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Biologia molecolare, I parte Appunti scolastici Premium

Appunti di biologia molecolare sulla prima parte basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Fiaschi dell’università degli Studi di Firenze - Unifi, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biologia molecolare docente Prof. T. Fiaschi

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rna che ci sono nel nucleo quelle molecole di rna messaggero che sono ormai mature e quindi sono

pronte per essere passate dal nucleo al citoplasma. Questo avviene perchè in queste molecole di rna

messaggero mature si legano un sacco di proteine. All'estremità 5' si lega la cap binding proteine,

all'estremità 3' alla coda di poliA si lega altre proteine specifiche per il legame alla coda di poliA e

le proteine che si legano alle zone esoniche SR(ricche di serina). A questa molecola di rna

messaggero ormai maturo si lega anche una proteina che è il recettore di esportazione nucleare.

Quando un rna messaggero è ormai maturo e pronto per essere trasportato nel citoplasma,vi si lega

una ulteriore proteina che è un recettore id esportazione nucleare.Questo recettore di esportazione

nucleare, fa passare l'rna messaggero maturo dal nucleo al citoplasma. Per cui,tutte quelle proteine

che devono entrare nel citoplasma e che sono attaccate all'rna messaggero nel nucleo si staccano

mentre tutte le altre proteine insieme al recettore di esportazione nucleare inducono il trasporto di

questo rna messaggero dal nucleo al citoplasma. L'rna messaggero maturo passa dal nucleo al

citoplasma attraverso i pori nucleari, piccoli forellini che sono presenti su tutta la membrana

nucleare. Un rna messaggero maturo nel citoplasma è costituito fondamentalmente da tre regioni:

una regione codificante,che è la porzione centrale,che è quella porzione nucleotidica che contiene

l'informazione necessaria per la sintesi proteica.Questa regione codificante,che deriva dal premrna

messaggero dopo lo splicing perchè è costituita soltanto da forme esoniche.Quindi,soltanto da

regioni del dna che contengono informazioni genica necessaria per la produzione di una proteina.

Questa regione codificante che è la porzione centrale dell'rna messaggero maturo, è seguita e

preceduta da altre due regioni. All'estremità 5' c'è una regione che si chiama 5' UTR che significa

regione non tradotta come all'estremità 3' c'è un'altra regione UTR regione non tradotta perchè sia

all'estremità 5' che all'estremità 3' non sono regioni codificanti.Quindi non sono regioni che

contengono la sequenza nucleotidica necessaria per la produzione per la sintesi di una proteina.

Queste regioni 5' UTR e 3' UTR sono regioni ch avranno il cappuccio all'estremità 5' all'estremità 5'

UTR e la coda di poliA nella regione 3' UTR. Siccome non sono regioni codificanti cioè non

contengono la sequenza nucleotidica necessaria per la produzione di una proteina.In realtà queste

regioni 5' UTR e 3' UTR sono regioni di regolazione della traduzione cioè regolano quando e se

questo rna messaggero deve essere letto e tradotto in proteina.La regione 5' UTR e la regione 3'

UTR costituiscono regioni di regolazione perchè si possono formare sia a livello della regione 5' o

nella regione 3' UTR delle strutture a forcina,delle strutture in cui l'rna messaggero acquisisce una

struttura a doppio filamento a forcina e queste strutture a forcina sia che si formino all'estremità 5'

UTR che a livello dell'estremità 3' UTR regolano la traduzione cioè la capacità di questo rna

messaggero di essere tradotto in proteina.

La trascrizione è un processo che produce tutte le molecole di rna che sono contenute all'interno

delle cellule. Tutte le molecole di rna vengono prodotte sottoforma di precursore. Gli rna

ribosomiali sono gli rna contenuti nei ribosomi.I ribosomi sono delle strutture che partecipano nel

citoplasma alla sintesi proteica. Sono formati da due subunità: una subunità maggiore e una

subunità minore. Ciascuna di queste due subunità è formata da rna ribosomiale e proteine.Queste

due subunità sono dissociate quando non sono coinvolte nel processo di traduzione.Diventano

associate,per cui la subunità minore del ribosoma si associa alla subunità maggiore del ribosoma

soltanto nel momento in cui comincia la sintesi proteica. I ribosomi degli eucarioti sono

caratterizzati da un cosiddetto coefficiente di sedimentazione,che è chiamato Svedberg e viene

indicato con la S. Questo coefficiente di sedimentazione nei ribosomi assemblati è di 80S.Quello

della subunità maggiore 60S e della subunità minore di 40S. Ognuna di queste due subunità è

associata a proteine. Le proteine presenti nella subunità maggiore sono 50.Quelle nella subunità

minore 33 e la subunità maggiore e la subunità minore contengono oltre a proteine rna di tipo

ribosomiale. Nelle nostre cellule ci sono 4 tipi di rna ribosomiale,ciascuno con un proprio

coefficiente di sedimentazione svedberg,che è 28S,18S, 5,8S e 5 S.L'unico rna visibile nella cellula

è quello ribosomiale perchè è quello più presente,che ha una concentrazione più presente rispetto

agli altri. L'rna ribosomiale viene prodotto,sintetizzato e maturato in una regione particolare che si

chiama nucleolo. Gli rna ribosomiali vengono prodotti nel nucleolo,per lo meno 3 di questi vengono

prodotti nel nucleolo e derivano tutti da un rna ribosomiale precursore di 45 S. Questo rna

ribosomiale precursore immaturo subisce delle modifiche chimiche grazie a due enzimi che sono

PSEUDOURILASI e la METILASI che modificano determinati nucleotidi all'interno di questa

forma immatura dell'rna ribosomiale.Queste modifiche chimiche servono per tagliare il precursore

di questi rna ribomiali. Su questo precursore dell'rna ribosomiale agiscono delle proteine che si

chiamano SnoRNP che contengono degli snoRNA dove sno sta per small nucleolar rna,che hanno

una sequenza nucleotidica complementare a quella del PRE-rRNA.Questi snoRna che sono

contenuti nelle snoRNP guidano le pseudourilasi e le metilasi a modificare chimicamente la forma

immatura dell rna ribosomiale. Queste modificazioni chimiche servono da sito di riconoscimento di

taglio di questo precursore dell rna ribosomiale. Per cui,da questo precursorsore di 43S,che

costituisce la forma immatura dell rna ribosomiale,grazie a dei tagli che vengono individuati proprio

sulla base di queste modificazioni chimiche fatte dalle metilasi e dalle pseudourilasi,da questo

precursore si formano tre delle quattro forme di rna ribosomiali che sono contenute nelle nostre

cellule,in particolare si forma l'rna 18S,il 28S e il5,8S. LA forma più piccola cioè l'rna ribosomiale

5S viene codificato da un gruppo di geni diversi da quello che dà origine alla forma immatura di

43S e poi dà origine a queste tre forme di rna ribosomiale e viene codificato da una diversa rna

polimerasi che è l'rna polimerasi III.

L'rna transfer è una molecola che nella forma matura somiglia a un trifoglio però come tutti gli rna

anche l'rna transfer prima di arrivare a essere una molecola matura a trifoglio,viene prodotto come

forma immatura e poi subisce un processo di maturazione.QUesto processo di maturazione prevede

quattro fasi. La prima modifica è la rimozione di un introne all'estremità 5' fosfato della molecola di

tRNA immatura,per formare una estremità 5' fosfato che è più corta dell'altra estremità del tRNA

che invece è l'estremità 3'OH. L'estremità 3' OH subisce anch'essa una maturazione,in particolare

subisce una sostituzione di nucleotidi,per cui i due nucleotidi che vengono inseriti all'interno della

regione 3' OH sono dei nucleotidi che sono ACC,è un codone ,sono tre nucleotidi in sequenza ACC.

Questo nucleotide ACC identifica la regione 3' OH del tRNA,che è una regione più lunga

dell'esremità 5' fosfato. A questa regione 3'OH si lega l'aminoacido. Dopo di che viene exciso un

introne a livello di un'ansa del tRNA,una ansa che quando il tRNA è maturo viene chiamata ansa A

dove A sta per ansa dell'anticodone. Infine,il tRNA è una molecola di rna particolare perchè

presenta un sacco di basi modificate.Per cui,un'altra maturazione a cui va incontro l'rna transfer è la

modifica delle basi azotate.Per cui,l'rna transfer viene prodotto come molecola di rna transfer

immatura che subisce una rimozione di un introne all'etremità 5' fosfato, per formare una estremità

5' fosfato più corta rispetto alla corrispondente estremità 3' OH. L'rna transfer immaturo subisce

anche una maturazione all'estremità 3' OH.QUesta maturazione all'estremità 3' OH induce la

sostituzione dell'estremità 3' OH con tre nucleotidi che sono Adenina Citosina Citosina, per cui si

forma un'estremità 3' OH più lunga rispetto a quella 5' fosfato.L'estremità 3' OH nel tRna è

fondamentale perchè attraverso il gruppo ossidrile all'estremità 3' OH che il tRNA si lega

all'aminoacido e lo porta nel punto del citoplasma in cui avviene la sintesi proteica. Poi viene tolto

un introne a livello di un'ansa che si chiama ansa A dove A sta per Anticodone.QUindi, quella ans

alì è l'ansa dell'anticodone.Infine l'ultima modifica a cui va incontro il tRNA immaturo è la modifica

chimica delle basi,perchè i t-RNA rispetto a tutti gli altri tipi di rna contengono delle basi

codificate,come la ribotimidina ,la 5,6,diidrouridina, la pseudouridina e la inosina. L'rna transfer

maturo ha una struttura particolare perchè ha una struttura a trifoglio (chiede spesso di disegnarlo).

L'rna trasfer maturo che presenta l'estremità 5' fosfato più corta, l'estremità 3' OH che è formata da

un atripletta ACC e poi ci sono tre anse più un'ansa variabile più piccola. L'ansa T è ricca di una

base modificata che è la ribotimidina, l'ansa D ricca di 5,6 diidrouridina e poi ansa A che è l'ansa

dell'anticodone,fondamentale per il riconoscimento t-RNA -rna messaggero. L'rna transfer ha una

struttura a trifoglio come struttura secondaria nello spazio acquisisce una struttura tridimensionale a

L.

REAL TIME PCR

Se si colora il nucleo di una cellula eucariote con una colorazione particolare, si possono

individuare all'interno del nucleo due colorazioni:una più chiara una più scura,che corrispondono a

diverse forme di dna complessato con gli istoni. In particolare la forma scura,è l'eterocromatina e

quella chiara è l'eucromatina. Il dna si impacchetta e si può vedere sotto forma di eterocromatina

grazie agli istoni. Il dna è complessato con gli istoni sia quando comincia la duplicazione del dna

ma anche quando avviene la trascrizione del dna cioè la formazione delle molecole di rna.Soltanto

che questi istoni via via che la duplicazione va avanti e anche la bolla di trascrizione va avanti

grazie alla dna polimerasi, questi istoni vengono rimossi.In particolare, durante la duplicazione del

dna, quando la forca di replicazione si apre, ci sono delle proteine che staccano gli istoni dai due

filamenti parentali e poi devono essere duplicati. Poi,siccome da una molecola di dna se ne devono

formare due che devono essere complessate esattamente uguale alla molecola di dna madre, la

cellula sintetizza nuove molecola di istoni H2A,H2B,H3,H4 in numero sufficiente da poter essere

attaccati alla due molecole di dna figlie. Per cui,le due molecole di dna figlie, avranno una parte di

istoni vecchi e una parte di istoni nuovi. Gli istoni vengono riattaccati alle molecole di dna figlie da

alcune proteine che si chiamano chaperoni molecolari,in particolare chaperoni del dna.Gli

chaperoni molecolari sono delle proteine che servono per far si che un acido nucleico (in questo

caso) ma anche le proteine, tutte le proteine in generale acquisiscano la giusta struttura

tridimensionale in maniera tale che l'acido nucleico (in questo caso) o una proteina che è stata

sintetizzata da poco acquisisca la struttura tridimensionale giusta che la renda funzionale. Ci sono

alcune proteine che sono talmente piccole da non aver bisogno di queste proteine per acquisire la

struttura tridimensionale che le rende funzionali ma la maggior parte delle proteine ne ha bisogno

per raggiungere la propria struttura tridimensionale. Gli chaperoni molecolari,in particolare gli

chaperoni del dna agiscono anche dopo che è avvenuta la duplicazione del dna perchè sono quelli

che attaccano gli istoni alle due molecole di dna figlie e li riattaccano in maniera tale che siano

esattamente uguali a quelli della molecola madre. Questi chaperoni del dna sono due e si chiamano

Nap-1 e Cap-1 e sono affini per i due diversi tipi di istoni. Nap.1 carica i dimeri H2A,H2B e Cap-1

carica il tetramero H3-H4 sulle due nuove molecole di dna. In questo modo ,durante la duplicazione

del dna gli istoni attaccati al dna vengono rimossi,la cellula sintetizza gli istoni mancanti e poi

questi chaperoni molecolari che riattaccano un po' di istoni vecchi e un po' di istoni nuovi

casualmente. Una cosa simile avviene durante la trascrizione.Per cui,durante la trascrizione ci sono

degli chaperoni molecolari che prima rimuovono gli istoni attaccati sul dna,fanno passare l'rna

polimerasi e poi altri chaperoni molecolari che li riattaccano.

A partire da due geni presenti sul dna, questi due geni possono essere trascritti.Quindi,può essere

prodotto rna messaggero o in maniera eguale o in maniera differente. Per cui dal gene A vengono

prodotte tante molecole di rna,dal gene B poche molecole di rna. Se si tratta di un rna messaggero,

quello che si otterrà è che queste tante molecole di rna messagero derivate dalla trascrizione del

gene A verranno utilizzate per produrre la proteina A mentre questa unica o poche molecole di rna

messaggero trascritte dal gene B verranno poi utilizzate per produrre la proteina B. Siccome la

cellula ha deciso di trascrivere tante molecola di rna messaggero dal gene A e poche molecole di rna

messaggero dal gene B come effetto finale si ha che all'interno della cellula si avranno tante copie

di proteina A e poche copie di proteina B. Tutti quei meccanismi che decidono che regolano che

controllano quanto un gene deve essere trascritto e quanto l'rna messaggero che è stato trascritto

viene poi tradotto in proteina vanno sotto il nome di controllo dell'espressione genica. Quindi,il

controllo dell'espressione genica sono tutti quei meccanismi che sono all'interno della cellula che

decidono se e quanto un determinato gene deve essere trascritto e se e quanto una determinata

proteina deve essere tradotta. Ad esempio, in una cellula c'è stato un meccanismo che ha deciso che

venisse prodotto tanto rna dal gene A e poco rna dal gene B e questo tanto rna trascritto dal gene A

venisse prodotto in proteina. Come effetto finale, si ha che all'interno di questa cellula c'è una bassa

quantità della proteina B e un'alta concentrazione della proteina di tipo A. In laboratorio, è possibile

stabilire la quantità di mrna di un determinato gene stato prodotta mediante la real time PCR.

Questa realtà in PCR valuta quanto rna messaggero viene prodotto dal gene A e quando rna

messaggero viene prodotto dal gene B. Per cui,con la relatà in PCR si può fare una analisi di tipo

quantitativo. Si può associare al rna messaggero di tipo A un numero una concentrazione così come

si può associare una concentrazione all'rna messaggero di tipo B. Mentre la pCr stndard dà una

valutazione di tipo qualitativo, la realtà in PCR dà una analisi di tipo quantititativo. La realtà in

PCR sfrutta la trascrizione inversa,cioè sfruta la capacità che hanno alcuni virus,i retrovirus, di

passare l'informazione genica al contrario di quello che facciamo noi. Ci sono alcuni virus,che

tramite un enzima ,la trascrittasi inversa, gli permette di trasportare il loro genoma da RNA a DNA.

Per cui,nella realtà in PCR viene sfruttata la trascrittasi inversa. Quindi,la capacità di questo enzima

di trasformare una molecola di rna in una molecola di dna. Siccome la realtà in PCR è una tecnica

che serve per quantificare l'rna messaggero, la prima differenza tra la PCR standard e la realtà in

PCR è che nella PCR standard si parte da dna che deve essere amplificato mentre nella reaaltà in

PCR siccome si vuol dare una analisi quantitativa all'rna messaggero che è presente all'interno di

una cellula non si parte da rna ma si parte da rna messaggero. Quindi,il substrato della realtà in

PCR non è il dna ma è l'rna messaggero . Questo rna messaggero,se noi si vuol sapere quanto Rna

di quel tipo , è presente all'interno delle nostre cellule, l'Rna messaggero deve essere amplificato.

