Biologia molecolare

D

aggiunge il segmento per le catene pesanti.

• Oltre alla ricombinazione omologa, ad aumentare la variabilità delle immunoglobuline sono fenomeni

spaziatori,

di splicing alternativo e la presenza di dalla lunghezza variabile, tra un sito e l’altro.

• In totale i frammenti che possono ricombinare sono più di 300.

- REG1 REG2;

Le ricombinasi che partecipano al meccanismo sono e il taglio è corretto dal sistema

NHJE (ricombinazione non omologa) che provoca la rimozione di alcune basi, aumentando

ulteriormente la variabilità. 28

BIOLOGIA MOLECOLARE

Trascrizione nei procarioti

- La trascrizione è la sintesi di un filamento di RNA complementare a un filamento di DNA.

• +1; -1.

Sul DNA stampo: il primo nucleotide trascritto è indicato con quello appena precedente con Il

antisenso;

filamento stampo è detto il suo complementare, che ha la stessa sequenza del trascritto, è

senso.

detto

• Rispetto alla replicazione, la reazione di polimerizzazione avviene con lo stesso meccanismo; nella

ribonucleotidi deossiribonucleotidi;

trascrizione si utilizzano e non il trascritto resta appaiato al DNA

per 8-9 nucleotidi, prima di distaccarsi consentendo alla bolla di trascrizione di richiudersi. Nei

procarioti il filamento trascritto può essere tradotto anche durante la trascrzione; negli eucarioti deve

essere processato.

• Come nella replicazione, la polimerizzazione avviene in senso 5’-3’.

- RNA polimerasi.

L’enzima chiave per la trascrizione è Le più semplici sono presenti nei mitocondri e nei

T3 T7):

fagi (es. e queste sono costituite da un singolo polipeptide; tra le due, quella fagica non

riconosce fattori di trascrizione mentre quella mitocondriale ne necessita per iniziare la trascrizione.

RNA polimerasi batterica

- core

I batteri hanno una sola RNA polimerasi il cui è composto da cinque subunità che formano una

a chela:

struttura due subunità α, β, β’ e ω.

• pinze

Le della chela sono costituite dalle subunità β e β’, che possiedono anche il sito catalitico

centrale attivo)

dell’enzima. Il sito attivo si trova alla base della chela (solco e contiene cationi

bivalenti (Mg ).

2+

• Le subunità α e ω hanno un ruolo strutturale.

- L’enzima completo (oloenzima) necessita di un fattore σ che interagisce con la polimerasi e fa sì che

questa riconosca il promotore e inizi la trascrizione; senza σ RNA polimerasi si lega al DNA, ma non si

attiva in corrispondenza dei promotori.

• Il fattore σ può legare il promotore solo se complessato a RNA polimerasi, a causa della diversa

conformazione che ha quando si trova libero.

• Esistono diversi fattori σ che possono essere sintetizzati dalla cellula in momenti differenti: in virtù

della loro diversa affinità ai promotori, possono essere prodotti fattori σ specifici per aumentare

l’efficienza della trascrizione di un gene quando è necessario che la proteina per cui codifica sia

prodotta in grandi quantità. Così esistono fattori σ specifici per gli enzimi che operano nel riparo del

DNA, o altri che vengono prodotti in situazioni di stress.

• Possiede quattro domini principali che verranno descritti assieme al meccanismo di inizio.

- NTP-uptake RNA-exit

Il sito attivo possiede cinque canali: permette l’ingresso di ribonucleotidi;

DNA downstream canale T

permette l’uscita dell’RNA; accoglie il DNA a valle da trascrivere; il accoglie

canale NT

il filamento template; il accoglie il filamento non-template. 29

BIOLOGIA MOLECOLARE

- primer

A differenza di DNA polimerasi non necessita di un che funge da innesco: per questo motivo il

primo nucleotide (spesso una adenina) viene tenuto saldamente in sede nelle prime fasi della

trascrizione.

Struttura di un promotore batterico

- Il promotore è una sequenza di DNA che precede la sequenza da trascrivere e che indica a RNA

forte

polimerasi in che senso e quando trascriverla. Un promotore può essere più o meno a seconda

forte

del numero di trascritti cui questo è in grado di dare origine nell’unità di tempo: un promotore ha

maggiore affinità per l’oloenzima (σ) che, quindi, vi si lega più frequentemente.

- Confrontando i promotori dei diversi geni batterici è possibile individuare sequenze consenso più o

meno conservate tra di essi: più la sequenza di un promotore si avvicina alla sequenza consenso più il

forte.

promotore è La sequenza del promotore quindi ha un ruolo nella regolazione dell’espressione del

gene che precede.

- Nei batteri è costituito da due zone conservate riconosciute dal fattore σ della polimerasi e localizzate,

rispetto al punto di inizio (+1) nelle posizioni (-35) e (-10): l’elemento -35 ha sequenza TTGACA;

l’elemento -10 ha sequenza TATAAT; i nucleotidi tra i due possono variare.

- UP,

Può essere presente un elemento ricco in adenina e timina detto posto a monte rispetto al -35, che

α-CTD):

ha un’affinità per la subunità α di RNA polimerasi (sul C-terminale: la presenza di questa

sequenza aumenta ulteriormente la forza di quel promotore.

