Biologia Molecolare prof.ssa Fiaschi

ESEMPIO SONDA ASPECIFICA

La Cyber green è una molecola fluorescente non specifica perchè

si intercala tra i due filamenti del DNA, a prescindere dalla

sequenza nucleotidica di questi due filamenti di DNA, basta che

ci sia un doppio filamento di DNA per far si che la sonda

fluorescenti si intercali tra i due filamenti e se viene eccitata ad

una determinata lunghezza d’onda riemette questa energia

sottoforma di fluorescenza. Per cui che cosa succede durante una

reazione rtPCR: questo è il DNA denaturato durante la prima fase

della PCR, questo è il primer e questa è la sonda, che

praticamente si intercala tra i due filamenti, però durante la

fase di denaturazione le due eliche di DNA sono separate e

quindi la sonda non si intercala tra il doppio filamento

perchè non c’è. Questa sonda riesce a mettere fluorescenza

quando è intercalata tra i due filamenti di DNA.

Quando la reazione di PCR va avanti, dopo la fase di

denaturazione, c’è la fase di annealing, in cui si ha il legame

del primer con il filamento complementare, tale legame

genera una porzione di doppia elica tra primer e elica

complementare, e tale frammento permette l’inserzione di

questa molecola fluorescente che quando si intercala tra i due filamenti se viene eccitata ad una

determinata lunghezza d’onda riemette fluorescenza, poca,

perchè all’inizio durante l’annealing la quantità di DNA a doppio

filamento è molto piccola, però via via che durante la fase di

elongazione a partire dal primer, la TAQ-polimerasi incomincia a

sintetizzare il filamento complementare, a quello stampo, del

nuovo DNA, quindi forma l’amplificato; la porzione quindi a

doppio filamento aumenta, e

aumentando la quantità di

doppio filamento questa

sonda si intercala sempre di

più ed emette sempre più fluorescenza se eccitata alla

giusta lunghezza d’onda. Questa fluorescenza emessa da

questa sonda, sarà direttamente proporzionale alla

quantità di amplificato prodotto, quindi alla quantità di

DNA a doppio filamento che è stato prodotto durante il

processo di amplificazione. 17 di 18

SONDA TAQMAN

È una sonda che non è altro che un primer, quindi una piccola

sequenza nucleotidica, che è complementare al frammento di DNA

che si deve amplificare, questa sonda Tagman, che è un piccolo

primer complementare alla zona interna dell’amplificato, e quindi

non prende il posto dei primer della PCR.

Questa sonda poi è un primer modificato perchè ha le estremità

5’P e 3’OH legate a delle molecole e queste molecole sono una

molecole R (R=Reporter) e Q (Q=Quencher).

Qual’è la funzione di R e di Q?

R è un molecola fluorescente, quindi è grazie all’eccitazione

di R che c’è fluorescenza , perchè R è quella molecola che se

eccitata ad una determinata lunghezza d’onda, prende

energia e poi dopo la riemette sottoforma di fluorescenza ad

una lunghezza d’onda più elevata. Però R, questo Reporter,

non riesce a mettere fluorescenza fino a quando si trova

legato al Quencher. Quando il Reporter, si trova vicino al

Quencher, non riesce a emettere fluorescenza, perchè

Quencher impedisce/inibisce l’emissione di fluorescenza.

R è in grado di emettere fluorescenza quando Q è lontano da R e questo avviene durante il

processo di amplificazione (elongazione), perchè?

Supponiamo che questo sia il frammento di DNA da

amplificare, questo è la sonda fluorescente specifica, che è un

piccolo primer, che ha una sequenza complementare ad una

porzione interna del DNA da amplificare, quindi non prende il

posto del primer. Durante la reazione di elongazione la TAQ-

polimerasi fa quello che deve fare e comincia a sintetizzare il

filamento di DNA, fino a che non incontra la sonda, che ha

legati R e Q, quando la TAQ polimerasi incontra questa sonda,

attiva la sua attività esonucleasi 5’P-3’OH, e comincia a

staccare i nucleotidi di questa sonda specifica che quindi

viene completamente degradato. Rompendo i legami fosfodiesterici, Q ed R, si trovano ad

essere lontani, perchè vengono staccati, e quindi R può emettere fluorescenza, dopo che è stato

eccitato ad una certa lunghezza d’onda, che generalmente è un laser. 18 di 18

Continuo Real time PCR

La sonda Sybr Green che si intercala nel doppio filamento di DNA via via che la reazione di PCR

va avanti e che questa intensità di fluorescenza è direttamente proporzionale alla quantità di

amplificato che a sua volta è direttamente proporzionale alla quantità di RNAm utilizzato

(molecola da cui si parte per fare la rtPCR). Questo era un esempio di sonda aspecifica, che si

chiamano così per il fatto che sono sonde che si intercalano nel doppio filamento di DNA a

prescindere dalla sequenza nucleotidica che costituisce il doppio filamento di DNA (quindi

l’amplificato di PCR) e si differenziano dalle sonde specifiche come per esempio la sonda

