Biologia molecolare prof.ssa Poli

La biologia molecolare

2 ottobre 2015

La biologia molecolare è lo studio della biochimica a livello molecolare. Si occupa principalmente della comprensione delle interazioni tra i vari sistemi di una cellula, incluse (ma non solo) le interazioni tra DNA, RNA e proteine a livello della loro biosintesi e della regolazione della loro funzione. La biologia molecolare si sovrappone parzialmente con la genetica, la biologia cellulare e la biochimica.

Descrizione di William Astbury

William Astbury (cristallografo che pose le basi per la scoperta della struttura del DNA), descrive così la biologia molecolare:

(Molecular Biology is) not so much a technique as an approach, an approach from the viewpoint of the so-called basic sciences with the leading idea of searching below the large-scale manifestations of classical biology for the corresponding molecular plan. It is concerned particularly with the forms of biological molecules and [...] is predominantly three-dimensional and structural—which does not mean, however, that it is merely a refinement of morphology. It must at the same time inquire into genesis and function.

Scoperte fondamentali

1953: James Watson e Francis Crick scoprono la struttura del DNA: nasce la biologia molecolare.

1984: gruppo di scienziati che ha battezzato il progetto genoma. Idea di partenza: tutte le malattie hanno una base genetica. Le tecniche di sequenziamento poi si sono evolute.

Progetto Genoma

La comprensione dei meccanismi molecolari che regolano le interazioni tra macromolecole e il loro significato biologico doveva però passare attraverso la caratterizzazione della loro struttura primaria (sequenza) e la capacità di manipolarle (a scopo sperimentale e poi magari terapeutico). Serviva conoscere solo la sequenza del DNA codificante (più facile e importante); è su questo che ci si è concentrati col Progetto Genoma.

La conoscenza della sequenza del DNA genomico (codificante che non) ci permette la caratterizzazione della struttura dei geni e della struttura primaria delle proteine o degli RNA da loro codificati, e i meccanismi che regolano la loro espressione.

Il progetto di sequenziamento genoma (finito nel 2001, Craig Venter e Francis Collins) si concentrati sul DNA codificante (più facile e più importante):

• Caratterizzazione dei geni (tutti o quasi), della struttura primaria delle proteine e dei meccanismi che regolano l'espressione genica. È sempre più evidente che anche le parti non codificanti (DNA spazzatura) del genoma sono importanti soprattutto per la regolazione dell'espressione genica (rivoluzione degli RNA non codificanti).
• L'era post genomica (post sequenziamento genomico) ha il nuovo scopo di capire come funzionano le sequenze conosciute, come, dalla sequenza primaria di DNA, si possa arrivare alla sintesi di una proteina, necessaria e insostituibile nel metabolismo cellulare. Scopo finale è riuscire ad interpretare le informazioni sperimentali per dargli un significato e per costruire ad esempio modelli di interazione cell-cell.

Definizioni chiave

Genoma: Insieme delle informazioni genetiche che caratterizzano un organismo.

Controllo trascrizionale

Trascrittoma: Insieme dei trascritti (codificanti e non) prodotti da una determinata popolazione cellulare. Per ogni tipo cellulare diverso sono espressi all’incirca 10,000 geni diversi.

Controllo post-trascrizionale

Proteoma: Insieme delle proteine prodotte da una determinata popolazione cellulare. Sono gli RNA trascritti. Abbiamo circa 25,000 geni. Missing Links:

• Come viene regolata la trascrizione, la sequenza da sola non è sufficiente epigenetica. Sono necessarie interazioni con varie proteine per l’epigenetica.
• Come è regolata l'espressione genica, non solo il cosa è importante ma anche il quanto di una certa proteina post trascrizionale.

Regolazione trascrizionale - Eucarioti

È un meccanismo basilare che avviene sia negli organismi unicellulari, dove regola la duplicazione cellulare e serve a rispondere agli impulsi esterni, sia negli organismi pluricellulari dove serve, oltre che alla duplicazione cellulare, anche allo sviluppo, al differenziamento cellulare e per organizzare la risposta all'ambiente esterno (che è quasi sempre costituito dall'interno dell'organismo a parte alcune cellule particolari, come le cellule epatiche o cellule nervose) e per il coordinamento delle funzioni tra i diversi tipi cellulari; sia nei virus, dove è ancora più semplice (duplicazione sfruttando cellule invase).

