Biologia Molecolare

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I meccanismi di maturazione sono già stati affrontati, invito a guardare i capitoli precedenti. La regolazione a livello post-trascrizionale avviene quando l'RNAm è stato prodotto, ma non regola più quanto RNA deve essere prodotto ma quando questo deve essere trasformato in proteina. Uno dei meccanismi è l'RNA interference (interferenza RNA) che è un controllo dell'espressione genica che si basa sulla presenza di piccole molecole a RNA e doppio filamento, le quali servono a bloccare la traduzione di una RNAm, dunque la formazione di una proteina. Basta attaccare all'RNAm una piccola molecola, corta di RNA, chiamato RNA antisenso, che non è altro che un piccolo (20 nucleotidi circa) frammento di RNA, complementare alla regione dell'RNA bersaglio. Questo meccanismo veniva utilizzato in precedenza per bloccare la produzione di proteine, ma si rivelava poco efficiente. Solo grazie agli scienziati Fire e Mello, si

trovò un processo più efficiente: loro presero un nematode (Caenorhabditis elegans), inibendo l'espressione di vari geni. Loro inserirono in 3 gruppi diversi di nematodi 3 differenti molecole di RNA. In un gruppo di nematodi è stato inserito un piccolo frammento di RNA antisenso (con sequenza COMPLEMENTARE alla molecola bersaglio); in un altro gruppo sono state inserite molecole di RNA senso (ossia consequenza UGUALE alla molecola bersaglio); nell'ultimo invece sono state inserite molecole di RNA a doppio filamento formate dall'unione da frammenti antisenso e senso. Quali geni hanno inibito? Hanno inibito quel gene che codificava per una proteina, la quale, in sua assenza, il nematode avrebbe avuto degli spasmi; oppure il gene che induceva la colorazione dell'embrione. Soltanto con il la molecola a RNA a doppio filamento il nematode iniziava ad avere degli spasmi, stessa cosa valeva per la colorazione dell'embrione. Ne derivò cheall'interno delle cellule c'è un meccanismo di regolazione che avviene attraverso la produzione di RNA a doppio filamento. Ne susseguirono tutta una serie di esperimenti che fecero notare che in realtà esistono due tipi di RNA a doppio filamento che sono miRNA (dove "mi" sta per micro) e siRNA (dove "si" sta per small interfering RNA). In miRNA sono prodotti endogeni, che la cellula produce da sé, e induce la degradazione dell'mRNA o inibendo la traduzione; mentre i siRNA sono prodotti esogeni o endogeni che agiscono su un solo mRNA bersaglio Funzione di difesa verso elementi genetici estranei (come nelle piante). Come funzionano i miRNA? Vengono generati nel nucleo, passati poi nel citoplasma dove bloccano l'RNAm bersaglio. Nel nucleo avviene la biosintesi del miRNA e può essere di tipo canonico o non canonico (parte dai mirtroni che non sono altro che introni). • Nella biogenesi canonica i miRNA presentano a

livello del DNA dei veri e propri geni che vengono trascritti e trasformati in RNA. I geni del miRNA possono essere singoli (un gene) o più geni raggruppati. Chi li trascrive? L'RNAp II, che dà origine a una forma immatura del miRNA detti primi miRNA, che può essere singolo o dall'unione di più molecole (a seconda di come è avvenuta la trascrizione).

Questi miRNA (che hanno una forma a forcina), hanno la caratteristica di avere a 5' un cappuccio e a 3' una coda di PoliA, come abbiamo visto anche nell'RNAm. (NOTA: la professoressa chiede il disegno all'esame). Questi pri-miRNA subiscono, a livello del nucleo, un taglio che li trasforma in pre-miRNA, il taglio toglie il cappuccio e la poliA, lasciando i nucleotidi sporgenti. Il taglio viene compiuto da un complesso, detto complesso del microporcessore, la quale contiene una RNAasi che si trova nel nucleo che si chiama Drosha (una RNAsi che taglia il pri-miRNA formando un pre-miRNA).

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costituito da 60-70 nucleotidi), la quale si fa aiuta da delle proteine che si legano nelle zone che devono essere tagliate del pre-miRNA.

• La biogenesi non canonica i miRNA vengono prodotti a partire da delle regioni di DNA chiamati mirtroni, che ricordano appunto gli introni. Queste zone però non vengono degradate perché contengono l'info per produrre un miRNA.

Cosa accade? Si forma un pre-RNA con introni ed esoni, che subirà i vari processi di maturazione. Noi sappiamo che nel processo di splicing si viene a formare una struttura a cappio che poi viene degradata, ma siccome non stiamo trattando con introni, questa struttura permane, anzi è diventa substrato di un enzima, detto enzima deramificante del cappio (Ldbr) che trasforma questa struttura a cappio in un pre-miRNA.