Per cui,la prima cosa da fare è trasformare questa molecola di Rna messaggero in Dna. Si deve

sintetizzare un primer,che è complementare a una regione dell'rna messaggero che mi interessa.

Quindi bisogna conoscere la sequenza nucleotidica di quel determinato RNA messaggero. Si deve

sintetizzzare un primer con lo stesso meccanismo rispetto a quello visto per la PCR standard.IL

primer viene sempre sintetizzato a partire dalla regione 5' fosfato alla regione 3' OH e la regione 5'

fosfato è quella che si lega è opposta all'estremità 3' OH in questo caso del filamento di rna

messagggero. Dopodichè viene allestita una reazione di trascrittasi inversa cioè di reverse

transcription utilizzando la trascrittasi inversa tipica di alcuni virus. Questa trascrittasi inversa legge

l'rna messaggero stampo e sintetizza un primo filamento di dna a partire dal primer.Per cui con la

trascrittasi inversa a partire dal primer viene sintetizzato un primo filamento di dna. Per cui già la

sequenza nucleotidica dell RNA messaggero viene trasformata in un primo filamento di dna. A

questo punto , si ottiene un ubrido DNA- RNA. Rna messaggero iniziale e Dna che è stato ottenuto

grazie all'azione della trascrittasi inversa che agisce a 42 gradi. Dopodichè viene eliminato l'rna

messaggero e rimane il singolo filamento di dna. Su questo primo filamento di DNA può essere

inserito un nuovo primer complementare questa volta al filamento di dna.Per cui si allestisce una

reazione di PCR con il primer che è complementare al primo filamento di dna che io ottenuto

dall'rna messaggero grazie all'azione della trascrittasi inversa .A questo punto non agisce più la

trascrittasi inversa ma si usa la Taq polimerasi,che è la dna polimerasi che viene utilizzata in tutte le

reazioni di PCR .Per cui la Taq polimerasi sintetizza il secondo filamento di dna.A questo punto è

successo che da una molecola di rna messaggero si ottengono prima per l'azione della trascrittasi

inversa e successivamente anche per azione della dna polimerasi,si ottiene una molecola di dna a

doppio filamento che è derivata da una molecola di rna messaggero. A questo punto si allestisce una

reazione di PCR normale,per cui avvengono i cicli di PCR:denaturazione ,annealing e elogazione

con i due primer che si legano ai due filamenti di dna. Quindi,questo frammento di dna che è stato

ottenuto a partire da una molecola di rna messaggero viene amplificato tante volte da poter essere

quantificabile. Nella PCR standard,il prodotto di PCR si valuta al plateau della reazione cioè

quando nonostante si aumenti il numero di cicli di PCR la quantità di dna amplificato non varia.

Non varia perchè ormai tutti i reagenti di reazione sono stati finiti. Per cui,la quantità di prodotto

che noi visualizziamo alla fine non è direttamente proporzionale alla quantità di dna che noi

abbiamo cominciato a amplificare. Invece la quantità di amplificato è direttamente proporzionale

all'rna messaggero iniziali,rna messaggero su cui noi abbiamo fatto la reverse trascrittasi perchè

nella real time anzichè lavorare al plateau della reazione, si lavora durante la fase esponenziale della

PCR,cioè durante la fase della PCR dove non c'è nessun effetto limitante:per cui la Taq polimerasi

funziona bene perchè siamo ancora all'inizio della reazione, i deossiribonucleotidi sono più che

sufficienti.Non c'è alcun limite che non faccia andare la reazione nel verso ottimale. Si guarda la

misura dell'amplificato in tempo reale cioè mentre l'amplificato viene prodotto noi in realt time,si

guarda il prodotto dell'amplificato in diretta, in tempo reale. In questo modo,lavorando sulla fase

esponenziale, della reazione quindi in una fase in cui la reazione è ottimale,il prodotto

dell'amplificazione,la quantità dell'amplificato è direttamente proporzionale alla quantità di rna

messaggero iniziale che noi vogliamo amplificare. In una PCR standard,il prodotto

dell'amplificazione quindi il prodotto di PCR viene visualizzato mediante l'elettroforesi di dna,per

cui si vede il dna perchè il dna viene inserito in un gel di agarosio e poi viene sottoposto a corsa

elettroforetica e poi si mette su un transilluminatore e, in questo modo il dna,appare visibile. Appare

visibile perchè noi si è portata la reazione di PCR all'estremo fino al plateau mentr enella reltà in

pcr si lavora nella prima fase della reazione,per cui non si può valutare visivamente il prodotto di

amplificazione semplicemente per il fatto che è troppo poco. É sotto il limite di sensibilità

dell'occhio . Il sistema di rilevazione allora usato è la fluorescenza. Quindi,il prodotto di PCR non

viene più visualizzato attraverso un elettroforesi ma viene visualizzata l'intensità di fluorescenza

che è il prodotto che l'amplificato immette nella realt time. Via via che avviene l'amplificazione del

frammento di real time dall'rna messaggero,questo frammento di dna emette fluorescenza e questa

fluorescenza è quella che viene visualizzata. Chiaramente la fluorescenza viene rilevata da un

computer a cui è collegata il sider,la macchinetta in cui viene fatta la realtà in PCR, e il computer dà

origine a un grafico. In questo grafico di una realtà in PCR,la curva sul grafico è l'emissione di

fluorescenza,che è scaturita dall'amplificato. IN questo grafico sull'asse delle ascisse ci sono i cili di

PCR ,sull'asse delle ordinate c'è l'intensità di fluorescenza. Siccome con la realt time si valuta il

prodotto non più con l'elettroforesi ma con la fluorescenza, c'è bisogno di molecole che funzionino

in maniera tale da emettere fluorescenza, coè c'è bisogno di molecole che si leghino all'amplificato

e che emettano fluorescenza.Infatti nella realt time si utilizzano delle sonde che sono sonde

fluorescenti. La fluorescenza è la capacità di una molecola di emettere energia dopo che è stata

eccitata a una determinata lunghezza d'onda. Ci sono molecole fluorescenti che emettono

fluorescenza quando vengono eccitate dalla luce a 300 nm,vengono eccitata da una lunghezza

d'onda a 300 nm nell'ultravioletto e emettono a 700 nm nel rosso. Quindi,le sostanze fluorescenti

sono sostanze che hanno la capacità di assorbire energia se eccitati a una determinata lunghezza

d'onda e di riemettere questa energia sotto forma di fluorescenza a una lunghezza d'onda più lunga.

Le sonde fluorescenti che vengono utilizzate nella realtime PCR sono di due tipi: sono sonde

fluorescenti aspecifiche oppure sonde fluorescenti specifiche per il prodotto di PCR. Le sonde

aspecifiche sono dei coloranti che si intercalano nel doppio filamento di DNA mentre le sonde

specifiche sono specifiche perchè sono sonde fluorescenti che sono complementari al prodotto di

PCR. Quindi hanno la sequenza nucleotidica che è complementare al prodotto di PCR che noi ci

aspettiamo. Una molecola di tipo aspecifico è la cosiddetta Sybr green.Questa molecola è una

molecola fluorescente non specifica che si intercala nel doppio filamento di dna a prescindere dalla

sequenza nucleotidica del dna,per questo è ASPECIFICA. La Sybr green è una sonda aspecifica

perchè si intercala tra il doppio filamento di dna. Per cui, succede che all'inizio del processo di

amplificazione quando i due filamenti di dna perchè si sono denaturati sono liberi, questa sonda

siccome lei si intercala per sua natura tra i due filamenti di dna,le basi non si inseriscono fra i due

filamenti di dna perchp i due filamenti sono liberi e quindi non ci si intercala lei.Quindi,non c'è

fluorescenza. Al contrario,quando il processo di amplificazione continua succede che si attacca il

primer e già comincia a esserci la formazione di un piccolo frammentino di dna a doppio filamento,

per cui già qui la sonda si può inserire e comincia una piccola emissione di fluorescenza. Dopodichè

via via che a partire dal primer si avrà la duplicazione del secondo filamento di dna per cui si

allungherà la quantità di dna a doppio filamento.Per cui tante più molecole di SYBR green

aspecifica si intersicheranno tra le basi,tanta più fluorescenza viene emessa e tanta più fluorescenza

viene analizzata dal computer. Le sonde specifiche invece come la Taqman, sono delle sonde che

hanno la sequenza nucleotidica nucleotidica che è complementare a un filamento di dna amplificato,

per cui si ottiene dalla reazione di amplificazione. Sono sonde specifiche perchè sono sonde

costruite apposta con la sequenza nucleotidica che è complementare a un filamento di dna che viene

fuori da un processo di amplificazione. Queste sonde sono un po' particolari perchè oltre ad avere la

sequenza nucleotidica complementare alla molecola di dna che viene amplificata,presentano

all'estremità 5' fosfato e all'estremità 3' OH dei gruppi. In particolare, all'estremità 5' fosfato c'è un

gruppo che si chiama reporter e all'estremità 3' OH c'è una molecola che si chiama Quencer. Il

reporter è la molecola fluorescente cioè il reporter presente all'estremità 5' fosfato è quella molecola

che quando viene eccitata a una determinata lunghezza d'onda e la lunghezza d'onda dipende dal

tipo di molecola.Questa molecola R viene eccitata, assorbe energia e la riemette sotto forma di

fluorescenza a partire da una lungheza d'onda maggiore. Però, il reporter non può emettere

fluorescenza quando si trova vicino al quencer,perchè il Quencer inibisce l'emissione di

fluorescenza da parte del reporter. Quindi,quando quencer e reporter sono vicini questa sonda non

emette fluorescenza. Per emettere fluorescenza il reporter,si deve allontare dal quencer perchè il

quencer blocca l'emissione di fluorescenza da parte del reporter. Quando vengono utilizzate queste

sonde, queste sonde siccome hanno la sequenza nucleotidica complementare a un filamento di dna

che deve essere amplificato, si attaccano alla molecola di dna che deve essere amplificata. La sonda

si associa al filamento di dna in una zona diversa da quella del primer. Quindi, la Taq polimerasi

inizia a sintetizzare il filamento complementare e quando arriva alla sonda,scalza questa sonda,la

degrada.Quindi la Taq polimerasi stacca i legami fosfodiesterici che tengono uniti nucleotidi che

costituiscono la sonda e degradando la sonda,il reporter si allontana dal quencer e il reporter può

emettere fluorescenza perchè si è allontanato dal quencer. L'emissione di fluorescenza sta a

significare che è statoottenuto per PCR il secondo filamento di dna. Per cui,l'emissione di

fluorescenza sarà direttamente proporzionale a quanti filamenti di dna sono stati amplificati. La taq

polimerasi sintetizza in direzione 5' fosfato 3' OH e ha attività esonucleotidica in direzione 3'OH 5'

fosfato. In questo caso,ha attività polimerasica in direzione 5'fosfato 3' oH e attività esonucleasica

in direzione 5' fosfato 3' OH. Queto perchè queste Taq polimerasi non sono quelle native ma sono

tutti enzimi che sono stati modificati cioèingegnerizzati in maniera tale che questa taq polimerasi

non abbia più l'esonucleasi in direzione 3' OH 5' fosfato ma abbia tutte due queste attività in

direzione 5' fosfato 3' OH.

IL grafico che si ottiene dalla realtà in PCR,è un grafico che ha il numero di cicli sull'asse delle

ascisse e l'intensità o incremento di fluorescenza sull'asse delle ordinate. La curva nel gravico è la

curva di amplificazione presa durante le prime fasi di amplificazione di PCR. Questa è la curva di

amplificazione di un campione di rna messaggero che è stato deciso quantificare. Su questo grafico

si identificano tre regioni : una regione che si chiama BASELINE o REGIONE BASALE, in cui c'è

la cosiddetta fluorescenza aspecifica cioè c'è una fluorescenza che è propria di tutte le molecole e

che non è dovuta all'amplificato ed è al di sopra di questa linea,che si chiama linea basale che

avviene l'amplificazione la misura e ha bisogno di questo valore della regione basale di questa

baseline che si ottiene la fluorescenza specifica derivata dalla duplicazione del mio campione.

L'operatore ossia chi fa la realtà in PCR identifica una cosiddetta thresold. Thresold sta per soglia

quindi identifica un valore di fluorescenza soglia che interseca la curva di amplificazione dle mio

rna messaggero.Per cui questa soglia,questa thresold che è identificata da un certo valore di insità di

fluorescenza che l'operatore sceglie,chi ha allestito la reazione sceglie. Questa intensità di

fluorescenza che costituisce la cosiddetta thresold cioè la soglia interseca la mia curva di

amplificazione in un determinato punto.Se noi si riporta questo punto sull'asse delle ascisse,si

ottiene il valore del ciclo di PCR che si chiama CT.CT è il numero del ciclo di PCR a livello del

quale si ha la fluorescenza del mio amplificato che interseca la thresold. Quindi,in un grafico di real

time si individuano tre regioni: una regione basale al di sotto della quale si ha la fluorescenza

aspecifica che non deriva dalla fluorescenza del mio amplificato e al di sopra della quale c'è la

fluorescenza specifica cioè la fluorescenza che deriva dal mio amplificato . L'operatore poi

individua una thresold,una intensità di fluorescenza soglia,che interseca la curva di amplificazione

in un determinato punto.Questo punto in cui la linea di amplificazione interseca la thresold se

riportata sull'asse delle ascisse individua il punto, il numero di cicli di PCR che interseca la

thresold che io ho scelto. Quando si fanno le real time non si fa mai una sola realtime,non si fa mai

la quantificazione di un solo rna messaggero perchè sono reazioni molto costose. Sono reazioni

molto costose e quindi si cerca di limitare i costi facendo con la stessa miscela di reazione,che poi

viene suddivisa in varie provette la quantificazione di più rna messaggeri. Questi rna messaggeri

possonoessere anche 10-15. Per cui quello che si ottiene da una reazione di real time non è mai una

sola curva di amplificazione ma sono più curve di amplificazione. Ciascuna delle quali è la curva di

amplificazione di un rna messaggero particolare specifico scelto dall'operatore. Se vengono ad

esempio quantificati 7 tipi di rna messaggero diverso con una reazione di real time in pcr,sul grafico

si può notare che la thresold quando si ha più di un amplificato deve intersecare le curve di tutti gli

amplificati. Su questi amplificati si può già fare una cosa ossia una quantificazione relativa, si può

dire quale è l'rna messagero che era meno concentrato e l'rna messaggero più concentrato . Si può

fare un'analisi relativa per più di un amplificato. Utilizzando la thresold scelta si può vedere il

numero di cilo di pcr da cui è uscita la fluorescenza relativa di ogni rna messaggero. Già da qui può

essere dedotto quale tra gli rna mesaggeri era presente in concentrazione più bassa e quale era

presente in concentrazione più alta nelle cellule. Da qui, si può dire che il terzo rna messaggero era

concentrato meno nelle cellule rispetto al secondo rna messagger e al primo rna messaggero. Il

secondo rna messaggero è concentrato di più rispetto al terzo ma meno rispetto al primo,perchè ci

sono voluti nel caso dell'rna messaggero 2 e 3 di cicli di PCR maggiore per rendere la fluorescenza

visibile e intersecarle con la soglia di fluorescenza scelta. Dei sette rna messageri si può dire che il

primo rna messaggero era presente in concentrazione maggiore rispetto a tutti gli altri nelle nostre

cellule, il secondo più piccolo di quello rosso era presente in una concentrazione più bassa e l'rna

messaggero con la concentrazione più bassa di tutti è l' rna messaggero che ha l'ultima curva sul

grafico. Questo tipo di quantificazione si chiama quantificazione relativa,cioè una quantificazione

in cui si può paragonare la concentrazione iniziale di un rna messaggero rispetto all'altro senza però

dargli un valore assoluto di concentrazione. Quindi con la realtà in PCR,si può fare una

quantificazione relativa che può essere fatta paragonando i Ct oppure una quantificazione assoluta,

cioè gli rna messaggeri vengono quantificati in maniera assoluta dando un valore di concentrazione.

