Biologia molecolare - terza parte

Caratterizzazione funzionale del promotore

Un promotore, nell'unità di trascrizione, deve essere sempre a monte rispetto alla regione da trascrivere. Grazie alla bioinformatica, molti studi possono essere resi più facili in quanto si possono individuare le regioni a monte del gene di interesse ed identificare le regioni a monte del promotore stesso.

Bisogna fare uno studio in cui si va a caratterizzare il promotore, cioè a verificare se tale promotore funziona. Si costruisce dunque un vettore di espressione in cui il promotore viene clonato a monte del gene reporter: se il promotore funziona, il gene si esprime.

Dal punto di vista sperimentale, si procede nel seguente modo:

1. Si prende quello che si pensa sia il promotore e lo si lega ad un gene reporter, cioè un gene la cui attività sia facilmente evidenziabile in vitro, in linee cellulari e poi si saggia l'attività del promotore.
2. Tale costrutto promotore-gene reporter viene trasfettato.

monte il promotore. Si ottiene un vettore di espressione che ha clonato all'interno il promotore inserito, e a valle in gene reporter. Se funziona correttamente il promotore, si vede l'espressione del gene reporter. Se il promotore invece non è corretto, il gene non si esprime.

Bisogna:

1. Capire se il promotore funziona nella sua totalità
2. Capire se le singole regioni potenzialmente funzionanti del promotore sono significative per l'attivazione del gene di interesse.

Il promotore viene tagliato in singole regioni, ciascuna clonata ed inserita in vettori diversi. Si verifica quali dei frammenti del promotore sono in grado di far funzionare il gene reporter, in base a dove il gene reporter viene espresso. Se non si esprime il gene reporter, significa che mancano delle regioni funzionali importanti per la sua espressione. basate sull'utilizzo di Recentemente, si sono imposte metodiche di mutagenesi linker scanner trasposoni batterici, come Tn5 o Tn7, in grado

di inserirsi casualmente in un DNA plasmidico fino asaturare il gene di interesse. Digerendo con uno specifico enzima di restrizione e rilegando, si ottengonomutazioni costituite da 3 o 6 bp.

➢ Espressione del gene Luciferasi: in bianco, sono le varie dimensioni di frammenti di promotori clonatiin plasmidi diversi e trasfettati in cellule diverse. Nel promotore ci sono quindi regioni fondamentali71dell’RNA Polimerasi, vicini al sito di inizio della trascrizione. L’attività dellache vedono il legameLuciferasi si perde quando vengono a mancare regioni funzionali del promotore.

CARATTERIZZAZIONE STRUTTURALE DEL PROMOTORE

Dopo che la regione di DNA è stata caratterizzata dal punto di vista funzionale, si procede con lacaratterizzazione strutturale del promotore, cioè si identificano quali fattori proteici si legano e dove silegano.

Altri studi sono legati a informazioni precise che riguardano la tipologia di fattori di trascrizione specifici alivello della

si è legato mediante la tecnica della PCR.–- Emsa rispetto alla tecnica precedente, non è in grado di dire quali sono le proteine, ma può comunque dire se ci sono proteine legate al promotore. Un promotore legato a proteine ha un PM maggiore rispetto a quando la proteina o il DNA sono da soli, per cui una corsa elettroforetica ritardata in seguito al PM indica la presenza di proteine. A livello del DNA ci sono quindi proteine e, per averne la certezza, si analizza mediante elettroforesi per capire quali sono le proteine presenti.–- Footprinting sfrutta il fatto che il DNA può essere tagliato dalle proteine nucleasi a livello dei legami fosfodiesterici. Inserita una proteina in un fattore di trascrizione, se avviene il legame specifico tra proteina e promotore si forma un complesso. Aggiungendo una nucleasi, questa taglia a livello dei legami fosfodiesterici, ma non la regione protetta dalla proteina. Facendo poi correre i frammenti di DNA su gel, con

Affianco il DNA non tagliato, integro, si può capire qual era la sequenza occupata da tale proteina. Tramite il gel si riesce a risalire alla composizione delle basi: nel punto in cui c'è la proteina, mancano le basi occupate da essa. Anche questo esperimento è più complesso e meno efficace di quanto possa essere il primo, in quanto qui bisogna sapere se la proteina si lega al promotore e se bisogna fare il sequenziamento. Con la prima tecnica invece si può sapere in tempo reale se il fattore di trascrizione si è legato al promotore.

REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA

REGOLAZIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI - l'operone

Tale discorso vale anche per i procarioti, ma in un sistema più semplice LAC consente di inquadrare le problematiche a partire da una regione di DNA per arrivare alle proteine. Quando si parla di regolazione dell'espressione genica, si intende lo studio degli eventi correlati direttamente alla

Né come efficacia né come importanza: alcuni sono meno importanti o comunque non così dannosi, mentre altri sono punti fondamentali, e un errore a livello di questi comporta una serie di danni e di disfunzioni a valle. Ad esempio, i meccanismi di regolazione che agiscono prima della trascrizione sono di gran lunga preferiti rispetto a quelli che agiscono dopo la trascrizione, quando ormai buona parte del lavoro è già stata fatta e sono state spese risorse ed energia.

Tutti gli eventi che riguardano principalmente la Trascrizione sono critici, in particolare, il momento in cui il gene viene trascritto a RNA, che riguarda la regolazione dell'RNA Polimerasi; meno critici ma comunque gravi riguardano la Traduzione, mentre quelli più leggeri possono essere i controlli non precisi dello step post-traduzionale. Questo è conseguenza del fatto che, se il controllo a monte viene fatto in maniera fedele, non si dovrebbero avere problemi/danni a valle.

Il passaggio da una forma condensata a una forma meno condensata diventa un punto di regolazione importante.

La metilazione è l'aggiunta di un gruppo metile (−CH₃) ad una citosina che sia vicino ad una guanina.

Si tratta delle cosiddette isole CpG (citosina-fosfato-guanina) che si trovano vicino ai promotori (le regioni da cui inizia la trascrizione), su entrambi i filamenti del DNA. Il filamento metilato parentale diventa poi lo stampo per la formazione del filamento di nuova sintesi nella replicazione.

La metilazione avviene ad opera di un particolare enzima, la DNA Metiltransferasi, ed è reversibile grazie ad un altro enzima, la Demetilasi, sul nucleotide CpG. L'enzima Citosina Metiltransferasi aggiunge un gruppo metile al C5 della Citosina: il risultato è la 5-metilcitosina.

I geni con alti livelli di 5-metilcitosina nella regione del

Promotore sono trascri