasi di restrizione

Ai fini della clonazione molecolare è necessario tagliare ripetutamente in frammenti distinti sia il DNA di partenza, che contiene la sequenza bersaglio, sia il vettore di clonazione. Questo avviene per mezzo di particolari enzimi chiamati endonucleasi di tipo II. Una delle prime è stata quella del batterio EcoRI.

Questo enzima si lega a una regione del DNA contenente una specifica sequenza palindromica e scinde in modo specifico il legame internucleotidico tra l’ossigeno (presente nel ossidrile) del carbonio 3’ dello zucchero di un nucleotide e il gruppo fosfato legato al carbonio 5’ dello zucchero appartenente al nucleotide adiacente.

Oltre a EcoRI, sono state isolate centinaia di endonucleasi di restrizione di tipo II da vari ceppi batterici come l’HpaII isolata dall’Haemophilus parainfluenzae. Le sequenze palindromiche in corrispondenza delle quali la maggior parte delle endonucleasi di tipo II si legano e tagliano la molecola di DNA si chiamano siti di riconoscimento. Ognuno di questi enzimi sarà quindi in grado di tagliare un diverso sito di riconoscimento. Alcuni però scinderanno il DNA lasciando prolungamenti fosfato 5’ oppure prolungamenti ossidrili 3’ oppure lasceranno prolungamenti di entrambi. Il sito di riconoscimento può essere lungo quattro, cinque, sei, otto o più coppie di nucleotidi. Ogni enzima di restrizione sarà in grado di scindere il DNA in un sito di riconoscimento di lunghezza diversa. Per la maggior parte dei protocolli comuni di clonazione si utilizzano endonucleasi di restrizione che tagliano entro siti di quattro e di sei coppie di nucleotidi.

Mappe di restrizione

Trattando di volta in volta la molecola di DNA con singole endonucleasi di restrizione differenti è possibile realizzare mappe fisiche che designano l’ordine lineare dei siti delle endonucleasi di restrizione presenti in quel determinato segmento di DNA. La posizione dei siti di taglio si può ricavare dall’analisi della dimensione dei frammenti, che si determina mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Elettroforesi su gel

È una tecnica di impiego per la separazione delle proteine e degli acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi, quindi si avrà una separazione in funzione della velocità. Per la separazione delle molecole di acidi nucleici si utilizza principalmente come matrice di gel l’agorosio. Esso è un polisaccaride ricavato dalle alghe marine. Un gel agarosio all’1% risolve catene duplex di DNA lunghe da 600 a 20.000 bp. Per quanto riguarda invece la separazione delle proteine, viene generalmente utilizzato come matrice di gel la poliacrilammide. In soluzione con la proteina si impiega sodio dodecilsolfato (SDS). L'SDS è un detergente anionico che si lega saldamente alle proteine (1 molecola di SDS ogni 2 residui amminoacidici) e ne provoca la denaturazione, di conseguenza l'elettroforesi avviene in condizioni non native.

La T4 ligasi

Da soli gli enzimi di restrizione non bastano per la clonazione molecolare. Infatti è necessario un mezzo per ricostituire il legame internucleotidico tra l’ossidrile 3’ e il gruppo fosfato 5’. Questo problema può essere risolto con l’ausilio dell’enzima DNA-ligasi. Esso è in grado di formare il legame fosfodiestere tra due estremità adesive ibridate.

I vettori di clonazione plasmidici

Molecole circolari di DNA capaci di autoreplicazione e mantenuti nei batteri come entità extracromosomiali. Come elementi genetici autoreplicanti e autonomi, i plasmidi possiedono gli attributi fondamentali che ne fanno potenziali vettori del DNA clonato. Quelli naturali (non modificati), tuttavia, mancano spesso di importanti caratteristiche necessarie per servire da vettori di clonazione di qualità elevata. Tali caratteristiche sono:

• Piccole dimensioni, necessarie per resa del trasferimento di DNA esogeno;
• Siti unici di restrizione nei quali possa essere clonato l’inserto di DNA;
• Marcatori per identificarne la presenza.

Tra questi vi sono ad esempio il pBR322 e il pUC19. Il primo fu uno dei vettori di clonazione plasmidici meglio studiati e più ampiamente utilizzati nel decennio 1980-1989. Tuttavia possedeva solo pochi siti specifici di clonazione e la sua utilizzazione esigeva laboriosi procedimenti di selezione. È stato perciò inevitabile l’utilizzo di nuovi sistemi tra cui appunto il pUC19. Tra i componenti più importanti che possiede vi è un gene per la resistenza all’ampicillina, un segmento regolabile del gene per la beta-galattosidasi chiamato lacZ’ e un gene lacI che produce una proteina repressore che regola l’espressione del gene lacZ’. La procedura avviene in questo modo. Quando si fanno crescere le cellule recanti pUC19 immodificato in presenza di isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG), il quale è in grado di competere con lacI e attivare i geni a valle di lacZ, il prodotto del gene lacI non è in grado di legarsi alla regione promotore-operatore del gene lacZ’, perciò quest’ultimo viene trascritto e tradotto.

Fosfatasi alcalina

Negli esperimenti di clonazione con pUC19, quindi, si taglia il DNA da un organismo di partenza con una delle endonucleasi di restrizione per le quali la sequenza di clonazione multipla contiene un sito di riconoscimento. Tale DNA viene mescolato con i plasmidi pUC19 inizialmente trattati con la stessa endonucleasi di restrizione e, in seguito, con la fosfatasi alcalina. Dopo la legatura per mezzo della T4 ligasi si introduce la miscela di reazione mediante trasformazione in una cellula ospite capace di sintetizzare quella parte della beta-galattosidasi che si combina con il prodotto del gene lacZ’ a formare l’enzima funzionante. A questo punto si effettua la piastratura delle cellule ospiti su un mezzo che contiene ampicillina. In presenza di ampicillina le cellule ospiti trasformate non saranno in grado di crescere, mentre quelle contenenti plasmidi possono invece crescere con l’ampicillina.

