bionanotecnologie

Bionanotecnologie

Lezione 1

Inizialmente la nanoscala era vissuta come un concetto fantascientifico. Alla fine degli anni '50, Richard Feynman ipotizzò che alla nanoscala ci fossero molte possibilità di sviluppo di nuove tecnologie. La nanotecnologia non ha una definizione univoca:

• La nanotecnologia è la progettazione, caratterizzazione, produzione e applicazione di sistemi controllandone la forma e le dimensioni alla scala nanometrica (Royal Society & the Royal Academy of Engineering).
• Comprensione e controllo della materia a dimensioni comprese fra 1 e 100 nm, dove fenomeni unici possono permettere nuove applicazioni (National Nanotechnology Initiative).

L'ordine di grandezza di riferimento per le nanotecnologie è 10^-9 m. Una biomolecola come il DNA ha dimensioni intorno a 2 nm. In natura esistono nano-oggetti e ci sono organismi viventi che hanno già inventato la nanotecnologia: un esempio tipico è il geco, le cui zampe hanno una struttura macroscopica o mesoscopica. A livello micro, si possono intravedere un milione di piccole setole che costituiscono la zampa del geco. Osservate con microscopi elettronici, si nota che ogni setola ha delle punte di dimensioni atomiche in grado di sviluppare interazioni di Van Der Waals con la parete. La nanostrutturazione può sviluppare dispositivi con performance non riproducibili alla macroscala.

Anche le ragnatele sono materiali viscosi prodotti dalle ghiandole dei ragni. Oltre ai fili viscosi, ci sono anche fili non viscosi ma molto resistenti: sono fibre di dimensioni nanometriche con un carico di rottura confrontabile con quello dell'acciaio.

Le nanoscienze sono di fatto la conoscenza dei fenomeni alla nanoscala. Convergono varie discipline ed è una scienza supradisciplinare (fisica, chimica, scienza dei materiali, biologia molecolare, ecc.). L'applicazione di queste conoscenze per realizzare dispositivi sono le nanotecnologie, e i prodotti finali hanno caratteristiche molto diverse in quanto la materia a questa scala dimensionale ha dei comportamenti non tradizionali.

Le nanotecnologie si distinguono in due grandi famiglie:

1. Tecnologie di tipo top-down: riduzione delle dimensioni con metodi fisici per arrivare a livelli nanometrici.
2. Tecnologie di tipo bottom-up: partenza da piccoli componenti, molecole di cui controlliamo l'organizzazione e l'assemblaggio per realizzare delle nanostrutture. I materiali costituenti possono essere di tipo organico, inorganico o biologico.

Il raggio ionico focalizzato può essere accoppiato a un capillare ad alta temperatura che inietta vicino alla punta del raggio ionico una molecola metallorganica precursore del platino. Sono atomi di platino circondati da leganti organici che lo rendono più volatile. Quando questo platino i leganti organici si rompono e rimane l'atomo di platino che quindi si deposita nei punti dove ho condotto il raggio ionico, in questo modo lavoro in maniera additiva, posso costruire delle linee di platino o dei fili o anche una nano cella elettrochimica. Questa tecnologia si usa solo a scopo esemplificativo per introdurre il concetto top-down e bottom-up.

In natura si osserva l'effetto loto: capacità dei fiori di loto di autopulirsi, la foglia è nanostrutturata e quindi non bagnabile; quindi, la goccia di pioggia rotolando via lava la superficie della foglia. Questo concetto in natura viene poi traslato in tecnologie: sono state realizzate delle nanovernici che permettevano alle superfici di essere autopulenti, ci sono anche prodotti commerciali a base di nano-compositi. All'interno di una matrice polimerica si trova una seconda fase nanometrica: sono stati realizzati dei paraurti più leggeri ma due volte più resistenti dei paraurti tradizionali o delle palline da tennis in grado di rimbalzare di più. Infine, esistono dei rivestimenti antimicrobici, l'argento in fase cristallina è in grado di uccidere i batteri.

Le bionanotecnologie sono l'applicazione delle scienze della vita per realizzare tecnologie. Alla nanoscala ci possono essere diverse applicazioni: si possono usare i virus per realizzare dei cristalli liquidi, i virus hanno delle proteine sia nel guscio che nei flagelli esterni e si è scoperto che questi flagelli possono essere selezionati in base al colore in quanto alcuni sono più affini a legarsi con dei cristalli. I virus hanno anche la capacità di allinearsi in strutture ordinate quindi, se sono stati legati ai cristalli di semiconduttori, questi organizzeranno anche i cristalli in strutture ordinate. Utilizzo la capacità della materia vivente di organizzarsi in nanostrutture per realizzare dei dispositivi.

