Biologia Molecolare - seconda parte

Metodi di marcatura delle sonde

A seconda del tipo di marcatura della sonda, si ha un diverso metodo di visualizzazione:

• Marcatura con isotopi radioattivi
• I tre elementi più usati sono P, S e H:
• 32P: emette una radiazione b molto energetica, quindi gli elettroni tendono a diffondere in tutte le direzioni; ciò si traduce nella formazione di bande larghe e diffuse visibili nell'autoradiografia.
• 35S: emivita di quattro volte maggiore rispetto al fosforo; emette una radiazione meno energetica, per cui le bande risultano più nette.
• 3H: emette una radiazione b meno energetica; impiegato per alcune tecniche in situ dei cromosomi, dove è necessario che la risoluzione su lastra autoradiografica sia minore di 1μm.

La marcatura radioattiva di una sonda di DNA può essere realizzata con diversi metodi, tra cui...

cui il metodo dei primer random, in cui il DNA viene denaturato in singoli filamenti mediante bollitura e rapido raffreddamento in ghiaccio. Primer di DNA da sei nucleotidi, sintetizzati per incorporazione casuale di nucleotidi, vengono fatti ibridare al DNA: ciò avverrà in molti punti della molecola, perché nella miscela di reazione sono presenti tutti i possibili esanucleotidi.

I primer vengono allungati dal Frammento di Klenow della DNA Polimerasi I, che usa precursori (dNTP) marcati radioattivamente, di solito mediante l'utilizzo di un isotopo radioattivo legato al 5' dello zucchero desossiribosio. La rilevazione del DNA legato alla sonda dipenderà dal tipo di isotopo utilizzato e dalla capacità di rilevarne le particelle emesse.

Per esempio, se una sonda marcata con P si è ibridata ad una sequenza di DNA bersaglio su un filtro, il filtro viene messo a contatto con una lastra 32 sensibile alle particelle emesse, e il tutto viene posto al buio.

Ogni punto del filtro dove si trova P viene rilevato come una zona nera su lastra (banda) dopo lo sviluppo. Questa procedura è chiamata "autoradiografia", e la fotografia risultante dal segnale è chiamata "autoradiogramma".

40Marcatura non radioattiva (marcatura fredda)

Metodi basati sulla coppia di ligandi Avidina (o Streptavidina) e Biotina, che si legano con alta affinità (Kd = 10^-14). La Biotina viene inizialmente incorporata nella molecola di DNA, sia chimicamente, sia tramite l'incorporazione di nucleotidi marcati con Biotina. L'ibridazione viene rivelata o tramite Avidina a sua volta marcata o con fluorocromi o con enzimi capaci di catalizzare una reazione colorata, oppure con anticorpi anti-avidina.

Il sistema basato sulla bioluminescenza prevede la denaturazione della sonda con Glutaraldeide e Perossidasi. La Perossidasi si associa al DNA in modo irreversibile a causa della presenza della Glutaraldeide, e la sonda

ottenuta viene usata per l'ibridazione del DNA target. Gli ibridi vengono rilevati grazie all'utilizzo di un substrato della Perossidasi, che emette luce una volta metabolizzato (luminol): la luce emessa impressiona una lastra fotografica, su cui viene evidenziata la banda specifica riconosciuta dalla sonda. Gli inconvenienti di questa tecnica sono la fugacità della reazione di luminescenza (dura circa 10 minuti) e la necessità di usare una grande quantità di sonda. Un'altra tipologia di marcatura non radioattiva consiste nel marcare i nucleotidi mediante l'addizione di undideossiterminatori gruppo chimico fluorogeno, diverso per ogni base (metodo Sanger di sequenziamento del DNA) che, quando colpito da un laser, emette fluorescenza. Le caratteristiche di bioluminescenza o di radioattivo impregneranno la lastra, e consentiranno di individuare il DNA ibridato con la sonda. A seconda della marcatura, si ottiene una visualizzazione diversa: le

lastre autoradiografiche possono impregnarsi sia di chemio-luminescenza sia di radiograficità: mentre nel sistema con Avidina o Streptavidina le bande si vedono direttamente colorate sul filtro di nitrocellulosa (senza bisogno di lastra autoradiografica), in questo caso il filtro resta bianco, e deve necessariamente essere sottoposto a lastra autoradiografica, per evidenziare le bande.

PREPARAZIONE DI UNA SONDA

Marcatura terminale all'estremità 5' - Trattamento della sonda con Fosfatasi alcalina, enzima in grado di eliminare il gruppo fosfato all'estremità 5'.

Trattamento del DNA così defosforilato viene trattato con Polinucleotide Chinasi, un enzima capace di catalizzare il trasferimento dell'atomo di fosforo γ dell'ATP al terminale 5'-OHP in defosforilato del DNA.

Marcatura terminale all'estremità 3' (end filling) - L'enzima Terminal Transferasi catalizza l'aggiunta di circa 20-30

deossinucleotidi (dNTP) all'estremità 3'-OH di un filamento di DNA. Se come substrato vengono forniti nucleotidi trifosfati α32marcati con P in posizione, la coda di nucleotidiche viene aggiunta al filamento di DNA conterrà un atomo di fosforo radioattivo per ogni base.