TaqMan, che sono sonde particolari, in quanto sono dei primer, che hanno una sequenza

nucleotidica complementare all’amplificato. quindi le sonde TaqMan sono sonde di nucleotidi

che presentano le estremità 5’P e 3’OH modificate, perché sono attaccate a due molecole che

sono il Quencher e il Reporter. Il Reporter è quello che emette fluorescenza ma non la emette

finche si trova vicino al Quencher, solo nel momento in cui il Reporter e il Quencher si separano,

allora riesce ad emettere fluorescenza; ed emette fluorescenza quando la Taq-polimerasi

incontra questa sonda che è interna al DNA amplificato e attivando la sua attività esonucleasica

in direzione 5’P-3’OH taglia questa sonda e quindi separa e allontana il reporter dal quencher. Il

quencher a questo punto non è più in grado di inibire le emissioni di fluorescenza da parte del

Reporter che emette quindi fluorescenza. Chiaramente l’emissione di fluorescenza avviene dopo

che la molecola, in questo caso il Reporter, viene eccitato, e questa eccitazione avviene grazie

ad un Laser, che ha una determinata lunghezza d’onda, che colpisce ed eccita il Reporter

portandolo ad un livello energetico più alto. Quando il Reporter perde questa energia che ha

acquisito grazie all’eccitazione da parte del laser, questa energia viene riemessa sottoforma di

fluorescenza, ed è quello che viene rilevato da un rilevatore che poi manda i dati al computer

che costruisce un grafico.

Plot di Amplificazione

Il grafico che viene fuori sullo schermo di un computer, direttamente collegato al Cycler è

questo: (la professoressa all’esame chiede questo grafico e va saputo anche disegnare)

Questa è una curva di amplificazione, che viene fuori con la amplificazione con la rtPCR:

- Sull’asse delle ascisse c’è il numero di cicli di PCR

(indicati con Ct, questo acronimo sta a significare il

numero di cicli di PCR)

- Sulle ordinate, c’è l’intensità di fluorescenza.

In questo grafico si possono distinguere 3 regioni; una

linea che viene detta regione basale, che è una linea

parallela all’asse delle ascisse e quindi che interseca

l’asse delle ordinate a livello di una determinata misura

di fluorescenza e si chiama linea basale, perchè al di

sotto di questa linea basale è compresa tutta l’intensità

di fluorescenza aspecifica, quindi che non dipende

dalla amplificazione e quindi non dipende dalla

reazione PCR. 1 di 22

Che cosa è una fluorescenza aspecifica?

É una fluorescenza basale propria di tutte le molecole in quanto tutte le molecole hanno una

praticamente una fluorescenza aspecifica perchè è una caratteristica propria delle molecole,

anche se queste non vengono eccitate da nessun laser. Quindi diciamo che è quello che si

chiama “il Background” la misura/quantità di fluorescenza che non dipende dal fatto che è

avvenuto l’amplificazione.

Soltanto al di sopra di questa regione basale, si comincia a misurare la fluorescenza che invece

dipende dall’amplificazione, in quanto viene misurata l’intensità di fluorescenza che deriva

dall’amplificato. Questa curva di fluorescenza, viene fuori in real time, in live (in diretta), proprio

perché si parla di PCR in tempo reale, quindi, se noi abbiamo il Cycler, collegato al computer, in

live viene costruito, via via che i clici di PCR vanno avanti, un pezzettino di questa curva di

fluorescenza.

Alla fine della PCR, l’operatore, può scegliere la cosiddetta Treshold o linea soglia. La linea

soglia è una linea che individua un intensità di fluorescenza, che interseca la fluorescenza,

dovuta alla presenza dell’amplificato, in un determinato punto della curva di amplificazione.

Se si riporta il punto in cui la Treshold interseca la curva di amplificazione sulle ascisse, si ottiene

il numero di cicli di PCR a livello del quale c’è stata l’intersezione tra la curva di amplificazione e

la Treshold (che ricorda viene scelta dall’operatore). Quindi l’intersezione tra la Treshold e la

linea di amplificazione individua quello che si chiama il “Ct”

che è il numero di cicli della reazione di PCR che ha

permesso di visualizzare un intensità di fluorescenza

superiore a quella della linea basale. Siccome La linea

Treshold viene scelta dall’operatore, quindi due operatori

possono scegliere due linee Treshold diverse, in quanto la

scelta è arbitraria, però, la linea Treshold scelta deve

sempre intersecare la curva di amplificazione, in modo tale

da estrapolare sull’asse delle ascisse il Ct.

Abbiamo poi detto che possiamo fare con la rtPCR un

analisi quantitativa di più RNAm, quindi il computer

riporterà svariate curve di amplificazione sullo stesso

grafico (ogni curva viene identificata con un colore diverso),

dunque al momento della scelta della Treshold; tale Treshold va scelta in maniera tale che

intersechi tutte le curve di amplificazione, di tutti gli RNAm che si è deciso di amplificare. Quindi

sul pc non avremo mai una singola curva, ma ne avremo diverse, fino a 90 rtPCR

contemporaneamente, ciascuna che corrisponde ad un RNAm differente. Quindi in pratica deve

intersecare tutte e 90 le curve di amplificazione.

Quindi in pratica la Treshold va scelta in maniera tale che sia superiore alla linea basale e che

intersechi tutte le curve di amplificazione di tutti gli RNAm amplificati, perchè

contemporaneamente devo dare una misura di tutti gli RNAm che ho deciso di quantificare e

che sono presenti all’interno di una mia determinata po