Biologia molecolare

UAG, UGA.

Controllo

Negli eucarioti può avvenire a livello dell’mRNA mediante:

- il sequestro degli mRNA da parte di specifiche proteine ed il rilascio quando essi siano

richiesti,

- la rapida degradazione di alcuni altri mRNA;

la fosforilazione dei vari fattori d’inizio pare un metodo generale per la regolazione della traduzione

negli eucarioti (es: la sintesi della Hb nei reticolociti di mammiferi).

Regolazione della sintesi proteica della

globina nelle cellule eritropoietiche ad

opera dei livelli di eme

Se i livelli di eme diminuiscono, la chinasi, sotto controllo dell’eme, diviene attiva e fosforila eIF2,

ciò blocca l’ulteriore traduzione, sequestrando questo fattore in un complesso stabile con IF2B;

quando i livelli di eme sono adeguati, la chinasi è inibita ed l’eIF2 è disponibile per l’inizio della

traduzione.

Gli inibitori della replicazione

La DNA girasi introduce dei superavvolgimenti negativi nel DNA con l’idrolisi di ATP, l’enzima è

un tetramero con due subunità A e due B.

Le subunità A legano e scindono il DNA, le B realizzano la trasduzione dell’energia dovuta

all’idrolisi dell’ATP; esso diminuisce il numero di legame del suo substrato di due unità per volta,

perché la doppia elica del DNA passa attraverso un taglio di entrambi i filamenti.

I meccanismi catalitici delle girasi di tipo I e II

L = T + W

Il numero di legame (L) di una molecola circolare è definito come il numero di volte che un

filamento di DNA si avvolge intorno all’altro in direzione destrogira, molecole che differiscono

soltanto nel numero di legame sono isomeri-topologici o topoisomeri;

T (numero di Twisting) è il numero di giri di elica di Watson e Crick

W(numero di Writhing) è il numero di giri di superelica

Interferisce con la girasi, che scinde e salda le catene di DNA. Il sito di legame è la subunitù A

dell’enzima

Si lega alla subunità B della girasi inibendo l’idrolisi dell’ATP;

mutanti batterici che resistono all’acido nalidixico o alla novobiocina hanno alterazioni strutturali

rispettivamente nelle subunità A o B della girasi.

Inibitori della trascrizione

La rifamicina e la rifampicina (proc)

Sono entrambi antibiotici

Il primo deriva da un ceppo di Streptomyces, il secondo è un derivato semisintetico;

inibiscono la sintesi di RNA, legandosi specificatamente alla subunità β delle RNA polimerasi

batteriche, impedendo l’inizio della trascrizione (bloccando la formazione del primo legame

fosfodiestere).

La actinomicina -D (proc. Euc)

È un antibiotico che deriva da un ceppo diverso di Streptomyces, il suo sistema ad anello triciclico

(fenossazone) si intercola nel DNA a doppia elica tra appaiamenti G C, consecutivi, deformando il

DNA;

questa alterazione locale impedisce il movimento dell’RNA polimerasi lungo lo stampo. Di fatto,

l’Actinomicina-D altera tutta la doppia catena

L’acridina (Proc. Euc)

Inibisce la sintesi di RNA come la Actinomicina-D

L’α-amanitina (Euc.)

È una tossina prodotta dal fungo velenoso amanita, è un octapeptide ciclico; blocca la sintesi di

mRNA, inibendo la RNA polimerasi II e, a più alte concentrazioni, la polimerasi III; non ha effetti

sulla I.

Impedisce la formazione di precursori dell’mRNA, legandosi saldamente alla RNA polimerasi II.

La streptomicina (proc)

È un trisaccaride che interferisce con il legame del formilmetionil-tRNA ai ribosomi, impedendo il

corretto inizio della sintesi proteica;

a concentrazioni relativamente basse causa l’errata lettura del codice genetico, a concentrazioni più

alte inibisce l’inizio della sintesi proteica, la proteina S12 (subunità 30S), bersaglio dell’antibiotico;

è responsabile della sensibilità alla streptomicina.

La tetraciclina (proc) Si lega alla subunità 30S del ribosoma e inibisce il legame degli

amminoacil-tRNA, bloccando il sito A.

Il cloranfenicolo (proc) ed il cicloesimide (euc)

Inibiscono la peptidil-transferasi che catalizza il legame peptidico tra il gruppo carbossilico attivato

della catena polipeptidica in fase di crescita e il gruppo amminico dell’aminoacil-tRNA.

Eritromicina (proc)

Inibisce la traslocazione, legandosi alla subunità 50S; la traslocazione consiste nell’attuazione di tre

movimenti distinti:

1) il tRNA scarisco lascia il sito P

2) il peptidil-tRNA si muove dal sito A al sito P

3) l’mRNA si sposta di tre nucleotidi

Puromicina (proc. Euc.)

Viene prodotta dalla muffa Streptomyces Alboniger, ha una struttura molto simile all’estremità 3’ di

un aminoacil-tRNA, si lega al sito A e partecipa ai passaggi dell’allungamento fino alla formazione

della peptidil-puromicina, ma non si lega al sito P e non trasloca;

essa si dissocia dal ribosoma subito dopo essersi legata all’estremità carbossilica del peptide,

causando la prematura terminazione della sintesi del peptide.

Tossina difterica (euc)

Blocca la sintesi proteica negli eucarioti, è un enzima codificato da un batteriofago presente come

lisogeno nel batterio Corynebacterium Diphteriae.