A questo punto il miRNA viene trasportato nel citoplasma. Viene legato a una proteina che è un recettore di esportazione nucleare che si chiama esportina 5 che è legata a

un'altra proteina monomerica che si chiama RUN detta G proteina, perché si lega al GTP, per questo esiste in due forme: attiva se legata a RUN o non attiva se non legata. Attraverso l'idrolisi di GTP può passare attraverso i pori, l'idrolisi inoltre permette la dissociazione di RUN e esportina. A questo punto siamo nel citoplasma. Qui agisce una RNAasi, la ribonucleasi Dicer che taglia il pre-miRNA formando un miRNA maturo a doppio filamento sporgente al 3'. Dicer agisce in associazione con altre proteine che sono importanti nella formazione del successivo complesso RISC. Il mRNA si lega alla proteina argonauta e si forma il complesso proteico pre-RISC (RNA-induced silencing complex). Questo complesso individua tra i due filamenti di miRNA il filamento senso e antisenso, e degrada il filamento SENSO, perché ha la sequenza nucleotidica uguale al filamento di RNA messaggero a cui si deve legare. Vi è dunque la rimozione del filamento passeggero e la formazione.del complesso RISC con il filamento guida delmiRNA che si potrà legare all'RNAmessaggero bersaglio.(NOTA: questo processo va saputo alla perfezione, laprofessoressa ci tiene particolarmente all'esame, se cifossero delle incertezze controlla il libro).La proteina argonauta ha 3 dominui: Il dominio PAZ ècoinvolto nel legame all'estremità 3' OH dell'RNA. Il dominio PIWI, contiene due ioni magnesio,serve a legare i gruppi fosfato negativi sul miRNA, consiste di un canale carico positivamente, chegli conferisce le caratteristiche di RNA-binding protein, dal momento che l'acido ribonucleico ècarico negativamente. Il dominio MID riconosce la regione 5'UTR del filamento guida.Quando il miRNA antisenso si lega all'RNA bersaglio possono accadere due cose: o c'è ladegradazione dell'RNAm, oppure l'RNAm non viene tradotto in proteina. Queste due stradedipendono dalla complementarietà dei due filamenti.

Perché se la complementarietà è perfetta e combaciano si ha la degradazione dell'RNAm, se invece il miRNA combacia in maniera imperfetta vi è il blocco della traduzione.

Cosa sono i miRNA circolanti? Attraverso i meccanismi appena visti può essere prodotto un filamento a singola elica di miRNA e veicolati all'interno del sangue, i meccanismi di passaggio ancora non sono chiari. Questi vengono captati da cellule e i filamenti entrano nelle cellule da cui vengono captate. Dunque, per chiarirsi, determinate cellule producono questi filamenti di miRNA, i quali poi entrano nel flusso sanguigno, i filamenti vengono captati da altre cellule e vi entrano in essi andando a regolare l'espressione di queste cellule.

L'altro tipo di RNA già prima citato, sono siRNA, sono molecole che la cellula prende dall'esterno e li ingloba nel citoplasma. Questi vengono utilizzati per bloccare l'espressione di una determinata proteina.

Molecole di siRNA si producono a partire da lunghe molecole di RNA prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula, quali trasposoni, virus o transgeni. RNA perciò rappresenta un sistema di difesa contro l’invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma.

Recentemente si è notato che i miRNA possono regolare anche la formazione di eterocromatina e possono regolare la trascrizione di determinati geni (dunque non solo un controllo post-trascrizionale). Come si svolge la funzione dei miRNA, sulla formazione di eterocromatina? Vi sono meccanismi epigenetici con modificazioni chimiche sugli istoni, in particolar modo è stato visto che queste modifiche epigenetiche, che promuovono la formazione di cromatina, sono quelle che coinvolgono la metilazione sulla lisina 9 e 27 dell’istone H3.

Quando la lisina in posizione 9 viene metilata si ha il silenziamento genico e la formazione di eterocromatina.

quando invece la lisina in posizione 9 viene acetilata si ha l'espressione genica, quando si ha la trascrizione, perché l'acetilazione sulle code terminale ha l'effetto opposto dell'ametilazione. Quando la lisina in posizione 27 viene metilata si ha il silenziamento. RICAPITOLIAMO: Vengono prodotte a livello del nucleo queste molecole di RNA a doppio filamento, passano nel citoplasma, dove grazie a Dicer vengono scisse in tante molecole più corte di siRNA. I miRNA ripassano dal citoplasma al nucleo (con un meccanismo tutt'oggi ancora non conosciuto), dove vanno a legarsi in prossimità del DNA dove ci sono gli istoni H3, in prossimità della lisina 9/27 e in questo modo guidano gli istoni metil-trasferasi che sono enzimi che servono alla metilazione della lisina 9 e 27, che metilandosi bloccano la trascrizione di quella porzione di DNA e promuovono la formazione di eterocromatina. Traduzione Nel processo di traduzione si passa da un linguaggio a nucleotidi.icato da un amminoacido specifico.