Biologia molecolare - terza parte

Trascrittasi inversa

Dal momento che l’mRNA è una molecola a singolo filamento di per sé instabile, è necessario produrre copie di esso stabili di DNA a doppio filamento: la reazione è catalizzata dalla Trascrittasi Inversa, o che usa l’RNA DNA Polimerasi RNA-dipendente messaggero come stampo per produrre una copia di DNA ad esso complementare, chiamata cDNA.

Questa tecnica viene molto utilizzata nell’ingegneria genetica per clonare un gene che codifica per una determinata proteina, trasformando il suo corrispettivo mRNA in cDNA, in modo che quest’ultimo possa essere inglobato, mediante clonaggio, all’interno di un vettore di espressione e successivamente espresso ed amplificato nelle cellule ospiti.

Il cDNA, infatti, essendo la copia complementare dell’mRNA, codifica per la stessa proteina, ma non contiene gli introni in quanto deriva dall’mRNA maturo: una volta nel vettore di espressione, il cDNA non deve subire splicing, ma potrebbe essere soggetto a cap o coda di poli-A.

L’mRNA può quindi:

• Essere tradotto direttamente in proteina.
• Essere utilizzato come stampo, mediante la Trascrittasi Inversa, per produrre una copia di DNA complementare, cDNA.

Purificando tanti mRNA diversi in cDNA, che vengono clonati in tanti vettori di espressione e trasferiti nelle cellule ospiti, si possono così ottenere librerie di cDNA.

Attività funzionali della trascrittasi inversa

Trascrittasi Inversa, un enzima proprio dei Retrovirus coinvolto per sua natura in diverse attività funzionali:

Trascrittasi Inversa = enzima retrovirale coinvolto per sua natura in varie attività funzionali:

• DNA Polimerasi RNA-dipendente utilizza il filamento di RNA virale come stampo per la sintesi di un filamento di cDNA, così da formare il doppio filamento ibrido RNA-DNA.
• DNA Polimerasi DNA-Dipendente utilizza DNA neosintetizzato per sintetizzare il filamento di DNA complementare e costituire la doppia elica di DNA.
• Ribonucleasi degrada il filamento di RNA genomico dagli ibridi RNA-DNA appena formatisi.
• Nucleasi che catalizza l’idrolisi dell’acido ribonucleico in componenti più piccole, attività di RNasi H.

Retrovirus e genoma virale

I retrovirus sono un gruppo di virus che utilizza la Trascrittasi Inversa per convertire il proprio genoma da RNA a DNA durante il proprio ciclo di replicazione virale. Comprendono diverse famiglie, la più nota delle quali è la famiglia Retroviridae. Questi virus possiedono un genoma a RNA a singolo filamento che al loro ingresso nel citoplasma viene convertito in DNA dalla Trascrittasi Inversa virale, migra nel nucleo ed infine si integra nel genoma della cellula ospite. Nel nucleo il DNA a doppio filamento viene utilizzato per produrre mRNA, da cui vengono sintetizzate le proteine virali e lo stesso genoma virale.

Il virione del Retrovirus presenta una forma grossolana-sferica, dal diametro variabile dai 100 ai 120 nm. In particolare, quelli appartenenti alla famiglia dei Retroviridae presentano un genoma costituito da due molecole di RNA a singolo filamento, con polarità positiva. 20

Anche se numerosi, i retrovirus sono piuttosto simili tra loro:

• Tutti i Retrovirus presentano una membrana lipoproteica esterna chiamata pericapside o envelope.
• L'enzima Trascrittasi Inversa è indispensabile per trasformare il genoma da RNA in DNA.
• Il genoma dei retrovirus contiene almeno tre geni indispensabili per la replicazione del virus:
• 1. gag, group-specific antigen, gene di un precursore poliproteico che produce le proteine strutturali, in particolare quelle del capside virale.
• 2. pol, polymerase, codifica per gli enzimi Trascrittasi Inversa, Proteasi ed Integrasi, utili per la replicazione del virus e la sua integrazione.
• 3. env, envelope, codifica per le proteine di membrana, pericapside, ossia la glicoproteina del rivestimento analoga alla proteina G del virus Stomatite Vescicolare VSV.

Le proteine gag e pol sono tradotte da un trascritto completo, e la traduzione di pol richiede un frameshift da parte del Ribosoma; env è invece tradotto da un mRNA separato generato per splicing.

Tutte le proteine vengono poi modificate da proteasi, per produrre proteine multiple.

