Biologia Molecolare, prof Barabino

Storia della scoperta del DNA

Nel 1869 Miescher isolò dal nucleo di cellule eucariotiche un insieme di DNA e proteine che chiamò "nucleina". Alla fine del 1800 si scoprì l'RNA del citosol. Nel 1928 Griffith scoprì la trasformazione batterica. Il DNA fu indicato come molecola portante l'informazione genetica solo negli anni '30. All'inizio si pensava che fossero le proteine le biomolecole informazionali poiché erano composte da un maggior numero di monomeri distinti. Nel 1944 Avery dimostrò che la degradazione del DNA portava ad una perdita di informazione genetica: egli usò proteasi per degradare le proteine, DNAasi per degradare il DNA e RNAasi per degradare l'RNA. La trasformazione batterica successiva a questi trattamenti avveniva solamente laddove il DNA non era stato intaccato. Nel 1952 Harshey e Chase dimostrarono definitivamente che è il DNA a portare l'informazione genetica: il loro esperimento prevedeva di

marcare il DNA di un batteriofago con ³²P e di monitorare poi la sua eventuale entrata nella cellula batterica infettata. In una seconda infezione furono invece marcate con un isotopo di S le proteine del capside virale. Ciò che i due scienziati videro fu che solo l'isotopo del fosforo era entrato nelle cellule batteriche e che quindi era il DNA a portare l'informazione per replicare i batteriofagi. Nel 1950 Chargaff studiò la composizione percentuale delle quattro basi del DNA e le quantità di DNA di diverse specie.

Regole di Chargaff:

• La quantità di DNA è specie specifica
• [A] = [T] e [C] = [G]
• [C+G] < [A+T]

Nel 1952 Rosalind Franklin ottenne la radiografia del DNA tramite esperimenti di cristallografia. Nel 1953 Watson e Crick capirono la struttura base del DNA: ha un passo di 3.4nm, un diametro di 2nm e che la distanza interbasica è di 0,34nm.

Il DNA nella maggior parte dei casi è stabile come doppia elica.

solo in alcuni virus si presenta come singolo filamento.

Le basi azotate sono la parte variabile che compone i nucleotidi sono due purine: Adenina e Guanina (doppio anello5+6); e due pirimidine: Citosina e Timina (singolo anello esatomico).

Lo zucchero è invece il desossiribosio. A completare la struttura del nucleotide c'è un gruppo fosfato che si lega al gruppo -OH del C-6 dello zucchero.

Un nucleoside è invece l'unione della sola base azotata con lo zucchero.

Una catena di DNA inizia con un gruppo fosfato (P-5') e termina con un gruppo ossidrile libero (OH-3').

Per convenzione si scrivono le sequenze nucleotidiche nel seguente modo: 5'-ATCG-3'.

La catena cresce sempre in direzione 5'-3'.

La doppia elica del DNA è composta da due filamenti antiparalleli: ossia condirezioni opposte.

Tra Adenina e Timina si formano due legami idrogeno mentre tra Citosina e Guanina tre; questa differenza è alla base del base pairing.

I ponti idrogeno si instaurano sempre tra atomi degli anelli esatomici e servono a stabilizzare la struttura del DNA. Questo tipo di appaiamento è anche noto come "Appaiamento Watson-Crick". Oltre ai legami idrogeno, le altre forze che stabilizzano il DNA sono: interazioni idrofobiche tra basi sovrapposte, forze elettrostatiche.

Sequenza senso: contiene l'informazione codificante

Sequenza antisenso: catena complementare alla sequenza senso

B-DNA

Struttura canonica del DNA così come è stata prevista da Watson e Crick. Ha un'elica sinistrorsa che comprende l'alternanza di solchi maggiori e solchi minori. Le proteine interagiscono col DNA attraverso i solchi maggiori.

Elica-A

Non si riconoscono i due solchi e la spirale è più ripida. Questa elica si forma in condizioni fisiologiche in ibridi DNA-RNA oppure dalla disidratazione del B-DNA. Questa struttura si forma anche in doppie eliche di RNA (rare). Questo genere di elica provoca

interazioni con proteine diverse da quelle che ci sono con l'elica canonica. Ha un andamento destrorsoElica-ZElica con andamento sinistrorso. Ha un diametro minore del B-DNA e il solco minore è ulteriormente stretto e profondo.Questa elica si forma con alte concentrazioni di sali. Si pensa che il DNA nei cromosomi in particolari condizioni assumala struttura Z.

2RNANelle cellule si trova principalmente in tre forme:

• RNA messaggero - mRNA: substrato della sintesi proteica
• RNA transfer - tRNA: decodifica il codice genetico
• RNA ribosomiale - rRNA: catalizza la sintesi proteica e corrisponde a circa l'80% di tutto il RNA

L'RNA è costituito dalle basi A-U e C-G, l'Uracile sostituisce la Timina come pirimidina. Lo zucchero è il ribosio. L'RNA nasce e generalmente funziona come molecola a singolo filamento. La sua struttura a doppio filamento si genera per ripiegamento su sé stessa di una singola

molecola di RNA. Non si applicano le regole di Chargaff per l'RNA poiché è appunto generalmente una molecola a singolo filamento. L'RNA ha strutture II non estese che consistono in regioni a doppio filamento all'interno di una molecola lineare. La sua struttura III rappresenta il ripiegamento tridimensionale ed è tipica del tRNA dove le basi si appiano sia con accoppiamenti tipici che non.

