Biologia Molecolare - seconda parte

Ricomposizione omologa

I danni che coinvolgono entrambi i filamenti della doppia elica (DSB Double Strand Break), per esempio le rotture causate da radiazioni ionizzanti, sono molto più gravi di quelli che interessano un singolo filamento e possono portare alla morte della cellula. In caso di rottura, il macchinario molecolare coinvolto nella riparazione deve procedere a identificare i frammenti di DNA risultanti dalla rottura e a ricongiungerne le estremità, ricostruendo la sequenza corretta.

Meccanismi di ricombinazione di DSB

• Non Homologous End-Joining (NHEJ): Unione delle estremità non omologhe
  Quando il DNA subisce delle rotture a doppio filamento, il danno può essere riparato grazie al meccanismo di unione delle estremità non omologhe, che implica il coinvolgimento di specifiche proteine (Ku70 e Ku80) per legare i frammenti di DNA nei siti di rottura. In seguito, interviene una nucleasi che taglia queste estremità, rimuovendone alcuni nucleotidi, e una DNA Ligasi IV, che può risaldare la doppia elica. Tale meccanismo porta a una riparazione che può introdurre degli errori (error prone) provocando la perdita di brevi tratti di sequenza, o la ricongiunzione di estremità non corrette, che può causare riarrangiamenti cromosomici.
• Direct Homologous Recombination (HDR): Riparazione per ricombinazione omologa
  Permette di riparare rotture del doppio filamento del DNA in maniera fedele alla doppia elica di origine, mediante la ricombinazione di regioni di una certa dimensione: riguarda sia procarioti che eucarioti, ed è la conseguenza di un danno che riguarda entrambi i filamenti di DNA. La forma più comune di HDR è la ricombinazione omologa. Tale meccanismo può essere utilizzato dalla cellula solo quando nel nucleo è presente un pezzo di DNA omologo, principalmente nelle fasi G2 e S del ciclo cellulare: necessita di altro DNA “donatore”, ossia della presenza di un cromatidio fratello (o di un cromosoma omologo, negli organismi diploidi) come stampo, e quindi agisce solo dopo la replicazione del DNA.

Un primo meccanismo è l'intervento di filamento sintesi-dipendente (SDSA): esonucleasi modifica il sito di rottura, degradando in direzione 5’-3’ le due estremità 5’ di ogni filamento; le estremità sporgenti vengono stabilizzate dalla proteina RecA (Rad51 negli eucarioti).

Il singolo filamento stabilizzato può, a questo punto, cercare le sequenze omologhe sul cromatidio fratello, mediante l’invasione del filamento e la formazione di un’ansa (ansa D, per displacement), permettendo la sintesi complementare utilizzando come stampo il cromatidio preesistente. Successivamente, i filamenti si separano, l’ansa si risolve e la DNA polimerasi riempie le lacune. Il legame fosfodiesterico tra le due estremità libere è saldato dalla DNA Ligasi.

La riparazione senza errori delle rotture a doppio filamento può avvenire anche per un meccanismo alternativo, che coinvolge entrambi i filamenti di DNA, con la formazione di “giunzione di Holliday”, una struttura a croce nota come la quale può essere risolta in modi differenti, generando uno scambio delle sequenze dei cromosomi omologhi (crossing over durante la meiosi), oppure sostituendo la sequenza del cromatidio fratello/cromosoma omologo danneggiato con quella dell’altro cromatidio fratello/cromosoma omologo (conversione genica).

Non sempre ci sono regioni omologhe nei punti in cui il DNA viene tagliato, perché il danno potrebbe avvenire in qualsiasi regione: se le estremità sono qualsiasi, il ricongiungimento da parte delle proteine può portare a conseguenze come inserimento/rimozione o sostituzione di qualche nucleotide, quindi mutazioni INDEL (ossia mutazioni da inserzione o delezione). Non è quindi un meccanismo preciso! Tali mutazioni sono spesso presenti in regioni di DNA non importanti, quindi in cui vengono ben tollerate nell’insieme della molecola.