Attivazione/inattivazione dell’espressione genica negli eucarioti:

• Decisioni cellulari durante lo sviluppo differenziamento (quali devono essere i geni accesi/spenti?)
• Regolazione del ciclo cellulare (attivazione e inattivazione ciclica).
• Attivazione cellulare in risposta a mediatori esterni quali fattori di crescita, ormoni etc. (reversibile, rapida).

La complessità degli stimoli esterni varia per tipo cellulare e in base al tipo di segnale, ad esempio negli unicellulari troviamo la presenza/assenza di glucosio, caso in cui le decisioni da prendere sono binarie, tipo on/off, oppure negli organismi pluricellulari dove troviamo diversi segnali che arrivano alla cellula che li classifica tutti e quindi prende una certa serie di risposte, ad esempio i segnali della vita che inibiscono l'apoptosi, o altri segnali che vengono poi integrati nel nucleo come succede per la divisione o il differenziamento cellulare. La cessazione di ogni stimolo manderebbe la cellula in apoptosi.

Quindi la maggioranza delle risposte cellulari richiede l’attivazione e/o la repressione coordinata di molti geni. Negli organismi viventi le informazioni contenute nel genoma non si esprimono contemporaneamente e sono finemente regolate.

La finezza della regolazione è basilare e si diversifica in base alla tipologia dei geni: nei geni housekeeping o costitutivi, nei geni ad espressione condizionale che possono essere indotti o viceversa sono espressi e possono essere repressi, e infine nei geni specializzati che sono espressi solo in certe cellule o in certi tessuti, di nuovo o costitutivi o condizionali (cheratinociti esprimono sempre certe ciclocheratine ma alcune possono essere indotte da infiammazione).

Geni housekeeping

Sempre attivi a livelli molto simili; sono proteine necessarie per le funzioni fondamentali (sintesi del DNA ad esempio).

Il differenziamento cellulare: è misterioso, come uno stesso genoma di partenza dà vita a un linfocita ed anche ad un neurone. Le decisioni cellulari che portano al differenziamento vengono prese a partire dalle cellule staminali, prova di questo sono gli esperimenti di clonaggio.

Esperimenti di clonaggio

Il primo esperimento di clonaggio in assoluto fu quello che riguardava le cellule epidermiche della rana, che vennero private del nucleo che fu poi impiantato nel citoplasma di una cellula uovo non fecondata e a sua volta privata del suo nucleo (scambio nuclei). Si vide che il nucleo della cellula epidermica impiantato nell'ovocita si de-differenziava per tornare ad essere il nucleo di una cellula uovo ancora pluripotente, che se poi fecondato dava vita ad un nuovo individuo. Questo esperimento venne fatto in seguito anche con le piante e quindi con i mammiferi, ad esempio la pecora Dolly, caso in cui vennero presi i nuclei di cellule differenziate in un soggetto adulto (fibroblasti dell'ovidotto), si fece fondere il nucleo con un ovocita e in qualche modo esso fu ricondizionato dal citoplasma dell'ovocita che una volta fecondato diede vita ad un nuovo embrione. Importanza del citoplasma!

La trascrizione

La RNA polimerasi non è simmetrica. Ha una testa e una coda. La RNA polimerasi è direzionale: da una parte entrano i ribonucleotidi trifosfati e dall’altra esce l’mRNA. Il complesso fattore sigma + RNA-POLIMERASI è detto oleoenzima. La pinna in posizione chiusa è costituita dal dominio carbossi-terminale CTD dell'RNA polimerasi. L’RNA nascente fuoriesce da un canale che è in prossimità della pinna.

Melting della doppia elica (elicasi) per svolgere e rendere disponibile l'elica codificante, copia, e poi riavvolgimento.

Problema dell'RNA polimerasi:

• Scelta del substrato (in che punto legarsi alla sequenza del DNA), come fa a decidere l'RNA polimerasi quali regioni trascrivere e in che quantità? La maggior parte dei meccanismi coinvolti nella regolazione della trascrizione è atta a veicolare la RNA polimerasi dove deve essere attiva.