Catalizza una reazione in cui il NAD+ addiziona un gruppo ADP-ribosio a un’istidina modificata, la

diftamide facente parte del fattore di traslocazione eEF2 (l’equivalente eucariotico di EF-G),

impedendogli di traslocare la catena polipeptidica in fase di crescita.

Essendo un catalizzatore, sue minuscole quantità possono bloccare

irreversibilmente l’apparato della sintesi proeica di una cellula; quindi, la tossina

pura è tra le più micidiali sostanze conosciute.

La diftamide è una istidina modificata.

Tecnologia del DNA ricombinante

Riconoscono sequenze di basi azotate specifiche nel DNA a doppia elica e tagliano entrambi i

filamenti in punti specifici,

questi bisturi naturali sono indispensabili per:

- analizzare la struttura dei cromosomi

- sequenziare le molecole molto lunghe di DNA

- isolare i geni

- creare nuove molecole di DNA che si possono poi clonare

si trovano in numerose specie batteriche, riconoscono e digeriscono il DNA eterologo* che viene

ristretto (tagliato), quello della cellula non viene digerito, perché la sequenza riconosciuta

dall’enzima di restrizione è metilata (e pertanto protetta) da una specifica DNA metilasi.

sostanza organica proveniente da specie animale diversa da quella considerata.

*da

L’endonucleasi di restrizione e la corrispondente metilasi vengono denominate: sistema di

restrizione-modificazione

Le endonucleasi di restrizione batteriche riconoscono i siti bersaglio non metilati nelle molecole di

DNA estraneo (Es. DNA virale); la metilasi e la endonucleasi di restrizione riconosco la stessa

sequenza di basi azotate.

La metilazione di questi siti specifici è la parola d’ordine che indica che il DNA appartiene al

batterio e non ad un intruso (Es. virus), essa avviene subito dopo la sintesi del DNA batterico ad

opera di DNA metilasi appartenenti al batterio.

Esempio di sequenza riconosciuta da un enzima di restrizione

La maggior parte di questi enzimi riconosce sequenze specifiche di lunghezza compresa tra 4 e 8

basi azotate, essi idrolizzano un legame fosfodiestere su ciascun filamento; la sequenza riconosciuta

è palindromica Palindromo: deriva dal greco palindromos: tornare indietro di

nuovo. È una parola, frase o verso che risulta uguale quando

viene letto da sinistra verso destra o viceversa.

Nel DNA, il terminale viene applicato quando vi sono delle

ripetizioni invertite di una sequenza di basi azotate, con una

doppia simmetria presente nelle due catene.

Sequenze di riconoscimento di

Alcune endonucleasi di

Restrizione

Le endonucleasi di restrizione sono indicate da: un’abbreviazione a tre lettere che indica

l’organismo di appartenenza, l’indicazione del ceppo (se necessaria), un numero romano (se

l’organismo produce più enzimi di restrizione.

Gli enzimi di restrizione di uso prevalente da parte dei biologi scindono entrambi i filamenti del

DNA in modo sito-specifico e si dividono in tre tipi principali.

AdoMet (S-adenosilmetionina) è un

donatore di gruppi metilici

Tipo I

Presenta tre subunità

La catena α ha l’attività nucleasica

La catena β ha l’attività metilasica

La catena γ riconosce la sequenza palindromica;

la scissione avviene fino a 10 kbasi (kbp) dal sito di riconoscimento e la metilazione avviene al suo

interno; l’enzima si sposta lungo il DNA, idrolizzando ATP (richiesto per la traslocazione

dell’enzima e per il superavvolgimento del DNA)

Tipo II

Molti enzimi sono omodimeri, con subunità di P.M tra 30 e 40 kDa, ciascuno ha una corrispondente

metilasi (che non fa parte dell’omodimero); il tipo II non richiede ATP e taglia il DNA all’interno

della stessa sequenza di riconoscimento, si utilizzano diffusamente nella tecnologia del DNA

ricombinante.

Sequenze di riconoscimento di alcune endonucleasi di restrizione di tipo II, con indicate le basi

azotate che vengono metilate:

Tipo III

Esso ha due subunità per le attività nucleasi e metilasica, si sposta lungo il DNA senza consumo di

ATP; modifica solo un filamento di DNA ed ha un sito di taglio relativamente vicino al sito di

riconoscimento (24-26 bp).

Alcune endonucleasi di restrizione scindono entrambe le catene di DNA, lasciando basi appaiate in

entrambe le estremità: tali vengono chiamate estremità non coesive;

altre operano tagli obliqui, lasciando così due o quattro nucleotidi non appaiati in ciascuna

estremità: estremità coesive o appicicose.

Scissione di molecole di DNA in frammenti ad opera di endonucleasi di restrizione

L’enzima è un omodimero (subunità di 31 KDa ciascuna), si lega al DNA in modo che il suo asse di

simmetria coincida con l’asse di simmetria del sito bersaglio del DNA; scivola lungo la scanalatura

principale, piegando il DNA in modo transitorio, creando una neoangolatura nella doppia elica e

cercando coppie di GAA con una simmetria simile a quella dell’enzima, non svolge la doppia elica

del DNA.

Il DNA contineue due tipi di scanalature, chiamata scanaltura principale e secondaria, che si

formano poiché i legami glicosidici di una coppia di basi azotate non sono diametralmente opposti.

La neoangolatura, causata dall’enzima, allarga la scanalatura principale del DNA, con il

conseguente ingresso di α eliche che verificano l’identità delle basi azotate; le basi azotate sono lette

con altissima precisione.

Quattro α eliche (2 per ogni subunità dell’enzima) entrano nella scanalatura principale allargata alla

ricerca del sito bersaglio palindro