Biologia Molecolare, prof Barabino

Biologia molecolare anno accademico 2017-2018

DNA

Nel 1869 Miescher isolò dal nucleo di cellule eucariotiche un insieme di DNA e proteine che chiamò “nucleina”. Alla fine del 1800 si scoprì l’RNA del citosol. Nel 1928 Griffith scoprì la trasformazione batterica. Il DNA fu indicato come molecola portante l’informazione genetica solo negli anni ’30. All’inizio si pensava che fossero le proteine le biomolecole informazionali poiché erano composte da un maggior numero di monomeri distinti. Nel 1944 Avery dimostrò che la degradazione del DNA portava ad una perdita di informazione genetica: egli usò proteasi per degradare le proteine, DNAasi per degradare il DNA e RNAasi per degradare l’RNA. La trasformazione batterica successiva a questi trattamenti avveniva solamente laddove il DNA non era stato intaccato.

Nel 1952 Harshey e Chase dimostrarono definitivamente che è il DNA a portare l’informazione genetica: il loro esperimento prevedeva di marcare il DNA di un batteriofago con 32P e di monitorare poi la sua eventuale entrata nella cellula batterica infettata. In una seconda infezione furono invece marcate con un isotopo di S le proteine del capside virale. Ciò che i due scienziati videro fu che solo l’isotopo del fosforo era entrato nelle cellule batteriche e che quindi era il DNA a portare l’informazione per replicare i batteriofagi.

Nel 1950 Chargaff studiò la composizione percentuale delle quattro basi del DNA e le quantità di DNA di diverse specie.

Regole di Chargaff

• La quantità di DNA è specie specifica
• [A] = [T] e [C] = [G]
• [C+G] < [A+T]

Nel 1952 Rosalind Franklin ottenne la radiografia del DNA tramite esperimenti di cristallografia. Nel 1953 Watson e Crick capirono la struttura base del DNA: ha un passo di 3.4nm, un diametro di 2nm e che la distanza interbasica è di 0,34nm. Il DNA nella maggior parte dei casi è stabile come doppia elica e solo in alcuni virus si presenta come singolo filamento. Le basi azotate sono la parte variabile che compone i nucleotidi sono due purine: Adenina e Guanina (doppio anello 5+6); e due pirimidine: Citosina e Timina (singolo anello esatomico). Lo zucchero è invece il desossiribosio. A completare la struttura del nucleotide c’è un gruppo fosfato che si lega al gruppo -OH del C-6 dello zucchero. Un nucleoside è invece l’unione della sola base azotata con lo zucchero. Una catena di DNA inizia con un gruppo fosfato (P-5’) e termina con un gruppo ossidrile libero (OH-3’). Per convenzione si scrivono le sequenze nucleotidiche nel seguente modo: 5’-ATCG-3’. La catena cresce sempre in direzione 5’-3’. La doppia elica del DNA è composta da due filamenti antiparalleli: ossia con direzioni opposte. Tra Adenina e Timina si formano due legami idrogeno mentre tra Citosina e Guanina tre; questa differenza è alla base del base pairing. I ponti idrogeno si instaurano sempre tra atomi degli anelli esatomici e servono a stabilizzare la struttura del DNA. Questo tipo di appaiamento è anche noto come “Appaiamento Watson-Crick”. Oltre ai legami idrogeno le altre forze che stabilizzano il DNA sono: interazioni idrofobiche tra basi sovrapposte, forze elettrostatiche.

Sequenza senso e antisenso

• Sequenza senso: contiene l’informazione codificante
• Sequenza antisenso: catena complementare alla sequenza senso

B-DNA

Struttura canonica del DNA così come è stata prevista da Watson e Crick. Ha un’elica sinistrorsa che comprende l’alternanza di solchi maggiori e solchi minori. Le proteine interagiscono col DNA attraverso i solchi maggiori.

Elica-A

Non si riconoscono i due solchi e la spirale è più ripida. Questa elica si forma in condizioni fisiologiche in ibridi DNA-RNA oppure dalla disidratazione del B-DNA. Questa struttura si forma anche in doppie eliche di RNA (rare). Questo genere di elica provoca interazioni con proteine diverse da quelle che ci sono con l’elica canonica. Ha un andamento destrorso.

Elica-Z

Elica con andamento sinistrorso. Ha un diametro minore del B-DNA e il solco minore è ulteriormente stretto e profondo. Questa elica si forma con alte concentrazioni di sali. Si pensa che il DNA nei cromosomi in particolari condizioni assuma la struttura Z.