Batteri

I batteri hanno una sola RNA polimerasi e diversi fattori sigma (che variano a seconda della risposta da attivare) che riconoscono il promotore e determinano il posizionamento dell'RNA polimerasi. Il promotore è una piccola sequenza di DNA che viene legata da attivatori o repressori e serve a regolare sia cosa che quanto trascrivere di una certa sequenza.

L'RNA polimerasi è asimmetrica e deve quindi essere reclutata oltre che in un posto specifico anche in una posizione specifica, anche i promotori devono quindi essere asimmetrici: uno e il più famoso è la TATA box. Questa asimmetria è fondamentale per posizionare nel punto corretto e con il giusto orientamento la RNA polimerasi. Il macchinario di trascrizione basale (ad esempio la Tata Binding Proteine BiP) viene legata alla sequenza e inizia a lavorare. Se inverto il promotore la polimerasi (esperimenti in vitro) verrà reclutata sul filamento opposto (scelta substrato, punto corretto, orientamento corretto: 3 problemi).

Il genoma nei batteri

• È compatto;
• Non ci sono introni ed esoni;
• I geni sono organizzati in operoni;
• Le zone di controllo sono molto più piccole (200 paia di basi);
• L'RNA polimerasi (che è di un solo tipo) è in grado di riconoscere la sequenza anche con un solo fattore sigma;
• Molti promotori non hanno bisogno di altri elementi (triptofano).

Esistono diversi fattori sigma che hanno affinità diverse in base ai diversi promotori: è sufficiente cambiare il fattore sigma per cambiare la specificità della polimerasi.

Quindi l'RNA polimerasi asimmetrica viene reclutata dal promotore e visto che anche il promotore è asimmetrico essa trascriverà il gene a valle del promotore. L'RNA polimerasi dovrà quindi legarsi in modo da avere la sua parte frontale rivolta verso la regione a valle del promotore. Il promotore asimmetrico è in grado di reclutare l'RNA polimerasi e soprattutto di posizionarla in modo che cominci la trascrizione nella direzione corretta.

Procarioti

• Genoma estremamente compatto;
• L'RNA-POLIMERASI legata al fattore sigma può riconoscere il promotore in assenza di altre proteine;
• I geni sono organizzati in operoni (numero elementi di controllo è ridotto rispetto al numero di geni);
• Regioni di controllo sono molto piccole (meno di 200 bp).

La regolazione nei batteri

La regolazione può essere negativa o positiva. In quella negativa è espresso un repressore legato all'operatore che impedisce la trascrizione. Esso può essere legato da un ligando e quando questo accade il repressore si stacca e il gene può essere trascritto. Oppure un tipo diverso di controllo negativo mediata da ligando è quella in cui il repressore è legato all'operatore in presenza di ligando. Quando il ligando non è più presente il repressore non è più legato, cambia conformazione e si stacca.

La regolazione può essere anche positiva. In questo caso sono presenti delle proteine attivatrici che quando sono legate permettono la trascrizione e che possono essere regolate da un ligando o in termini di repressione o in termini di attivazione.

Spesso nei batteri la regolazione è di tipo on/off, però è necessario che il batterio risponda anche a stimoli esterni, due esempi classici sono il lac-operon e l'operon del triptofano.

L'operone del triptofano

Attua un controllo negativo. L'operone contiene diversi geni che codificano per enzimi responsabili della biosintesi del triptofano. Questo viene sintetizzato quando manca dal substrato (terreno di coltura), mentre se è presente il batterio silenzia la trascrizione e lo assume dall'esterno (risparmio energia).

L'operatore sta in mezzo alle regioni toccate dal fattore sigma e in assenza di triptofano l'operone viene letto e trascritto. Il repressore, nonostante sia sempre presente, è inattivo in assenza di triptofano. Quando il triptofano è presente si lega al repressore causando un cambiamento conformazionale che permette al repressore di legarsi all'operatore e oscurare il sito dove sigma si lega all'operone, rendendo impossibile la trascrizione. Il triptofano agisce quindi da ligando.

Il triptofano si lega al repressore e fa shiftare le due eliche dando alla proteina l’angolo giusto per interagire con il DNA.

