Biologia molecolare vegetale - Appunti

TIPI DI RNA E LORO PROCESSAMENTO

Gli rna sono classificati in base alle loro dimensioni e funzione, si possono separare gli rna su un

gradiente di saccarosio che va dal 2 al 15% in ultra centrifuga, e si separano generalmente 3

frazioni: la frazione che va da 23 a 25S (svedbergh che sono dei coefficienti di sedimentazione che

sono equivalenti a 10 alla –13 secondi, secondo il tempo di cui si ha la separazione) poi quelli a 16-

17 svedbergh che corrispondono all’rna ribosomale, poi ci sono quelli piccolini a 4 svedbergh a cui

appartengono gli rna transfert i t-rna e i piccoli rna che servono al processamento dell’rna.

Gli m-rna sono una piccola parte della popolazione totale della popolazione degli rna 1-2%, talvolta

3-4%, gli r-rna e i t-rna sono in generale degli rna abbastanza stabili anche perché hanno nelle loro

strutture molecolari degli appaiamenti intra molecolari, zone a doppio filamento per cui sono

abbastanza stabili e si possono visualizzare bene su un gel di agarosio colorando con bromuro di

etidio e si possono vedere 2 bande che corrispondono alle diverse frazioni dell’rna ribosomali,

invece l’mrna è una molecola al quanto instabile, è a singolo filamento, molto sensibile alla

degradazione per cui vanno usate delle precauzioni, va conservato a –80 sia l’mrna sia i materiali da

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cui si estrae l’mrna, quando si preparano le soluzioni per fare l’estrazioni dell’mrna qualora non si

usano dei kit preconfezionati si deve trattare tutta l’acqua con dietilpirocarbonato (DEPC) per

distruggere le rnasi, stabili anche dopo autoclavatura, resistono e se me le porto dietro non lavoro

più, l’mrna non banda con una molecola di dimensioni precise ma se si separa su un gel colorandolo

con bromuro di etidio in questo caso se devo colorare l’rna in un gel conviene mettere il bromuro di

etidio nell’odin baffer che poi carico sul gel, non colorare il gel, perché essendo a singolo

filamnento c’è una minore possibilità che l’etidio bromuro sia un intercalante e si vada e legare e

vada a interferire con l’mrna, non si vede una banda precisa, ma uno smir, una strisciata di varie

dimensioni che vanno da 2.500 fino a 4-5-600 paia di basi, separando in questo gradiente di

saccarosio si formano queste 3 frazioni, frazioni che possono essere diluite separatamente e

analizzate con vari sistemi.

Rna ribosomali: nelle piante ci sono 3 tipi di rna ribosomali, ci sono quelli presenti nel citosol, nei

plastidi e nei mitocondri e sono tutti formati da una subunità piccola e una grande, la subunità

piccola è formata da una sola molecola di rrna, mentre le subunità grandi sono formate da 2 o 3

molecole a seconda dell’organo in cui siamo, avremo 3 diversi sistemi di sintesi proteica nei tre

diversi compartimenti a cui corrispondono 3 diversi tipi di rna ribosomali, il numero di proteine che

compone ogni diversa subunità è parecchio da 18S di quella che fa parte dell’unità 40S dell’rna

ribosomali del citosol è fatta da 35 proteine, quindi sono multi componenti; gli rna ribosomali sono

sintetizzati dall’rna polimerasi 1 che è una rna polimerasi che polimerizza abbastanza lentamente,

circa 20 nucleotidi al minuto e l’rna che si ottiene non ha il CAP al 5’ che poi vedremo essere una

caratteristica degli mrna, la terminazione della trascrizione avviene grazie a una proteina di legame

al dna che quando l’rna polimerasi 1 la incontra determina un blocco e si interrompe la sintesi,

questa sequenza è localizzata a 10-20 paia di basi a valle del sito di termine della trascrizione del

gene dell’rrna. Queste sono le strutture dell’rna ribosomali, nella figura vediamo quella del plastidio

con le varie subunità, tutte queste zone in cui ci sono delle omologie consentono l’appaiamento dei

filamenti con la formazione di questi domini, ognuno di questi domini ha particolari funzioni,

queste strutture secondarie sono altamente conservate per quanto riguarda gli rna ribosomali che ci

sono nel citosol, nei plastidi, nei mitocondri anche se c’è una notevole differenza di sequenza, è

conservata la struttura, ma le sequenze che determinano questa struttura sono notevolmente

diversificate nei diversi organismi.

Rna transfer: ogni t-rna accetta uno solo dei 20 aa però ci sono dei t-rna diversi che possono

accettare lo stesso aa, solo la metionina e un altro aa sono specificate da un solo codone, tutti gli

altri aa sono specificati da più codoni e il fatto di essere specificati da più codoni può volere dire

che lo stesso t-rna riconosce diversi codoni oppure può voler dire che lo stesso aa può legare

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proprio a t-rna diversi che riconoscono codoni diversi sull’rna messaggero, lo stesso aa può esere

legato a diversi t-rna, ha questa struttura un po’ a quadrifoglio con questi 4 bracci che assumono

nomi diversi a seconda della loro funzione o a seconda del tipo di base particolari che sono presenti

nel t-rna, una caratteristica del t-rna è quella di avere delle basi che sono modificate post-

trascrizionalmente in modo chimico, come ad esempio la pseudo uridina, ecopentenil adenosina, etil

guanosina etc. il ramo dove poi si lega l’aa alla sua estremità 3’ OH si chiama ramo accessore.