A monte e a valle di questi geni si trovano le sequenze LTR, Long Terminal Repeat, chiamate segmenti R-U5, all’estremità 5’, e R-U3, all’estremità 3’, del genoma provirale: queste fungono da promotore e da segnale di poliadenilazione, dato che contengono al loro interno alcune regioni coinvolte nella trascrizione inversa, nell’integrazione e nel controllo dell’espressione del genoma virale, comprendono sequenze di regolazione che consentono al genoma del virus di potersi integrare nella cellula ospite, legandosi al DNA della cellula infettata per replicarsi successivamente.

Tra le altre sequenze disperse all'interno del genoma si trova anche il segnale di impacchettamento, packaging signal, che permette il trasferimento del genoma virale all'interno del virione.

L’mRNA retrovirale ha una struttura convenzionale:

• Cap al 5’.
• Coda di poliA al 3’.

Il genoma virale è un filamento singolo a RNA, che può subire modificazioni alle estremità in modo che, una volta nella cellula, venga utilizzato per produrre il DNA dei retrovirus, che diventa esso stesso la base per la produzione delle proteine; in altri casi, potrebbe anche essere direttamente tradotto. 21

Meccanismo della trascrittasi inversa

Qual è il meccanismo attraverso cui la Trascrittasi Inversa è in grado di produrre una molecola di DNA a partire da una molecola di RNA?

I retrovirus sono gli unici virus con genoma a RNA con polarità (+), per la precisione due molecole di RNA, genoma diploide, in cui il genoma non viene utilizzato come un mRNA, dopo l'ingresso del virus nella cellula. Una volta integrato nel genoma della cellula ospite, il provirus a DNA si trova sotto il controllo della cellula ospite e viene trascritto esattamente come gli altri geni cellulari.

Quando il retrovirus entra nella cellula, il suo genoma è un singolo filamento di RNA che di per sé non consente al virus di potersi replicare, ma ha bisogno che venga trasformato in DNA per essere oggetto della trascrizione di quei geni importanti per produrre le proteine virali, mediante l’apparato trascrizionale della cellula ospite.

I retrovirus sono chiamati virus a filamento più, perché l'RNA virale codifica per i prodotti proteici. La trascrittasi inversa è responsabile della conversione del genoma, filamento più di RNA, in un filamento complementare di DNA, che si chiama filamento meno di DNA. Questo enzima ha un'attività DNA polimerasica che le permette di sintetizzare un DNA duplex dal singolo filamento prodotto dalla trascrizione inversa dell'RNA. Il secondo filamento di DNA di questo duplex si chiama filamento più di DNA.

Come aggiunta necessaria a questa attività, l'enzima ha un’attività di RNasi H, che può degradare la parte RNA dell'ibrido RNA-DNA.

I segmenti R alle estremità sono usati, durante la conversione dalla forma a RNA a quella a DNA, per generare le ripetizioni dirette più estese che si trovano nel DNA lineare: l'accorciamento di 2 bp a ciascuna estremità della forma integrata è una conseguenza del meccanismo d'integrazione.

Come altre DNA polimerasi, la trascrittasi inversa richiede un primer, che in natura è costituito da un tRNA primer, presente nel virione e successivamente iniettato nell'ospite, che presenta una sequenza complementare alla regione U5. Una sequenza di 18 basi all'estremità 3' del tRNA si appaia con un sito posto a 100-200 basi all'estremità 5' di una delle molecole di RNA virale, il tRNA può anche appaiarsi con un altro sito vicino all'estremità 5' dell'altro RNA virale, contribuendo così alla formazione di un dimero fra gli RNA virali, fornendo il 3’-OH alla Trascrittasi Inversa, che comincia a trascrivere in direzione 5’→3’.

La sintesi in vitro procede fino all'estremità, generando una breve sequenza di DNA chiamata strong stop minus DNA: questa molecola non si trova però in vivo, perché la sintesi continua con la Trascrittasi Inversa che cambia stampo, portando con sé il DNA nascente sul nuovo stampo. Questo è il primo salto da uno stampo all'altro, in cui la regione R al terminale 5' dello stampo di RNA è degradata dall'attività di RNasi H della Trascrittasi Inversa, in modo che rimanga l’estremità 3’ protrudente.

La sua rimozione permette alla regione R all’estremità 3' di appaiarsi con il DNA appena sintetizzato e la trascrizione inversa continua quindi attraverso la regione U3 nel corpo centrale dell'RNA. 22

La regione di DNA prodotta fa un “salto”, cioè lascia l’RNA su cui si trova per appaiarsi con l’altro RNA virale, sempre al terminale R-U3’.

