Biologia Molecolare prof.ssa Fiaschi

Biologia molecolare

Dogma centrale della biologia

All'interno delle cellule eucariote c'è un'informazione, che segue una determinata direzione e questa informazione si sposta, dalla molecola che contiene tutta questa informazione, che è il DNA, all'RNA (i due acidi nucleici, che si trovano nel nucleo), e poi passa nel citoplasma, dove viene utilizzato per la sintesi di una proteina, per lo meno le molecole di RNA che contengono l'informazione necessaria per la produzione di proteine e cioè l'RNAm. Quindi questo è il flusso dell'informazione delle cellule eucariotiche. Dunque l'informazione passa da DNA, a RNA e infine alle proteine. In conclusione noi eucarioti possiamo avere soltanto un'unica direzione dell'informazione.

Ci sono però dei casi in cui sono presenti delle Trascrittasi Inverse, quindi si parla di trascrizione inversa, che permettono di fare il contrario, cioè passare dall'RNA al DNA, noi eucarioti non lo possiamo fare, ma dei retrovirus (sono dei virus a genoma a RNA) lo possono fare, proprio grazie a questi enzimi Trascrittasi Inversa, possono quindi compiere una trascrizione inversa, e quindi trasformare il loro genoma a RNA ad uno a DNA.

OSSERVAZIONE: noi la Trascrittasi Inversa non ce l'abbiamo, per questo non possiamo trascrivere al contrario (quindi retrotrascrivere). Questo appena detto è il dogma della biologia, cioè il flusso dell'informazione genica all'interno delle cellule.

Approfondimento

Il dogma centrale della biologia molecolare è un principio formulato negli anni cinquanta, secondo cui, in biologia molecolare, il flusso dell'informazione genetica è monodirezionale: parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine, senza considerare un percorso inverso. Il termine «dogma» non era inteso in senso assoluto, ma derivava da una personale interpretazione dell'ideatore della teoria, il premio Nobel per la medicina Francis Crick.

Allo stato attuale, il dogma centrale è rassegna dei meccanismi alla base dell'espressione genica, in quanto nel tempo sono stati scoperti meccanismi biologici che espandono questa descrizione. Nel sistema dell'espressione genica cellulare sono identificabili tre punti che rappresentano la direzione fondamentale del flusso di informazione genetica:

• L'informazione genetica è conservata negli acidi nucleici DNA ed RNA (come in alcuni virus), che possono essere duplicati per la propagazione dell'informazione (è parte del flusso trasmettere l'informazione).
• Il DNA, per essere espresso nella cellula, viene trascritto sotto forma di RNA. L'RNA, presente in alcuni virus come informazione genetica, può essere retrotrascritto in DNA.
• L'RNA (se codificante) è tradotto in proteine, concepite come la forma operativa e terminale delle informazioni contenute nel genoma.

Acidi nucleici

Dato che abbiamo introdotto il DNA e l'RNA, si parla ora degli acidi nucleici. Gli acidi nucleici sono il DNA (acido deossiribonucleico) e l'RNA (acido ribonucleico), che sono tutti e due costituiti da dei mattoncini, che sono i nucleotidi (unità fondamentali degli acidi nucleici), che a loro volta sono costituiti da 3 componenti che sono:

• Un gruppo fosfato
• Uno zucchero
• Una base azotata

Quindi DNA e RNA sono polinucleotidi. Ogni nucleotide, all'interno della stessa catena polinucleotidica, varia in base al tipo di base azotata che lo forma. Ciò che cambia e che definisce e che distingue RNA e DNA è lo zucchero; perché, nel DNA c'è, come zucchero il deossiribosio, che è il ribosio privato del gruppo OH in posizione 2, il quale è stato sostituito da un H, mentre nell'RNA, c'è il ribosio.

Le basi azotate invece vengono divise in purine e pirimidine, le purine (basi grandi) sono l'Adenina e la Guanina, e le pirimidine (basi piccole), sono la Timina, la Citosina, e l'Uracile. Sia nel DNA che nell'RNA, si trovano l'Adenina, la Guanina e la Citosina, ciò che cambia sono la Timina e l'Uracile, nel primo caso troviamo la Timina, mentre nel secondo l'Uracile. Nel DNA, quindi, abbiamo Timina, Citosina, Adenina e Guanina, mentre nell'RNA, abbiamo Uracile, Guanina, Adenina, e Citosina.