Il meccanismo di errore-riparo può essere innescato volutamente dalle cellule, e richiede come primo step il taglio del DNA a doppio filamento, operato da una proteina che favorisce meccanismi che portano a ricombinare il DNA. Non è più quindi un meccanismo di danno e riparo, bensì fisiologico, cioè utilizzato dalla cellula stessa per consentire la ricombinazione di una data regione del DNA: avviene spesso durante il crossing over, per lo scambio di regioni di DNA tra cromatidi fratelli.

Ci sono dunque due possibilità che un danno possa essere riparato:

• Congiungimento delle due estremità di DNA
• Utilizzo di un DNA esterno donatore utilizzato per riparare il danno

Riparazione per ricombinazione omologa in E. coli

Anche nei procarioti, la ricombinazione omologa nasce essenzialmente per riparare danni provocati da eventi sia fisiologici sia patologici della molecola di DNA, la quale ha subito un taglio netto dei due filamenti, che deve essere ripristinato. Il meccanismo avviene mediante il sistema elicasi/nucleasi RecBCD. L’enzima RecBCD processa le molecole di DNA con rottura del doppio filamento DBS, per generare regioni di DNA a singolo filamento, e aiuta poi il caricamento della proteina RecA.

L’enzima RecBCD è composto da 3 subunità:

• RecB
• RecC
• RecD

Esso possiede un'attività elicasica e un'attività nucleasica; si lega inoltre alla molecola del DNA a livello del DSB.

Il meccanismo è regolato dai siti  (“chi”), ossia sequenze di DNA specifiche che insieme costituiscono il Crossover Hot Spot Investigator (). Il DNA viene processato da parte delle proteine RecBCD: queste possono entrare sulla molecola da entrambe le estremità del DNA tagliato, ma i siti funzionano solo in un orientamento. RecBCD ha due attività elicasiche:

• RecD (attività 5’→3’), si muove rapidamente sul filamento con l’estremità 5’.
• RecB (attività 3’→5’), si muove lentamente sul filamento con l’estremità 3’.

Conseguenza delle diverse velocità è la formazione di un’ansa sul filamento 3’. Quando arriva al sito , l’attività nucleasica della proteina RecBCD viene modificata, e successivamente si distacca dal DNA. Infatti, appena RecBCD raggiunge specifiche sequenze poste a distanza dal sito :

• Non idrolizza più il filamento di DNA con direzione 5’→3’
• Idrolizza più velocemente il filamento di DNA con direzione 3’→5’

Di conseguenza, la molecola di DNA a doppio filamento viene trasformata in una molecola con una coda a filamento singolo, l’attacco di RecA, che rappresenta la proteina fondamentale per la ricombinazione omologa in E. coli: appartiene alla famiglia delle proteine che scambiano il filamento e che catalizzano l’appaiamento di molecole di DNA omologhe. Le molecole di DNA che devono essere scambiate devono avere precise caratteristiche:

• Presenza di sequenze di DNA complementari tra le due molecole di DNA.
• Almeno un filamento deve essere più lungo rispetto all’altro, per favorire il legame della RecA.
• Una regione a singolo filamento su almeno una delle due molecole, per consentire l’attacco di RecA.
• Presenza di un'estremità nella regione di complementarietà, che consenta la formazione della struttura a doppia elica: bisogna distinguere le basi complementari, cioè le sequenze di nucleotidi ben definite che rappresentano i siti di riconoscimento per segnalare lo scambio di un dato filamento.

RecA è una proteina polimerica (più monomeri globulari) costituita da molte subunità organizzate a formare una struttura ad anello, che si assembla (mediante interazione diretta) sul filamento di DNA, attorcigliandosi al filamento 3’; in questa fase, il filamento al 5’ è inutile e fastidioso ai fini del meccanismo, per cui deve essere eliminato. Le subunità di RecA si associano più velocemente al 3’, e ciò genera una direzionalità dell’assemblaggio, con conseguente ricopertura del filamento al 3’ da parte della stessa RecA, mentre il filamento al 5’ viene considerato “substrato da scartare”.