Gene

Il gene è l'unità fisica e funzionale dell'ereditarietà ma una definizione univoca ed esaustiva per il gene non è ancora stata stesa. La teoria genica è stata elaborata da Mendel nel 1866 e successivamente inglobata nella genetica nei primi anni del 1900. Il concetto di gene precede la scoperta della struttura e composizione chimico-fisica del DNA. Un gene è fondamentalmente un segmento di DNA che contiene sequenze codificanti per proteine, altri geni invece codificano per i vari tipi di RNA. Thomas Morgan ha

elaborato le prime mappe fisiche del cromosoma in cui un gene occupa un preciso locus. Esistono tuttavia geni che si muovono all'interno o su cromosomi diversi. Negli eucarioti le porzioni codificanti di DNA sono inserite in regioni non codificanti che tuttavia sono trascritte ed entrano quindi a far parte di un gene. Il numero dei geni spesso aumenta in rapporto alla complessità filogenetica; in generale negli organismi il numero di geni varia tra 500 e 40'000. I batteri parassiti obbligati sono gli organismi con i genomi più piccoli mentre alcune angiosperme sono gli organismi con i genomi più grandi. Con l'aumento di dimensione del genoma non aumenta proporzionalmente il numero di geni.

Genoma

Il genoma è l'insieme del materiale genetico dell'organismo. Questo implica che il genoma non sia esclusivamente composta da geni. Nel genoma si trova il DNA intergenico e il DNA ripetitivo (sia codificante che non). Il DNA intronico non

è codificante. Organizzazione del genoma batterico

I genomi batterici sono molto compatti poiché la parte codificante è preponderante su quella non codificante. Nei batteri i geni si trovano in aggregati con una regione di controllo comune.

Operone: aggregato dei geni di una stessa via metabolica controllati da una regione comune. Questi geni sono espressi da un unico mRNA detto “mRNA policistronico”

Organizzazione del genoma eucariotico

I geni degli eucarioti sono costituiti da blocchi codificanti, esoni, intervallati da regioni non codificanti, introni. Ogni gene è regolato in modo specifico ed indipendentemente l’uno dagli altri. Il precursore mRNA contiene sia esoni che introni e solo successivamente viene modificato a dare il vero mRNA costituito da sole sequenze esoniche.

Paradosso valore C: negli eucarioti non c’è correlazione tra quantità di DNA, numero di geni e complessità evolutiva. Cè la

La quantità totale di DNA di un genoma aploide, n, è il numero di cromosomi in un genoma aploide. I cromosomi si dividono in autosomi e cromosomi sessuali (XY).

Ploidia: numero di copie di cromosomi per cellula

• Aploidia (n)
• Diploidia (2n)
• Anaploidia: numero di cromosomi errato o presenza di cromosomi incompleti
• Poliploidia

Suddivisione DNA

Il DNA si suddivide in:

• Codificante (<10%)
  • Geni codificanti proteine
  • Geni singoli per le proteine strutturali
  • Copia multipla
  • Identiche
  • Non identiche: le famiglie geniche
• Moderatamente ripetuto (10 - 10 copie)
  • SINES
  • LINES
• Altamente ripetuto (> 10 copie)
  • Microsatellite
  • Minisatellite
• Geni codificanti RNA (sono molto ripetuti)
• Geni codificanti istoni (sono molto ripetuti)
• Non codificante (>90%): può essere distinto in extragenico e intragenico

Ripetizione sequenze

Dal punto di vista delle sequenze nucleotidiche troviamo:

• Non ripetute:
geni in singola o poche copie
1. Moderatamente ripetute: famiglie geniche come quelle degli rRNA, tRNA o istoni. Comprendono gli elementi mobili del DNA
2. Altamente ripetute: brevi sequenze ripetute. Tra le sequenze altamente ripetute troviamo il DNA satellite che ha un peso minore del grosso del DNA cellulare. È costituito da tratti fino a 100kb di ripetizioni di 200 nucleotidi. Si trova in tutti i cromosomi nella zona del centromero, ai telomeri e a seconda del cromosoma in regioni specifiche. Queste zone specifiche possono essere individuate con la tecnica FISH. Il DNA satellite è composto da minisatellite e microsatellite
3. Mini: tratti ripetuti di 100bp per un totale di 5kb. Il minisatellite è individuo specifico per via degli errori nella sua duplicazione. Questo DNA è usato nelle tecniche di fingerprinting
4. Micro: DNA intergenico
Elementi mobili:
• Trasposoni: sequenze di DNA in grado di spostarsi dal loro locus. Si pensa siano sequenze di
  1. LINES: long interspected elements. L1 è la tipologia più comune e rappresenta il 15% del genoma umano
  2. SINES: short interspected repeats. Alu è la tipologia più nota con una sequenza di 300bp; la loro sequenza è riconosciuta da Alu1 che è un enzima di restrizione batterico. Gli Alu sono tipici dei primati

  LINES e SINES hanno avuto un importante ruolo nell'evoluzione biologica

  Famiglie ripetute: geni per rRNA e tRNA. Negli eucarioti si usa il termine Cluster per indicare quei geni che sono trascritti in un unico mRNA che poi viene opportunamente modificato. Sono tutti co-trascritti da un unico sito regolativo. Un esempio nell'uomo di famiglia è quello dei geni delle globine, la parte proteica della emoglobina. Si pensa che la famiglia delle globine si sia evoluta per duplicazione e mutazioni. Successivamente c'è stata una trasposizione su cromosomi diversi dei geni che codificano per le catene

  α e β. Successive duplicazioni hanno portato alle varie varianti di questedue catene con anche mutazioni