A questo punto, la Trascrittasi Inversa riconosce il sito al 3’-OH dell’estremità U3, su cui si lega e comincia a polimerizzare il frammento di DNA in direzione 3’→5’, lasciando fuori la regione U5.

Il risultato di questo scambio e dell'estensione è quello di aggiungere un segmento U3 all'estremità 5'. Il tratto di sequenza U3-R-U5 si chiama long terminal repeat, LTR, lunga ripetizione terminale, perché una serie simile di eventi aggiunge un segmento U5 all'estremità 3', generando la stessa struttura U5-R-U3.

Adesso bisogna generare il filamento più del DNA e la LTR all'altra estremità: la Trascrittasi Inversa innesca la sintesi del filamento più del DNA da un frammento di RNA che rimane dopo la degradazione della molecola originale di RNA. Uno strong stop plus DNA viene generato quando l'enzima raggiunge l'estremità dello stampo. Questo DNA viene quindi trasferito all'altra estremità di un filamento meno.

Il DNA è rilasciato probabilmente da una reazione di spostamento, quando un secondo ciclo di sintesi del DNA parte da un frammento primer più a monte, e usa la regione R per appaiarsi con l'estremità 3' di un filamento meno di DNA. Questo DNA a doppio filamento richiede quindi il completamento di entrambi i filamenti per generare un LTR duplex a ciascuna estremità.

DNA provirale e integrazione

Il DNA a doppio filamento che si forma attraverso questa reazione è noto come DNA provirale o provirus e risulta essere più lungo dell'RNA virale poiché ha una copia in più delle regioni U3 e U5: ad ogni estremità, presenta una ripetizione diretta delle sequenze U3-R-U5, nota come sequenza LTR.

In tutte le cellule infettate si possono osservare tre forme di DNA provirale: la forma lineare, una forma circolare con uno LTR e una forma circolare con due LTR. La prima e la terza sono infettive.

Successivamente l'integrazione del DNA lineare è catalizzata da un singolo prodotto virale, l'integrasi, che agisce sia sul DNA retrovirale che sul DNA bersaglio. Le estremità del DNA bersaglio sono importanti tanto che le mutazioni di queste impediscono l'integrazione. La caratteristica più conservata è la presenza della sequenza dinucleotidica CA vicino all'estremità di ciascuna ripetizione invertita.

L'integrasi porta insieme le estremità del DNA lineare in un complesso ribonucleoproteico e converte le estremità nette in estremità sfalsate rimuovendo le basi esterne alla CA conservata. I siti bersaglio sono scelti a caso rispetto alla sequenza e vengono tagliati in modo sfalsato dall'integrasi. Le estremità 5' generate dal taglio del DNA bersaglio sono unite covalentemente alle estremità 3' rientranti del DNA virale. A questo punto, entrambi i terminali del DNA virale sono uniti per un filamento al DNA bersaglio.

La regione a singolo filamento è riparata da enzimi cellulari e nel corso di questa reazione le 2 basi sporgenti a ciascuna estremità 5' del DNA virale sono rimosse, con il risultato che il DNA virale integrato ha perso 2 paia di basi all'estremità sinistra della sequenza U3 al terminale 5' e 2 paia di basi all'estremità destra della sequenza U5 al terminale 3'. A ciascuna estremità del genoma retrovirale integrato si trova una breve ripetizione diretta di DNA bersaglio.

Una volta integrato, il genoma verrà trascritto ad opera della RNA polimerasi II dell'ospite insieme agli altri geni cellulari. La sequenza U3 funzionerà come regione regolativa presentando dei promotori da cui parte la trascrizione. 23

Geni retrovirali e proteine

Una tipica sequenza retrovirale contiene tre o quattro geni, che in questo caso identificano regioni codificanti ciascuna delle quali dà in realtà origine a molteplici proteine in seguito a reazioni di modificazione-maturazione. Un tipico genoma retrovirale con tre geni è organizzato nella sequenza gag-pol-env. L'mRNA retrovirale ha una struttura convenzionale e possiede un cappuccio all'estremità 5' ed è poliadenilato all'estremità 3'. L'mRNA può trovarsi in due forme; quella a lunghezza intera è tradotta per dare le poliproteine Gag e Pol.