T-rna mitocondriali e del plastidio: in generali i mitocondri non hanno un set di t-rna sufficienti per

la sintesi proteica e quindi i t.-rna che servono per la sintesi proteica mitocondriale per le poche

proteine che sono sintetizzate nel mitocondrio con il dna del mitocondrio vengono di fatto

sintetizzate con il dna nucleare e poi vengono importate nel mitocondrio, alcune le ha lui e altre

vengono importate. Invece nei plastidi si stima che ci siano circa una trentina di t-rna che sono

reputati essere sufficienti per la sintesi proteica dio proteine codificate dal dna che è presente nel

plastidio. L’rna polimerasi 2 è invece quella che trascrive geni per gli mrna, malgrado lavori molto

velocemente perché può trascrivere fino a 2.000 nucleotidi al minuto, a volte ci può volere molto

tempo a trascrivere un gene sia per l’azione di proteine accessorie che servono per dare al dna una

conformazione adatta alla trascrizione sia perché un gene è fatto non solo da esoni, ma anche da

introni, a volte ci sono introni che sono molti lunghi e questo comporta più tempo; ci sono diverse

proteine che si associano all’rna polimerasi 2 durante la trascrizione che hanno diverse funzioni,

quelle di rendere disponibile tramite attività elicasica tramite interazione, rendere disponibile il dna

per la trascrizione, ci sono anche proteine che hanno anche attività acetiltransferasica che si

associano al complesso dell’rna polimerasi mentre trascrive, per cui uno dei meccanismi per

allentare la costrizione delle proteine istoniche, quando è acetilato la struttura è meno compatta,

quando è deacetilato la struttura è più copmpatta e quindi meno disponibile alla trascrizione.

Ora vediamo questi processamenti: il CAP, l’agginuta del CAP al 5’, l’aggiunta della coda di poli A

al 3’, processo di plicing perché molti rna contengono introni, processo che subiscono pochi rna che

si chiama editing.

Il CAPPING: l’rna una volta che è nel citosol (rna maturo) e tipicamente ha regioni 5’ e 3’ non

tradotte, la regione codificante, codone di stop e la coda do poli A, una struttura caratteristica è

questa 5’ CAP alla sua zona 5’ che è una modificazione che aiuta l’rna messaggero durante la

traduzione, aiuta il trasferimento dell’rna messaggero neo sintetizzato dal nucleo al citoplasma e

aumenta anche la stabilità dell’mrna, ci sono diverse proteine che si legano a questa zona CAP al 5’,

modificazione che avviene molto precocemente, questo evento è completato prima che la sequenza

raggiunga i 30 nucleotidi, anzi la prosecuzione della trascrizione di un gene è legato al

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completamento di questa modificazione, perché il complesso promoter-escape cioè il fatto che l’rna

polimerasi 2 vada avanti a trascrivere è subordinato che avvenga questo tipo di modificazione.

Al 5’ c’è questo gruppo trifosfato, con una fosfoidrolasi viene rimosso un grupo fostato, questo

interagisce con GTP e quindi contiene un gruppo guanina, si ha la rimozione di un piro-fosfato e la

riformazione di un gruppo trifosfato, quindi all’rna messaggero si lega la guanina col gruppo

zuccherino e si forma ancora il gruppo trifosfato, poi si ha la donazione di un gruppo metilico che si

va a legare all’azoto in posizione 7 della guanina per cui quando si parla di CAP si parla

dell’aggiunta di 7 metil guanilato al 5’ dell’mrna, c’è la guanina e il gruppo metilico legati in

posizione 7 della guanina.

LA POLIADENILAZIONE: la poliadenilazione è un processo che avviene contemporaneamente

alla trascrizione perché c’è questo CPSF che si associa al fattore di trascrizione 2D che costruisce la

macchina di trascrizione di base, questo fattore si muove insieme all’rna polimerasi quando questa

corre sul dna ed è lei che riconosce il punto dei segnali di adenilazione, incontra un AAUAAA, una

volta che questa proteina riconosce questo segnale determina un blocco della trascrizione del gene,

(è CPSF che riconosce), il legame di questo determina l’aggiunta di questa polimerasi che

determina l’aggiunta di A, e di questo CSTF, tutte queste interagiscono tra di loro quindi una

determina che si lega l’altra e questo CSTF è quello che determina un taglio al 5’ di circa 20-30

nucleotidi a valle di questo segnale di poliadenilazione e quindi si elimina questa parte 3’ dell’rna

messaggero e resta questo CA, quindi parte la PAP questa poly A polimerasi e comincia ad

aggiungere poliadenine, all’inizio le aggiunge con un ritmo lento, però poi si aggiunge questa

ulteriore poliadenilate binding protein 2 che in un certo senso accelera la velocità di reazione e

determina polimerizzazione più veloce, in generale vengono aggiunte dalle 20 alle 250 adenosine al

5’ e anche il poli a come funzioni facilita il trasposto da nucleo, stabilizza l’rna messaggero anche

se di fatto si hanno degli mrna che hanno delle code d poli A molto corte ed è stato visto che sono

molto stabili, però sicuramente ha un ruolo perché in certi casi la perdita o la riduzione della coda di

poli A riduce la vita di un determinato mrna e poi ha un ruolo per l’inizio della traduzione.

Quelli che abbiamo visto prima erano gli mrna nucleari, però ci sono mrna anche nei plastidi e nei

mitocondri, le differenze sono che questi non hanno il CAP al 5’ e non hanno il poli A anche se in

realtà almeno per quelli plastidiali per