L'operone lattosio

Integra due informazioni ed è un esempio di controllo positivo. Essendo un operone debole ha bisogno sia di un attivatore che di un repressore. A seconda delle esigenze il batterio prende determinate decisioni:

• Caso 1: sono presenti sia glucosio che lattosio. Il batterio preferisce (perché energeticamente più efficiente) il metabolismo del glucosio e il lac-operon è spento passivamente. Non c’è l’attivatore CAP.
• Caso 2: in presenza di solo glucosio e assenza di lattosio il repressore lac è attivo e l’attivatore CAP non è legato.
• Caso 3: c'è lattosio e non glucosio. Si stacca il repressore lac e si attacca l'attivatore CAP già pronto, che causa l'inizio della trascrizione (operon acceso).
• Caso 4: se non ci sono né glucosio né lattosio la cellula deve da una parte conservare energia e quindi mantenere l'operatore del lattosio spento ma deve essere anche pronta a buttarsi su una nuova molecola di lattosio che dovesse passare di lì e quindi: gene represso, operatore represso, operone represso permettono di inattivare il repressore ma a questo punto viene anche sintetizzato e legato l'attivatore.

Abbiamo dunque sia l'attivatore che il repressore. L'operone è spento ma pronto a partire in modo che se continua a non esserci glucosio ma arriva del lattosio, il repressore si stacca e può cominciare la trascrizione perché l'attivatore è già legato. Questa interazione è basata sul fatto che il promotore è debole e quindi richiede il legame di un attivatore. È un promotore debole perché viene riconosciuto debolmente dal fattore sigma. L’interazione tra repressore e attivatore rende il controllo più stringente e più flessibile.

Se non ci fosse il repressore, potrebbero verificarsi episodi di trascrizione.

Controllo trascrizionale nei batteri

Controllo trascrizionale mediante azioni a distanza (Lac repressor): Il Lac Repressor può interagire con operatori addizionali a monte del lac operon classico, con conseguente rafforzamento del legame e della repressione. Prime dimostrazioni del looping del DNA mediato da proteine.

Eucarioti

Negli eucarioti tutto il sistema funziona in modo più complesso:

• La trascrizione e la traduzione sono compartimentalizzate (nucleo e citoplasma)
• Ci sono diversi e più evoluti sistemi di regolazione tra le varie fasi;
• I genomi eucarioti sono molto meno compatti e molto più lunghi;
• Non ci sono operoni ed ogni gene ha la sua sequenza regolatrice;
• C'è molto DNA non codificante;
• Le sequenze geniche sono suddivise in esoni ed introni;
• Le sequenze regolatorie per ciascun gene sono molto più lunghe e possono essere anche molto distanti;
• Sono presenti più RNA polimerasi diverse che hanno bisogno di molti fattori per trascrivere, veri e propri macchinari con migliaia di proteine.

Macchinario di trascrizione basale = GTF + Pol II; ci sono anche proteine regolatorie che legano o no il DNA.

Complessità negli eucarioti

A cosa è dovuta questa grande complessità? A causa della cromatina cioè delle varie fasi di impacchettamento del genoma eucariotico. A causa di questo necessario impacchettamento però le sequenze genomiche sono difficili da raggiungere e queste difficoltà hanno dato vita ad un sistema molto complesso per livelli successivi di complessità. La fibra di 30 nm è la condizione della cromatina che deve essere trascritta.

Il primo livello è il controllo della trascrizione. Il secondo è il controllo della maturazione del trascritto primario → splicing, poliadenilazione e aggiunta del cappuccio. Il terzo è il controllo del trasporto del RNA messaggero dal nucleo al citoplasma che dipende dall'efficienza del processing. Il quarto livello è il controllo traduzionale che regola “quanta proteina” deve essere prodotta. Il quinto è il controllo della degradazione del RNA messaggero che può essere stabilizzato ma anche destabilizzato a seconda che debba produrre più o meno proteina. Il sesto è il controllo dell'attività della proteina che può essere prodotta in forma inattiva o attiva e che può poi essere rispettivamente attivata o disattivata mediante modificazioni post-traslazionali.

Elementi fondamentali della trascrizione negli eucarioti

• Il promotore ovvero la sequenza con funzione regolatoria che si trova direttamente a valle dell'inizio della trascrizione;
• Su questa sequenza si assembla l'RNA-polimerasi (in particolar modo ci occuperemo della RNA-polimerasi 2 che è quella che trascrive...