Paragonando le curve di amplificazione di più rna messaggero,si può fare solo una quantificazione

di tipo relativo. Per la quantificazione assoluta, è necessario costruire una curva standard,che è la

stessa curva standard di "biochimica". Occorre costruire una curva in cui c'è una correlazione

lineare tra i mg (microgrammi) di rna messaggero che si amplificano e i Ct.

IL CONTROLLO DELL'ESPRESSIONE GENICA

I meccanismi che servono alla cellula per capire se un gene deve essere trascritto più o meno o non

deve essere trascritto per niente e i meccanismi che regolano l'rna messaggero in prossimità della

proteina. Il controllo dell'espressione genica comprende tutti i meccanismi che permettono alla

cellula di decidere se un determinato gene deve essere trascritto o meno e se viene trascritto in

quanta quantità deve essere trascritto. All'interno di uno stesso organismo,il genoma delle cellule è

sempre uguale. Il genoma in tutte le cellule di un organismo che siano cellule del pancreas,

ervose,del fegato è esattamente uguale in tutte le cellule. Però,se si prende il fegato di un individuo

e il cervello di un individuo e si omogenea per estrarre le proteine e poi si fa una elettroforesi di

proteine,si nota che nonostante il genoma sia lo stesso nelle cellule del cervello e nelle cellule del

fegato,le proteine che sono presenti sono diverse. Le proteine che vengono prodotte nel cervello di

un uomo sono differenti rispetto a quelle che vengono prodotte nel fegato dello stesso uomo

nonostante il fatto che il dna sia uguale. Ognuna di queste proteine viene regolato attraverso tutti

quei processi che regolano l'espressione di un determinato gene. I meccanismi di controllo

dell'espressione genica sono a vari livelli: a partire dal dna fino ad arrivare a una proteina attiva.

Quindi, a partire dal dna quindi nel nucleo fino ad arrivare a una proteina che può essere sulla

membrana plasmatica ci sono tutta una serie di livelli in cui viene regolata la produzione della

proteina. Questi meccanismi di controllo partono nel nucleo e poi si ritrovano anche nel citoplasma.

Nel nucleo si trovano il controllo trascrizionale, i controlli delle modificazioni degli RNA,tutte le

maturazioni a cui sono soggetti gli RNA e poi un controllo di tipo posttrascrizionale,che avviene in

parte nel nucleo in parte nel citoplasma. I meccanismi di tipo trascrizionale sono quei meccanismi

che regolano l'entità della trascrizione cioè regolano se una determinata regione del dna deve essere

trascritta o meno.Questo controllo trascrizionale è fondamentalmente dovuto a due tipi di

meccanismi: i meccanismi epigenetici e la presenza dei fattori trascrizionali. A sua volta, i

meccanismi epigenetici comprendono la metilazione del dna e le modificazioni chimiche degli

istoni. Quando si è parlato di come il dna si associa,si è detto che ci sono due stati della cromatina :

l'eterocromatina e l'eucromatina,la cui presenza dipende dall'interazione del dna con gli istoni.

L'eterocromatina è la forma di dna più compattata e più silente dal punto di vista trascrizionale.

Quindi l'eterocromatina è una forma di dna altamente compattata con gli istoni che non viene

trascritta. Al contrario, l'eucromatina è una forma di cromatina più lassa in cui il dna è meno

compattato agli istoni ed è la forma di cromatina che può essere trascritta. Chiaramente,la cromatina

all'interno del nucleo può essere in forma di eu o eterocromatina ma la zona di eterocromatina non

resta sempre eterocromatina così come la zona di eucromatina non resta sempre eucromatina ma c'è

una dinamicità di passaggio da eterocromatina a eucromatina e viceversa da eucromatina a

eterocromatina. Quindi,le zone di dna che costituiscono l'eterocromatina possono cambiare e

diventare eucromatina così come è vero il contrari zone di dna che sono eucromatina possono

diventare eterocromatina. Questo dal punto di vista funzionale della trascrizione vuol dire ch$ zone

di dna silenti dal punto di vista trascrizionale che non possono essere trascritte possono diventare

zone attive dal punto di vista trascrizionale,cioè che possono essere trascritte. Proprio perchè

l'eterocromatina si può trasformare in eucromatina che è la forma attiva del dna,in cui il dna è meno

complessato con gli istoni. I meccanismi che regolano la dinamicità della cromatina sono i

meccanismi epigenetici. I meccanismi epigenetici sono tutti quei meccanismi che portano al

rimodellamento della cromatina,per cui una zona di dna che è eterocromatina può passare a una

zona di dna che è eucromatina e viceversa. Tutte queste modifiche che inducono un rimodellamento

della struttura della cromatina vanno sotto il nome di meccanismi epigenetici. I meccanismi

epigenetici sono meccanismi ereditari quindi i meccanismi epigenetici si ereditano di madre in

figlio, quando la cellula si duplicano, da una cellula madre a due cellule figlie. Sono meccanismi

che non dipendono dalla sequenza nucleotidica del dna.Quindi,i meccanismi epigenetici non

alterano la sequenza nucleotidica del dna ma alterano delle molecole o al dna o agli istoni,senza

però modificare la sequenza nucleotidica.

Il primo meccanismo epigenetico è la METILAZIONE del dna. Quindi la metilazione del dna vuol

dire che alcune basi particolari a cui viene aggiunto un metile (CH3). La metilazione del dna è il

primo meccanismo epigenetico che non induce modifiche nella sequenza nucleotidica del dna. La

metilazione del dna trasforma una citosina del dna in 5 metilcitosina. Quindi è una modifica

chimica del dna in cui non viene modificata la sequenza nucleotidica ma determinate citosine del

dna che vengono aggiunte grazie all'azione di dna metilasi un gruppo metile (CH3). Un gruppo

metile che trasforma la citosina in 5 metil citosina. La metilazione del dna è una metilazione che

induce l'inibizione della trascrizione.Quindi,il dna metilato a livello di queste citosine è una regione

di dna che non è trascrivibile,cioè una regione di dna in cui non avviene la trascrizione. Quindi,geni

che presentano le 5 metilcitosine sono geni che non vengono trascritti,perchè la metilazione del dna

blocca la trascrizione. Vengono metilate soltanto alcuni tipi di citosine. Le citosine che vengono

metilate e trasformate in 5 metil citosina sono le citosine che si trovano nelle isole cosiddette Gpc,

dove p sta a indicare il gruppo fosfato che tiene unite le citosine e le guanine. Soltanto queste

citosine che fanno parte di queste isole Gpc vengono metilate. Queste isole Gpc si trovano in delle

regioni ben precise di dna, si trovano proprio nella regione del promotore.Queste isole Gpc si

trovano nelle regioni del promotore dei geni e se sono metilate bloccano la trascrizione di quel

gene, se non sono metilate la trascrizione può avvenire. La trascrizionw non avviene perchè questi

metili attaccate alle citosine fanno da ingombro sterico. I fattori trascrizionali non si legano più non

riconoscono più la zona del promotore,non legandosi i fattori trascrizionali chiaramente non si lega

più l'rna polimerasi e la trascrizione non avviene. Queste metilazioni vengono ereditate quando le

cellule si duplicano. Quindi,tutti i meccanismi epigenetici sono ereditabili quando la cellula si

duplica in maniera tale che determinati controlli di trascrizione vengono ereditati dalle cellule figlie.

I promotori metilati sono promotori i cui geni non vnegono trascritti. Promotori che non sono

metilati sono promotori i cui geni vengono trascritti. Lo zigote è la cellula che è meno metilata

possibile. In cui tutti ipromotori sono non metilati perchè tutti i geni hanno bisogno in maniera

temporaria di essere trascritti,perchè da quella unica cellula si deve poi formare un organismo.

Quindi questa cellula si deve duplicare e poi dare origine a tessuti che formano il bambino,che deve

nascere. Per cui, lo zigote rispetto a una cellula adulta le isole Gpc nello zigote sono nello stato nn

metilato così che tutti i geni possono essere trascrivibili mentre in cellule adulte la metilazione dei

promotori è molto più accentuata,proprio perchè delle proteine non servono più e rimangono silenti.

Lo stesso discorso si può fare sulle cellule staminali,cioè più una cellula è staminale cioè più è in

grado di differenziarsi in più tipi di tessuto più hanno dei promotori non metilati. Più questa cellula

è differenziata più è allontanata dallo stato di staminalità più i promotori sono metilati. Quindi la

prima modificazione epigenetica è la metilazione del dna. La metilazione del dna che avviene a

carico di particolari citosine che fanno parte delle isole Gpc.Queste citosine vengono metilate a 5

metil citosina. Queste citosine non si trovano distribuite a caso ma si trovano nella regione del

promotore. Per cui,promotori che hanno le isole Gpc metilate sono promotori che non si possono

legare ai fattori trascrizionali e quindi al meccanismo di trascrizione. Al contrario i promotori non

metilati sono promotori che possono essere trascritti.

La seconda modificazione epigenetica è il cosiddetto codice istonico. Il codice istonico è un insieme

di modificazioni chimiche che non avvengono a livello del dna ma avvengono a livello delle

proteine che sono associate a livello del dna cioè gli istoni. In particolare, quando abbiamo parlato

degli istoni,questi istoni presentano le regioni N' terminali libere anche quando si forma il

nucleosoma. Queste estremità N' terminali libere sono quelle che subiscono le modificazioni

chimiche. Le modificazioni chimiche a cui vanno incontro gli istoni sono di tre tipi:

metilazione,acetilazione e fosforilazione. Tutti e tre questi tipi di modificazioni avvengono a carico

delle estremità ammino terminali dei quattro tipi di istoni,che sono le estremità che non prendono

contatto con il dna. Quindi,allo stesso modo della metilazione del dna,anche le modificazioni degli

istoni non inducono un cambiamento nella sequenza nucleotidica perchè il dna non lo toccano

nemmeno,perchè questo tipo di modificazione genetica avviene a carico delle proteine associate al

dna cioè gli istoni. Gli istoni possono andare incontro a tre tipi di modificazioni che sono la

metilazione, l'acetilazione e la fosforilazione. La metilazione avviene sui residui di arginina e lisina.

L'acetilazione avviene sui residui di lisina e la fosforilazione avviene su residui di serina. Dal punto

di vista trascrizionale,l'acetilazione la metilazione e la fosforilazione avvengono a opera di enzimi.

L'acetilazione su residui di lisina avviene grazie a degli istoni acetiltransferasi, che trasferiscono

gruppi acetili su residui di lisina e l'acetilazione è una modificazione che attiva la trascrizione. Al

contrario,la rimozione di acetili a opera di istoni deacetilasi inibiscono la trascrizione. La

metilazione che avviene grazie agli enzimi metiltransferasi inibiscono la trascrizione. Mentre la

fosforilazione che avviene grazie a enzimi chinasi su residui di serina, è una modifica che favorisce

l'acetilazione,che è una modifica chimica che attiva la trascrizione. Quindi,la fosforilazione insieme

alla acetilazione è una modifica che attiva la trascrizione. Dal punto di vista di struttura della

cromatina, queste tre modificazioni (metilazione,acetilazione e fosforilazione) si possono anche

riassumere in questo modo: la metilazione favorisce la formazione di eterocromatina,perchè la

forma di dna inattiva e quindi la metilazione favorisce il passaggio da eucromatina a

eterocromatina. Al contrario, l'acetilazione e la fosforilazione,che invece sono due modifiche

istoniche che attivano la trascrizione,dal punto di vista della struttura della cromatina, sono

modificazioni che fanno passare l'eterocromatina in eucromatina. Quindi fanno passare la cromatina

inattiva dal punto di vista trascrizionale a una cromatina attiva. I meccanismi epigenetici che sono

quei meccanismi che coinvolgono gli istoni nella modificazione degli istoni H2A,H2B,H3,H4 e non

coinvolgono l'istone H1,che è l'istone che serve per riunire due nucleosomi adiacenti. L'istone H1

non subisce questi tipi di modifiche ma le modifiche chimiche che modificano la cromatina sono

soltanto a carico dei quattro tipi di istoni che formano il nucleosoma,H2a,H2b,H3 e H4. Quando le

code N-terminali degli istoni vengono modificate dal punto di vista chimico, queste modificazioni

alterano l'associazione del dna con gli istoni,la alterano non fanno staccare un core istonico dal dna.

Queste tre modificazioni chimiche aumentano o inibiscono l'associazione del dna con gli istoni. Per

far allontare un gruppo e spostare un ottamero istonico sul dna ci vogliono altre proteine. Altre

proteine che sono dei complessi che vengono chiamati COMPLESSI DI RIMODELLAMENTO

DEL DNA ATP DIPENDENTI,perchè utilizzano energia ottenuta dall'idrolisi dell'ATP .In questo

stato il complesso di rimodellamento del dna atp dipendente può spostare o allontare un nucleosoma

dal dna. Questi complessi agiscono così. Dopo che le code n terminali degli istoni hanno subito

delle modifiche in questo caso si parla di passaggio da eucromatina a eterocromatina.Nella zona in

cui c'è il promotore che deve essere trascritto arriva una proteina specifica che riconosce quella

regione del dna e vi si lega. Dopodichè arriva un'altra proteina che si chiama RIMODELLATORE

che utilizzando energia ottenuta dall'idrolisi di ATP fa spostare o allontanare addiritura il

nucleosoma dal dna. Questi rimodellatori della cromatina possono agire inducendo proprio il

distacco dagli istoni. Quindi, gli istoni il core istonico si allontana dal dna oppure inducono lo

scivolamento del core istonico dal dna.In ogni caso, che funzionino nell'uno o nell'altro modo

utilizzando per rimodellare la cromatina l'energia ottenuta dall'idrolisi di una molecola di ATP.

Dopodi chè,grazi eal rimodellatore e all'ATP si ha o lo scivolamento del nucleosoma lungo la

molecola di dna oppure il nucleosoma si stacca dal dna. Per cui, in ogni caso quella che rimane

libera è una regione del dna che contiene il promotore. Quindi,il rimodellamento della cromatina

quando si passa da una cromatina silente a una cromatina attiva dal punto di vista trascrizionale

avvengono tutte delle modifiche che alterano l'associazione nucleosomi istoni- dna, che ha come

effetto finale quello di far ritornare acceddibile il promotore,in maniera tale che su questo

promotore possa attaccarsi i fattori trascrizionali l'rna polimerasi e quindi un gene due geni che

prima non erano trascrivibili perchè erano legati agli istoni a questo punto lo sono. Quindi,il

rimodellamento della cromatina non fa altro che esporre un promotore che prima era associato agli

istoni e quindi inaccessibile dall'apparato trascrizionale.

L'apparato trascrizionale è costituito oltre da dna che deve essere trascritto e trasformato in rna,al

processo di trascrizione partecipa anche l'rna polimerasi tutta una serie di altre proteine che vanno

sotto il nomedi fattori trascrizionali. I fattori trascrizione sono delle proteine che sono strutturate

apposta per riconoscere e legarsi a determinate sequenze del dna. Le sequenze a cui si legano i

fattori trascrizionali sono le sequenze del promotore. La regione del promotore. IL promotore è una

porzione regolativa di un gene, dell'unità trascrizionale. É una porzione che regola quanto deve

essere trascritta la porzione di dna che si trova a valle dopo il pomotore ma la regione del promotore

è solo una regione di controllo. Questo promotore è formato da tre tipi di zone: due zone sono le

cosiddette elementi di controllo e una regione più vicina al punto +1 (punto di inizio della

trascrizione) che costituisce il promotore vero e proprio,perchè è la cosiddetta TATA BOX. La

trascrizione può essere regolata attraverso la presenza di fattori trascrizionali differenziali quindi

differenti nei due tessuti,in cui deve avvenire la trascrizione di questo gene. I fattori trascrizionali

che sono proteine che legano il dna nella regione del promotore e quindi indirizzano l'rna polimerasi

in quale regione del dna si deve legare. Indicano al dna polimerasi quale gene deve essere trascritto.

