Biologia molecolare prof.ssa Poli

REGOLAZIONE DELLA METILAZIONE DURANTE LO SVILUPPO

La metilazione del DNA è importante nello sviluppo ed è fortemente regolata durante questa fase.

Nelle cellule germinali primordiali (quelle che si formano nell'embrione molto

– precocemente e che poi si differenziano per dare spermatozoi e cellule uovo) i livelli di

metilazione sono molto bassi e aumentano progressivamente durante il differenziamento

nelle cellule germinali adulte. Inoltre vi sono livelli diversi di metilazione negli spermatozoi

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e nelle cellule uovo. Nel primo caso c'è maggiore metilazione e ciò dipende dal fatto che lo

spermatozoo ha bisogno di compattare maggiormente il suo DNA rispetto alla cellula uovo.

=> i genomi dei gameti maschili e femminili non sono equivalenti.

Fecondazione: lo zigote ha un livello di metilazione intermedio tra quello dello

– spermatozoo e quello della cellula uovo.

Dopo circa 3-4 giorni e una serie di divisioni cellulari vi è la formazione di una blastocisti,

– ricoperta dalla zona pellucida. La zona pellucida si rompe, facendo schiudere la blastocisti e

si ha l'impianto nella mucosa uterina attraverso le cellule del trofoblasto. Nella fase di pre-

impianto la metilazione cala vertiginosamente e ciò avviene per demetilazione passiva

perchè ci sono tante divisioni cellulari successive e la DNA metiltransferasi di

mantenimento viene esclusa dal nucleo e il DNA non viene metilato fino alla perdita

progressiva della metilazione. Inoltre si ha demetilazione attiva soprattutto per il

pronucleo maschile, mediata dagli enzimi tet tramite idrossilazione della 3-metilcitosina. I

livelli di metilazione delle cellule della massa cellulare interna della blastocisti sono identici

a quelli delle cellule germinali primordiali.

Subito dopo l'impianto si ha il differenziamento e le formazione dei foglietti embrionali. A

– questo punto si verifica una metilazione de novo nelle cellule somatiche che è differenziale

sia come identità che come localizzazione a seconda del tipo di cellula. La metilazione

cambia qualitativamente a seconda del tipo di cellula in cui deve avvenire.

Si ha metilazione de novo anche nei lineage dei trofoblasti che daranno origine a placenta,

– sacco vitellino e altri annessi extra-embrionali. Si ha molto presto il raggruppamento delle

cellule germinali primordiali che mantengono il loro genoma ipometilato per potersi

differenziare in spermatozoi e cellule uovo e devono poter imprimere uno schema di

metilazione specifico. Demetilazione

passiva/attiva

La metilazione cambia qualitativamente a seconda del tipo di cellula in cui deve avvenire. Si ha

metilazione de novo anche nei lineage dei trofoblasti che daranno origine a placenta, sacco

vitellino e altri annessi extrembrionali mentre si ha molto presto il raggruppamento delle cellule

germinali primordiali che mantengono il loro genoma ipometilato per potersi differenziare in

spermatozoi e cellule uovo e devono poter imprimere uno schema di metilazione specifico. 78

Schema delle modificazioni epigenetiche durante lo sviluppo non solo a livello della metilazione

del DNA ma anche a livello di modificazioni chiave degli istoni, correlati ai livelli di espressione di

geni associati alla pluripotenza e di geni associati alle funzioni specializzate nel differenziamento.

La demetilazione del DNA delle prime fasi dello sviluppo si associa ad alta espressione di geni

associati alla pluripotenza. Gli altri marcatori sono:

metilazione di H3K4 che ha significato attivatorio. Quando troviamo alti livelli di H3K4

– metilato siamo in presenza di una regione altamente trascritta. Questa modificazione

aumenta con il differenziamento;

metilazione di H3K27 è correlata ad una repressione strutturalmente molto simile

– all'eterocromatizzazione ma non è mediata da metilazione del DNA, è una repressione

molto forte ma transiente/reversibile ed è mediata da un sistema di proteine del gruppo

Polycomb. Questa modificazione aumenta nella fase della morula e della blastocisti e poi

diminuisce. Ciò correla con l'attivazione di geni necessari nello sviluppo e che vengono

mantenuti repressi proprio dalla metilazione di H3K27 fin quando non è necessario attivarli.

H3K27 metilato e il complesso Polycomb mantengono repressi i geni che non devono

essere attivi nelle cellule pluripotenti. Mentre i geni associati alla pluripotenza non sono

metilati su H3K27, sono attivi nella fase della blastocisti ma vengono repressi

permanentemente da metilazione durante lo sviluppo.

CLONAZIONE ANIMALE

Nella pratica tutto questo ci può servire nel momento in cui si voglia interferire con degli schemi

epigenetici per regolare le funzioni cellulari a scopo terapeutico ma anche se si vuole far

dedifferenziare delle cellule come succede nella clonazione animale.

La clonazione è la generazione di organismi identici a partire da un organismo iniziale, non tramite

riproduzione sessuale bensì utilizzando delle cellule somatiche.

Come funziona: si possono prendere cellule differenziate dalla blastocisti, dall'embrione, dal feto o

dall'adulto (come nel caso di Dolly). Quelle prese dall'adulto provengono dal follicolo ovarico, dai

fibroblasti, dai cheratinociti, ecc. Queste cellule somatiche differenziate vengono messe in coltura

e si fanno fondere con delle cellule uovo private del loro nucleo (dando uno stimolo elettrico si

fondono le membrane delle cellule). Ora le cellule uovo hanno un nucleo diploide e invece di

essere differenziate, alcune di esse prolifereranno dando origine a un embrione pre-impianto 79

(morula o blastocisti) e quando impiantati nell'utero di madri adottive, sono in grado di dare

origine ad embrioni, feti e infine alla progenie clone.

