Biologia, prof. Salvetti

BIOLOGIA

MOLECOLARE

Prof. ssa Alessandra Salvetti

Corso di Laurea in

MEDICINA E CHIRURGIA

Canale L-Z

a.a. 2014-2015 A.B

1

MEMBRANA CELLULARE

Fatte da tre macromolecole:

LIPIDI: hanno testa idrofilia e coda idrofobica, nelle membrane esistono diversi tipi di fosfolipidi con

• caratteristiche diverse (…..). Dal confronto della composizione lipidica delle membrane plasmatiche

di diversi tipi di cellule appare che c’è una differenza qualitativa e quantitativa nella composizione

delle membrane. La cardiolipina (un lipide tipico della membrana plasmatica batterica) si ritrova

nella membrana del mitocondrio, che infatti probabilmente ha origine batterica. L’unico modo in

cui i lipidi si possono posizionare per formare membrana è il doppio strato fosfolipidico: essendoci

acqua nell’ambiente extracellulare e nell’ambiente del citosol si tratta dell’unico modo per non fare

entrare in contatto le code idrofobiche con l’acqua. Questo però non è sufficiente, perché sul

bordo avrei ancora code idrofobiche a contatto con l’acqua, così avviene la chiusura del foglietto

planare, questa struttura chiusa è favorita energicamente. Il doppio strato è un fluido

bidimensionale, quindi i lipidi possono muoversi all’interno di ogni monostrato compiendo una

diffusione laterale oppure ruotando su se stessi. È più difficile che il lipide passi da un monostrato

all’altro, questo passaggio si chiama diffusione trasversale (passaggio lipide da un monostrato

all’altro) o movimento a flip-flop: evento che richiede Flippasi (= categoria di enzimi che servono

per far avvenire la diffusione trasversale dei lipidi). è possibile marcare i lipidi di superficie con una

molecola in grado di emettere fluorescenza. Prendiamo delle cellule e utilizziamo questa molecola

che si lega ai lipidi di membrana, così al microscopio a fluorescenza usando una determinata

lunghezza d’onda sono in grado di eccitare questa molecola e vedo una cellula punteggiata. Se con

un laser distruggo la molecola fluorescente in una zona precisa della superficie della cellula

(PLICCING?) vedrei un buco nero, ma se la riguardo dopo un po’ mi accorgo che il buco nero non ha

più le stesse dimensioni, perché i lipidi si sono spostati.

La fluidità delle membrane dipende dalla composizione lipidica. Un ruolo importante lo svolgono le

code idrocarburiche idrofobiche, perché i lipidi sono tutti vicini con le code che interagiscono. Più

queste code sono lunghe e minore è la fluidità, perché maggiori sono le interazioni. Le code lunghe

determinano un aumento della temperatura di transizione (alla quale avviene il passaggio da fluido

cristallino a gel). Se vengono inseriti dei doppi legami si ha una distorsione della coda idrocarburica,

quindi se io ho una distorsione le interazioni fra code vicine sono minori rispetto alle interazioni fra

code sature, cioè code senza doppi legami, quindi l’introduzione di doppi legami determina un

aumento di fluidità. Per avere fluidità creo insaturazione e scorcio le code. Se la temperatura

esterna è più alta di quella di transizione avrei una membrana troppo fluida e questo non va bene

perché per essere efficienti le membrane devono mantenere la giusta fluidità, allora allungo le code

e riduco la presenza di doppi legami.

Il colesterolo (solo cellule eucariotiche) ha un ruolo fondamentale nella fluidità della membrana.

Testa idrofilica e regione fatta dagli anelli steroidei che è idrofobica. Ha una duplice funzione sul

controllo della fluidità che dipende dalla t: ad alte temperature le membrane tenderebbero a

diventare troppo fluide e i lipidi a distanziarsi, ma il colesterolo essendo una struttura rigida

interagisce con le code vicine e mantiene uniti i lipidi, diminuendo la fluidità, invece se la t si

abbassa le membrane tenderebbero a gelificare e in questo caso dove è presente il colesterolo le

code si possono impacchettare con difficoltà perché il colesterolo fa da ingombro e quindi si

mantiene una maggiore fluidità. Il colesterolo ha il compito di mantenere la fluidità e si trova

concentrato in micro domini o zolle lipidiche. 2

Adattamento omeoviscoso: è la capacità della cellula di adattare la fluidità della propria membrana

in risposta alle condizioni ambientali, allungando o accorciando le code idrocarburiche oppure

regolando l’insaturazione.