Un altro oggetto biologico che ha la capacità di organizzarsi è il DNA che è in grado di formare strutture complesse. Modificando chimicamente il DNA in modo che sia in grado di legare delle particelle d'oro, posso creare delle strutture ordinate di particelle d'oro sfruttando la capacità di autoassemblamento del DNA.

Un altro esempio di imitazione della natura è quello del muscolo molecolare: strutture sintetiche che di fatto imitavano il filamento di actina e miosina e la loro contrazione. Il movimento era ottenuto cambiando il potenziale redox e questi nano-oggetti possono essere dei nano-interruttori.

Un altro esempio di applicazione è la realizzazione di nanoparticelle per il rilascio controllato di farmaci: nanosfere in grado di contenere farmaci e di portarli in maniera selettiva verso dei comparti biologici specifici.

Lezione 2

Gli argomenti di questa lezione sono la micro e nano scala, i fenomeni peculiari di questa scala dimensionale e la scalabilità delle proprietà fisiche e l'applicazione di questi concetti al design di MEMS e BIOMEMS. Dal punto di vista dimensionale, gli organismi viventi hanno dimensioni che variano dai mm fino ai µm; la dimensione di una cellula è compresa fra 1 e 100 µm, i virus sono dei nano-oggetti e possono essere utilizzati come vettori di farmaco. Le biomolecole sono di dimensioni che variano fra le unità e le decine di nm, le proteine sono generalmente un po' più grandi. Se utilizziamo radiazioni fortemente energetiche, vediamo che queste hanno piccole lunghezze d'onda e quindi sono dimensionalmente le più adatte per interagire con le nano-molecole mentre al crescere delle lunghezze d'onda si va verso caratterizzazioni più di tipo macroscopico.

Materiali scalabili alla nanoscala: come abbiamo visto esistono delle tecniche per costruire delle nanostrutture, queste strutture hanno delle proprietà diverse anche a parità di materiale costituente rispetto ai materiali utilizzati alla scala più grande in quanto alcuni fenomeni fisici dipendono fortemente dalla scala dimensionale. I fenomeni fisici che dipendono dalla massa sono più rilevanti alla scala macroscopica in quanto la massa è funzione del volume che a sua volta è funzione della lunghezza alla terza potenza, quindi, graficando la dipendenza della massa dalla scala dimensionale, otteniamo una curva da cui si capisce che per valori di x piccoli il fenomeno diventa irrilevante.

Su questa base possiamo derivare la scalabilità di molti fenomeni fisici: il tempo avrà una dipendenza di ordine zero dalla scala dimensionale mentre la lunghezza avrà una dimensione del primo ordine, la forza gravitazionale ha una dipendenza di ordine cubico. Immaginiamo di avere due masse che saranno attratte da una forza F la cui legge dipende dal prodotto delle masse diviso per il quadrato della distanza. Supponiamo che tutte queste grandezze scalino in modo proporzionale e quindi diminuiscano tutte nella stessa maniera: andando a sostituire, si osserva che F ha una dipendenza alla quarta potenza rispetto alla scala dimensionale e quindi questa forza sarà preponderante alla macroscala e trascurabile alla nanoscala. Il rapporto superficie/volume invece dipende come 1/L e quindi in questo caso la dipendenza dalla lunghezza caratteristica diventa molto importante alla nanoscala.

Si osserva in natura che organismi più piccoli tendono a dissipare maggiormente il calore. Per mantenere la propria temperatura corporea infatti gli animali più piccoli hanno una maggiore velocità metabolica. Dal punto di vista tecnologico, è molto importante avere in certi casi un alto rapporto superficie/volume. Nanostrutturando una superficie, posso ottenere più posizioni su cui effettuare delle funzionalizzazioni: facendo crescere nanotubi di carbonio sulla superficie, aumenta la densità di molecole di leganti in quanto aumenta il rapporto superficie/volume.

