Biologia molecolare

Biologia molecolare

Introduzione

Materiale per la preparazione dell’esame di Biologia Molecolare per il CdL in Medicina e Chirurgia.

Indice

• Introduzione
• Genoma
• Cromatina e istoni
• Tecniche di biologia molecolare
• Replicazione del DNA: procarioti e eucarioti
• Meccanismi di riparo del DNA
• Ricombinazione omologa
• Ricombinazione conservativa sito-specifica (CSSR)
• Trasposizione
• CRISPR/Cas9
• Ricombinazione V(D)J
• Trascrizione: procarioti e eucarioti
• Maturazione dell’mRNA
• Splicing alternativo
• RNA editing
• Proteine che legano il DNA
• Regolazione dell’espressione genica: procarioti e eucarioti
• Traduzione
• RNA regolatori

Introduzione

Scoperte scientifiche rilevanti per la fondazione della disciplina:

• Esperimento di Griffith (1928): Vengono inoculati in due topi due ceppi batterici: uno patogeno e uno non patogeno; il topo che ha ricevuto il batterio patogeno muore. In seguito, i batteri del ceppo patogeno vengono uccisi esponendoli a temperature elevate; le cellule morte vengono quindi inoculate in due topi: il primo sopravvive perché i batteri patogeni inoculati sono inattivati; il secondo, invece, riceve una miscela di batteri non patogeni e di batteri patogeni morti e muore. Questo esperimento permise di comprendere che alla base di questo fenomeno non c’erano le proteine, denaturate dal calore, ma qualcosa di diverso.
• Esperimento di Avery (1944): Avery comprese che il principio trasformante di Griffith era il DNA.
• Esperimento di Hershey e Chase (1952): In un virus si marcano proteine del capside e del DNA con isotopi di zolfo e fosforo; le particelle virali che si generano dopo l’infezione hanno soltanto il DNA marcato: il DNA è il depositario dell’informazione genetica.
• Scoperta del DNA: Franklin e Wilkins ottengono un’immagine in cristallografia del DNA. Watson e Crick definiscono la struttura a doppia elica della molecola e il principio di appaiamento dei filamenti complementari; ne ipotizzano il funzionamento. Mendelson e Stahl (1958) dimostrano che la replicazione è semiconservativa.

Genoma

- Procarioti: genoma aploide, un cromosoma circolare o comunque in numero limitato; eucarioti: più cromosomi lineari presenti in copie multiple e di dimensioni maggiori rispetto a quelli procarioti.

- La complessità del genoma non è correlata alla sua dimensione (il genoma di alcuni vegetali è più esteso rispetto a quello umano) ma alla densità genica, definita come il numero di geni presenti per milione di basi (Mb).

• Esempi: Saccaromyces cerevisiae: 500 geni/Mb; batteri: 1000 geni/Mb; uomo: 10 geni/Mb.

- Una minor densità genica rivela la presenza di una grande quantità di sequenze non codificanti. Il gene umano è costituito al 10% da esoni, al 90% da introni e sequenze regolatrici.

- Pseudogeni: porzioni del genoma derivate dalla duplicazione di geni ma che, in seguito a modificazioni che hanno subito, non sono funzionali. Talvolta hanno un ruolo nella regolazione dell’espressione del gene di origine. Si formano per fenomeni di trascrizione inversa: l’mRNA maturo viene trascritto in DNA che si inserisce nel genoma: lo pseudogene ha la stessa sequenza del gene da cui origina ma non ha le sequenze introniche. Per questo motivo è più soggetto a mutazioni casuali e, quindi, alla perdita della funzionalità biologica.

- Sequenze ripetute:

• DNA satellite: sequenze altamente ripetute (>1000 copie) presenti soprattutto nelle regioni centromeriche dei cromosomi; hanno dimensione di circa 170bp.
• DNA microsatellite e minisatellite: sequenze più brevi e ripetute (10 - 1000 copie); le ripetizioni possono essere ridotte o aumentate in seguito a errori replicativi; possono avere importanza funzionale e diagnostica se sono contenute nella sequenza codificante di un gene.

- Sequenze trasponibili: porzioni di DNA che tendono a cambiare di posizione nel genoma; possono essere di derivazione retrovirale.

Cromatina e istoni

- Il genoma procariotico ed eucariotico è compattato dall’associazione con proteine rispettivamente istoniche ed non istoniche.

• Batteri: compattamento fino a 1000x, associazione con proteine basiche; uomo: compattamento fino a 10000x, associazione con proteine istoniche.