Modello a due fasi per la selezione e lo scambio dei filamenti

1. Assemblaggio su regione di ssDNA con filamento singolo
2. Il complesso RecA-ssDNA attivo è necessario per la ricerca della regione omologa (regione complementare per riformare la doppia elica) grazie al sito primario e al sito secondario RecA praticamente scannerizza intere regioni di DNA per trovare la regione complementare (meccanismo poco chiaro).

Modello della riparazione della rottura a doppio filamento

1. DBS (rottura a doppio filamento)
2. Una nucleasi (RecBCD) degrada la molecola di DNA3’ del doppio filamento, posizionandosi all’estremità per produrre delle regioni a singolo filamento con 3’ OH, estremità a cui si lega la proteina RecA.
3. I siti  sono elementi di segnalazione di una rottura del filamento: le proteine RecBCD si posizionano all’estremità e modificano il filamento  fino ai siti , dove si fermano. Esse hanno quindi attività elicasica e nucleasica, in quanto svolgono l’elica rompendo i legami idrogeno e tagliano frammenti di DNA che vengono eliminati: accorciano le estremità fino a raggiungere i siti . Il compito di tale complesso è infatti quello di raggiungere i siti di omologia, perché solo lì possono avvenire i processi molecolari che consentiranno il riparo del danno: devono aprire, rompere e accorciare i filamenti!
4. Al termine, i due filamenti che si ottengono a seguito delle varie modificazioni non hanno lunghezza uguale: l’estremità 3’ di un filamento è più corta rispetto alla 5’ dell’altro filamento, dal momento che le proteine del complesso si muovono con velocità e direzioni diverse, creando delle anse a livello del filamento 3’ (più corto, con estremità su cui si va a legare la RecA).

La sequenza  è chiamata “Sequenza di Omologia” ed è caratterizzata da una sequenza nucleotidica ben precisa, poiché fornisce indicazioni alle RecBCD per modificare i filamenti (rappresentano il punto di arrivo delle proteine stesse) e alla proteina RecA per riparare il danno ed evitare di perdere del materiale. I siti  non vengono tagliati, ma devono necessariamente trovare il loro sito omologo sull’altro filamento.

Il filamento omologo intatto viene invaso dalle code di DNA a singolo filamento, a seguito di cui le due molecole di DNA sono connesse da filamenti che si incrociano. Questa struttura a croce è nota come “Giunzione di Holliday”: la ricerca del filamento omologo genera uno scorrimento della struttura di Holliday, per cui si parla anche di “migrazione del chiasma”.

Le due Giunzioni di Holliday che si formano negli intermedi di ricombinazione si muovono per migrazione del chiasma, e infine vengono risolte per terminare la ricombinazione.

Una volta trovata la sua regione di complementarietà (mediante la DNA Polimerasi), il filamento che invade si appaia con il filamento complementare sull’altra molecola di DNA complementare, cioè blocca il suo cammino per poter ripristinare la sua struttura. Il DNA assume una forma alterata, in cui è ancora instabile e non può esistere (solo la doppia elica è stabile!) per cui, una volta riparato il danno, anche la giunzione di Holiday deve essere eliminata.

Eliminazione della giunzione di Holliday

Affinché un appaiamento diventi definitivo, è necessario che la Giunzione di Holliday venga rimossa ad opera delle Endonucleasi RuvABC, mediante due possibili tagli:

• Verticale: avviene esclusivamente sui due filamenti del DNA di una delle due molecole parentali, e porta alla formazione di una molecola ricombinante (prodotto dello scambio ad incrocio o crossing over o splicing). A seguito della separazione delle due molecole quindi, un filamento rimane integro, mentre l’altro viene coinvolto nel meccanismo di taglio (che avviene solo su una regione di DNA) e si va a ricombinare con la parte di filamento da cui è stato tagliato, sull’altra molecola. Dei quattro filamenti di due molecole di DNA, solo due filamenti per molecola vengono tagliati e ricongiunti!
• Orizzontale: avviene su entrambi i filamenti di DNA che contengono sequenze provenienti dai filamenti parentali, e genera filamenti ibridi (prodotti partch). A seguito del taglio, due filamenti rimangono integri, mentre gli altri due vengono tagliati per poi ricongiungersi con quelli opposti. Il taglio avviene in modo da eliminare l’incrocio (per tornare ad essere parallelo) mediante la rottura, da parte della RuvABC, dei legami fosfodiesteri tra i nucleotidi dei frammenti di DNA: i doppi filamenti possono così ricongiungersi. A seconda di come viene tagliato l’incrocio, si ottengono molecole diverse, quindi ricombinazioni di DNA diverse tra loro, in modo da generare prodotti patch (taglio orizzontale) o crossing over (taglio verticale).