I fattori trascrizionali possono essere di due tipi: fattori di trascrizione generali e fattori di

trascrizione regolativi. I fattori trascrizionali regolativi sono quelli che regolano la trascrizione di un

determinato gene. Quindi ne inducono l'aumento della trascrizione o l'inibizione della trascrizione

mentre i fattori di trascrizione generali sono i cosiddetti fattori trascrizionali basali,quelli che hanno

tutte le cellule,perchè sono quei fattori trascrizionali che trascrivono i geni che sono fondamentali

per la sopravvivenza cellulare. Poi ci sono alcuni tipi cellulari in cui la trascrizione basale,la

trascrizione a un livello minimo di un determinato gene non è sufficiente ma è necessario che quel

gene venga trascritto a livello superiore o non venga trascritto. In questo caso, entrano in gioco i

fattori trascrizionali di tipo regolativo che regolano la trascrizione del gene e che quindi indicano se

un gene deve essere trascritto di più o trascritto di meno. Sono quelli che abbiamo chiamato

enhancers o silencer, in cui gli enhancers sono quei fattori trascrizionali che si legano a regioni

regolative del promotore e che aumenta la trascrizione del gene mentre i silencer sono dei fattori

trascrizionali che si legano alle regioni del promotore di un gene che non deve essere trascritto.Per

cui,inibiscono la trascrizione di quel gene. Quindi,i fattori trascrizionali sono di due tipi generali e

fattori trascrizionali regolativi.Questi fattori trascrizionali si legano anche a regioni differenti del

promotore perchè i fattori trascrizionali generali si legano anche alla regione del tatabox. Si legano

alla regione del promotore vera e propria mentre i fattori di trascrizione di tipo regolativo si legano

alle regioni di controllo che si trovano prima della TATABOX e che funzionano da enhancers o

silencers. ESEMPIO,cellule di fegato e cellule di cervello. In tutti e due nonostante siano tessuti

differenti quindi abbiamo differenti funzioni, il genoma però di queste due tipi di cellule è lo stesso.

Quello che cambia è la trascrizione genica e quindi il prodotto finale cioè la produzione delle

proteine. L'albumina è una proteina che viene tradotta in grossa quantità dal fegato e il fegato dopo

averla prodotta la secerne,la manda in circolo nell'ambiente extracellulare e la manda nel circolo

sanguisgno. L'albumina nel sangue serve a veicolare un sacco di moleocla tra cui lipidi ma anche

molecola che non sono solubili,che non sono idrofile,idrofobe che se non associat a proteine che

invece sono idrofile e possono essere solubilizzate nel plasma che è un ambiente acquoso

tenderebbero a precipitare. Quindi, la PSA serve a veicolare a mantenere solubili nel sangue tutte

quelle molecole che per natura chimica non lo sono,per esempio gli acidi grassi. Gli acidi grassi

sono lipidi che sono idrofobe. Quindi, il gene dell'albumina,presente in tutte le cellule, deve essere

trascritto in maniera più massiccia dal fegato . Infatti, sia nel cervello che nel fegato presentano i

fattori trascrizionali generali però il fegato presenta delle proteine dei fattori trascrizionali regolativi

che il cervello non ha. Questi fattori trascrizionali regolativi vanno a legarsi alle regioni di

controllo prossimale che sono quelle che si trovano prima della TATABOX e aumentano la

trascrizione del gene dell'albumina per cui nel fegato e nel cervello succede che nel cervello

producono a un livello basale l'rna messaggero dell'albumina perchè tutti e due contengono i fattori

trascrizionali generali che sono quelli che vanno a legarsi al TATABOX e danno un livello basale di

trascrizione. Per cui basalmente sia le cellule del fegato che le cellule del cervello riescono a

trascrivere il gene dell'albumina e a trasformare a trascrivere il gene dell'rna messaggero

dell'albumina a livello basale. Il livello basale è il livello che è necessario per la sopravvivenza di

queste cellule. Però, il fegato,oltre che per la sua vitalità cellulare, ha bisogno di produrre l'albumina

anche per mandarla in circolo perchè l'albumina è una delle proteine maggiormente presenti nel

sangue. IL fegato quindi ha bisogno rispetto al cervello di produrne tanta di più. Per produrne tanta

di più presenta dei fattori di trascrizione regolativi che non si legano più alla TATABOX,alla

regione del promotore che è quella fondamentale per avere la trascrizione basale ma si legano a

elementi di controllo prossimale che ci sono prima della TATABOX,legandosi a questi elementi di

controllo prossimale. Questi fattori di trascrizione regolativi nel caso della PSA nel fegato

funzionano da enhancers cioè aumentano l'efficienza di trascrizione del gene

dell'albumina.QUindi,aumentano il numero di copie di rna messaggero che vengono prodotte nelle

cellule del fegato e queste copie di rna messaggero verranno prodotte in proteina che il fegato

manderà in circolo.QUindi,anche la presenza di vari tipi di fattori trascrizionali regola la

trascrizione di uno stesso gene in tessuti differenti e questa regolazione dipende dalle funzioni che

un tessuto ha. Tipo in un tessuto muscolare verranno trascritti e poi tradotti in proteina tutti quei

geni che servono per la contrazione muscolare. Gli stessi geni nel fegato non vengono trascritti

perchè il fegato ha altre funzioni.

L'espressione genica può essere regolata a livello post-trascrizionale. Il livello post-trascrizionale

avviene quando l'rna messaggero ormai è stato prodotto. QUIndi, il meccanismo posttrascrizionale

non regola più quanto rna messaggero deve essere prodotto ma quale rna messaggero è stato

prodtto. Quindi,sono meccanismi che si hanno dopo la trascrizione,sono post trascrizionali .

Regolano quanto un rna messaggero deve essere tradotto in proteina. Uno dei meccanismi di

controllo post trascrizionale che è stato scoperto da relativamente molto poco è la cosiddetta

INTERFERENZA A RNA o RNA INTERFIERENCE. L'interferenza a RNA è un controllo

dell'espressione genica di tipo post trascrizionale e si basa sulla presenz adi piccole molecole di rna

a doppio filamento. Quindi l'intrferenza a rna è un meccanismo di controllo post trascrizionale che

si basa sulla produzione da parte della cellula di piccole molecole di rna a doppio filamento. Queste

molecole di dna a doppio filamento servono a bloccare la traduzione di un rna messaggero. Quindi

la formazione di una proteina a partire da quell'rna messaggero. Per bloccare l'attività di un rna

messaggero basta attaccargli a un determinato rna messaggero una piccola molecola corta di rna che

viene chiamata rna antisenso. L'rna antisenso sono un piccolo frammento di rna che è

complementare a una regione dell'rna bersaglio,per cui si forma una regione a doppio filamento tra

questa piccola molecola di rna e l'rna messaggero di cui io voglio bloccare la traduzione,che è l'rna

messaggero dell'albumina. Si parla di rna antisenso perchè quel frammentino di rna ha una sequenza

complementare a quella dell'rna messaggero complementare.Quindi questa molecola di rna

antisenso che serve per bloccare l'rna messagero bersaglio ha una sequenza complementare all'rna

messaggero bersaglio che io voglio bloccare. Queste piccole molecole di rna antisenso andavano a

bloccare con efficienza bassisima la traduzione in proteina di questo rna messaggero. Fino a che

alcuni scienziati americani( che poi recentemente hanno preso il premio nobel) non hanno scoperto

il meccanismo di regolazione genica post trascrizionale naturale che è l'interferenza a RNA o RNA

interfierence. Questi scienziati che sono Fire e Mello hanno preso un nematode che è il

CHAernobitis elegans e hanno fatto degli esperimenti per cui hanno tentato di inibire l'espressione

di vari geni. Inibire l'espressione di vari geni vuol dire che hanno permesso la trascrizione e poi

hanno bloccato la traduzione di questo rna messaggero e la formazione di proteine da questo rna

messaggero. Essi hanno inserito in tre gruppi diversi di nematosi, tre differenti molecole di rna. In

un gruppo di nematodi è stato inserito un piccolo frammento di rna antisenso, ossia un piccolo

frammentino di rna che ha una sequenza complementare all'rna messaggero bersaglio. In un altro

gruppo di nematodi sono state inserite delle molecole di rna senso,le molecole di rna senso sono

delle molecole di rna che hanno una sequenza nucleotidica uguale a quella dell'rna messaggero

bersaglio. Nel terzo gruppo di nematodi,sono state inserite delle molecole di rna a doppio filamento

formate dall'unione dell'rna antisenso con l'rna antisenso. Sono andati a inibire innanzitutto la

produzione di una proteina che loro sapevano che,quando veniva inibita, il verme iniziava a avere

degli spasmi,cioè dei movimenti incontrollati. Il fattoche cominciasse a tremare voleva dire che

quella proteina non c'era più. Oppure sono andati a inibire il gene che induceva la colorazione

dell'embrione.Per cui,se veniva tolto la proteina che induceva la colorazione dell'embrione,

trovavano un embrione non colorato. Quindi la presenza di spasmi , movimenti incontrollati da una

parte e la presenza di un embrione di colore bianco, anzichè marrone,voleva dire che loro erano

andati a inibire in maniera selettiva l'rna messaggero che poi dava origine alla proteina che inibiva

la presenza di spasmi e dall'altra parte la proteina che regolava la colorazione dell'embrione. Infatti,

loro hanno visto ,iniettando in questi tre gruppi di nematodi i tre differenti tipi di rna (rna senso,rna

antisenso e rna a doppio filamento) tutti rivolti verso la proteina che blocca il movimento del

nematode, loro hanno trovato in maniera quasi inaspettata che soltanto in quei nematodi in cui era

stata iniettata la molecola di dna a doppio filamento,si aveva la presenza di contrazioni

incontrollate. La presenza di queste contrazioni incontrollate voleva dire che solamente in questo

gruppo di nematodi in cui erano stati inseriti questa molecola di rna a doppio filamento, era stata

inibita l'espressione di quella proteina che regolava il movimento. Voleva dire che la proteina che

regolava il movimento non c'era più. Allo stesso modo,quando loro sono andati a contollare la

colorazione dell'embrione,hanno visto che soltanto in quei nematodi in cui era stato inserita la

molecola di rna a doppio filamento che andava a colpire in maniera specifica l'rna messaggero dle

gene che colorava l'embrione,hanno visto che questo embrione era bianco anzichè marrone.

Soltanto in quei nematodi in cui erano state iniettate queste molecole di rna messaggero a doppio

filamento c'era l'effetto di inibizione di quella proteina,codificata da quel determinato rna

messaggero. Questa scoperta era un po' particolare perchè l'inibizione di un rna messaggero si

faceva utilizzando soltanto delle molecole di rna antisenso. Da questo esperimento loro hanno

dedotto che all'interno delle cellule c'è un meccanismo id regolazione dell'espressione genica a

livello post trascrizionale che avviene attraverso la produzione di molecole di rna a doppio

filamento, perchè soltanto in quei nematodi in cui era stato iniettate molecole di rna a doppio

filamento era stato visto l'effetto di inibizione dell'rna messaggero. In realtà ci sono due tipi di

molecole di rna a doppio filamento,che si chiamano MIRNA dove Mi sta per microRNA e siRNA

dove si sta per SMALL INTERFIERENCE RNA. I miRNA sono prodotti endogeni cioè sono

prodotti che la cellula produce da se che regolano l'espressione genica di un gene inducendo la

degradazione dell'rna messaggero oppure bloccando la traduzione della proteina. I siRNA invece

sono prodotti esogeni o endogeni che la cellula produce, che agiscono su un solo rna messaggero e

vengono utilizzati nelle piante per esempio come sistema di difesa verso l'entrata all'interno delle

cellule vegetali di molecole di rna esogeno.

I miRNA vengono generati nel nucleo, poi vengono passati dal nucleo al citoplasma ed è nel

citoplasma che bloccano l'rna messaggero bersaglio . Per cui,nel nucleo avviene la produzione della

forma immatura del miRNA ,questo,una volta maturato, passa dal nucleo al citoplasma.Nel

citoplasma viene ulteriormente maturato e nel citoplasma è dove agisce. Nel nucleo avviene la

biosintesi del miRNA che può avvenire in due modi: o una sintesi di tipo canonico o una biosintesi

di tipo non canonico,che parte da delle strutture particolari che si chiamano mirtroni. I mirtroni sono

delle regioni di dna che sono gli introni. Poi,una volta che sono stati prodotti e processati in parte

nel nucleo,passano nel citoplasma dove avviene un ulteriore processamento e dove funzionano.

Nella biogenesi canonica, i miRNA presentano a livello del dna dei geni propri,i miRNA hanno geni

proprio che vengono trascitti e trasformati in rna come qualsiasi altro gene .Quindi c'è l'rna

polimerasi che trascrive questi geni dei miRNA. I geni dei miRNA possono essere singoli.Quindi,ci

può essere un solo gene oppure ci possono essere più geni raggruppati di uno stesso tipi di miRNA.

L'rna polimerasi II trascrive i geni dei miRNA ed è la stessa rna polimerasi che trascrive e forma

l'rna messaggero. Per cui, questi geni dei miRNA come tutti i geni hanno un loro

promotore,possono essere geni singoli o geni raggruppati. Quindi più geni posti uno in seguito

all'altro dello stesso miRNA. L'rna polimerasi II a partire dal promotore trascrive i geni che

codificano per i miRNA.L'rna polimerasi II dà origine a una prima forma immatura del mi-RNA

che nel nucleo si chiama pri-miRNA.Questo pri-mirna, pu essere singolo se la trascrizione da parte

dell'rna polimerasi è avvenuta a partire da un gene singolo del mi-rna oppure i primirna possono

essere costituiti dall'unione di più molecole quando l'rna polimerasi ha trascritto il mirna a partire

dall'unione di più geni di mirna. Queste molecole di primirna subiscono gli stessi processi di

maturazione che subisce l'rna messaggero,a parte lo splicing. Questi primi primirna quando

vengono trascritti dall'rna polimerasi II vengono modificati a livello dell'estremità 5' fosfato dove

gli viene attaccato un cappuccio e all'estremità 3' OH dove viene attaccata una coda di poliA. Questi

primirna sono delle strutture a forcina che hanno la caratteristica di avere l'estremità 5' fosfato con il

cappuccio e l'estremità 3' OH con la coda di poliA cosìcome si ha nell'rna messaggero. Dopodichè, i

primirna che presentano il cappuccio all'estremità 5' e la coda di poliA all'estremità3',che possono

essere singoli se derivano dalla trascrizione di un gene singolo oppure più geni se derivano da geni

di miRNA associati. Questi primirna subiscono a livello del nucleo un taglio. Un taglio, che

trasforma i primirna in pre mirna. Questo taglio trasforma un primirna in premirna ed è un taglio

con cui viene tolto il cappuccio all'estremità 5' e la coda di poliA all'estremità3'e si hanno due

nucleotidi sporgenti a singolo filamento all'estremità 3'. Il premirna si forma sia che questo taglio

avvenga da un primirna singolo che avvenga da primirna accoppiati. Per cui,nel caso che questi

primirna siano accoppiati toglie solo ilcappuccio all'estremità 5' e la coda di poliA all'estremità 3'

ma separa anche i primirna e anche quando i primirna sono accoppiati a altri,si formano più

primirna tutti caratterizzati dal non avere più il cappuccio al'estremità5',la coda di poliA

all'estremità 3' ed hanno due nucleotidi a singolo filamento che sporgono all'estremità 3'. Il taglio

viene compiuto da un complesso che si chiama COMPLESSO DEL MICROPROCESSORE.Questo

complesso del microprocessore è costituito contiene una rnasi che si trova nel nucleo che si chiama

DROSHA. DROSHA è l'rnasi che taglia il primirna e trasforma il primirna in premirna. Drosha per

sapere dove tagliare,si aiuta da alcune proteine che si legano nelle zone che devono essere tagliate

del pri-mirna.Per cui,queste proteine si legano in alcune zone del primirna e indirizzano Drosha al

taglio di quella zona. Però l'rnasi ch etrasforma il primirna in premirna,trasformazione che avviene

nel nucleo,si chiama Drosha,che fa parte di un complesso che si chiama complesso del

microprocessore insieme a altre proteine che si legano alle zone del primirna e indicano a drosha

quali sono le zone del primirna che devono essere tagliate per trasformare il primirna in premirna.