- Il DNA umano è una doppia elica destrogira con un passo di 10.5 bp per giro. Avvolgimenti destrogiri sono detti positivi e comportano un aumento di tensione nel DNA; avvolgimenti levogiri sono detti negativi e ne comportano il rilassamento.

- Linking number: numero di intrecci dei due filamenti del DNA (es. 270 bp con passo di 10.5: L = 26); è indice del compattamento e del rilassamento del DNA. Vale la relazione L = T + W:

• Twist (T): numero di avvolgimenti dei due filamenti della doppia elica.
• Writhe (W): numero di superavvolgimenti della doppia elica su se stessa.

- Di conseguenza, superavvolgimenti negativi causano un rilassamento del DNA (es. avvolgimento toroidale sinistrorso del nucleosoma).

- Nei cromosomi circolari L è costante: può essere variato in seguito ad interventi enzimatici. Per facilitare la denaturazione esistono enzimi detti gyrasi che introducono superavvolgimenti negativi rilassando il DNA.

- Istoni e nucleosoma

- Riconoscimento degli istoni:

• Si utilizzano nucleasi micrococciche che degradano il DNA non associato a proteine.
• Con una blanda degradazione si ottengono frammenti di 200bp; con un’ulteriore digestione se ne ottengono di 140bp: il DNA complessato agli istoni ha una lunghezza totale di 200bp ma di queste solo 140bp sono direttamente associate alle proteine.

- Istoni

• 5 proteine che partecipano al compattamento della cromatina. Il diametro della cromatina è di 10 nm (collana di perle) senza l’intervento dell’istone H1, 30 nm (zig zag) con l’istone H1.
• Formano con il DNA un complesso detto nucleosoma; il DNA core è il DNA avvolto attorno al nucleosoma e il DNA linker è il DNA posto tra due nucleosomi.

- Il DNA compie 1.65 giri attorno all’ottamero istonico.

• Struttura delle proteine: sono molto conservate sotto l’aspetto evolutivo. Gli istoni che formano l’ottamero (H2a, H2b, H3, e H4) condividono un dominio istonico histone fold costituito da 3 α-eliche separate da 2 loop senza struttura secondaria.

- Dispongono di code che partecipano all’interazione tra nucleosomi.

- Instaurano con il DNA interazioni elettrostatiche nei solchi minori della doppia elica; sono costituiti per il 20% da amminoacidi basici (arginina e lisina).

• Assemblaggio del nucleosoma: H3 e H4 si associano a formare un dimero, quindi due dimeri si appaiano a formare un tetramero; questa struttura lega la porzione centrale del DNA core. In seguito, H2a e H2b formano un dimero; due dimeri interagiscono con il tetramero che si è formato precedentemente per completare l’ottamero. I dimeri H2 interagiscono con le porzioni terminali del DNA core. H1 interagisce con il DNA linker e con la porzione centrale del DNA core, avvicinandoli.

- L’avvolgimento del DNA attorno al nucleosoma è sinistrorso (negativo): di conseguenza, si riduce il passo dell’avvolgimento (da 10.5 a 10.2 bp per giro) e i due filamenti aumentano la loro tendenza a separarsi, facilitando le operazioni di trascrizione e replicazione.

- Il posizionamento dei nucleosomi è sequenza-aspecifico anche se sono predilette le zone ricche in adenina e timina perché meglio ripiegabili.

- Le strutture dei nucleosomi sono assai dinamiche e soggette a rimodellamenti o spostamenti che hanno un ruolo nella regolazione dell’espressione genica.

- Code istoniche

• Le code istoniche sono soggette a modifiche post traduzionali che riguardano l’aggiunta di gruppi (fosfato, metilici, acetilici, ubiquitina, proteina SUMO) sui loro amminoacidi.
• Acetilazione: regolata da enzimi acetilasi e deacetilasi; coinvolge zone riconosciute da proteine con bromodomini; sono associate a porzioni di DNA trascrizionalmente attive.
• Metilazione: regolata da enzimi metilasi e demetilasi; coinvolge zone riconosciute da proteine con cromodomini; sono associate a porzioni di DNA trascrizionalmente inattive.
• Le modificazioni delle code istoniche possono essere trasmesse in seguito alla replicazione del genoma: il tetramero H3-H4, infatti, rimane legato al DNA durante il processo.
• La fibra di 30 nm può essere ulteriormente compattata grazie all’intervento di altre proteine, fino al raggiungimento del massimo compattamento visibile sui cromosomi in metafase.