RNA

Nelle cellule si trova principalmente in tre forme:

• RNA messaggero – mRNA: substrato della sintesi proteica
• RNA transfer – tRNA: decodifica il codice genetico
• RNA ribosomiale – rRNA: catalizza la sintesi proteica e corrisponde a circa l’80% di tutto il RNA

L’RNA è costituito dalle basi A-U e C-G, l’Uracile sostituisce la Timina come pirimidina. Lo zucchero è il ribosio. L’RNA nasce e generalmente funziona come molecola a singolo filamento. La sua struttura a doppio filamento si genera per ripiegamento su sé stessa di una singola molecola di RNA. Non si applicano le regole di Chargaff per l’RNA poiché è appunto generalmente una molecola a singolo filamento. L’RNA ha strutture II non estese che consistono in regioni a doppio filamento all’interno di una molecola lineare. La sua struttura III rappresenta il ripiegamento tridimensionale ed è tipica del tRNA dove le basi si appiano sia con accoppiamenti tipici che non.

Gene

Il gene è l’unità fisica e funzionale dell’ereditarietà ma una definizione univoca ed esaustiva per il gene non è ancora stata stesa. La teoria genica è stata elaborata da Mendel nel 1866 e successivamente inglobata nella genetica nei primi anni del 1900. Il concetto di gene precede la scoperta della struttura e composizione chimico-fisica del DNA. Un gene è fondamentalmente un segmento di DNA che contiene sequenze codificanti per proteine, altri geni invece codificano per i vari tipi di RNA. Thomas Morgan ha elaborato le prime mappe fisiche del cromosoma in cui un gene occupa un preciso locus. Esistono tuttavia geni che si muovono all’interno o su cromosomi diversi. Negli eucarioti le porzioni codificanti di DNA sono inserite in regioni non codificanti che tuttavia sono trascritte ed entrano quindi a far parte di un gene.

Il numero dei geni spesso aumenta in rapporto alla complessità filogenetica; in generale negli organismi il numero di geni varia tra 500 e 40'000. I batteri parassiti obbligati sono gli organismi con i genomi più piccoli mentre alcune angiosperme sono gli organismi con i genomi più grandi. Con l’aumento di dimensione del genoma non aumenta proporzionalmente il numero di geni.

Genoma

Il genoma è l’insieme del materiale genetico dell’organismo. Questo implica che il genoma non sia esclusivamente composto da geni. Nel genoma si trova il DNA intergenico e il DNA ripetitivo (sia codificante che non). Il DNA intronico non è codificante.

Organizzazione del genoma batterico

I genomi batterici sono molto compatti poiché la parte codificante è preponderante su quella non codificante. Nei batteri i geni si trovano in aggregati con una regione di controllo comune.

Operone: aggregato dei geni di una stessa via metabolica controllati da una regione comune. Questi geni sono espressi da un unico mRNA detto “mRNA policistronico”.

Organizzazione del genoma eucariotico

I geni degli eucarioti sono costituiti da blocchi codificanti, esoni, intervallati da regioni non codificanti, introni. Ogni gene è regolato in modo specifico ed indipendentemente l’uno dagli altri. Il precursore mRNA contiene sia esoni che introni e solo successivamente viene modificato a dare il vero mRNA costituito da sole sequenze esoniche.

Paradosso valore C: negli eucarioti non c’è correlazione tra quantità di DNA, numero di geni e complessità evolutiva. C è la quantità totale di DNA di un genoma aploide, n è il numero di cromosomi in un genoma aploide. I cromosomi si dividono in autosomi e cromosomi sessuali (XY).

Ploidia: numero di copie di cromosomi per cellula.

• Aploidia (n)
• Diploidia (2n)
• Anaploidia: numero di cromosomi errato o presenza di cromosomi incompleti
• Poliploidia

Suddivisione DNA

Il DNA si suddivide in:

• Codificante (<10%)
  • Geni codificanti proteine
    • Geni singoli per le proteine strutturali
    • Copia multipla
      • Identiche
      • Non identiche: le famiglie geniche
  • Moderatamente ripetuto (10 – 10⁴ copie)
    • SINES
    • LINES
  • Altamente ripetuto (> 10⁴ copie)
    • Microsatellite
    • Minisatellite
  • Geni codificanti RNA (sono molto ripetuti)
  • Geni codificanti istoni (sono molto ripetuti)
• Non codificante (>90%): può essere distinto in extragenico e intragenico

Ripetizione sequenze

Dal punto di vista delle sequenze nucleotidiche troviamo:

• Non ripetute: geni in singola o poche copie
• Moderatamente ripetute: famiglie geniche come quelle degli rRNA, tRNA o istoni. Comprendono gli elementi mobili del DNA
• Altamente ripetute: brevi sequenze ripetute. Tra le sequenze altamente ripetute troviamo il DNA satellite che ha un peso minore del grosso del DNA cellulare. È costituito da tratti fino a 100kb di ripetizioni di 200 nucleotidi. Si trova in tutti i cromosomi nella zona del centromero, ai telomeri e a seconda del cromosoma in regioni specifiche. Queste zone specifiche possono essere individuate con la tecnica FISH. Il DNA satellite è composto da minisatellite e microsatellite.
  • Mini: tratti ripetuti di 100bp per un totale di 5kb. Il minisatellite è individuo specifico per via degli errori nella sua duplicazione. Questo DNA è usato nelle tecniche di fingerprinting
  • Micro
  • DNA intergenico

Elementi mobili

• Trasposoni: sequenze di DNA in grado di spostarsi dal loro locus. Si pensa siano sequenze di origine virale.
• LINES: long interspected elements. L1 è la tipologia più comune e rappresenta il 15% del genoma umano
• SINES: short interspected repeats. Alu è la tipologia più nota con una sequenza di 300bp; la loro sequenza è riconosciuta da Alu1 che è un enzima di restrizione batterico. Gli Alu sono tipici dei primati

LINES e SINES hanno avuto un importante ruolo nell’evoluzione biologica.

Famiglie ripetute

Geni per rRNA e tRNA. Negli eucarioti si usa il termine Cluster per indicare quei geni che sono trascritti in un unico mRNA che poi viene opportunamente modificato. Sono tutti co-trascritti da un unico sito regolativo. Un esempio nell’uomo di famiglia è quello dei geni delle globine, la parte proteica della emoglobina. Si pensa che la famiglia delle globine si sia evoluta per duplicazione e mutazioni. Successivamente c’è stata una trasposizione su cromosomi diversi dei geni che codificano per le catene α e β. Successive duplicazioni hanno portato alle varie varianti di queste due catene con anche mutazioni perdita-di-funzione per alcuni geni. Ciascun gene è regolato in modo indipendente. L’emoglobine di embrione, feto ed adulto sono tutte diverse.

Organizzazione fisica DNA

Il DNA si può trovare nel nucleo, nei mitocondri e nei cloroplasti. È una molecola carica e quindi in vivo non si trova mai nudo ma associato a proteine con carica netta positiva (Lys, Arg). Nei batteri si individua un nucleoide. Nell’uomo il DNA è nel nucleo, una struttura dal diametro di 3μm. L’organizzazione gerarchica della sovrastruttura del DNA è:

• Nucleosomi: strutture di 11nm in cui il DNA è avvolto attorno ad ottameri di istoni, ciascun ottamero porta una copia di istoni H2A, H2B, H3, H4. Attorno a ogni core il DNA si avvolge 1,6 volte. L’istone H1 si lega al DNA linker tra i diversi ottameri e svolge la funzione di graffetta tra i vari nucleosomi. I nucleosomi hanno carica positiva perché ricchi di proteine con residui di lisina (H1, H2A, H2B) e arginina (H3 e H4). Il DNA linker e le proteine H1 (histon like proteins) impaccano i diversi nucleosomi a formare la fibra a rosario. Le code istoniche N-terminali sono dei random coil che prendono contatto col DNA stesso. Un istone resta legato al proprio sito per circa 2 minuti, c’è quindi un continuo turnover.
• Fibra 30nm: ha una struttura elicoidale detta a solenoide in cui i nucleosomi sono strutture dinamiche e non fisse.
• Fibra 300nm: la struttura a solenoide forma delle anse su una impalcatura proteica.
• Fibra 700nm
• Cromosoma

Nucleolo: contiene il DNA che codifica le subunità dei ribosomi.

Eucromatina: DNA che contiene geni attivi. L’eucromatina è dispersa nel cromosoma.

Eterocromatina: DNA non attivo. È composta da cromatina condensata e si trova sempre ai bordi nel nucleo.

• E. facoltativa: è tessuto specifica
• E. costitutiva: forma telomeri e centromeri

Il cromosoma metacentrico ha il centromero circa a metà delle quattro braccia: il topo non ha cromosomi metacentrici, l’uomo si. All’interno dei nuclei interfasici si possono evidenziare chiaramente i centromeri per via della loro maggiore densità.

Centromero: strutture essenziali per la segregazione dei cromosomi. Il loro DNA è composto da numerose sequenze brevi ripetute specie-specifiche, ricche di A-T. in questa regione si legano specifici istoni e le fibre del cinetocore.

Telomeri: hanno sequenze ripetute di 6 nucleotidi specie-specifiche, ricche di C-G. Alla loro estremità il filamento 3’ terminale è più lungo del suo complementare 5’ terminale.