Marcatura delle sonde su tutta la loro lunghezza:

1. Nick-Translation scissione di un legame fosfodiesterico 5'P – 3'-OH
1. La endonucleasi Dnasi I catalizza la su un filamento di DNA, producendo dei tagli nell'elica del DNA (nick).
2. La DNA Polimerasi I, a partire dal taglio prodotto, eliminerà i nucleotidi freddi mediante attività esonucleasica 5'→3', e li sostituirà con nucleotidi marcati.
2. Al termine della reazione, i nucleotidi non incorporati devono essere separati dalla sonda marcata con una cromatografia di filtrazione su gel (sephadex G50): le prime frazioni eluite della colonna contengono la sonda marcata.

Multi Random

Priming Dopo denaturazione, la sonda viene messa in presenza di una miscela di oligonucleotidi sintetici (esa-nucleotidi), le cui sequenze casuali corrispondono a tutte quelle matematicamente possibili (4096). Tra questi, ce ne sarà uno che si ibrida con la sonda e funge quindi da primer per il Frammento di Klenow della DNA Polimerasi I. Nella miscela di reazione vengono aggiunti dei dNTP che verranno incorporati nell'elica neosintetizzata, radioattivi, la quale risulterà quindi altamente marcata. Dopo la marcatura, si purifica la sonda marcata dai nucleotidi in eccesso con cromatografia di filtrazione su gel. → In sintesi, nel caso di marcatura radioattiva o chemioluminescenza, si usano lastre radiografiche per la visualizzazione, mentre nel caso di marcatura non radioattiva, si utilizzano tecniche diverse (non viene usata autoradiografica, dal momento che le bande appaiono già colorate e visibili sul filtro di nitrocellulosa). → Se si parte dal DNA,si può utilizzare la DNA polimerasi per amplificare specifiche regioni del DNA. Questo processo è noto come PCR (Polymerase Chain Reaction). Se invece si parte dall'RNA, si utilizza la trascrittasi inversa. Questo enzima converte l'mRNA in cDNA (DNA complementare all'mRNA stesso). Il multi-random priming è una tecnica che permette di marcare sonde e creare librerie genomiche. Questo significa amplificare il contenuto della molecola di partenza (mRNA o DNA) alle concentrazioni che consentono di cercare la molecola di interesse con maggiore facilità e velocità. Per ottenere una libreria di cDNA, si utilizza la trascrittasi inversa insieme a una miscela di primers. Questi primers hanno la capacità di ibridare con un frammento di cDNA e consentire alla polimerasi di costruire il filamento complementare, ovvero procedere alla polimerizzazione. Infine, partendo da un DNA genomico e utilizzando una miscela di primers, si può utilizzare la DNA polimerasi per amplificare specifiche regioni del DNA.si legano in modo complementare ad esso. Questo permette di identificare la presenza della sequenza di DNA desiderata. Le sonde possono essere marcate con sostanze fluorescenti o radioattive per facilitarne la rilevazione. Inoltre, è possibile utilizzare la tecnica della Southern blotting per analizzare specifiche sequenze di DNA. Questa tecnica prevede l'uso di enzimi di restrizione per tagliare il DNA in frammenti, che vengono poi separati mediante elettroforesi su gel. Successivamente, i frammenti di DNA vengono trasferiti su una membrana e ibridati con sonde specifiche per la sequenza di interesse. In questo modo è possibile individuare la presenza o l'assenza della sequenza di DNA desiderata. Infine, la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction) permette di amplificare specifiche sequenze di DNA. Questa tecnica prevede l'utilizzo di due primer che si legano alle estremità della sequenza di interesse. La DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA complementari alla sequenza bersaglio, permettendo così di ottenere una grande quantità di copie della sequenza desiderata. La PCR è molto utilizzata in ambito diagnostico e di ricerca, in quanto consente di amplificare anche piccole quantità di DNA.rappresentano dei nucleotidi specifici che possono corrispondere, nella loro sequenza, alle rispettive sequenze di DNA con cui si potrebbero ibridizzare. Oggi, le tecniche della real-time PCR consentono di avere risultati simili: Southern e Northern Blotting danno comunque la capacità di confrontare due campioni (patologico e di controllo), per comprenderne la potenziale patologia. I frammenti di DNA/RNA vengono cristallizzati, bloccati sulla nitrocellulosa, in modo da poter essere analizzati tramite sonde marcate. In caso di patologie, con il Blotting è possibile vedere la banda di DNA di interesse isolandola e ibridandola con una sonda complementare. L'ibrido ottenuto viene poi analizzato con una tecnica specifica, trasferito su lastra radiografica: se il PM o la dimensione delle bande sono diversi da quella della banda controllo, significa che c'è un'alterazione nel campione di DNA in analisi, cioè una patologia. Mentre su gel si può vedere.Il DNA totale, quindi tutte le bande, per evidenziare solo una banda si sfruttano la complementarietà delle basi al DNA target. L'ibrido sonda-usano sonde specifiche che DNA/RNA target viene trasferito (in base al tipo di sonda usata), per confrontare solo le bande di DNA/RNA di interesse ed avere quindi informazioni palesi/nitide/pulite sui pesi molecolari e sulle concentrazioni delle quantità di interesse, e quindi si possono fare confronti con le molecole di DNA campioni, per capire se ci sono alterazioni o meno. Si può recuperare il DNA di interesse nei campioni, si va a sequenziare e si capisce quali sono le effettive alterazioni. TRASCRIZIONE La Trascrizione è una funzione esclusiva del genoma (DNA), mediante cui si produce una molecola di mRNA a partire da una molecola di DNA stampo, ad essa complementare. Il DNA è la mol