Tecniche di biologia molecolare

- Enzimi di restrizione: enzimi batterici sintetizzati per frammentare il DNA esogeno e, quindi, conservare l’integrità del genoma batterico. Ne esistono molti, ciascuno specifico per una determinata sequenza in cui avviene il taglio. Possono generare frammenti con estremità piatte o protrudenti (sticky ends).

• BamH1: enzima di restrizione che taglia la sequenza 5’ GGATCC 3’ tra il primo e il secondo nucleotide.

- Ibridazione

• Tecnica per valutare la presenza di una specifica sequenza di DNA in un campione o per studiarne la struttura: si sfrutta la rinaturazione con sonde opportunamente marcate.
• Denaturazione del DNA: esposizione della doppia elica a temperature che rompono i ponti a idrogeno tra le basi azotate separando i due filamenti.

- Lo stato di denaturazione si rileva tramite lo spettrofotometro: il DNA denaturato espone le basi azotate che assorbono più frequenze rispetto a quelle assorbite dal DNA nativo.

- Poiché la denaturazione dipende dalla presenza di ponti a idrogeno tra le basi azotate, porzioni ricche in A e T si denaturano a una temperatura inferiore rispetto a quelle ricche in G e C.

- T-melting: temperatura alla quale il 50% del DNA si trova denaturato.

- La velocità di rinaturazione è direttamente proporzionale alla dimensione dei filamenti (o della sonda) e dal livello di similitudine tra le basi che li compongono. Quest’ultima considerazione spiega perché il genoma eucariotico, ricco di sequenze ripetute, si rinaturi più velocemente rispetto a un genoma che ne è privo.

Southern Blot e Northern Blot

- Tecniche che permettono di valutare la presenza di precise sequenze nel genoma (Southern Blot) o nell’RNA (Northern Blot). Consente, per esempio, di identificare traslocazioni tra i cromosomi.

- Fasi:

• Frammentazione del DNA con enzimi di restrizione e denaturazione.
• Immersione in gel d’agarosio, nel quale, in seguito all’applicazione di una differenza di potenziale, si possono distinguere i frammenti a seconda del loro peso molecolare.
• Trasferimento dei campioni su un filtro dove sono ordinati, per capillarità, secondo il loro peso molecolare.
• Esposizione alla sonda marcata. La presenza della sonda permette di valutare la presenza di mutazioni o traslocazioni.

FISH

- Ibridazione fluorescente in situ: si utilizza una sonda fluorescente in modo che la sua ibridazione con porzioni del genoma risulti ben evidente. Viene utilizzata anche per l’analisi del cariotipo e per la diagnosi di mutazioni cromosomiche.

Microarray DNA

- Sfrutta un vetrino su cui sono presenti microcelle contenenti ciascuna sequenze di oligonucleotidi di uno specifico gene. Questi vengono fatti ibridare con frammenti di mRNA prelevati dalla cellula, in modo da valutare il livello di espressione di ogni gene presente sul microarray.

- Questa tecnica può essere utilizzata per stabilire se alcuni geni sono portatori di determinate mutazioni, utilizzando frammenti del gene sano e del gene malato e analizzando su quale dei due avviene l’ibridazione.

DNA ricombinante

- Tecnica che permette lo studio e il clonaggio di un gene sfruttando un vettore plasmidico. Per inserire il gene nel plasmide entrambi vengono tagliati dallo stesso enzima di restrizione in modo che le sequenze che protrudono alle estremità siano complementari, possano quindi appaiarsi ed essere legate da DNA ligasi.

- Il plasmide modificato viene inserito in un batterio mediante il processo naturale di trasformazione, con il quale i batteri si scambiano materiale genetico. Il batterio può così replicare e generare cloni di quel gene.

- Se il gene da clonare è eucariotico, essendo questo composto da esoni e introni che non possono essere correttamente interpretati dai batteri, non è opportuno utilizzare un campione di DNA.

• A tale scopo una molecola di mRNA maturo viene retrotrascritto in cDNA: quest’ultimo viene inserito nel plasmide. L’enzima che opera questa conversione necessita di un primer, un frammento ricco in timina, che va ad appaiarsi alla coda di poli-A dell’mRNA.