Cromosomi politenici: si trovano nelle ghiandole salivari dei ditteri. Sono il risultato della duplicazione del DNA senza la separazione dei cromosomi omologhi. Per questo fatto sono molto grandi e quindi si può osservare la trascrizione attivamente. Durante lo sviluppo nel cromosoma stesso vengono attivati in successione loci differenti. Nel cromosoma il DNA forma delle anse che spiegano la distanza delle zone di controllo dai geni controllati. Tramite queste anse infatti il regolatore può trovarsi vicino alla sequenza genica controllata.

Cromosoma batterico: elica di DNA circolare che porta tutti i geni essenziali alla vita della cellula. Esso può essere associato a uno o più plasmidi. Anche in questo caso il DNA è associato a proteine che lo compattano. Le proteine sono dette NAP (Nucleoid Associated Protein) e sono anch’esse basiche. Tuttavia, non c’è alcuna omologia con gli istoni eucariotici. Le NAP partecipano anche in altri eventi del DNA come replicazione, trascrizione e riparazione.

Replicazione DNA - Introduzione

Il meccanismo di replicazione è connesso al principio di appaiamento delle basi. In ogni doppia elica nuova un filamento è di origine parentale e l’altro è neosintetizzato. Questo principio era già stato ipotizzato dagli stessi Watson e Crick. I meccanismi possibili di replicazione sono:

• Semiconservativa: quello reale in cui ogni nuovo DNA porta un filamento parentale e uno neosintetizzato
• Conservativa: ricostruzione della doppia elica parentale
• Distruttiva: frammentazione della doppia elica parentale e sintesi di nuovo DNA

Esperimento di Meselson-Stahl

Si fanno crescere batteri in precursori di nucleotidi con N¹⁵ così che il nuovo DNA sia marcato da questo isotopo. Successivamente si trasferiscono i batteri per poco tempo su un terreno normale così da far avvenire un paio di cicli di duplicazione con dei precursori normali. La prima replicazione mostra nuove molecole di DNA con il 50% N in forma di isotopo e metà normale. In un secondo ciclo di duplicazione si trovano invece molecole di DNA completamente prive di isotopi. Queste osservazioni confutano le ipotesi di replicazione conservativa, perché si trovano molecole di DNA prive di DNA completamente marcato, e distruttiva, perché si trova esattamente in rapporto 1:1 l’isotopo di N con l’azoto normale.

Replicazione DNA Procarioti

La sintesi di DNA richiede i 4 nucleotidi sotto forma di deossinucleosidi trifosfati, la DNA polimerasi, un primer RNA e il template. La DNA Pol può iniziare la sintesi solo a partire da un primer di 10 nucleotidi di RNA e parte dalla estremità 3’-OH dell’innesco. In laboratorio il primer lo si costruisce con DNA. Le nucleasi si dividono in due categorie:

• Endonucleasi: rompono i legami fosfodiesterici interni al filamento
• Esonucleasi: rompono i legami in direzione 5’-3’ o viceversa partendo dall’estremità del filamento

La replicazione del DNA parte sempre dalle bolle di replicazione in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche. Per ciascuna bolla agiscono 4 DNA-Pol fino a che tutte le bolle di replicazione si uniscono. Le due forche di replicazione si muovono in direzioni opposte. Il filamento sintetizzato 5’-3’ è il filamento guida o continuo. L’altro filamento è sintetizzato a blocchi poiché ha direzione 3’-5’, ciascun frammento è ovviamente sintetizzato 5’-3’. Questo filamento è detto ritardato o discontinuo e i frammenti sono detti frammenti di Okazaki. La sequenza di sintesi del frammento di Okazaki è: primer RNA, estensione del frammento (fino a 2'000 nucleotidi), nuovo primer, nuovo frammento, rimozione dei primer, ligazione dei vari frammenti. La DNA-Pol-I ha una attività esonucleasica che rimuove i primer RNA e successivamente la ligasi usa ATP per unire i diversi frammenti.

L’identificazione delle proteine coinvolte nella replicazione del DNA è stata condotta su E.coli. le cellule trattate con mutageni hanno determinati geni silenziati e quindi in base alla funzione persa dalla cellula si associa quella funzione a un determinato gene. Il silenziamento dei geni essenziali porta alla morte delle cellule. Per studiare i geni essenziali si usano i “Mutanti condizionali” in cui solo per determinate condizioni il gene viene inattivato.

Mutanti termosensibili: a più di 42°C i geni vengono bloccati.

• Mutanti quick-stop: la crescita si blocca subito raggiunti i 42°C
• Mutanti slow-stop: a 42°C fanno un ultimo ciclo