Formazione di un nucleotide

Come si legano queste 3 componenti per formare un nucleotide? Si legano in questo modo:

• Al centro c'è lo zucchero, che è il deossiribosio nel caso del DNA, o ribosio nel caso dell'RNA, la base azotata si lega al carbonio in posizione 1 dello zucchero, tramite un legame N-glicosidico, attraverso l'eliminazione di una molecola d'acqua. Quindi qualunque sia la base azotata che si lega allo zucchero forma un legame glicosidico con il carbonio 1. Mentre il gruppo fosfato si lega al carbonio in posizione 5, attraverso un legame fosfoesterico, formando così un nucleotide. Il gruppo fosfato può essere presente in un nucleotide in numero variabile, per un massimo di 3 gruppi fosfato presenti contemporaneamente, legati l'uno all'altro, per cui si può parlare di nucleotide monofosfato se c'è un gruppo fosfato, difosfato se ce n'è 2, trifosfato se ce n'è 3.

Il legame fosfodiesterico e polinucleotidi

Come si legano i nucleotidi? I nucleotidi si legano, tra di loro attraverso la formazione di un legame fosfodiesterico.

Come si forma questo legame fosfodiesterico? Si forma tra il gruppo ossidrile in posizione 3 di un nucleotide e il gruppo fosfato in posizione 5 del nucleotide che deve essere attaccato. Dunque una catena di acidi nucleici si allunga in direzione 5'P-3'OH. Infatti sono catene fatte in modo tale che il primo nucleotide abbia il gruppo fosfato libero, e l'ultimo nucleotide abbia il gruppo 3'OH libero, quindi praticamente questi due gruppi, il gruppo fosfato legato al carbonio in posizione 5 dello zucchero, e il gruppo ossidrile legato al carbonio in posizione 3 dello zucchero, identificano una direzione, che è la direzione 5'P-3'OH, e questa direzione indica la direzione di allungamento degli acidi nucleici. Per cui gli acidi nucleici si allungano sempre in direzione 5'P-3'OH, e gli enzimi che producono questi acidi nucleici, che sia la DNA polimerasi o che sia la RNA polimerasi, attaccano i corrispettivi nucleotidi sempre in direzione 5'P-3'OH.

OSSERVAZIONE: Il legame fosfodiestereo fa da ponte tra 2 nucleotidi.

Il DNA

Il DNA, rispetto all'RNA, è formato da due catene che si dicono antiparallele e complementari.

Complementari che vuol dire?

Vuol dire praticamente che le basi azotate che costituiscono i nucleotidi e che si trovano una su un filamento e una sull'altro, si legano seguendo delle regole ben precise, e cioè si legano seguendo la cosiddetta, legge della complementarietà delle basi, quindi non si legano a caso. E questa legge dice che l'Adenina presente su un filamento si lega con la Timina dell'altro filamento, e la Citosina e la Guanina lo stesso. Questi legami tra le basi azotate dei nucleotidi che formano i due filamenti sono quelli che tengono insieme i due filamenti di DNA, perché tra queste basi azotate si formano dei legami a H, quindi l'adenina presente su un filamento e la timina presente sull'altro filamento, così come la citosina e la guanina, sono unite da dei legami a H, in particolare la Citosina e la Guanina si legano con 3 legami a idrogeno, mentre Adenina e Timina con 2 legami a idrogeno.

Questo lo rivedremo, per esempio quando guarderemo la struttura dei siti ORI, che sono quei siti presenti sul DNA, che sono quelli a livello dei quali comincia la replicazione del DNA, che sono costituiti praticamente da una regione formata da Adenine e timine, perché queste due basi azotate sono tenute insieme da due legami ad H, al contrario della Guanina e della Citosina, che sono tenute insieme da 3 legami ad H, e quindi la cellula spenderebbe più energia per rompere 3 legami ad H rispetto a 2.

Antiparallele che significa?

Significa che l'estremità 5'P di un filamento si lega all'estremità 3'OH dell'altro filamento, e questo avviene sia su un'estremità del filamento che l'altra. Questa complementarietà e antiparallelismo che è presenta nella molecola di DNA, deve essere mantenuto anche quando la molecola di DNA si duplica, per cui quando una molecola di DNA si duplica, da una molecola di DNA madre che è complementare e antiparallela, si devono formare due molecole figlie di DNA, che sono sempre complementari e antiparallele come la molecola di DNA parentale/madre.