- Allo stesso modo è possibile indurre la trascrizione, e quindi la traduzione, del gene da parte del batterio allo scopo di produrre grandi quantità della proteina che quel gene codifica (proteine ricombinanti): in tal caso è necessario che a monte del gene, nel plasmide, vi sia una sequenza promotore opportunamente riconosciuta dal complesso di trascrizione batterico.

PCR

- Polymerase Chain Reaction: permette di stabilire la presenza o meno di una sequenza di DNA in un campione e dà informazioni quantitative sul numero di copie in cui si trova. Partendo da un campione di materiale genetico possono essere prodotte molte copie della sequenza target attraverso una serie di reazioni di amplificazione.

• Molecole di DNA a doppio filamento vengono denaturate; sono inseriti i primer per la sequenza target, che consentono a DNA polimerasi di replicarla; il successivo abbassamento della temperatura permette di rinaturare il DNA, legando i primer ai filamenti stampo.
• DNA polimerasi sfrutta i primer come inneschi e replica la sequenza target.
• Vengono ripetuti più cicli di denaturazione, rinaturazione con primer, amplificazione. Inizialmente sono amplificate molecole più lunghe di quella target perché la polimerasi non si interrompe al suo termine; con il proseguire dei cicli vengono amplificate in modo esponenziale soltanto le sequenze target.
• Il processo di amplificazione può continuare fino all’esaurimento dei nucleotidi disponibili o fino all’insorgenza di danni agli enzimi.

- Alla fine della PCR, si sono create copie di una sequenza che può essere facilmente inserita in un plasmide.

- La PCR viene utilizzata, con primer specifici, per valutare la presenza di un gene mutato a scopo diagnostico: in questo caso i frammenti prodotti vengono separati in gel d’agarosio e il test è positivo se si riscontra la presenza di frammenti dal peso molecolare atteso per il gene mutato (l’amplificazione di un gene normale con gli stessi primer darebbe frammenti dalla dimensione diversa per la diversa disposizione dei primer). Allo stesso modo si può individuare la presenza di un trascritto di fusione che si genera in seguito alla combinazione di due geni dopo la traslocazione di una regione cromosomica.

- La PCR ha una sensibilità che permette di individuare una cellula mutata ogni 1000 cellule analizzate; sensibilità maggiori si hanno con la Nested PCR che, amplificando ulteriormente porzioni dei frammenti precedentemente amplificati da un normale ciclo di PCR (ampliconi), raggiunge una sensibilità pari a 10^-4.

• RT-PCR: come PCR, ma viene amplificato RNA retrotrascrivendolo in cDNA.
• Real Time PCR: permette di valutare in tempo reale la quantità di molecole amplificate.

Sequenziamento del DNA

- Tecniche che permettono di stabilire la sequenza di nucleotidi presenti in una molecola di DNA.

- Metodo Sanger: sfrutta il processo di replicazione della molecola; tuttavia, vengono inseriti dideossiribonucleotidi marcati invece di deossiribonucleotidi (che, cioè, non hanno i gruppi ossidrili su entrambi i C2 e C3 del ribosio).

• Quando DNA polimerasi inserisce un nucleotide modificato la replicazione si blocca, generando frammenti che terminano tutti con lo stesso nucleotide.
• I frammenti vengono ordinati secondo il loro peso molecolare in gel d’agarosio. L’analisi delle bande che si formano e della disposizione dei marcatori permette di determinare la sequenza del frammento iniziale di DNA.
• Questa tecnica ha tempi accettabili di realizzazione per l’analisi di frammenti fino a 800 bp.

- NGS: Next Generation Sequencing; permette di accelerare i tempi analizzando più sequenze contemporaneamente. Risulta inoltre essere un modo più economico del metodo Sanger.

Replicazione del DNA nei procarioti

- Principali caratteristiche

- Reazione chimica di polimerizzazione del DNA

• Reagenti: deossiribonucleotidi trifosfato, DNA stampo, innesco; enzima: DNA polimerasi
• La reazione è di tipo SN²: il gruppo ossidrilico al 3’ terminale della catena dell’innesco fa un attacco nucleofilo sul fosfato α del nucleotide entrante; si libera un pirofosfato che viene idrolizzato da una fosfatasi. L’energia liberata dall’idrolisi del pirofosfato rende la reazione di polimerizzazione esoergonica.

- DNA polimerasi è un enzima DNA-dipendente (necessita di uno stampo di DNA) che non è in grado di iniziare la polimerizzazione senza che vi sia un 3’ OH esposto: a differenza di RNA polimerasi, necessita di un primer che funge da innesco.