Il prodotto Gal è tradotto leggendo a partire dal codone di inizio fino al primo codone di terminazione che deve essere aggirato per esprimere Pol. Meccanismo diversi sono usati da virus diversi per procedere oltre il codone di terminazione di gag, secondo la relazione fra i moduli di lettura gag e pol. Quando gag e pol vengono lette senza interruzione, una soppressione da parte di un glutammil-tRNA che riconosce il codone di terminazione permette di generare una singola proteina, mentre quando gag e pol sono in moduli di lettura diversi, si verifica un frameshift ribosomiale per generare una singola proteina.

La poliproteina Env è espressa, invece, in un altro modo: un splicing genera un messaggero subgenomico più breve che è tradotto nel prodotto Env. Il gene gag dà origine ai componenti proteici del core nucloproteico del virione, il gene pol codifica per funzioni che riguardano la sintesi e la ricombinazione dell'acido nucleico, mentre, il gene env codifica per componenti dell'involucro della particella che sequestra anche componenti della membrana citoplasmatica cellulare.

Comunque sia i prodotti Gag o Gag-Pol che Env sono poliproteine che vengono tagliate da una proteasi per rilasciare le singole proteine che si trovano nei virioni maturi. Quindi ricapitolando una volta trascritto il genoma virale integrato avremo un trascritto genomico che rappresenterà il genoma dei virioni, mentre altri trascritti andranno a costituire con diverse modalità come abbiamo visto le proteine, indispensabili per il perdurare degli stessi virioni, che andranno a interagire con la membrana plasmatica per la formazione del virione attraverso gemmazione.

La Trascrittasi Inversa è quindi una polimerasi che consente di produrre al termine della reazione una molecola di DNA a doppio filamento, che è la copia complementare rispetto all’RNA a singolo filamento introdotto nella cellula.

Utilizza un tRNA come primer, e la sintesi della molecola avviene attraverso dei “salti”, ossia inizia in un punto per finire e ricominciare da un’altra parte della molecola, producendo molecole di DNA parziali che diventano ogni volta primers per sintetizzare la restante parte della molecola.

L’enzima ha anche una capacità RNasica, che gli consente di degradare l’RNA appena trascritto.

Essendo molto grande, è un enzima molto efficiente nelle sue attività, riuscendo contemporaneamente a:

• Rompere legami H.
• Rompere/formare legami fosfodiesterici.

Tutte queste funzioni sono svolte dalle numerose subunità che lo compongono. 24 27/11/2020

Il codice genetico

Le regioni di DNA che diventano substrato di enzimi Polimerasi per essere trascritte in RNA prendono il nome di “unità di trascrizione”. Gli RNA sono distinti in:

• Codificanti: dalla loro sequenza viene direttamente prodotta una proteina, mRNA.
• Non codificanti, rRNA, tRNA e snRNA, aiutano l’mRNA nel meccanismo di sintesi e regolazione.

Esiste un meccanismo ben preciso che consente di tradurre le sequenze composte dall’alternanza di soli 4 nucleotidi diversi, A, U, G, C, in sequenze proteiche di 20 aminoacidi canonici.

In che modo i nucleotidi di una molecola di mRNA specificano la sequenza amminoacidica di una proteina? Avendo a disposizione quattro nucleotidi diversi, A, C, G, U, qualora si trattasse di un codice a una sola lettera, potrebbero essere codificati soltanto quattro amminoacidi. Diversamente, se fosse un codice a due lettere, potrebbero essere codificati 16, 4 x 4, amminoacidi. Un codice a tre lettere, invece, genera 64, 4 x 4 x 4, codici possibili più di quanto sia necessario per codificare i 20 aa presenti nelle cellule viventi. Dal momento che esistono solo 20 diversi aminoacidi, il presupposto dell’esistenza di un codice a tre lettere suggerisce, come in effetti avviene, che alcuni amminoacidi possano essere codificati da più combinazioni di tre nucleotidi.

Una regione di mRNA che deve essere tradotta viene letta 3 nucleotidi per volta, a partire dal 5’ e mantenendo la direzione della Replicazione e della Trascrizione. Supponendo che 3 nucleotidi corrispondono ad un aminoacido, l’associazione tra tripletta e aminoacido dipende dal Reading Frame.

In che momento bisogna iniziare a contare le triplette? Nell’mRNA, oltre ad essere contenuta la sequenza di DNA da tradurre in proteina, ci sono anche informazioni che indicano qual è la prima tripletta che corrisponde all’aminoacido da tradurre. Queste inf