Nella biogenesi non canonica, i mirna vengono prodotti a partire da alcune parti del dna che si

chiamano mirtroni. I mirtroni sono delle regioni del dna che sono gli introni. Gli introni, sono delle

regioni dell'rna messaggero che non vengono utilizzate per la traduzione di una proteina perchè

sono zone che non contengono l'informazione necessaria per produrre una proteina. Infatti, vengono

tolti tramite il meccanismo di splicing. Questo accade per tutti gli introni eccetto i mirtroni. I

mirtroni, sono delle zone introniche che non vengono degradati,come avviene invece per gli introni

che non contengono nessun tipo di informazione, perchè i mirtroni contengono l'informazione per

produrre un miRNA. I mirtroni,sono degli introni, che si trovano sul dna e che vengono trascritti

insieme all'rna messaggero di cui fanno parte che però non vengono degradati come gli altri introni

ma vengono utilizzati perchè loro contengono l'informazione necessaria per la produzione di un

microrna. Questi mirtroni si trovano all'interno di un gene che poi deve essere trascritto in un

determinato rna messaggero. Questi mirtroni producono i mirna che servono ad attaccarsi

all'inibizione dello stesso rna messaggero di cui fanno parte. Quindi,questi microrna della biogenesi

non canonica non hanno dei geni propri, ma vengono fuori dagli introni di un determinato rna

messaggero. Durante la trascrizione viene prodotto un rna messaggero immaturo. Un premrna che

quindi ha alternanza di esoni e di introni.Come tutti gli rna messaggeri anche questo premrna andrà

incontro ai processi di maturazione.Quindi,cappuccio al 5',coda di poliadenilazione al 3' e il

meccanismo di splicing. Il meccanismo di splicing è quel meccanismo attraverso cui vengono

rimossi gli introni per la riunione degli esoni,perchè gli esoni sono delle regioni che contengono

l'informazione genica necessaria per la produzione di una proteina. Per cui succede che in questo

rna messaggero avviene lo splicing e attraverso lo splicing si forma la struttura a cappio,formata

dall'introne quando l'introne viene rimosso. Però quando l'introne non è un mirtrone questa struttura

a cappio viene degradata perchè viene mandata nell'endosoma nucleare dove ci sono tutte le

ribonucleasi che degradano l'introne. Quando invece un introne è un mirtrone ossia ha la sequenza

nucleotidica giusta per formare un mirna. Questo mirtrone non viene degradato ma diventa il

substrato di un enzima che si chiama Ldbr o enzima deramificante del cappio,che trasforma questa

struttura a cappio in un premirna. Quindi,il premirna che è questa struttura a forcina in cui

l'estremità 3' OH è più lunga di due nucleotidi dell'estremità 5' fosfato,viene fuori da tutti e due i tipi

di biogenesi. Siccome nella biogenesi non canonica l'enzima DROSHa non è coinvolta,si dice anche

che è una biogenesi degli mi-RNA drosha indipendente,perchè non coinvolge l'attività di Drosha

che è invece coinvolta nella biogenesi canonica. A questo punto, il premirna deve essere trasportato

dal nucleo al citoplasma. Viene trasportato dal nucleo al citoplasma. Il premirna viene legato a una

proteina che è un recettore di esportazione nucleare che si chiama ESPORTINA 5.Questa proteina a

un'altra proteina che si chiama RAN. Ran è una Gproteina sono delle proteine monomeriche

formate da una sola subunità.Si chiamano proteine G perchè sono proteine che si legano al GTP.

Poichè si legano a GTP,si possono trovare in due forme. Nella forma attiva Ran è legato a

GTP,guanosina trifosfato,nella forma inattiva è legata a GDP,guanosina difosfato. Quando,si forma

il premirna a livello del nucleo,per essere trasportato dal nucleo al citoplasma,il premirna viene

legato a un recettore di esportazione nucleare che è l'esportina 5,che è legato a una proteina

monomerica che si chiama RAN. Ran è in forma attiva perchè è legata al GTP. L'esportina 5 legata

a RANGTP e al premirna attraverso i pori nucleari trasporta attraverso l'idrolisi di GTP che si

trasforma da GTP a GDP trasporta il premirna dal nucleo al citoplasma. L'idrolisi del GTP induce la

dissociazione tra il premirna e l'esportina 5 e ran. Nel citoplasma, agisce una ribonucleasi/rnasi

citoplasmatica che si chiama DICER.DICER trasforma il premirna,che ha una struttura a loop e

l'estremità 3' Oh sporgente, in una molecola di miRNA matura. Questa molecola di miRNA matura

nel citoplasma è formata da due filamenti di nucleotidi appaiati ed è formata dal filamento senso e

dal filamento antisenso e ha la caratteristica di avere su tutti e due i filamenti l'estremità 3' OH che

sporge di due nucleotidi. Questa molecola di miRNA si associa a una proteina che si chiama

ARGONAUTA a formare un complesso che si chiam COMPLESSO PRERISK cioè un complesso

di silenziamento di rna messaggero. Questa molecola di miRNA a doppio filamento che ha due

nucleotidi singoli all'estremità 3' OH si associa a una proteina che si chiama argonauta a formare il

complesso che si chiama PRERISC. Questo complesso prerisc invidua quale è tra i due filamenti di

rna quale è il filamento senso e il filamento antisenso e degrada il filamento senso del mirna,perchè

il filamento senso è il filamento di mirna che ha la stessa sequenza nucleotidica dell0rna messagero

bersaglio. Per cui avendo la stessa sequenza nucleotidica non si può legare. Mentre il filamento

antisenso è quel filamento di rna che ha la sequenza nucleotidica complementare alla sequenza

dell'rna messaggero bersaglio. Avendo la sequenza complementare all'rna messaggero bersaglio vi

si lega e blocca la funzionalità dell'rna messaggero. A questo punto il complesso prerisc si lega all

rna messaggero bersaglio . La proteina ARGONAUTA è costituita di tre domini: il dominio MID,il

dominio PIWI e il dominio PAZ. Il dominio MID serve a alloggiare l'estremità 5'fosfato del

filamento antisenso del mrna.Il dominio PIWI contiene due ioni MG2+ che serve per legare i gruppi

fosfato negativi presenti sul filamento antisenso del microRNA. Il dominio PAZ lega la regione

3'OH del microrna. Quando il complesso risc si lega all'rna messaggero bersaglio,possono

succedere due cose:o la degradazione dell'rna messaggero oppure l'rna messaggero non viene

tradotto in proteina. Queste due diverse strade dipendono dal grado di complementarietà tra il

microrna e l'rna messaggerobersaglio,perchè se la complementarietà tra il mirna e l'rna messaggero

bersaglio è perfetta, quindi tutti i nucleotidi del mirna combaciano perfettamente con i nucleotidi

dell'rna messaggero e si ha una complementarietà perfetta si ha la degradazione dell'mrna

messaggero.Se invece,il microrna combacia in maniera imperfetta con l'mrna messaggero bersaglio,

ci sono dei nucleotidi del mirna che non combaciano che non sono complementari ai nucleotidi

dell'rna messaggero bersaglio,per cui si ha una complementarietà imperfetta l'rna non viene tradotto

e non si ha laproduzione della proteina. Se noi prendiamo il nostro sangue, isoliamo il plasma dal

sangue e teniamo solo le molecole le strutture che sono fluttuanti nel sangue,si trovano proteine

lipidi ma anche mirna.é stato scoperto che i mirna che sono molecole che servono per il controllo di

tipo posttrascrizionale,per regolare la traduzione dell'rna messaggero dopo che questo mrna è stato

trascritto. Non rimangono all'interno dell acellula ma possono essere secrete cioè una cellula che li

produce,può produrli attraverso o un meccanismo canonico o uno non canonico produrre un mirna a

singolo filamento che può essere veicolato all'esterno della cellula e può essere inserito nel sangue.

All0interno del sangue,i mirna possono essere veicolati attraverso vescicole oppure possono far

parte di lipoproteine plasmatiche,che sono proteine che veicolano i lipidi nel sangue oppure possono

essere inseriti incomplessi proteici. Questi microrna,la cellula li può mandare all'esterno e si

ritrovano nel sangue. Questi microrna che circolano vengono catturati da altre cellule che si trovano

anche lontane dalle cellule che le hanno prodotti e anzichè regolare l'espressione genica delle cellule

che li hanno prodotti,regolano l'espressione genica delle cellule anche lontane che li hanno presi

dall'ambiente extracellulari. Si chiamano circolanti perchè sono rna che circolano nel sangue.

I sirna sono dei prodotti esogeni sono delle molecole che la cellula prende dall'esterno e le ingloba.

Quando queste cellule inglobano nel citoplasma questi siRNA vengono processati nel citoplasma. I

siRNA sono quei miRNA che vengono utilizzati nei laboratori di ricerca per bloccare l'espressione

di una determinata proteina. I si RNA hanno una complementarietà perfetta con il rna messaggero

bersglio e quindi inducono la degradazione completa dell'rna messaggero bersaglio. I siRNA si

producono a partire da lunghe molecole di RNA prodotti da elementi genetici normalmente silenti o

estranei alla cellula,quali trasposoni, virus e o transgeni. Sono molecole di rna a doppia elica e

inducono la degradazione di un filamento. I microRNA che vengono prodotti possono regolare

anche la formazione di eterocromatina.Quindi,non svolgono solo un controllo di tipo post

trascrizionale ma possono anche indurre un controllo di tipo trascrizionale,cioè regolare la

trascrizione di determinati geni perchè agiscono sui meccanismi di compattamento della cromatina.

In particolar modo,promuovendo la formazione di eterocromatina,che è quella forma di cromatina

silente dal punto di vista trascrizionale perchè è quella forma di cromatina che è altamente

compattata con gli istoni,per cui essendo una cromatina altamente compattata con gli istoni i

promotori di determinati geni non sono accessibili e quindi quei geni non sono trascrivibili. Queste

modifiche epigenetiche che promuovono la produzione di eterocromatina,la formazione di dna

molto compattato e silente dal punto di vista trascrizionale, sono quelle che coinvolgono la lisina in

posizione 9 e la lisina in posizione 27 dell'istone H3,che vengono metilate. La metilazione è una

modificazione epigentica che sia che avvenga sulle citosine del dna oppure che avvenga sugli istoni

che si associano al dna,è una modifica chimica che blocca la trascrizione perchè induce il

compattamento della cromatina. Quindi la formazione di eterocromatina. Quindi, quando la lisina in

posizione 9 viene metilata si ha il silenziamento genico e la formazione di eterocromatina.Quando

invece, la lisina in posizione 9 viene acetilata si ha la trascrizioneperchè l'acetilazione sulle code n

terminali degli istoni ativa la trascrizione. Quando la lisina in posizione 27 dell'istone H3 viene

metilata si ha il silenziamento genico . Quindi, i mirna producono eterocromatina agendo sulla

lisina 9 e la lisina 27 dell'istone H3,i miRNA promuovono la metilazione di queste due lisine

sull'istone H3 inducendo la formazione di eterocromatina,perchè i miRNA inducono la metilazione

della lisina in posizione 9 e 27 dell'istone H3 promuovendo la formazione di eterocromatina e

quindi il silenziamento genico. Questi miRNA vengono prodotti come molecole di rna a doppio

filamento nel nucleo,passano nel citoplasma dove grazie al DICER vengono scisse in tante

molecole più corte di siRNA.Queste suRNA ripassano dal citoplasma al nucleo con un meccanismo

sconosciuto.Nel nucleo, questi siRNA si legano sul dna in prossimità del dna in cui ci sono gli istoni

H3 e in prossimità della lisina 9 e della lisina in posizione 27 dell'istone H3. In questo

modo,guidano l'istone metiltransferasi,quegli enzimi che servono alla metilazione della lisina 9

della lisina 27 dell'istone H3,che in questo modo divento metilate e bloccano lla trascrizione di uella

porzione di dna in cui la lisina 9 e la lisina 27 sono metilate e promuovono la formazione di

eterocromatina.

IL CODICE GENETICO,TRADUZIONE E MUTAZIONI

Nelle nostre cellule,l'informazione passa dal dna all'rna attraverso un processo di trascrizione e poi

l'rna messaggero viene letto e tradotto in maniera da formare una proteina. Una proteina che è

costituita dalla successione di aminoacidi. Quando una molecola di dna si duplica si passa da una

molecola di dna formata da nucleotidi a due molecole di dna formate anch'esse da nucleotidi.

Quando avviene la trascrizione, l'informazione contenuta nel dna viene trasferita nell'altro acido

nucleico cioè l'rna non cambia il tipo di monomero perchè così come il dna è formato da

nucleotidi,l'rna è formato da nucleotidi,anche se con piccole difference. Il problema nasce quando si

passa da un linguaggio a nucleotidi come quello nell'rna messaggero a un linguaggio delle proteine

costituito da aminoacidi. Durante la traduzione avviene un cambiamento di linguaggio, si passa da

un liguaggio a nucleotidi che è quello ottenuto nell'rna messaggero a un linguaggio a aminoacidi

che sono contenuti nelle proteine. Gli aminoacidi sono 20,in realtà 22, per cui le proteine sono

formate dall'unione variegata di questi 20 aminoacidi.L'rna così come il dna invece è formato da

quattro nucleotidi. Per cui, si deve passare da una molecola formata da quattro nucleotidi a formare

una molecola come le proteine costituita dall'unione di 20 differenti aminoacidi. Per cui,se si deve

tradurre il contenuto a nucleotidi presente nell'rna messaggero si devono coprire tutti e 20 gli

aminoacidi. Se l'rna messaggero durante il processo di traduzione venisse letto a nucleotide singolo.

Quindi,un nucleotide corrispondesse a un aminoacido siccome i nucleotidi sono 4. un aminoacido

corrisponde a un nucleotide.SI avrebbe la corrispondenza 1 nucleotide 1 aminoacido.Quindi è

impossibile che l'rna messaggero venga letto a singolo nucleotide,perchè dopo 4 nucleotidi non si

potrebbe più inserire gli altri 16 aminoacidi. Se i nucleotidi presenti sull'rna messaggero venissero

letti a doppietto.Quindi se un aminoacido corrispondesse a una coppia di nucleotidi. SI avrebbero

4^2 combinazioni cioè 16 possibilità di accoppiamento. Ognuna delle quali richiamerebbe un

singolo aminoacido però 16 accoppiamenti sono sempre pochi rispetto ai 20 aminoacidi di cui son

formate le proteine,ne resterebbero 4 fuori. Per cui l'rna messaggero non viene letto nemmeno a

doppiette,perchè non bastano per coprire tutti gli aminoacidi ne restano fuori 4. Se invece, i

nucleotidi contenuti nel'rna messaggero sono letti a triplette,4 ^3 fa 64. si ha 64 combinazioni dei 4

nucleotidi. 64 combinazioni che sono più che sufficienti per leggere i 20 aminoacidi di cui sono

costituite le proteine. Per cui,il codice di lettura si dice che è a triplette. Un tripletta corrisponde a

un aminoacido. Infatti,queste 64 combinazioni costituiscono quello che viene chiamato il codice

genetico. Il codice genetico è un "vocabolario" in cui i quattro nucleotidi di cui son formati gli acidi

nucleici,in particolare l'rna messaggero, sono associati a triplette. Ognuna di queste triplette codifica

per un amminoacido. Di questi 64 codoni,c'è n'è uno che AUG ,è il cosiddetto codone di inizio,cioè

è il codone a livello del quale inizia la traduzione della proteina e codifica per l'aminoacido

METIONINA, perchè tutte le proteine iniziano con la metionina. La metionina viene codificata da

una sola tripletta AUG. Mentre tutti gli altri aminoacidi sono codificati da almeno due codoni,

addirittura la leucina da sei codoni. Ci sono poi tre codoni che sono chiamati codoni di stop,cioè

sono codoni che non corrispondono a nessun aminoacido e che indicano invece il termine della

sintesi proteica. Per cui,quando sull'rna messaggero si trovano uno di questi tre codoni la proteina

non viene più sintetizzata ma viene bloccata la sintesi proteica perchè questi tre codoni non

codificano per nessu aminoacido e viene bloccata la sintesi proteica. Siccome gli aminoacidi sono

20 e i codoni sono 64,si dice che il codice genetico è DEGENERATO o RIDONDANTE,vuol dire

che ogni aminoacido può essere codificato da più di un codone. Infatti,la prolina può essere

codificato da quattro codoni. Quindi il codice genetico è ridondante o degenerato perchè per uno

stesso aminoacido ci possono essere più codoni apparte la metionina che ne ha uno. É universale

perchè è valido per tutti gli esseri viventi però non è ambiguo vuol dire che anche se un aminoacido

può essere codificato da più codoni,un codone codifica sempre e solo per un aminoacido. Quindi, se

la leucina è codificata da sei codoni,il codice genetico è degenerato perchè la leucina può essere

codificata da 6 codoni ma ognuno di questi sei codoni codifica sempre e solo per la leucina. É vero

che un aminoacido è codificato da più codoni ma un codone codifica sempre per un aminoacido.