Dolly (così come altri animali clonati) ha sviluppato precocemente artrite reumatoide, quindi

invecchiava più velocemente. Ciò è dovuto alla lunghezza dei telomeri, le cellule somatiche hanno

dei telomeri più corti e quindi una potenzialità vitale abbreviata. E' un problema verificatosi nelle

pecore ma non per esempio nei topi.

Cosa succede alla cromatina della cellula somatica per poter diventare un embrione? La cellula

deve poter riprogrammare lo schema di espressione dei geni, di metilazione del DNA e delle

modificazioni epigenetiche degli istoni in modo da rendere il nucleo più simile a quello di uno

zigote e si parla infatti di riprogrammazione.

Tuttavia molti di questi embrioni muoiono precocemente per grossi problemi nello sviluppo perchè

il loro epigenoma non è stato riprogrammato correttamente.

Il concetto di clonazione portò all'idea che deve essere possibile far dedifferenziare una cellula

somatica e farla diventare una cellula embrionale staminale totipotente, senza dover utilizzare il

citoplasma di una cellula uovo. Primo lavoro pubblicato a riguardo è del 2006 da Yamanaka

(ricercatore giapponese che vinse il premio Nobel proprio per questo studio). Yamanaka ha

scoperto che prendendo delle cellule embrionali di topo (o anche fibroblasti adulti), mettendoli in

coltura e infettandoli con 4 retrovirus diversi esprimenti 4 fattori di trascrizione Oct3/4, Sox2, c-

Myc e Klf4, l'espressione contemporanea di questi fattori fa sì che queste cellule si riprogrammino

e diventino cellule staminali pluripotenti → Induced Pluripotent Stem Cells (iPS) 80

9 novembre 2015

Immagine sl. 14/28:

Le modificazioni epigenetiche sono irreversibili e quindi possono essere messe in correlazione con l'ambien-

te. L'ambiente quindi influenza il nostro genoma.

E' possibile che certe malattie siano molto correlate allo stato epigenetico à prospettive diverse di cura.

La regolazione della metilazione ha a che fare con il differenziamento cellulare. Gli embrioni pre-impianto

(precoci) hanno infatti il genoma fortemente de-metilato à sarà un genoma più sensibile. Le cells infatti de-

vono essere in grado di differenziare in tutti i tipi cellulari. Per essere "flessibili" quindi sono fortemente

demetilati. La metilazione è una modificazione che infatti tende ad essere molto stabile.

Spermatozoi e cells uovo sono invece cells altamente specializzate e quindi sono metilate. Ci deve essere

quindi una demetilazione durante le prime fasi dello sviluppo che fa sì che le cells embrionali possano esse-

re pronte per differenziare nei vari tipi cellulari.

Il differenziamento si correla ad un aumento della metilazione che è specifico per le diverse linee cellulari.

Molto presto nello sviluppo, la metilazione del DNA viene cancellata.

Geni associati alla pluripotenza iniziano ad essere espressi, e geni dello sviluppo sono repressi dalla metila-

zioni di HEK7 dal sistema PcG.

Durante la differenziazione delle cells pluripotenti come le cells ES, i geni associati alla pluripotenza sono

repressi, potenzialmente permanentemente, in seguito alla metilazione del DNA.

Allo stesso tempo, geni dello sviluppo iniziano ad essere espressi, e c'è un aumento della metilazione in

H3K4.

Oltre alla metilazione, anche le modificazioni degli istoni vengono regolate (metilazione ad es.). Queste mo-

dificazioni hanno a che fare con una repressione transiente (facilmente removibili) ma molto forte.

La clonazione animale presume che i nuclei somatici possano essere riprogrammati.

Si stanno sviluppando dei metodi per indurre il de-differenziamento di cells somatiche per farle revertire a

cells simili a quelle staminali embrionali (iPS). 4 geni venivano inseriti, tramite dei retrovirus, nelle cells

e questo era sufficiente alla riprogrammazione.

Si stanno studiando metodi per inibire degli enzimi, come

le DNMT, che possano spingere le cells a riprogrammarsi.

Vettori adenovirali: infettano le cells eucariotiche ma non

si replicano e non si integrano. Potrebbero quindi essere

usati per la riprogrammazione.

Cells iPS vengono fatte differenziare in senso neuronale;

si possono studiare (se ci sono) mutazioni nei meccanismi

di differenziamento, sia alterazioni molecolari. Questo si

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fa ad es per malattie neurodegenerative e per studiare approcci terapeutici.

iPS possono essere fatte differenziare nel tipo cellulare che ci interessa e poi essere re-impiantate nel pa-

ziente. Questo può funzionare per certi tipi cellulari e non per altri.

Si parla quindi di clonaggio terapeutico.

In molti tipi di malattie sono state trovate alterazioni epigenetiche specifiche.

Lo sviluppo di neoplasie comporta sempre anomalie nell'espressione genica.

Oncogeni: geni che possono causare il cancro quando espressi in modo eccessivo o inappropriato à muta-

zioni dominanti.

In genere: geni che stimolano la crescita cellulare (molti sono fattori di trascrizione, es. myc, fos, jun).

Oncosoppressori: geni la cui mancanza (per delezione o mutazione) può causare il cancro à mutazioni re-

cessive

In genere: geni che reprimono la crescita o causano la morte cellulare (molti sono fattori di tra