La fluidità della membrana è importante perché permette la diffusione delle proteine di membrana

e la loro interazione ed è importante come barriera di selettività, inoltre permette la fusione tra

cellule e vescicole.

La distribuzione lipidica non è uniforme: c’è differenza tra composizione lipidica di membrane

diverse, ma anche nella stessa membrana non c’è omogeneità, in particolare si formano zolle

lipidiche o micro domini sia sul monostrato esterno che interno, ricche di colesterolo e fosfolipidi

con code lunghe e sature, quindi sono zone di bassa fluidità e spesse, svolgono ruolo importante

nei processi di trasduzione del segnale (risposta della cellula a stimolo esterno attraverso recettori

che instaurano una cascata di segnale) quindi è un modo per mantenere in punti determinati della

cellula proteine che servono in determinati momenti. I lipidi non sono distribuiti in maniera

uniforme tra i due monostrati. Questa asimmetria si instaura al momento della biogenesi delle

membrane a livello del reticolo e viene mantenuta perché per passare da un foglietto all’altro

occorrono le flippasi.

PROTEINE: in un mare di lipidi sono immerse un mosaico di proteine diverse che svolgono funzioni

• diverse. La presenza delle proteine può essere vista con la tecnica della criofrattura: a determinate

temperature le membrane si dividono in due strati e posso vedere cosa c’è tra i due monostrati.

Proteine possono essere classificate in base alla loro distribuzione in due classi:

- Integrali: sono immerse nei lipidi, possono essere immerse solo in un monostrato

(Monotopica), oppure possono essere proteine integrali trans membrana, perché

attraversano entrambi i monostrati e possono attraversarla solo una volta (monopasso)

oppure più volte, quindi avere diversi domini trans membrana. Oppure esistono proteine

multimeriche che per poter funzionare devono associarsi ad altre proteine.

- Periferiche: non sono immerse nel doppio strato; possono interagire con altre proteine

integrali senza prendere rapporto con i lipidi, oppure possono essere ancorate a una

componente lipidica e l’aggancio con un lipide permette alla proteina di rimanere sulla

superficie.

Le proteine integrali trans membrana quando sono immerse nel doppio strato idrofobico per quel

tratto devono assumere una conformazione tale in cui gli amminoacidi che hanno carica laterale

idrofobica siano disposti verso le code idrofobiche dei lipidi, mentre gli amminoacidi rivolti verso la

parte interna possono essere anche amminoacidi carichi a seconda di quello con cui dovranno

interagire.

Si parla di asimmetria nella distribuzione delle proteine: le proteine hanno una regione iniziale

amminoterminale e terminano con una regione carbossiterminale. Le proteine possono essere

disposte in maniera diversa rispetto all’ambiente citosolico o all’ambiente extracellulare: una

proteina può avere una distribuzione diversa tra l’esterno e l’interno di gruppi funzionali. Un

ulteriore asimmetria è determinata da proteine presenti solo in uno dei due monostrati. Non c’è

distribuzione omogenea di proteina tra i due monostrati, ma anche le proteine integrali che

attraversano la membrana espongono gruppi diversi nei due strati, determinando un’asimmetria.

Posso usare un anticorpo che riconosce proteine di superficie della cellula del topo (rosso) e uno

che riconosce proteine presenti sulla superficie della cellula dell’uomo (verde). Produco una cellula

3

ibrida tra cellula di topo e uomo e inizialmente ho una metà rossa e una verde, ma dopo una

quarantina di minuti la distinzione netta è sparita e le due proteine rosse e verdi si sono mescolate,

perché il doppio strato è fluido e consente alle proteine di muoversi.

Non tutte le proteine si devono muovere, alcune per poter funzionare devono rimanere in precisi

punti della membrana. Posso ancorare le proteine di membrana a delle strutture citoscheletriche

(citoscheletro sono proteine filamentose presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche), oppure

ancoro le proteine a delle proteine della matrice extracellulare, oppure le ancoro a proteine di

superficie di cellule adiacenti, oppure utilizzo giunzioni, cioè dei paletti, che creano una

polarizzazione della cellula perché la parte apicale è diversa dalla parte basale dal punto di vista

funzionale, perché ci sono proteine diverse che svolgono funzioni diverse.

CARBOIDRATI: gli zuccheri si trovano all’esterno della cellula associati alle proteine o ai lipidi.