Struttura del DNA

Il DNA si trova in natura come una doppia elica destrorsa, in cui la struttura esterna è costituta dalla ripetizione zucchero-fosfato, quindi praticamente si forma una struttura a spirale, cioè questi due filamenti si spiralizzano e formano una struttura a spirale appunto, in cui una porzione esterna, quindi lo scheletro esterno, della molecola di DNA è costituito dalla ripetizione zucchero-fosfato, mentre all'interno dell'elica si trovano le basi azotate che sono legate in maniera complementare fra di loro e sono tenute insieme da legami ad H.

Forma del DNA

In realtà, in natura, è stato visto che il DNA è presente in 3 forme A, B e Z. La forma B è quella che è stata descritta fino ad adesso, che è la cosiddetta forma rilassata del DNA, la forma Z, invece ha una struttura più allungata, e la forma A invece ha una struttura un pochino più panciuta.

Superavvolgimenti del DNA

Il DNA può subire dei, cosiddetti, superavvolgimenti, cioè questa elica del DNA (che è destrorsa/senso orario), può trovarsi in una forma avvolta e si parla di un DNA superavvolto negativamente, quando l'avvolgimento è minore rispetto a quella della forma rilassata del DNA, e invece un DNA superavvolto positivamente quando invece la spiralizzazione è molto più elevata rispetto alla forma rilassata del DNA.

OSSERVAZIONE: Il superavvolgimento è negativo quando consiste in una rotazione in senso opposto a quello di avvolgimento del DNA; positivo quando la rotazione è nella stessa direzione dell'avvolgimento del duplex.

Approfondimento

Il DNA è avvolto in forma di doppia elica, nella quale entrambe ruotano attorno ad un asse.

• Un ulteriore ripiegamento o una torsione (quindi una rotazione in senso orario o antiorario) di tale asse, su se stesso, produce un superavvolgimento del DNA (negativo o positivo). Se non esiste alcun tipo di superavvolgimento si dice che il DNA si trova nello stato rilassato.

Le topoisomerasi e i superavvolgimenti

Questo DNA superavvolto positivamente, si forma durante la duplicazione del DNA, per cui praticamente quando il DNA passa dalla forma B, rilassata, ad una forma superavvolta; se questi superavvolgimenti non venissero tolti, la duplicazione del DNA verrebbe bloccata. Allora ci sono degli enzimi particolari delle cellule che servono per togliere i superavvolgimenti del DNA (li possono anche introdurre a seconda dell'enzima), che sono le topoisomerasi, in particolare ci sono due tipi di topoisomerasi:

• Le topoisomerasi di tipo 1 svolgono superavvolgimenti più semplici
• Le topoisomerasi di tipo 2 svolgono avvolgimenti più complessi.

Questo è per dire che l'elica del DNA si può anche superavvolgere e questi superavvolgimenti vengono tolti da degli enzimi presenti nella cellula, che si chiamano topoisomerasi.

Approfondimento

Le topoisomerasi sono una categoria di enzimi appartenenti alla classe delle isomerasi che regolano il metabolismo del DNA. In particolare, le topoisomerasi determinano un aumento o una diminuzione del grado di superavvolgimento. Tali enzimi svolgono un ruolo fondamentale nell'impacchettamento e nella replicazione del DNA. Più in dettaglio, essi sono in grado di introdurre una rottura del singolo o del doppio filamento di DNA in modo temporaneo.

La topoisomerasi II è una classe di enzimi tra i quali figura la Topoisomerasi DNA girasi procariote, che è in grado di introdurre, invece che di rimuovere, superavvolgimenti negativi (cioè ruota la molecola di DNA in senso opposto) ovvero rilassare i superavvolgimenti positivi dovuti all'azione, durante la replicazione del DNA, della DNA elicasi. Così facendo la DNA girasi riduce la tensione torsionale della molecola di DNA. Essa agisce:

• Rompendo reversibilmente la doppia elica per creare un passaggio di DNA
• Facendo passare la seconda elica vicina attraverso la rottura
• Risaldando la rottura e dissociandosi dal DNA
• Stabilizzando i filamenti separati

