Biologia Molecolare - Regolazione della Trascrizione

REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE

La regolazione della trascrizione è evidente dalla risposta agli stimoli esterni. I livelli di

regolazione sono vari:

controllo trascrizionale, ovvero capacità dei fattori di regolazione di legarsi al sito

• promotore;

controllo delle modificazioni dell'mRNA;

• controllo del trasporto nel citosol dell'mRNA attraverso canali specializzati;

• controllo della traduzione;

• controllo della degradazione dell'mRNA;

• controllo della funzionalità della proteina;

•

Il controllo della trascrizione prevede 2 meccanismi principali: l'utilizzo di fattori di regolazione

e proteine regolatrici che possono modulare la velocità di trascrizione del gene, e la modifica

conformazionale della struttura cromatinica in cui risiede il gene. Le sequenze di regolazione si

distinguono in sequenze di regolazione di base, come ad esempio la TATA box o la inr, che

costituiscono il promoter e che sono responsabili del posizionamento corretto dell'RNA

polimerasi sul +1 del gene, e in sequenze di regolazione di ordine superiore.

Tra le sequenze di regolazione di base si distinguono altre sequenze che regolano la velocità di

trascrizione, ovvero che velocizzano il reclutamento dei fattori di regolazione necessari per far

attivare l'RNA polimerasi; tra queste troviamo la sequenza CAAT box e la sequenza di isole C-

P-G.

La sequenza CAAT è posta a circa 75-80 nucleotidi a monte rispetto al sito di inizio della

trascrizione, e lega la proteina CTF, mentre la sequenza di isole C-P-G si trova a circa 100-200

nucleotidi a monte rispetto al sito di inizio della trascrizione, e lega la proteina SP1. Entrambe

legano proteine di regolazione, che successivamente prenderanno contatto con i fattori di

regolazione. Il legame delle proteine CTF e SP1 con le rispettive sequenze, provoca una modifica

conformazionale del DNA che pone entrambe le proteine in vicinanza delle proteine che si

assembleranno sulla TATA box; tale meccanismo di assemblaggio aumenta la velocità di

reclutamento dell'RNA polimerasi sul complesso del PIC; un'altra ipotesi è quella che il PIC è

sempre legato alla proteina CTF, e quindi, successivamente al legame con la RNA polimerasi,

una modifica conformazionale trasporta il PIC a livello della TATA box.

Le isole C-P-G sono presenti nel genoma dei mammiferi in un numero minore rispetto alle

aspettative. Ciò è dovuto al fatto che la citosina può andare in contro a metilazione in posizione

5, cosi come può essere rapidamente deaminata. La deaminazione della citosina non metilata

porta alla formazione di uracile, un nucleotide riconosciuto come errore; la deaminazione della

citosina metilata, invece, porta alla formazione di timina, che a questo punto può essere

sostituita con una citosina per ripristinare la coppia C-G, o può portare alla sostituzione della

guanina con una adenina, eliminando così una coppia C-G. Le sequenze C-G possono trovarsi

oltre che in vicinanza della TATA box, anche in zone lontane da essa. In generale, sono presenti

25000 isole, di cui solo la metà vicino la TATA, queste ultime mai metilate. Ricordiamo infatti

che la metilazione della citosina porta a silenziamento genico. Le citosine metilate sono solo

quelle lontane dalla TATA box. Le isole C-P-G sono inoltre presenti in prossimità di tutti i geni

che codificano per proteine del metabolismo e per proteine del ciclo cellulare e dell'apoptosi.

Tra le sequenze di regolazione di ordine superiore troviamo le sequenze enhancer (permissive) e

le sequenze silencer (inibitrici). Non hanno una localizzazione specifica; possono infatti trovarsi

a monte o a valle del +1 del gene, così come vicine o lontane fino a migliaia di basi dal sito di

inizio della trascrizione.

Alcune sequenze vengono trascritte solo in presenza di un determinato stimolo; di

conseguenza, nel nucleo sarà presente una proteina di regolazione che, legandosi all'enhancer,

consente l'assemblamento del PIC o l'inibizione dell'assemblaggio. Sull'enhancer non si

assembla un solo fattore di trascrizione, ma un numero elevato di proteine; uno o più di queste

proteine sono correlate allo stimolo, mentre altre vengono assemblate allo scopo di modificare i

nucleosomi dei geni in questione (come ad esempio le HAT o i complessi di rimodellamento).

Viene a costituirsi il cosiddetto enhanceosoma, l'insieme delle proteine assemblate

sull'enhancer. Le sequenze enhancer sono molto lunghe, anche migliaia di paia di basi; alcune

proteine che si legano ad esse sono costanti, come la HMGI, una proteina architetto come la

TBP, ricca in fenilalanina, che consente la modificazione conformazionale dell'enhaner e quindi

del DNA; altre proteine sono invece legate allo stimolo, come ad esempio le p50 e p65, presenti

nell'enhanceosoma per l'interferone che costituiscono il fattore di trascrizione NF-kB.

β,

L'attivazione dei fattori di trascrizione può seguire tantissime tipologie di meccanismi, tra i quali

la fosforilazione dell'inibitore del fattore di trascrizione che si distacca e diventa attivo (avviene

in NF-kB), l'attacco di un ligando al fattore che determina la sua attivazione, l'aggiunta di una

seconda subunità, la fosforilazione del fattore di trascrizione, attivandolo, il rilascio del fattore

dalla membrana, la rimozione della proteina inibitrice che rende possibile l'ingresso del fattore

all'interno del nucleo, così come la diretta sintesi del fattore di trascrizione.