Creazione e screening di una genoteca (libreria)

Talvolta può essere necessario isolare i geni che codificano per proteine e/o funzioni. I geni eucariotici sono caratterizzati da esoni (regioni codificanti) e introni (regioni non codificanti). Pertanto le strategie di identificazione sono diverse se si lavora con geni eucariotici o procariotici. La suddivisione del DNA genomico in elementi clonabili e il loro inserimento in cellule ospiti si definisce creazione di una genoteca (libreria, banca di cloni, banca genica). Una genoteca completa comprende, per definizione, tutto il DNA genomico dell’organismo di partenza. Negli organismi procarioti si effettua una digestione parziale con enzimi di restrizione dell’intero DNA genomico ed in seguito si effettua la clonazione.

Screening mediante ibridazione con DNA

1. Da ciascuna colonia distinta formatasi dalla piastra madre, si trasferisce un campione su una matrice solida quale una membrana di nitrocellulosa o nylon.
2. Si lisano le cellule e si denatura il DNA liberato.
3. In condizioni adatte all’ibridazione si aggiunge alla matrice una sonda di DNA marcata.
4. Si identifica una colonia della piastra madre che corrisponda a una regione di risposta positiva sulla pellicola a raggi X. Si esegue la subcoltura delle cellule della colonia positiva proveniente dalla piastra madre, in quanto possono portare il desiderato costrutto plasmide-DNA clonato.

È possibile determinare la presenza di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione di DNA con l’ausilio di una sonda di DNA. L’ibridazione del DNA è fattibile in quanto si può trasformare il DNA a due filamenti in DNA in un solo filamento trattandolo a caldo. Questo riscaldamento scinde i legami idrogeno che congiungono le basi del DNA (denaturazione) ma non influisce sui legami fosfodiestere dell’ossatura. In seguito si effettua un raffreddamento lento chiamato annealing (reibridazione). I singoli filamenti di DNA si possono marcare in vari modi. Ad esempio vi è l’utilizzo del metodo dell’innesco (primer) che si basa sull’uso di una miscela di oligonucleotidi casuali sintetici contenente tutte le possibili combinazioni di sequenze di sei nucleotidi che fungono da innesco nella sintesi del DNA. Dopo aver mescolato il campione di oligomeri con il DNA, si aggiunge una porzione della DNA polimerasi I di E.coli detta frammento di Klenow.

Screening mediante saggio immunologico

1. Da ciascuna colonia distinta formatasi dalla piastra madre, si trasferisce un campione su una matrice solida quale una membrana di nitrocellulosa o nylon.
2. Si lisano le cellule sulla matrice, fissandone le proteine sulla matrice stessa.
3. Si tratta la matrice con un anticorpo primario che si fissa esclusivamente alla proteina bersaglio.
4. Si elimina per lavaggio l’anticorpo non legato e si tratta la matrice con un anticorpo secondario, capace di legarsi esclusivamente a quello primario.
5. Si elimina mediante lavaggio tutto l’anticorpo non fissato e si esegue una reazione cromatica che può avere luogo solamente se è presente l’anticorpo secondario.
6. Si identifica sulla piastra madre una colonia corrispondente a una risposta positiva della matrice. Si subcoltivano le cellule della colonia positiva della piastra madre, in quanto possono essere portatrici del costrutto plasmide-inserto di DNA che codifica la proteina che lega l’anticorpo primario.

Clonazione di sequenze di DNA che codificano per proteine eucariote

Richiede tecniche speciali. Gli organismi procariotici non sono in grado di allontanare gli introni dalle molecole di RNA trascritte e quindi nella cellula del batterio ospite l’mRNA non viene tradotto correttamente. Quindi prima di poter essere clonate in un vettore le molecole di mRNA devono essere trasformate in due filamenti di DNA e questo avviene per mezzo della trascrittasi inversa. Essa, prodotta da virus a RNA, si serve di un filamento di RNA come stampo e forma inizialmente un primo filamento di DNA, e in seguito, viene prodotto il secondo aggiungendo il frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E.coli.

Sintesi chimica, sequenziamento e amplificazione del DNA

Sintesi chimica del DNA

La capacità di sintetizzare economicamente e velocemente piccole porzioni di DNA ha avuto un impatto incredibile sulle metodologie connesse con le tecniche del DNA ricombinante. Noi sappiamo che la DNA polimerasi è un enzima fondamentale per effettuare copie di DNA. Per effettuare la sintesi chimica di DNA ci avvaliamo di una sequenza di opportuni "inneschi", primer, detti costituiti da brevi sequenze di DNA (chiamate oligonucleotidi, costituiti da circa 50 nucleotidi) complementari alle estremità 5' e 3' dei due filamenti del segmento da riprodurre. Gli oligonucleotidi sono sintetizzati chimicamente e possono servire ad assemblare geni interi o frammenti genici, ad amplificare frammenti di DNA tramite la tecnica della PCR oppure a introdurre mutazione specifiche entro DNA isolati. Tuttavia possono essere utili anche come sonde di DNA (per vedere il legame dell’oligonucleotide ad una colonia tramite colorazione) per l’ibridazione (ovvero appaiamento di coppie di basi azotate con il metodo di Watson e Crick), come mezzi per il sequenziamento o come elementi di collegamento (linker) per facilitare la clonazione di geni.

Sequenziamento del DNA

Il sequenziamento del DNA permette di conoscere l'esatta sequenza...