Denaturazione del DNA

Una caratteristica peculiare del DNA è la, cosiddetta, denaturazione e rinaturazione, che è una caratteristica fondamentale, che ritroveremo in una tecnica che è la PCR, cioè la reazione a polimerizzazione a catena del DNA, che si basa proprio su questa caratteristica del DNA, che cosa significa? Se noi abbiamo una molecola di DNA, e lo inseriamo in una soluzione acquosa e portiamo a temperatura di bolle, oppure in un bagnato a secco, cioè senza acqua, la temperatura rompe i legami ad H che tengono unite le basi, per cui i filamenti non sono più legati, e si ha la separazione dei due filamenti del DNA. Quando il DNA passa ad essere da due filamenti a filamento singolo, si dice che il DNA è denaturato. Anche le proteine si denaturano, ma il DNA per sua natura riesce a rinaturarsi completamente, se si abbassa la temperatura, anche fino a temperatura ambiente e se si fa passare un po' di tempo, si riformano i legami ad H e per complementarietà e antiparallelismo si forma la stessa molecola iniziale del DNA (vedi reazione PCR), mentre una proteina che è stata denaturata troppo, non riesce ad acquisire di nuovo la sua forma iniziale e quindi a svolgere la funzione.

L'RNA

L'RNA è una molecola, sempre, a singolo filamento di nucleotidi, in particolare da ribonucleotidi. Però il fatto che l'RNA sia una molecola a singolo filamento non gli impedisce di formare strutture secondarie, come il tRNA, oppure quella a forcina, o delle gemme o delle anse. Quindi è vero che l'RNA è a singolo filamento ma ci sono degli RNA, che riescono a formare delle strutture secondarie, anche molto complesse, come nell'immagine qui a destra (RNAr 16S).

Compattamento del DNA

Qual è il problema della molecola di DNA? È che se uno la svolgesse, ci si rende conto che è lunghissima, perché è formata da miliardi e miliardi di nucleotidi, e questa deve entrare dentro una cellula, e non solo all'interno della cellula, ma all'interno del nucleo della cellula, che è una struttura ancora più piccola della cellula, per ciò non può entrare tutta svolta, ma deve essere compattata, quindi..

Come viene compattato il DNA in maniera da far sì che questa lunga molecola possa entrare nel nucleo?

Il DNA è una doppia elica spiralizzata, con filamenti complementari e antiparalleli, e all'interno troviamo le basi azotate, mentre lo scheletro è formato dallo zucchero e il fosfato. In soluzione acquosa, il gruppo fosfato si dissocia, portando cariche negative sulla molecola di DNA. Questo è il motivo per cui il DNA ha una carica netta negativa, perché la presenza del gruppo fosfato in soluzione acquosa, fa sì che i gruppi fosfato che costituiscono il nucleotide del DNA, e che partecipano alla formazione del legame fosfodiestereo siano in forma negativa, quindi espongano delle cariche negative e conferiscono al DNA una carica netta negativa.

Quindi se noi prendiamo una molecola di DNA e cerchiamo di compattarla, questa non si compatterà mai, perché praticamente le cariche negative tenderanno a far sì che i filamenti di DNA si separino, in quanto le cariche dello stesso segno si respingono.

Ma allora come fa a compattarsi?

Le cariche negative si respingono, quindi paradossalmente le eliche tenderebbero a separarsi, ci vogliono delle altre componenti, queste altre componenti che partecipano al compattamento del DNA, sono delle proteine, che si chiamano istoni. Gli istoni sono quelle proteine che servono al compattamento del DNA, perché proprio gli istoni? Perché gli istoni al contrario di quello che succede nel DNA, sono delle proteine basiche, cioè sono proteine che hanno una carica netta positiva, e quindi sono perfette per legarsi al DNA, che è ricco di cariche negative e per cercare di compattare il DNA, perché le cariche positive degli istoni annullano le cariche negative del DNA.

Quanti sono questi istoni?

Gli istoni che partecipano al complessamento del DNA sono 5 istoni, 4 di questi sono H2B, H2A, H3 e H4, e poi c'è anche H1, i primi 4 formano il core istonico, che non è altro che l'unione di 8 proteine istoniche, che sono costituiti dalla ripetizione ciascuno di 2 istoni, quindi nel core istonico si troverà 2 H2A, 2 H2B, 2 H3 e 2 H4, per un totale di 8, quindi il core istonico è formato da 8 istoni in cui 4 istoni sono ripetuti 2 volte. In particolare questo core istonico si forma perché si uniscono 2 dimeri H2A e H2B, quindi due dimeri H2A e H2B si uniscono e formano un tetramero, e poi si forma un tetramero H3 e H4, per un totale di 8 istoni. Quindi il core istonico è formato dall'unione di 2 dimeri H2A e H2B e da 2 dimeri H3 e H4, per un totale di 8 istoni che formano il core istonico.

Questi istoni hanno la particolarità di avere delle code ammino terminali (indicate con N nell'immagine) libere che non fanno parte del core istonico, in quanto non prendono parte alla formazione del core isto...