Fasi

- Inizio

• Il fattore σ associato a RNA polimerasi riconosce il promotore del gene e vi si lega:

- dominio 1

il si inserisce nel canale T della polimerasi simulando, con le sue cariche negative, un

filamento di DNA;

- l’elemento UP è legato dalla coda C-terminale della subunità α della polimerasi;

- dominio 4 helix-turn-helix;

l’elemento -35 è legato dal del fattore σ che ha una struttura di tipo

- dominio 2

l’elemento -10 è legato dal del fattore σ; in particolare in questa fase:

• σ-2 accoglie in tasche idrofobiche due nucleotidi (A in posizione 11 e T in posizione 7) della

sequenza, ribaltandoli verso l’esterno della doppia elica.

• Tale evento innesca la denaturazione del DNA e l’apertura della bolla di trascrizione che, nei

procarioti, non necessita di ATP e dipende soltanto dall’interazione di σ-2 col DNA. L’apertura della

complesso chiuso complesso aperto:

doppia elica segna il passaggio dal al questa transizione

(isomerizzazione) è irreversibile perché è causata dal cambio di conformazione del complesso

enzimatico verso una situazione energicamente più stabile.

- L’apertura della bolla avviene in genere tra -11 e +2. 30

BIOLOGIA MOLECOLARE

- Con la formazione del complesso aperto σ-1 si sposta dal canale T e lascia spazio al filamento

stampo del DNA; le pinze β-β’ si chiudono.

• sintesi abortiva

RNA polimerasi può ora iniziare la sintesi: inizialmente passa per una fase detta di in

cui dopo l’aggiunta di una decina di nucleotidi il filamento di RNA viene perso e la polimerasi, senza

dissociarsi, torna indietro per ricominciare la polimerizzazione.

- Il motivo per cui si verifichi questo evento non è chiaro: sembra che durante la sintesi abortiva

parte del fattore σ (σ-3/4) occupi il canale RNA-exit impedendo la fuoriuscita del filamento di

neosintesi e quindi il suo allungamento; a conferma di ciò è il fatto che una volta superata questa

fase il fattore σ appare complessato più debolmente a RNA polimerasi, tanto che talvolta si

dissocia.

- Allungamento

• Una volta superata la fase della sintesi abortiva RNA polimerasi sintetizza il filamento nascente a una

velocità di circa 50 nucleotidi al secondo; poiché la traduzione avviene ad una velocità di 15

amminoacidi al secondo, nei batteri i due processi possono avvenire contemporaneamente.

• Durante l’allungamento la bolla trascrizionale si richiude dietro all’oloenzima e mantiene una

lunghezza costante di 7-8 nucleotidi.

• RNA polimerasi ha una frequenza di errore di 10 raggiunta attraverso due sistemi di correzione:

-4

- pirofosfolitico

l’editing consiste nella rimozione di un ribonucleotide tramite la reincorporazione di

un pirofosfato (PP ) che consente di aggiungere il nucleotide corretto;

i

- idrolitico

l’editing consiste nel taglio di una porzione di RNA errata: la polimerasi torna indietro di

uno o più nucleotidi, taglia per idrolisi un legame fosfodiesterico e rimuove la porzione errata per

Gre

poi ripeterne la sintesi. Questo processo è indotto dai fattori che stimolano anche

l’allungamento aiutando il complesso nella sintesi di porzioni particolarmente difficili.

• positivi

Lo spostamento della bolla di trascrizione introduce superavvolgimenti a valle della stessa,

negativi topoisomerasi.

a monte: questi sono risolti da enzimi

- Terminazione

• La terminazione della trascrizione nei batteri può avvenire con due meccanismi:

- intrinseco:

meccanismo in questo caso il DNA stampo contiene una sequenza palindromica di

circa 20 nucleotidi, seguita da una zona ricca in A e T.

• a forcina

La trascrizione della sequenza invertita fa sì che l’RNA assuma una struttura secondaria

a causa degli appaiamenti intramolecolari tra le basi complementari.

• Una volta trascitta questa zona, il filamento di neosintesi resta appaiato al DNA stampo

esclusivamente tramite gli appaiamenti tra le basi A, T e U, che seguono la forcina.

• La presenza della forcina sembra sia sufficiente a causare la rottura del complesso: la presenza

delle suddette basi rende più instabile l’ibrido DNA-RNA, che si dissocia dalla polimerasi

causando la terminazione della trascrizione. 31

BIOLOGIA MOLECOLARE

- estrinseco Rho-dipendente:

meccanismo o il trascritto non ha una sequenza tale da permettere il

Rho.

meccanismo di terminazione intrinseco; la terminazione è mediata dalla proteina

• Rho è una proteina ad anello che si lega all’RNA appena trascritto e vi scorre sopra, fino al

raggiungimento di una sequenza di circa 40 nucleotidi ricca in citosina; qui, idrolizzando ATP,

svolge attività elicasica separando l’RNA sintetizzato dal filamento stampo di DNA,

interrompendo la trascrizione.

• La specificità di Rho è data dalla sequenza ricca in citosina che riconosce e dal fatto che non si

lega a regioni di RNA in fase di traduzione, in modo da interrompere la polimerizzazione solo

oltre la fine di un gene. 32

BIOLOGIA MOLECOLARE

Trascrizione negli eucarioti

- I meccanismi di trascrizione procarioti ed eucarioti sono simili; negli eucarioti il trascritto deve essere

processato a RNA maturo prima di poter essere tradotto, quindi la traduzione non avviene in

contemporanea alla trascrizi