Per cui,il codice genetico è ridondante ma non è ambiguo. Queste 64 combinazioni sono state

scoperte grazie all'esperimento di niremberg e Matthey ,che è stato fatto nel 1960.Loro hanno preso

dei batteri,generalmente E.coli perchè sono organismi che hanno un tempo di replicazione di 20

minuti, quindi si duplicano in un tempo molto breve e quindi basta una sola cellula per ottenere

miliardi di batteri . Hanno inserito in queste colture di batteri delle molecole artificiali di rna

messaggero che coprissero tutte le combinazioni possibili di quattro nucleotidi e hanno scoperto

tutte le correlazioni tra le 64 triplette e i 20 aminoacidi. Per cui,si sono accorti che inserendo un rna

messaggero formato da UUU trovavano proteine formate da fenilalanina,voleva dire che il codone

UUU codificava per la fenialanina, inserendo un rna messaggero formato da tutte adenine dove

trovavano un proteina lisina voleva dire che il codone AAA codificava per la lisina etc.. Quando c'è

un rna messaggero,l'rna messaggero a seconda di come viene letto vengono richiamati diversi

aminoacidi. Per cui,se c'è una mutazione all'interno di un rna messaggero cambia proprio

l'aminoacido che viene richiamato proprio perchè a seconda di quello che viene chiamto frame di

lettura dell'rna messaggero cambia la tripletta che viene letta e quindi cambiano gli aminoacidi che

vengono inseriti.Per cui, se un codone viene letto CUC viene richiamata la leucina ma se viene letto

UCA il primo aminoacido inserito è la serina. I componenti che partecipano alla sintesi proteica

sono l'rna messaggero,i ribosomi, il tRNA e numerose proteine chiamate fattori di traduzione o

EIEF. Quando comincia la traduzione, l'rna messaggero è la molecola che viene letta e poi viene

tradotta in proteina. L'rna messaggero viene letto in direzione 5' fosfato 3' OH. Quindi,così come la

dna polimerasi sintetizza le nuove molecole di dna in direzione 5' fosfato 3' OH,siccome l'rna

polimerasi produce nuove molecole di rna in direzione 5' fosfato 3' OH.Così l'rna messaggero viene

letto in direzione 5' fosfato 3' OH.Il polipeptide viene sintetizzato in maniera tale che il primo

aminoacido,che è sempre la metionina abbia il gruppo amminico libero e l'ultimo aminoacido della

catena polipeptidica abbia il gruppo carbossilico libero. Per cui, l'rna messaggero viene letto in

direzione 5' fosfato 3' OH,la proteina viene tradotta in direzione N--> C terminale,ammino

carbossiterminale. Questo vuol dire che il primo aminoacido che è la metionina della proteina ha il

gruppo amminico libero e l'ultimo aminoacido della proteina ha il gruppo carbossilico libero. Vuol

dire che la metionina avendo l'estremità amminoterminale libera coinvolge l'estremità carbossilica

nel legame peptidico che la metionina fa con il secondo aminoacido. (sapere il legame peptidico e

come si legano due aminoacidi).L' rna transfer partecipa alla traduzione e ha come struttura

secondaria una struttura a trifoglio con 4 anse e come struttura tridimensionale una struttura a L.

Nell'rna transfer,l'estremità 5' fosfato è più corta ripetto all'estremità 3' OH,che è più lunga di tre

nucleotidi che sono ACC,che vengono inseriti proprio durante il processo di maturazione dell'rna

transfer.Quest'estremità 3' OH dell'rna transfer è particolarmente importante perchè a questa regione

3' OH si lega l'aminoacido. L'aminoacido di lega all'estremità 3'OH attraverso il gruppo

carbossilico. Il gruppo carbossilico è il gruppo dell'aminoacido che partecipa al legame peptidico.

Ci sono due fondamentali regioni dell'rna transfer: l'estremità 3' OH che è l'estremità che serve per

legare l'aminoacido,che si lega all'estremità 3' OH dell'rna trasfer con il gruppo carbossilico e poi

l'ansa A dove A sta per anticodone. L'ansa A è l'ansa chiamata ansa dell'anticodone perchè a sta per

Anticodone.L'anticodone è una tripletta che è complementare al codone presente sull'rna

messaggero complementare. Per cui, l'rna transfer presenta l'ansa A con l'anticodone, questa tripletta

di nucleotidi che è complementare a un codone presente sull'rna messaggero. L'anticodone presente

sull'ansa A del tRNA è complementare alla tripletta presente sull'rna messaggero. All'estremità 3' Oh

si lega l'aminoacido,si lega al tRNA il corrispondente aminoacido che ha il codone corrispondente

all'anticodone di quel tRNA. Ad esempio,l'aminoacido fenilalanina si lega al tRNA che ha

l'anticodone corrispondente al codone della fenilalanina sull'rna messaggero. Il tRNA lega

all'estremità 3' OH un aminoacido. IL legame dell'aminoacido all'estremità 3'OH del tRNA vien

regolato dall'anticodone,anticodone che è complementare al codone presente sull'rna messaggero.

L'aminoacil tRNA sintetasi lega un determinato aminoacido all'estremità 3' OH del tRNA. L

'aminoacil trna sintetasi è un enzima un po' particolare perchè presenta tre siti attivi,che sono un sito

per il tRNA, un sito per l'ATP e un sito per l'aminoacido e lega l'aminoacido al proprio tRNA

seguendo una determinata successione di eventi. Per cui,all'inizio l'aminoacido e l'ATP si legano al

proprio sito di legame sull'aminoacil tRNA sintetasi. Viene eliminato pirofosfato e l'AMP viene

legato all'aminoacido formando un AMOAMINOACIDO o un AMINOACIDO ATTIVATO,perchè

lATP viene scisso in AMP e pirofosfato,il pirofosfato viene eliminato. L'AMP si lega all'aminoacido

formando un AMP aminoacido o un aminoacido attivato . A questo punto, interviene l'rna transfer

che si lega al proprio sito sull'aminoacil sintetasi, si ha la rottura del legame tra l'aminoacido e

l'AMP. L'AMP viene scisso, l'energia scaturita dalla dissociazione del legame AMP e aminoacido

viene utilizzata per formare il legame tra il tRNA e l'aminoacido. Quindi,l'aminoacido si lega

all'estremità 3' OH del tRNA , che a questo punto diventa un tRNA CARICO. Un tRNA carico che

porterà l'aminoacido nei ribosomi dove avviene il processo di traduzione. Il tRNA passa da essere

scarico, cioè non legato all'aminoacido a essere un tRNA carico cioè legato all'aminoacido

corrispondente. Il tRNA carico lascia l'enzima e viene portato nel sito del ribosoma in cui avviene la

sintesi della proteina. L'aminoacil tRNA sintetasi oltre ad avere una attività sintetasica ossia di

legare l'aminoacido all'estremità 3' OH del tRNA, ha anche un'azione di correzione di bozze, perchè

la tRNA sintetasi ha due siti attivi: un sito di sintetasi che serve per legare il corrispondente

aminoacido al proprio tRNA e poi un sito di controllo e di correzione in cui porta l'aminoacido che

ha sbagliato a legare,l'aminoacido che è stato legato in maniera erronea a un tRNA sbagliato viene

rimosso. In questo modo l'aminoacido che è stato legato in maniera erronea viene rimosso dall'rna

trasfer,l'estremità 3' OH dell'rna viene riportata nel sito di sintetasi e lì viene attaccato l'aminoacido

giusto. Per cui,ci sono tre differenti enzimi che fanno questi controlli: la dna polimerasi ,la rna

polimerasi e la aminoacil tRNA sintetasi. Il legame tra la terza base del codone e la prima base del

codone vacilla,che non segue in maniera stringente la regola di complementarietà tra le basi. La

regola di complementarietà tra le basi vorrebbe dire che la guanina si lega lal citosina e l'adenina

all'uracile. Se la citosina si trova nella terza base del codone non è detto che si leghi alla guanina ma

si può legare anche a altre basi,proprio perchè il legame tra codone presente nell rna messaggero e

anticodone presente sul rna transfer vacilla a livello della terza base. Vuol dire che questa

complementarietà codone anticodone deve essere stringente tra le prime due basi del codone e le

corrispondenti dell'anticodone mentre il legame tra la terza base del codone che corrisponde alla

prima dell'anticodone,perchè sono antiparalleli, vacilla e quindi si possono avere delle

complementarietà tra basi che normalmente non ci sono. Questo è il motivo per cui come all'interno

di ogni gruppetto di codoni che codificano per un determinato aminoacido.Quello che non cambia

mai sono le prime due basi mentre quello che cambia è la terza base. Proprio perchè il legame fra la

terza base del codone e la prima dell'anticodone vacilla e non segue in maniera stringente le regole

di complementarietà tra le basi,che sono quelle che regolano l'appaiamento fra due filamenti della

molecola di dna. Questo vuol dire che lo stesso TRNA che contiene lo stesso anticodone si può

legare a due codoni differenti dull'rna messaggero,portando però sull'rna messaggero sempre lo

stesso aminoacido. Proprio perchè il legame tra la priam dell'anticodone e la terza del codone

oscilla. Può dare origine a una complementarietà perfetta o imperfetta,che non è mai permessa se

non a livello di codone e anticodone. Le principali caratteristiche della traduzioni è che la direzione

di traduzione dell'rna messaggero va in direzione 5' fosfato 3'OH e che la sintesi della proteina va in

direzione amminoterminale carbossiterminale. Questo vuol dire che il primo aminoacido della

proteina che è sempre la metionina ha il gruppo amminico libero mentre l'ultimo aminoacido della

catena polipeptidica ha il gruppo carbossilico libero. I ribosomi sono formati dalla subunità minore

e dalla subunità maggiore che sono sempre dissociate fino a quando non viene attivato il processo di

traduzione. Fino a che non comincia la traduzione di una proteina le due subunità dei ribosomi

maggiore e minore sono dissociate. Si associano solo nel momento in cui si forma il complesso

traduzionale. La subunità minore del ribosoma contiene un sito di legame per l'rna messaggero cioè

è il sito in cui si lega e scorre l'rna messaggero e quindi è il sito del ribosoma in cui viene letto l'rna

messaggero in direzione 5' fosfato 3' OH. L asubunità maggiore del ribosoma invece presenta tre

siti, che sono il sito A ,il sito P e il sito E. Il sito A è il sito della subunità maggiore del ribosoma a

cui si lega il tRNA che ha legato il corrispondente aminoacido.QUindi si lega il tRNA carico.

Quindi il tRNA che ha legato all'estremità 3'OH l'aminoacido. AL sito P si lega la catena nascente

polipeptidica nascente sempre legata a un rna transfer.Il sito E è il sito di uscita dei tRNA scarichi,

cioè i tRNA che non sono più legati agli aminoacidi. La traduzione negli eucarioti avviene in tre

fasi,che sono l'inizio,l'allungamento e la terminazione. Il ribosoma si lega all'estremità 5' fosfato del

rna messaggero e scorre verso l'estremità 3'OH e via via traduce il polipeptide. Via via che termina

la traduzione di una proteina,il complesso del ribosoma formato dall'associazione tra la subunità

minore e la subunità maggiore del ribosoma si stacca dall'rna messaggero si dissocia e può

ricominciare un'altra volta la traduzione della proteina a livello dello stesso rna

messaggero,formando quello che viene chiamato un poliribosoma. L'inizio della traduzione negli

eucarioti prevede la formazione del complesso di pre inizio 43S ,S sta per svedberg. In questo

processo di inizio,ci sono le subunità del ribosoma che all'inizio sono dissociate. La subunità

minore e la subunità maggiore non si possono associare tra di loro perchè alla subunità maggiore è

legato questo fattore di inizio della traduzione che si chiama Eief6. Questo fattore Eief6 dove E sta

per eucariotico e "ief" sta per fattore di inizio 6,si lega alla subunità maggiore e si chiama fattore

antiassociativo perchè fino a che è legato alla subunità maggiore del ribosoma blocca il legame

della subunità maggiore del ribosoma a quella minore. Alla subunità minore del ribosoma si legano

altri tre fattori di inizio della traduzione che ,inizialmente sono EiF1 e eiF3 che si legano alla

subunità minore del ribosoma. Alla stessa subunità minore si lega un'altro fattore di inizio della

trascrizione che si chiama eiF2 che ha una attività CTPasica e infatti a questo fattore ci si lega anche

GTP.EiF2 serve a posizionare il primo tRNA che porta il primo aminoacido che è la metionina.

Serve per posizionare il primo tRNA che porta la metionina nel corrispondente sito P,sulla subunità

maggiore del ribosoma. Interviene a questo punto eif5 che aiuta a posizionare il tRNA e eiF2 sulla

subunità minore del ribosoma.Questo è quello che succede dalla parte del ribosoma per posizionare

il complesso di inizio 43S. A livello dell'rna messaggero che si viene a allineare sulla subunità

minore del ribosoma per formare il complesso di pre inizio, che è il complesso 43S. L'rna

messaggero maturo che contiene il codone AUG e contienel'estremità 5' fosfato col cappuccio con

la 7 metil guanosina a cui si è attaccata una proteina. All'estremità 5' fosfato si lega un complesso di

inizio ch esi chiama eiF4F. EiF4F è un complesso proteico che si lega all'estremità 5' dell'rna

messaggero è ch eè formato daun'altra serie di altre proteine tra cui due che sono eiF4A e eiF4B.

EiF4A è una RNA ELICASI mentre eiF4B stimola l'attività elicasica di eiF4A. L'rna elicasi serve

perchè ci sono alcuni rna messaggeri che presentano a livello della regione 5' fosfato delle regioni a

doppio filamento,delle strutture a loop. Queste strutture a loop devono essere rimosse perchè

altrimenti il ribosoma non scorre lungo l'rna messaggero . Per la rimozione di queste strutture a loop

della regione 5' UTR sono necessari degli enzimi che rompono i legami a idrogeno che tengono

unite queste strutture a doppio filamento. A questo punto si è formato il complesso 43S,chè è dato

dall'unione della subunità minore insieme all'rna messaggero che ha legato all'estremità 5' fosfato

questo complesso. Dopodichè,inizia quella che viene definità la scansione cioè la subunità minore

del ribosoma scansiona legge tutte le sequenze nucleotidiche dell rna messaggero in direzione 5'

fosfato 3' OH. Questa scansione serve per cercare il primo codone di inizio della traduzione che è il

codone che codifica la metionina,cioè il codone AUG. Per cui quando si è formato il complesso di

inizio 48S,comincia la scansione dell'rna messaggero della subunità minore del ribosoma lungo la

molecola di rna messaggero in direzione 5'fosfato 3' OH.Questa scansione si interrompe quando la

subunità minore del ribosoma incontra il codone AUG ossia il codone di inizio della traduzione.

Quando la subunità minore del ribosoma legge il codone AUG che corrisponde al codone di inizio

della traduzione, succede che tutti quei fattori traduzionali di inizio,che si erano attaccati da una

parte alla subunità minore del ribosoma dall'altra parte alla subunità 5' fosfato dell'rna messaggero

vengono rilasciati. In particolare, dalla subunità maggiore del ribosoma viene rilasciato l'eiF6.