Il filamento 5’, che inizialmente viene perso, in realtà contemporaneamente viene ricombinato dalla DNA Polimerasi, con la sintesi di filamenti complementari che ripristinano la regione danneggiata! In realtà, i complessi proteici che intervengono dall’inizio sono due: uno su una estremità e uno sull’altra, in modo che entrambe le regioni del doppio filamento vengano ricombinate contemporaneamente e alla stessa maniera.

Ricomposizione omologa negli eucarioti

La ricombinazione omologa è presente anche negli eucarioti, ma con alcune differenze rispetto ai procarioti:

• Nei procarioti è un meccanismo di riparo dei danni
• Negli eucarioti è un meccanismo di scambio di segmenti di DNA, alla base della variabilità genetica

Avviene durante la meiosi, in quanto è un meccanismo utilizzato in modo fisiologico per scambiare il DNA tra cromatidi fratelli: il taglio è solitamente di tipo verticale, e la rottura del DNA a doppio filamento è un evento programmato, attraverso gli stessi steps che interessano anche la ricombinazione nei procarioti. Tale meccanismo è alla base della variabilità genetica nelle cellule germinali che subiscono la divisione meiotica.

La formazione dei DSB durante la meiosi richiede la presenza di:

• Proteine Spo11 e del complesso MRX, omologhi dei complessi RecBCD in E. coli
• Proteine Dmc1 e Rad51, corrispondenti al complesso delle RecA in E. coli

MRX media l’accorciamento delle estremità 5’ a livello della rottura; successivamente, le proteine che scambiano i filamenti Dmc1 e Rad51 si assemblano sulle code a singolo filamento. La proteina Spo11 consente la formazione del taglio a livello del doppio filamento, che deve essere necessariamente generato per attivare il meccanismo: il gruppo OH di una Tirosina della Spo11 attacca il DNA con formazione di un legame covalente. Per generare una rottura a doppio filamento sul DNA, sono necessarie due subunità, ognuna delle quali attacca uno dei due filamenti; dopo il taglio effettuato da Spo11 si hanno gli stessi processi dei procarioti.

Quindi, nel caso in cui negli eucarioti si verifichi un danno/taglio al doppio filamento, si innesca comunque un meccanismo di ricombinazione, ma meno frequentemente rispetto ai procarioti, in quanto molto pericolosa!

Negli eucarioti il meccanismo della ricombinazione avviene quindi durante specifiche fasi del ciclo cellulare:

• Ricombinazione non omologa in G1
• Ricombinazione omologa (HDR) in S e G2

Riparazione dei double strand breaks

Nelle cellule eucariotiche, il danno del doppio filamento della molecola di DNA si ripercuote a livello tissutale, per cui i meccanismi di controllo dei danni stessi sono estremamente complessi e utilizzano le normali proteine di riparo, assieme a meccanismi di checkpoint (di verifica). Questi complessi molecolari garantiscono infatti l’azione o l’inibizione dei meccanismi di riparo, e sono coinvolti nel controllo del DNA: se sono presenti alterazioni, i checkpoint bloccano il ciclo cellulare e la replicazione del DNA, e allo stesso tempo permettono la riparazione e ricombinazione del DNA, e l’apoptosi della cellula stessa.

Un danno al DNA, che può essere per escissione di nucleotidi o di basi, viene rivelato da specifici sensori del danno, ossia le proteine ATM e ATR, che aiutano i meccanismi di riparo stessi ad essere effettuati. Il ruolo e l’interazione della ATM sono importanti in quanto associati a meccanismi tumorali. Le proteine CDK-cicline controllano e garantiscono le tempistiche e le procedure corrette del ciclo cellulare: sono strettamente associate ai sistemi che vanno a regolare il riparo del DNA!