• L’insieme di tutti gli zuccheri che ricoprono la membrana plasmatica prende il nome di

GLICOCALICE= insieme dei carboidrati che rivestono le membrane cellulari e iniziano ad essere

associati o alle proteine o ai lipidi nel reticolo e questo processo di aggiunta degli zuccheri si

completa con la glicosilazione.

Esistono diversi tipi di zuccheri.. galattosio, mannosio e glucosio, che formano il core glucidico.

La funzione del glicocalice è di permettere le interazioni cellula-cellula e cellula-substrato, è una

protezione meccanica, è una barriera, serve per la comunicazione e il riconoscimento cellulare.

Al di sotto del doppio strato è presente un’impalcatura che si chiama cortex, fatta da proteine di

spettrina, che formano dei filamenti e sono ancorate al monostrato citosolico attraverso proteine

trans membrana, questo cortex si vede bene a livello delle membrane interne degli eritrociti.

Funzione della membrana cellulare:

Barriera di impermeabilità, non tutti i soluti possono attraversare la membrana perché la

• composizione all’esterno della cellula non è uguale a quella interna al citoplasma, tuttavia è

necessario un continuo scambio con l’esterno e in più nella cellula eucariotica questa necessità si

presenta anche all’interno della cellula a livello delle membrane degli organuli

Organizzazione e compartimentalizzazione delle funzioni citoplasmatiche perché crea i

• compartimenti chiusi (organuli)

Processo di trasporto

• Rilevamento del segnale (recettori che determinano l’insorgenza di processi di trasduzione del

• segnale)

Comunicazione cellula-cellula attraverso ponti di proteine

•

TRASPORTO DI MEMBRANA

A seconda della molecola che deve essere trasportata esistono diversi tipi di trasporto. Il trasporto si divide

in:

trasporto passivo: non richiede energia, perché è spontaneo e le molecole si spostano seguendo un

gradiente di concentrazione, passando da regioni in cui il soluto è più concentrato verso regioni dove il

soluto è più concentrato. Poiché la direzione è data dal gradiente di concentrazione si tratta di un trasporto

non direzionale. 4

trasporto attivo: richiede energia ed è direzionale, perché non avviene secondo gradiente di

concentrazione, dunque è coinvolta una proteina che funziona in una sola direzione.

I tipi di trasporto sono stati studiati a partire dalla membrana degli eritrociti, perché a livello di questa

membrana avvengono tutti i tipi di trasporto.

Trasporto Passivo:

Diffusione semplice: riguarda il passaggio di piccole molecole apolari come CO2 e O2, che possono

o passare attraverso gli spazi presenti tra i fosfolipidi delle membrane. È richiesto solo un gradiente di

concentrazione, perciò avviene fino a quando si raggiunge l’equilibrio.

Osmosi: rientra nella diffusione semplice ed è il movimento passivo di acqua attraverso le

o membrane cellulari. L’acqua è una molecola apolare che riesce a passare liberamente all’interno

del doppio strato fosfolipidico. Si verifica quando la membrana è impermeabile al soluto, perciò

non può verificarsi una diffusione semplice del soluto, dunque è necessario che sia l’acqua a

spostarsi. L’acqua va dove il soluto è più concentrato. Le condizioni fisiologiche si hanno quando la

cellula si trova in una soluzione isotonica e in queste condizioni la quantità di acqua che entra è

uguale a quella che esce.

Diffusione facilitata: movimento di molecole secondo gradiente di concentrazione, non richiede

o energia, ma le molecole sono troppo grosse per passare attraverso i lipidi per cui il loro trasporto è

facilitato da alcune proteine trans membrana. Esistono due tipi diversi di diffusione facilitata:

mediata da proteine carrier o mediata da proteine canale. La differenza è che nelle proteine carrier

è il soluto (molecola che deve essere trasportata) a indurre il cambiamento conformazionale,

mentre nel caso delle proteine canale sono fattori esterni. Le proteine carrier sono proteine

transmembrana che oscillano tra una conformazione aperta verso il citosol e una aperta verso

l’esterno. Le proteine canale oscillano tra una conformazione aperta e una chiusa.

Esempio di diffusione facilitata mediante proteine carrier: trasportatore del glucosio.