L'eiF6, che era quel fattore traduzionale che blocca l'associazione tra la subunità maggiore e la

subunità minore del ribosoma. Per cui, quando la subunità minore del ribosoma incontra il codone

AUG sull'rna messaggero si ha il distacco di tutti i fattori traduzionali di inizio della traduzione che

si erano legati e soprattutto si ha il rilascio dell'eiF6 che è il fattore che quando è legato alla

subunità maggiore del ribosoma blocca l'associazione della subunità maggiore del ribosoma con

quella minore. Quando eiF6 viene rilasciato dalla subunità maggiore del ribosoma,si ha l'union etra

la subunità maggiore e quella minore del ribosoma. Tutti i fattori traduzionali di inizio che erano

serviti per formare il complesso di inizio vengono rilasciati e a questo punto si ha che l'rna

messaggero è legato alla subunità minore e alla subunità maggiore del ribosoma a formare un

complesso di inizio di 80 S,svedeberg. Quando la subunità minore si lega all'rna messaggero

comincia la scansione cioè si forma questo complesso di inzio formato dalla subunità minore del

ribosoma e dell'rna messaggero di 48S,che è il complesso di inizio prima che vi si leghi la subunità

maggiore del ribosoma e comincia la scansione. La scansione va avanti fino a che la subunità

minore del ribosoma non legge il codone AUG, che è il codone da cui parte la traduzione. La

regione 5' UTR non è detto che non contenga nessun AUG,la subunità minore del ribosoma

riconosce dove si trova l'AUG sia nei procarioti che negli eucarioti. Il codone AUG che codifica per

l'aminoacido metionina e che quindi fa iniziare la traduzione dell'rna messaggero è preceduto da

una sequenza consenso, che si chiama sequenza di Shine-dalgarno nei procarioti e sequenza Kozak

negli eucarioti.Il codone di inzio della traduzione deve essere preceduto o compreso in questa

sequenza Kozak negli eucarioti e shine-dalgarno nei procarioti. Durante la scansione, quando l'rna

messaggero viene scansionato dalla subunità minore del ribosoma e quindi si forma il complesso

48S,che è il complesso che precede l'associazione con la subunità maggiore del ribosoma.Comincia

la scansione per trovare l'AUG.Per trovare l'AUG la subunità minore del ribosoma si sposta lungo

l'rna messaggero in direzione 5' fosfato 3' OH formando questa struttura a bolla perchè il ribosoma

rimane sempre legato all'estremità 5' fosfato al cappuccio dell'rna messaggero,che sta scansionando

formando questa bolla,questo cappio . Soltanto quando ha letto la sequenza di kozak degli eucarioti

e ha incontrato,riconosciuto il codone AUG che è il codone vero e proprio da cui deve partire la

traduzione, la subunità minore del ribosoma si stacca dal cappuccio dell'rna messaggero,che ritorna

libero,non legato a nessuna subunità minore del ribosoma.La subunità maggiore del ribosoma si può

legare alla subunità minore di quel ribosoma che ha letto e riconosciuto la tripletta AUG di inizio

della traduzione e al cappuccio dell'rna messaggero si può legare un'altra subunità minore di un

altro ribosoma,in maniera che questo complesso traduzionale di 80S possa leggere l'rna messaggero

e tradurre la proteina e contemporanemante un altro si possa legare allo stesso rna messaggero un

altro ribosoma per formare quello che viene chiamatoi l poliribosoma,cioè questa struttura circolare

in cui in uno stesso rna messaggero si sono legati contemporanemente più ribosomi. Quindi un rna

messaggero viene tradotto in più copie di proteina contemporaneamente. La traduzione si nei

procarioti che negli eucarioti comincia con l'inserimento dell'aminoacido metionina ch eviene

codificato dal codone AUG. Nei procarioti però la prima metionina e soltanto la prima metionina

modificata perchè è la formil metionina.Nel caso dei procarioti soltanto la prima metionina è quella

che costituisce il primo aminoacido della catena polipeptidica è modificata cioè è una metionina con

attaccato un gruppo formile a formar el'n-formilmetionina. Mentre le eventuali metionine che ci

sono all'interno della proteina sono metionine che non sono modificate,cioè sono metionine normali

non formilate. L'n formil metionina è riconosciuta da un tRNA specifico per la Nformilmetionina

che è differente dal tRNA che riconosce la metionina non formilata. Quindi,i procarioti hanno due

tRNA per la metionina uno che riconosce l'Nformil metionina,che è la metionina iniziale,quella che

viene inserita come primo aminoacido e un tRNA che invece riconosce la metionina non formilata,

non legata al gruppo formile,che sono tutte quelle metionine,che sono all'interno della proteina.

All'inizio e soltanto nel caso della metionina,il tRNA che porta legata la metionina si trova nel sito P

mentre tutti gli altri tRNA andranno ad attaccarsi nel sitoA. Per cui,il primo tRNA che è quella che

porta la metionina.Quando si forma il complesso traduzionale 80S,quando la subunità maggiore si

lega alla subunità minore il tRNA con attaccata la metionina si trova nel sito P ed è l'unico perchè

tutti gli altri tRNA si legheranno al sito A .Quindi a questo punto,il tRNA contenente la metionina si

trova nel sito P, a questo punto la subunità minore del ribosoma può leggere il secondo codone che è

presente nell'rna messagero.QUindi, il codone che segue il codone AUG di inizio, viene quindi

richiamato sul sito A della subunità maggiore del ribosoma il tRNA che ha l'anticodone

complementare al secondo codone sull'rna messaggero e quindi porta l'aminoacido codificato dal

codone presente sull'rna messaggero. A questo punto succede che si hanno due tRNA legati uno

sulla subunità P e l'altro nel sito A della subunità maggiore del ribosoma. Si forma il primo legame

dipeptidico tra il secondo aminoacido e la metionina.Questo legame peptidico è catalizzato da un

enzima che si chiama peptidil transferasi e che utilizza GTP per formare questo legame. Questo

legame peptidico si forma tra il gruppo carbossilico della metionina o di un aminoacido precedente

e il gruppo amminico del secondo aminoacido,che deve essere inserito e quindi si forma un legame

peptidico catalizzato dalla peptidil transferasi tra il gruppo carbossilico o aminoacisdo o del peptide

se è una catena polipeptidica formata da più di un aminoacido che si trova nel sito P e l'aminoacido

che deve essere inserito che si trova nel sitoA. Il polipeptide nascente si è spostato dal sito P al sito

A. Dopo di che si ha la traslocazione,l'rna messaggero si sposta e il polipeptide passa dal sito A al

sito P e il tRNA scarico passa dal sito A al sito E. Il tRNA scarico che non porta più nessun

aminoacido viene staccato dal sito E della subunità maggiore del ribosoma e a questo punto il sito E

è libero e sul sito A viene richiamato un altro tRNA che porta l'aminoacido codificato dal codone

che si trova sull'rna messaggero e il tRNA deve avere l'anticodone complementare al codone. Tutto

questo continua fino a quando il ribosoma nonlegge più un codone che codifica per un aminoacido

ma legge un codone di stop,cioè uno dei tre codoni di stop. Il codone di stop non codifica nessun

aminoacido e quindi quando nel sito A della subunità maggiore del ribosoma anzichè essere

presente un codone che corrisponde a un aminoacido viene letto un codone di stop non viene più

richiamato nessun tRNA perchè a nessun tRNA corrisponde un aminoacido a un codone di stop ma

questo codone sìdi stop viene inserito nel sito A e richiama una proteina che si chiama fattore di

rilascio che si lega al sito A del ribosoma e il legame di questo fattore di rilascio al sito A del

ribosoma induce l'idrolisi tra il polipeptide nascente e il tRNA presente sul sito P .Per cui,il

polipeptide che ormai era stato tradotto in aminoacidi viene lasciato .Quindi si ha l'idrolisi tra il

gruppo carbossilico con cui era legato l'ultimo aminoacido del peptide dal tRNA del sito P e si ha la

dissociazione di tutto il complesso traduzionale. In questo modo la traduzione termina. Così come

avviene nei procarioti,anche negli eucarioti si formano delle strutture che sono i poliribosomi. I

poliribosomi sono l'attacco di numerosi siti di traduzione che si formano all'interno di uno stesso rna

messaggero.L'attacco della subunità minore che si lega al cappuccio,all'estremità 5' fosfato di un rna

messaggero maturo poi scansiona fino a trovare il primp AUG viene ripetuta tante volte fino a

quando il primo complesso di traduzione si forma a livello dell'AUG,questo complesso di

traduzione chiaramente scansiona l'rnq messaggero. Comincia la traduzione e finisce quando

incontra il codone di stop . A livello del quale si ha la dissociazione di tutto il complesso. Via via

che un complesso di traduzione si forma a livello del codone di inizio all'estremità 5' vi si attacca

una nuova subunità minore del ribosoma e così via... fino a formare questa struttura che è il

poliribosoma. Il poliribosoma è caratterizzato da una struttura circolare perchè il cappuccio dell'rna

messaggero che presenta l'estremità 5' si associa a quelle proteine che si legano alla coda di poliA

presente all'estremità 3' a formare questa struttura circolare. Gli aminoacidi sono 20. IN realtà,

quelli canonici sono 20 perchè ce ne sono altri due che sono la selenocisteina e la pirrolisina. La

pirrolisina e la selenocisteina sono presenti nei batteri però noi di questi du ene abbiamo solo uno,la

selenocisteina. La selenocisteina è una cisteina con un atomo di selenio.La caratteristica di questi

due aminoacidi,la pirrolisina e la selenocisteina,sono codificati/corrispondono a delle triplette che

sono triplette di stop. Quindi la pirrolisina e la selenocisteina sono degli aminoacidi particolari (noi

abbiamo la selenocisteina) sono codificate da delle triplette che corrispondono alle triplette di stop.

Quando il complesso di traduzione incontra questi codoni di stop non si interrompe la traduzione

perchè questi codono di stop sono inseriti o sono presenti in prossimità di una struttura a forcina

dell'rna messaggero. La presenza di queste strutture a forcina fa si che tutto l'apparato traduzionale

legga questa tripletta che codifica pr la selenocisteina o la pirrolisina non come codoni di stop ma

com e codoni ch edevono inseriti quell'aminoacido. Per favorire l'inserimento della selenocisteina

c'è una proteina che è un fattore di traduzione specifico per la selenocisteina che si lega a questa

struttura a forcina che si trova in prossimità del codone che codifica per la selenocisteina e la

presenza di questo fattore per la traduzione della cisteina che si lega a questa struttura a loop

indirizza il tRNA per la selenocisteina. In questo modo la selenocisteina viene inserita nella proteina

. In realtà la selenocisteina non ha un proprio tRNA specifico.Quindi,la selenocisteina non ha un

proprio tRNA ma sfrutta il tRNA della serina. Quindi,il tRNA della serina lega la serina e poi la

serina viene convertita enzimaticamente a selenocisteina. Il codice genetico è il meccanismo

"vocabolario" attraverso cui può avvenire la traduzione di un rna messaggero in proteina. Quando è

terminata la traduzione di una proteina, questa proteina nascente ha esclusivamente la struttura

primaria. Quindi, è una sequenza di aminoacidi dal primo che è la metionina col gruppo amminico

libero all'ultimo che ha il gruppo carbossilico libero. Le proteine però diventano funzionali soltanto

quando aquisiscono una struttura seconda e in seguito una struttura terziaria. Il passaggio dalla

struttura primaria alla struttura secondaria e poi alla struttura terziaria avviene grazie alla

formazione di un sacco di tipi di modificazioni che si chiamano modificazioni post traduzionali,che

coinvolgono per esempio la formazione di legami covalenti fra i gruppi SH di cisteine vicine oppure

la formazione di legami a idrogeno,di legami ionici per esempio se si tratta di proteine che

funzionano non come monomeri ma come dimeri. Le cellula hanno degli enzimi che si chiamano

Chaperoni molecolari che aiutano le proteine a acquisire la loro struttura tridimensionale. Per

cui,succede che alcune proteine molto piccole generalmente non hanno bisogno degli chaperoni

molecolari,perchè sono talmente piccole che riescono a acquisire la struttura tridimensionale che le

rende funzionali da sole.Però la stragrande maggioranza delle proteine di qualunque tipo che

vengono tradotte all'interno della cellula hanno bisogno dell'attività di questi chaperoni molecolari.

Per cui,succede che via via che una catena polipeptidica viene tradotta questa aquisisce grazie

all'attività di questi chaperoni molecolari,acquisisce le varie strutture secondarie e poi la struttura

terziaria e soltanto dopo che una proteina ha acquisito la corretta struttura terziaria cioè la giusta

disposizione nello spazio diventa funzionale. Questi chaperoni molecolari appartengono a due

famiglie che sono la famiglia degli chaperoni Hsp70 e la famiglia degli chaperoni Hsp60. Questi du

e tipi di chaperoni riconoscono le proteine che hanno raggiunto una struttura tridimensionale cioè

una struttura tridimensionale giusta da quelle che non l'hanno raggiunta perchè riescono a

identificare delle sequenze aminoacidiche idrofobiche che sono esposte all'esterno,verso l'ambiente

idrofilo. Perchè normalmente le sequenze idrofobe in tutte le proteine che devono essere inserite in

un ambiente idrofilo vengono inserite all'interno della proteina. Quindi, se proteine presentano delle

sequenze idrofobe rivolte verso l'esterno sono proteine che non hanno raggiunto una struttura

tridimensionale giusta. Gli chaperoni molecolari della famiglia Hsp70 utilizzano ATP e si legano via

via alla proteina nascente che esce dalla subunità maggiore del ribosoma e,utilizzando ATP.Quindi

con l'energia ottenuta dall'idrolisi di ATP,formano tutti quei legami che permettono alla proteina di

passare da una struttura primaria a una struttura secondaria e poi alla fine a una struttura terziaria.

Chiaramente a questo polipeptide nascente si legano tante molecole di chaperoni molecolari e alla

fine si può avere una proteina ripiegata correttamente quindi funzionale oppure questo tentativo di

far ripiegare il polipeptide non è andato a buon fine,per cui si ottiene una proteina che non è

ripiegata correttamente. Nel caso in cui una proteina non sia ripiegata correttamente,gli chaperoni

molecolari ritentano di far avere a questa proteina il folding giusto o struttura tridimensionale giusta

in maniera che questa proteina possa funzionare.Per cui si rilegano a questa proteina e tentano

nuovamente utilizzando l'energia ottenuta dall'idrolisi di AtP tentano di far acquisire a questa

proteina il folding funzionale. Gli chaperoni molecolari ritentano tante volte dopodichè se non ce la

fanno vuol dire che c'è qualcosa che non va per esempio nella proteina,per cui la cellula sceglie

un'altra strada. L'altra famiglia degli chaperoni molecolari,che sono la famiglia degli chaperoni

Hsp60. Sono degli chaperoni un po' più complessi perchè sono delle strutture proteiche con più di

una subunità,che presentano delle cavità,all'interno delle quali viene inserita la proteina che non ha

ancora raggiunto la giusta struttura tridimensionale. Questa cavità poi viene coperta con un'altra

subunità in maniera tale che la proteina si trovi isolata dal contesto che la circonda e all'interno di

questa struttura avvengono tutte le modifiche tali da far si da formare e stabilizzare la struttura

tridimensionale. Soltanto dopo che la proteina è stata ripiegata correttamente viene tolta la subunità

che chiude la cavità in cui è inserita la proteina e la proteina correttamente ripiegata viene fatta

uscire e a quel punto è attiva. Le forme polipeptidiche che non sono state ripiegate nonostante

l'aiuto di chaperoni molecolari non sono state ripiegate correttamente,vengono eliminate dalla

cellula perchè vengono indirizzate a una struttura proteica formata da più subunità che serve per la

digestione delle proteine che alla cellula non servono più.Questa struttura proteica che si trova nel

citoplasma adibita alla degradazione delle proteine si chiama PROTEASOMA. Le proteine che non

hanno acquisito il folding giusto devono essere eliminate perchè altrimenti tendono a precipitare nel

citoplasma e la precipitazione di proteine nel citoplasma può originare delle patologie anche molto

gravi,ad esempio l'alzhemeir. Il proteasoma è una struttura citoplasmatica formata da tre regioni:

una regione che si chiama anello di svolgimento, una regione all'altra estremità che si chiama

cappuccio e un cilindro centraleche ha attività enzimatica. É quella struttura che serve a rompere i

legami peptidici che sono quei legami che tengono uniti gli aminoacidi. Se una proteina non serve

più perchè non ha raggiunto la struttura tridimensionale giusta e quindi deve essere rimossa,questa

proteina deve essere riconosciuta tra la miriade di tutte le altre proteine che invece non devono

essere rimosse. Il riconoscimento è l'ubiquitina.Le proteina che devono essere degradate perchè non

sono funzionali vengono legate a un piccolo polipeptide che si chiama ubiquitina.Quindi

l'ubiquitina è un piccolo polipeptide che viene attaccato alle proteine che devono essere indirizzate

al proteasoma. Quindi,le proteine che vengono indirizzate al proteasomasi dice che vengono

ubiquitina,cioè legata a questo polipeptide tante volte.Quindi le proteine poliubiquinate sono quelle

proteine che vengono poi indirizzate al proteasoma. Tre enzimi agiscono in sequenza e si chiamano

E1,E2 e E3, questi tre enzimi trasferiscono l'uno verso l'altro l'ubiquitina fino a che questa

ubiquitina non arriva alla proteina. Quindi la cellula per poliubiquinare una proteina sfrutta questi

tre enzimi che agiscono in successione che sono chiamati E1,E2 e E3. L'ubiquitina prima si lega

all'enzima E1,poi l'enzima E1 trasferisce l'ubiquitina all'enzima E2 e l'enzima E2 trasferisce

l'ubiquitina all'enzima E3 ed è l'enzima E3 che poi trasferisce l'ubiquitina alla proteina che deve

essere degradata. Questo trasferimento dell'ubiquitina alla proteina da degradare non avviee una

volta sola ma viene fatta tante volte,per cui la proteina che deve essere degradata si trova a essere

legata a più ubiquitine,per cui si dice che le proteine che devono essere degradate sono

poliubiquinate. In particolare,l'ubiquitina si lega alla cisteina dell'enzima E1 alla cisteina

dell'enzima E2 e E3 e poi a livello della proteina che deve essere degradata si lega a una lisina.