Un altro parametro importante in questo contesto è la tensione superficiale: le molecole di un liquido hanno un certo grado di coesione le une con le altre che dipende dalle proprietà della sostanza. All'interno della massa di liquido, ogni molecola è in equilibrio in quanto circondata da altre molecole che esercitano delle forze attrattive su di essa in tutte le direzioni. Questa condizione di equilibrio non vale per le molecole che si trovano all'interfaccia aria/liquido e quindi le molecole in superficie si trovano in una situazione di non equilibrio e questa energia può essere quantificata con una tensione, la tensione superficiale che ha una dipendenza del primo ordine dalla lunghezza caratteristica.

Il tempo di diffusione è il tempo impiegato da un sistema composto da due diverse zone inizialmente a concentrazioni differenti per raggiungere l'equilibrio. Il tempo di diffusione dipende dalla legge di Fick, da cui si calcola che la dipendenza dalla lunghezza è quadratica; i tempi di diffusione sono quindi molto bassi su scale dimensionali piccole. Considerando dei contenitori con dimensioni lineari (diminuiscono di 10 volte a ogni step), i tempi di diffusione diventano sempre più piccoli. Le molecole impiegano meno tempo a diffondere e quindi è più facile effettuare dei mescolamenti per semplice diffusione lavorando con queste scale dimensionali. Anche le reazioni chimiche saranno più veloci dove i reattori sono di dimensioni micrometriche.

Il numero di Reynolds è dato dal rapporto fra le forze di inerzia e le forze viscose. A valori bassi del numero di Reynolds, il fluido scorre in maniera lineare (flusso laminare) mentre per Re alti il flusso è turbolento. Re è funzione della dimensione caratteristica del condotto in cui scorre il fluido ma anche la velocità, la dipendenza è quadratica. Per micro e nano canali, Re risulta basso e quindi il flusso è laminare e non si verifica il mescolamento fra i fluidi. Questo può avere delle applicazioni pratiche interessanti. Quindi in microfluidica, bassi valori di Re permettono di ottenere flussi laminari che sono più facili da modellare e non si verifica mescolamento: i fluidi fluiscono paralleli gli uni rispetto agli altri.

Quindi alla micro e alla nano scala possiamo fabbricare degli oggetti che possono interagire con dei sistemi viventi rispettando la loro scala dimensionale. Possiamo costruire dei device micromeccanici molto piccoli (10-100 µm), possiamo costruire delle nanoparticelle polimeriche, i nanotubi di carbonio. L'altra grande attività di fabbricazione di oggetti micro e nano sarà il campo delle bioMEMS, che sono largamente utilizzati nella creazione di circuiti integrati miniaturizzati che servono a processare, manipolare e analizzare o strutturare entità biologiche o biochimiche. Questi dispositivi possono essere classificati in due grandi gruppi: i dispositivi in vitro e in vivo. Questi dispositivi in vitro vengono chiamati lab-on-chip: trasferiamo il laboratorio biologico su un chip elettronico, miniaturizziamo questo laboratorio e lo interfacciamo con elettronica in grado di leggermi cosa sta succedendo sul chip tramite dei segnali.

I vantaggi delle bioMEMS rispetto agli altri sistemi sono benefici legati alla scala dimensionale. Abbiamo visto che variando le dimensioni variano le proprietà fisiche: si scende fino allo stesso ordine di grande delle cellule o delle biomolecole, quindi i dispositivi consumano meno materiale e sono facilmente trasformabili in sistemi ad alto rendimento. Posso parallelizzare la produzione, ridurre i costi di produzione e integrare diverse funzioni su un singolo dispositivo.

Tornando all'utilità di fare dei test microfluidici e quindi avere dei dispositivi con piccoli canali che poi applicheremo nelle bioMEMS, è stato osservato che si possono sfruttare i microcanali per ottenere dei gradienti di sostanze. Osservando il canale, si vede la proteina marcata luminosa nei due canali laterali mentre non vedo luce nel canale centrale perché qui la proteina non è marcata. Quando i tre canali confluiscono, si vede che i tre canali rimangono separati. Questo perché la lunghezza caratteristica del sistema è dell'ordine dei 50 µm circa.

Questo esperimento è stato effettuato anche con canali contenenti delle cellule: queste si distribuiscono nel canale centrale mantenendo il pattern di alimentazione. Nel canale in cui confluiscono i tre inlet, il pattern si mantiene, non c'è mescolamento neanche in presenza di sospensioni di cellule. Seminando delle cellule endoteliali nel canale di raccolta, è poi possibile avere dei trattamenti selettivi. Le cellule si dispongono lungo il canale e, iniettando delle sostanze che provocano il distacco delle cellule, vedo che solo in quelle zone si verifica il distacco delle cellule dalla parete e quindi posso selettivamente rimuovere delle cellule da una regione lasciandole invece aderire nelle altre.