Il trasportatore del glucosio oscilla tra due conformazioni T1 e T2. Quando arriva il glucosio questo si lega

interagendo con catene laterali che sono esposte nel lume del canale e induce un cambiamento di

conformazione, per cui si viene a trovare il sito del legame per il glucosio esposto verso il citosol e il

glucosio viene rilasciato. A questo punto la proteina torna nella sua conformazione originale. Questi

trasportatori sono specifici per una molecola o per classi di molecole. I trasportatori del glucosio prendono

il nome di GLUT. Esistono GLUT diversi a seconda del tessuto che si prende in considerazione, però tutti

appartengono alla solita famiglia, cioè hanno una alta omologia di sequenza amminoacidica: non sono

identici da un punto di vista amminoacidico, quindi la sequenza di amminoacidi non è identica, ma

l’omologia di sequenza, cioè il numero di amminoacidi identici, è tale da poterli classificare all’interno della

stessa famiglia proteica. Normalmente il gradiente di concentrazione del glucosio spinge il glucosio a

entrare nelle cellule dove è presente un enzima, CHINASI, che aggiunge un fosfato al glucosio

trasformandolo in glucosio 6 fosfato, che la cellula non riconosce come glucosio, per cui c’è sempre un

gradiente di concentrazione che porta all’interno della cellula il glucosio. L’unico caso in cui non ho questa

chinasi è all’interno dell’intestino, dove il glucosio entra con un trasporto attivo di Sodio. Un caso

particolare è quello che avviene nelle cellule muscolari e adipose, perché in condizioni normali in questo

caso la GLUT non è esposta sulla superficie della cellula, ma all’interno del citoplasma sulla superficie di

vescicole. Quando ho un glucosio da internare l’insulina viene rilasciata nel sangue e si lega a dei recettori

presenti sulla membrana della cellula muscolare determinando una trasduzione del segnale alla quale la

cellula risponde con un esocitosi regolata. Le vescicole si avvicinano alla membrana e si fondono con questa

grazie alla sua fluidità, per cui il recettore viene esposto sulla superficie della cellula e funziona come un

5

GLUT normale. Quando l’insulina non è più prodotta perché la glicemia è calata il recettore viene portato

nuovamente dentro le vescicole.

Proteine canale:

Porine:si trovano nella membrana esterna dei Gram meno e negli eucarioti a livello della membrana

esterna nucleare. Sono delle proteine trans membrana che non hanno grossa selettività. Solo le molecole

troppo grosse non riescono ad attraversarle.

Acquaporine: proteine trans membrana che si trovano nei tubuli prossimali a livello del rene e servono per

far passare grosse quantità di acqua sempre nella direzione dell’osmosi ma molto più rapidamente. Questi

canali non fanno passare gli ioni per un problema di repulsione elettrostatica, mentre altre molecole

vengono escluse sulla base delle dimensioni, dunque sono altamente selettive. Questi canali oscillano tra

una conformazione aperta e una chiusa e l’apertura dipende da fattori esterni.

Canali ionici: uno ione si sposta attraverso le membrane seguendo il potenziale elettrochimico che è dato

dal gradiente di concentrazione e dalla carica dello ione. Nella diffusione facilitata che vede coinvolte

proteine canale specifiche per lo ione il movimento è determinato dal potenziale elettrochimico. L’apertura

del canale può essere dovuta al gradiente, a ligandi esterni, a legami intracellulari o a stimoli meccanici

mediante interazione con il citoscheletro. I canali ionici sono selettivi per i vari ioni. Sono proteine trans

membrana che assumono una conformazione tale per cui all’interno del canale sporgono delle catene

laterali in grado di interagire con un determinato ione e questi gruppi che prendono contatto con gli ioni

sono in grado di stabilizzare lo ione nella sua forma adrica, non idratato dalle molecole di acqua.

Trasporto Attivo

L’energia è data dall’idrolisi di una molecola di ATP che si scinde in ADP e fosfato, per cui accade la

fosforilazione delle proteine coinvolte nel trasporto attivo, che prendono il nome di pompe, ed è l’idrolisi di

ATP che induce un cambiamento di conformazione. Esistono tanti tipi di pompe che prendono il nome di

ATPasi di trasporto perché scindono ATP per poter funzionare.

ATPasi di tipo P: pompa sodio-potassio, pompe protoniche, pompa calcio.

POMPA NA+/K+

È formata da sub unità alfa e beta, a cui è associata una componente glucidica. Alla sub unità alfa è legato il

sito di legame di ATP. Oscilla tra una conformazion