La trascrizione di un gene può essere inibita in vari modi: attivazione dei silencer tramite legame

con l'inibitore, che determina una modifica conformazionale tale da consentire l'azione

dell'attivatore sull'enhancer; competizione della proteina inibitrice con l'attivatore per il legame

con il DNA, quando le sequenze enhancer e silencer sono sovrapposte tra loro; formazione di

un dimero tra inibitore e attivatore al momento del legame con le rispettive sequenze,

impedendo la formazione dell'enhanceosoma, fenomeno che si verifica quando la sequenza

enhancer e silencer si trovano ad una distanza tale da consentire la formazione del dimero;

reclutamento da parte delle sequenze silencer di complessi di rimodellamento negativi o

deacetilasi.

Un esempio di meccanismo di controllo della trascrizione è il controllo genico da parte degli

ormoni, che superano la membrana plasmatica senza problemi, grazie alla loro idrofobicità per

quanto riguarda quelli di origine steroidea e grazie alla loro piccola struttura per quanto riguarda

gli ormoni tiroidei, che ne permette la penetrazione attraverso i pori. Degli ormoni lipofili

distinguiamo i glucocorticoidi, gli ormoni sessuali estrogeni e progestinici, la vitamina A la

vitamina D e gli ormoni tiroidei. Mentre i glucocorticoidi e gli ormoni sessuali legano recettori

a livello citosolico, le vitamine A e D legano recettori a livello nucleare. I recettori per gli

ormoni lipofili, comunque, posseggono tutti una struttura molto simile, caratterizzata da un

dominio aminoacidico centrale di legame del DNA (DNA binding protein), un estremo

aminoterminale che costituisce il dominio di attivazione, di dimensione variabile, ed un estremo

carbossiterminale che costituisce il dominio di legame dell'ormone, di dimensione costante.

I recettori proteici citosolici agiscono a partire dal legame ormone-proteina, che determina una

modifica conformazionale della proteina che porta a omodimerizzazione di quest'ultima.

L'omodimero venutosi a formare viene riconosciuto dalla chaperonina importina, che importa

il complesso proteina-ormone nel nucleo; qui avviene il legame con le sequenze enhancer, che

determina l'assemblaggio dell'enhanceosoma e quindi l'avviamento della trascrizione.

L'azione dei recettori proteici nucleari inizia con l'arrivo degli ormoni nel nucleo; qui avviene il

legame con le proteine recettoriali, che si troveranno già legato al DNA; il legame con gli

ormoni determinerà una modifica conformazionale del recettore, che verrà riconosciuta dalle

proteine accessorie, con conseguente assemblaggio dell'enhanceosoma

Un altro esempio di meccanismo di controllo è il controllo genico da parte di proteine, che non

riescono ad attraversare la membrana a causa della loro polarità. Un meccanismo di questo tipo

è quello attuato dal fattore di trascrizione STAT, che regola l'espressione genica mediante

citochine. La citochina si lega ad un recettore transmembrana avente 2 domini, un domino

aminoterminale esposto all'esterno ed uno carbossiterminale esposto verso il citosol. In

presenza di citochine, tale recettore dimerizza. Il recettore ha legato a se la proteina JAK, una

proteina ad attività serin treonin chinasica, che si attiva quando il recettore dimerizza. La JAK, in

presenza di ATP, a questo punto fosforila se stessa, autoattivandosi, ed il recettore. La

fosforilazione del recettore diventa il sito di riconoscimento per la proteina STAT, che tramite il

suo dominio SH2 riconosce il sito fosforilato e vi si lega. La JAK quindi fosforila anche la STAT,

che dimerizza con un'altra STAT che si fosforila. Le STAT, in queste condizioni, possono

staccarsi dal recettore ed entrare nel nucleo, dove potranno legarsi a sequenze enhancer di geni

che danno resistenza alla cellula sotto processo di infiammazione.

Altro sistema di controllo è il meccanismo di regolazione delle MAP chinasi RAS dipendente. In

questo caso la molecola segnale è un fattore di proliferazione, che si legherà a un recettore di

membrana tirosin chinasi, che dimerizza. La dimerizzazione attiverà l'azione tirosin chinasica del

recettore, che si autofosforila. A questo punto la proteina Grb 2 si lega ad un'altra proteina

chiamata SOS, ed il dimero formatosi si lega a sua volta con il recettore, a formare un trimero.

Al trimero, a sua volta, si lega una proteina RAS ad attività GTPasica. La RAS di solito lega GDP

quando è inattiva, ma quando il recettore è attivo, la RAS scambia GDP con GTP. La RAS legata

al GTP diventa così la proteina effettrice della MAP KKK (chinasi chinasi chinasi) serina

treonina. La RAS attiva la MAP KKK chiamata Raf che, in presenza di ATP, fosforila e attiva la

MAP KK chiamata Mek che, sempre in presenza di ATP, fosforila la MAP K chiamata Erk, che

attivatasi potrà fosforilare le proteine di regolazione, che potranno così passare nel nucleo.

La regolazione genica può anche essere posttrascrizionale. In generale, questa rende

indisponibile al ribosoma l'mRNA formatosi, evitando la traduzione. I meccanismi di

regolazione posttrascrizionale possono riguardare il controllo delle modificazioni dell'mRNA, il

controllo dell'accesso dell'mRNA nel citosol, il controllo della traduzione, il controllo

dell'attività delle proteine (modifica posttraduzionale), e l'