Le proprietà del flusso laminare possono essere sfruttate per costruire dei separatori microfluidici. A delle dimensioni che mi permettono di avere un flusso laminare, utilizzo un sistema microfluidico e una serie di ostacoli di scala micrometrica in modo da separare delle particelle in un fluido in base alle loro dimensioni. Se io ho un flusso laminare e un ostacolo impermeabile al fluido, allora questo aggirerà l'ostacolo biforcandosi intorno ad esso senza creare vortici e quindi mescolamento.

In questo caso, gli ostacoli sono stati realizzati mettendo due ostacoli a una distanza l/3; successivamente metto degli ostacoli shiftati orizzontalmente rispetto alla barriera precedente. A questo punto, se io ho un flusso laminare costituito da tre elementi che non si mescolano, ciascun fluido affronterà l'ostacolo come in figura. Infine, la posizione di partenza sarà riottenuta una volta superate 4 file di ostacoli.

Questo andamento può essere sfruttato per separare particelle di dimensioni differenti: se ho una particella più piccola della larghezza del liquido componente, questa fluirà coerentemente con il fluido che la ospita, mentre se la particella è più grande della larghezza di un componente e il suo centro immaginiamo che parta dalla posizione 2, ma date le sue dimensioni, benché tenderebbe a passare alla posizione 1, verrà respinta dall'ostacolo e tenderà a rimanere nella posizione 2 e così anche all'ostacolo successivo. Quindi queste particelle grandi tenderanno a stare sempre nella stessa posizione. In questo modo, è possibile separare le particelle più grandi da quelle più piccole selettivamente. Mentre le particelle piccole passano da una posizione all'altra quando incontrano gli ostacoli, quelle più grandi tenderanno a mantenere sempre la stessa posizione.

Altri benefici della nanoscala includono le analisi ad alto rendimento. Quando si sviluppa un farmaco, si vuole andare a vedere il suo effetto. L'azienda farmaceutica può avere diverse molecole candidate e vuole vedere qual è il loro potenziale target terapeutico, quindi il numero di esperimenti da condurre è molto alto. Inoltre, questi saggi devono essere effettuati in condizioni di alta purezza di reagenti e solventi che hanno un costo elevato, quindi una soluzione potrebbe essere quella di miniaturizzare i volumi. La miniaturizzazione permette di ridurre i tempi di reazione perché la probabilità che le molecole si incontrino è maggiore e quindi è possibile testare centinaia o migliaia di molecole differenti. Questo ha delle applicazioni in farmacologia, in genetica, in biotecnologia. È possibile identificare nuove molecole che regolano i processi biologici e in questo modo è anche possibile generare una grande quantità di dati.

Per la realizzazione di questi sistemi c'è stata una forte evoluzione in cui si è potuto aumentare il numero di reazioni per singola cellula al diminuire del volume di reazione. Se negli anni '80 si potevano fare un centinaio di reazioni in volumi di centinaia di µl, attualmente si possono fare migliaia di reazioni in volumi microlitrici. La richiesta è quella di arrivare a sistemi in cui si fanno reazioni in singole gocce e in questi volumi poter far avvenire milioni di reazioni. Le barriere sono l'evaporazione, il maneggiamento di liquidi, l'assorbimento superficiale, la precisione dei robot che maneggiano questi volumi, però sistemi micro o nano fluidici potranno in futuro soddisfare questa richiesta di saggi ad alto rendimento.

Idealmente possiamo realizzare dei sistemi a goccia che al momento esistono. Si usano delle piastre multipozzetto che contengono volumi nell'ordine dei mm e si può immaginare di trasferire il contenuto all'interno di microcanali. Si vuole passare alla microfluidica a goccia: si fa scorrere nel microcanale dell'olio in cui si emulsionano delle gocce acquose che contengono il campione. In questo caso si può scendere alle dimensioni del nl o del fl (fentolitro). La microfluidica a gocciolina quindi studia il comportamento delle cellule in ambienti diversi. Se i tradizionali saggi biologici valutano il comportamento cellulare in substrati bidimensionali e su grossi numeri di cellule e quindi misurano comportamento...