Soltanto le proteine che sono poliubiquinate vengono indirizzate al proteasoma, queste proteine

poliubiquinate vengono inserite all'interno del proteasoma,le ubiquitine vengono lasciate

fuori,vengonostaccate dalla proteina che deve essere degradata e poi verranno riutilizzate per

poliubitinare altre proteine da degradare. Quindi, soltanto la proteina che deve essere degradata

entra nel proteasoma.Quando la proteina deve essere degradata raggiunge la porzione centrale del

proteasoma che ha l'attività proteasica cioè scissione dei legami peptidici e a livello di questa parte

centrale si ha la rottura dei legami peptidici che tengono uniti gli aminoacidi in forma di peptide da

degradare e il polipeptide viene trasformato da una catena polipeptidica a singoli aminoacidi che

escono dalla porzione sottostante del proteasoma e in questo modo la proteina viene degradata

completamente in singoli aminoacidi.

Esistono dei controlli traduzionali che regolano quanta proteine deve essere tradotta.Quando si è

parlato della struttura di un rna messaggero maturo,è stato detto che nelle cellule eucariote è

formato da tre strutture che sono una porzione centrale che è la porzione codificante della proteina

cioè la cosiddetta la regioe dell'rna messaggero che contiene l'informazione che deve essere tradotta

in proteina durante il processo di traduzione (codeon region). Ci sono poi delle regioni che sono

state chiamate 5' UTR e 3' UTR che fiancheggiano la regione che contiene l'informazione genica

per la traduzione in proteina che non sono tradotte.Utr significa regioni non tradotte e che quindi

sono regioni che non contengono l'informazione genica necessaria per la formazione di una proteina

ma sono regioni di regolazione,di regolazione soprattutto per la traduzione perchè sia la porzione 5'

UTR sia la porzione 3' UTR possono formare delle strutture a forcina. Queste strutture a forcina,

sono strutture che possono regolare la formazione di un rna messaggero e quindi sono quelle che

sono alla base del controllo traduzionale. Un esempio di controllo traduzionale di due proteine che

presentano queste due strutture 5' UTR e 3' UTR. Queste proteine sono cinvolte nel metabolismo

del ferro e sono la ferritina e il recettore della transferrina. La ferritina è una proteina che serve

come deposito di ioni ferro.Per cui,è una proteina che presenta dei siti di òegame per il ferro. Può

legare fino a 4500 ioni ferro. La ferritina è una proteina presente nel fegato,che serve a captare

dall'esterno il ferro,dal sangue e ingloba il ferro. Poi questo ferro viene utilizzato tutte le volte che

deve essere sintetizzato quegli enzimi che contengono ferro oppure proteine che contengono ferro

tipo l'emoglobina. La transferiina invece è una proteina che circola nel sangue e che serve a captare

il ferro presente nel sangue. Per cui,questa transferrina se si lega al ferro deve essere poi legata a

una proteina presente sulla membrana plasmatica per poi questo ferro essere riportato all'interno

della cellula. Sia la ferritina che il recettore della transferrina presentano sulle regioni uno sulla

regione 5' fosfato e l'altro sulla regione 3' OH presentano delle strutture a loop,che sono delle

strutture cje si chiamano IRE,cioè di risposta al ferro. Questi ire non sono altro che strutture a

forcina che sono presenti sugli rna messaggeri della ferritina e sul recettore della transferrina.

Però,sull'rna messaggero della ferritina questa struttura a loop si trova nella regione 5' UTR,nel

recettore della trasferrina questa struttura a loop si trova nella regione 3' UTR.Quando in circolo c'è

poco ferro in circolo, succede che per una questione di sopravvivenza l'organismo tende a cercare il

ferro dappertutto,per cui cerca e produce quella proteina che riesce a captare il ferro. Per cui quando

non c'è il ferro a questa struttura IRE, questa struttura all'estremità 3' OH del trecettore della

transferrina si lega questa proteina che si chiama aconitasi citosolica che rende l'rna messaggero del

recettore della transferrina stabile. Stabile vuol dire che non viene attaccato da nessuna ribonucleasi.

Per cui viene tradotta. Viene tradotta perchè l'organismo ha bisogno di tradurre quelle proteine che

servono a captare e a legare anche quel poco ferro che c'è in circolo. Dall'altra parte quando il ferro

è poco la ferritina che costitusce la proteina deposito di ferro non c'è bisogno di essere tradotta

perchè c'è poco ferro per cui perchè la cellula deve utilizzare energia ATP per produrre una proteina

di cui non c'è bisogno perchè non c'è ferro a cui lei si deve legare. Per cui nell'rna messaggero della

ferritina questa volta a livello dell'estremità 5' UTR c'è questa regione IRE,questa struttura a loop a

cui si lega l'aconitasi citosolica,che blocca la traduzione dell'rna messaggero della ferritina. Perchè

la presenza di questa struttura a loop blocca lo scivolamento dei ribosomi che dovrebbero tradurre

quell'rna messaggero. Quindi la ferritina non viene tradotta. In caso di ferro in eccesso, quando il

ferro in circolo non è poco ma è tanto, succede che gli ioni ferro in eccesso si legano alla aconitasi

citosolica legata alla struttura a forcina dell'estremità 5' UTR dell'rna messaggero della ferritina,

rimuovono il blocco di traduzione. Per cui,il ferro che si lega all'aconitasi citosolica la stacca dalla

struttura a loop,la struttura a loop poi viene tolta da degli enzimi appositi e quindi viene rimosso il

blocco di scorrimento dei ribosomi a partire dall'estremità 5'.In questo modo l'rna messaggero della

ferritina viene tradotto. Quindi, viene sintetizzata la proteina perchè in quel momento c'è bisogno

della proteina ferritina perchè c'è tanto ferro quindi c'è bisogno della ferritina per legare il ferro. Nel

caso del recettore della transferrina,essendo tanto ferro in circolo non c'è bisogno di tradurre una

proteina che serve a captare il ferro e quindi anche qui il ferro si lega all'aconitasi citosolica legata

all'estremità 3' UTR presente nella regione 3' OH dellrna messaggerp la rimozione di questo enzima

fa si che venga esposta una regione del dna del recettore della transferrina che è soggetta all'azione

della ribonulceasi per cui si ha il taglio dell rna messaggero,l'rna messagero viene degradato e

chiaramente non viene tradotto il recettore della transferritna.

Le mutazioni possono essere indotte o spontanee.Spontanee si formano spontaneamente indotte ci

sono degli agenti mutageni che le producono,es. Amianto,brumuro di etidio(induce mutazioni

proprio a livello del dna). Le mutazioni che possono avvenire a livello del dna possono essere

fondamentalmente di tre tipi:

1. mutazioni geniche o puntiformi , sono quelle mutazioni che modificano il significato

dell'informazione genica contenuto nel dna,perchè viene modificata proprio la sequenza

nucleotidica.

2. mutazioni cromosomiche, alterano la struttura dei cromosomi, per esempio viene amplificata

una regione del cromosoma per cui quella regione nel cromosoma anziche esserci una volta

è ripetuta due volte oppure un pezzo di cromosoma si sposta da un cromosoma all'altro

oppure i cromosomi perdono delle regioni perchè ci sono delle delezioni di cromosomi.

3. mutazioni genomiche, sono mutazioni che modificano il numero dei cromosomi. Tutte

quelle mutazioni genomiche che mutano il numero di cromosomi sono mutazioni dell'assetto

cromosomico. Una tra le più famose è la sindrome di Down,che è causata dalla presenza di

tre cromosomi 21 anzichè due. Per cui, chi è affetto dalla sindrome di Down anziche avere

46 cromosomi ne ha 47.Poi ci sono le polipldie anzichè avere una coppia di cromosomi ce

n'è un cromosoma solo.

Le mutazioni geniche o puntiformi possono essere di tre tipi:

• Mutazioni di sostituzione, sono causate dalla sostituzione di una base con un'altra.La

sostituzione di una base con un'altra del dna altera il significato dell'informazione nel dna.

• Delezione, è la perdita di una base all'interno del dna.

• Inserzione, è l'aggiunta di una base ,dove per base si intende nucleotide .

Quando avviene una mutazione per sostituzione o delezione o interzione viene trascritto un rna

messaggero e poi tradotto in proteina. Quando avviene una mutazione per sostituzione,si possono

avere tre tipi di mutazione:

• Mutazioni silenti, le mutazioni silenti sono mutazioni che non portano alla modifica della

sequenza aminoacidica della proteina.Le mutazioni silenti sono delle mutazioni in cui anche

se viene mutato un nucleotide con un altro cambia il codone nell'rna messaggero.Quel

codone codifica per lo stesso aminoacido. Quello che avviene a livello della proteina è

silente perchè la sequenza nucleotidica ha si cambiato una base con un'altra base,ha si

cambiato codone ma il codone mutato codifica sempre per lo stesso aminoacido. Per cui

nella proteina questa mutazione è silente perchè non ha nessun effetto.

• Mutazioni missenso,sono mutazioni in cui viene alterata la sequenza degli aminoacidi della

proteina. Sono mutazioni in cui la sostituzione di un nucleotide con un altro. Ad esempio

adenina al posto di una guaninaporta alla formazione di un codone differente da GGC che

codifica per la glicina mentre sostituendo la G con la adenina viene AGC si ha la formazione

di un codone differente che codifica per la serina. Per cui quando questo rna messaggero

verrà tradotto durante il processo di traduzione.Se il ribosoma arriverà a leggere il codone

mutato che corrisponde a un aminoacido differente che in questo caso è la serina invece

della glicina.In questo caso,si ha la formazione di una proteina che ha un amminoacido

differente rispetto a quello della proteina nativa. Anche il cambio di un singolo aminoacido

può generare delle patologie.Per esempio,una patologia che è generata dalla sostituzione di

una base con un'altra e porta all'inserzione di un aminoacido al posto di un altro è quello che

succede nell'ANEMIA FALCIFORME. L'anemia falciforme è una patologia che colpisce i

globuli rossi per cui i globuli rossi dei pazienti che hanno l'anemia falciforme presentano

questa struttura a falce. L'anemia falciforme è causata dalla sostituzione di una base con

un'altra in particolare sull'rna messaggero che codifica una subunità dell'emoglobina, la

timina viene sostituita con l'adenina. Per cui, nell'rna messaggero si forma anzichè il codone

CAA che codifica il glutammato,si forma il codone GUA che codifica per la valina.

• Mutazioni nosenso, sono quelle mutazioni che portano alla trasformazioni di un codone che

codifica un aminoacido in un codone di stop. É una mutazione in cui la sostituzione di una

base con un'altra genera un codone che non richiama alcun aminoacido,un codone che non

codifica nessun aminoacido è un codone di stop. Quindi, la sostituzione di una base con

un'altra genera la formazione di un codone di stop.Quando poi questo rna messaggero verrà

tradotto succede che quando il ribosoma legge questo codone di stop che è il codone di

AGG, la traduzione viene bloccata. Quindi come evento finale sarà prodotta una proteina

più corta rispetto a quella matura. Essendo una proteina più corta rispetto a quella nativa

chiaramente è una proteina che non funziona.

Quando si ha la delezione di un nucleotide succede che nell rna messaggero maturo si trova il

codone di inizio AUG e poi dal primo codone di inizio il ribosoma leggerà anche gli altri codoni.

Ogni codone codificherà un aminoacido. Supponiamo che a livello del codone UUU che codifica la

fenialanina venga perso l'ultimo urascile. Succede la struttura traduzionale il ribosoma leggerà in

maniera corretta il codone fino a che non incontrerà il codone che ha perso un nucleotide.Da quel

codone in poi i codoni verranno letti tutti in maniera sfalsata perchè questo codone che era UUU

verrà letto come UUG, il codone successivo non verrà letto come GGC ma ma verraà letto come

GCG.Quindi dal punto in cui è stato tolto un nucleotidi si ha il cosiddetto FRAMESHIP cioè lo

scivooamento della fase di lettura dei codoni. Siccome i codoni vengono letti in un modo totalmente

differente rispetto a come vengono letti nell'rna messaggero non mutato,dalla lettura del codone

dove ci è stata la delezione si ha l'inserzione della proteina che viene tradotta in aminoacidi

totalmente differenti rispetto a quelli dell'rna messaggero non mutato. Si ha la produzione di un

aproteina totalmente alterata. Questo sia nel caso si abbia una delezione sia nel caso si abbia una

inserzione di nucleotide. Se viene inserito un nucleotide anche in questo caso ad esempio viene

inserito una C a livello dell rna messaggero,il codone che vengono letti saranno GUC però mentre

in quello normale quel codone viene letto CCU dove c'è stata l'inserzione della citosina si ha la

lettura del codone CCC.

DESTINO POST-TRADUZIONALE DELLE PROTEINE

La traduzione per qualunque sia il tipo di proteina comincia sempre nel citoplasma a partire dai

ribosomi che si trovano nel citoplasma e poi da lì viene smistata in tutti i siti intracellulari. La

traduzione di qualunque proteina comincia sempre dai ribosomi liberi nel citoplasma.Per cui l'rna

messaggero maturo esce dal nucleo entra nel citoplasma e poi è nel citoplasma che comincia la

traduzione di tutte le proteine. Poi,le proteine possono essere smistate in due vie differenti: la via

citopalsmatica e la via secretoria. La via citopalsmatica è la via di smistamento delle proteine in cui

le proteine vengono smistate o nel citoplasma e quindi vengono tradotte e rimangono nel

citoplasma, oppure vengono mandate al nucleo,ai perossisomi e nellle celllule vegetali anche ai

cloroplasti. Le proteine che vengono indirizzate nella via citoplasmatica vengono trasferite nel

luogo finale dove funzionino attraverso un meccanismo post traduzionale vuol dire cioè che prima

vengono tradotte dopo che sono state tradotte tutte vengono prese e trasportate nel nucleo nel

mitocondrio e nei perossisomi e nelle cellule vegetali nei cloroplasti. La via secretoria ,invece,è la

via che seguono quelle proteine che hanno come destino finale la membrana plasmatica,i lisosomi

oppure le vescicole di secrezione. Queste vescicole di secrezione sono quelle vescicole che poi si

fondono con la membrana plasmatica e riversano le proteine nell'ambiente citopslmatico. Per cui,

tutte quelle proteine che si trovano nella via secretoria,sono quelle proteine che andranno a far parte

della membrana plasmatica, del lisosoma o verranno riversate nell'ambiente extracellulare. Le

proteine che devono essere riversate all'esterno sono tutte le immunoglobuline di natura proteica

oppure tutte quelle proteine che fanno parte della matrice extracellulare tipo per esempio il

collagene. IL collagene, è una delle proteine che fa parte dell'ambiente extracellulare. É una

proteina che viene secreta dalla cellula nell'ambiente extracellulare e deve costituire la matrice

extracellulare cioè quella struttura all'esterno della cellula con cui tutte le celllule prendono

contatto a eccezione del sangue. A differenza delle proteine della via citoplasmatica che vengono

importate nei distretti finali con un meccanismo di tipo postraduzionale quindi dopo che sono state

tradotte vengono trasportate nl loro luogo finale di destinazione, le proteine della via secretoria

vengono indirizzate verso i loro compartimenti finali attraverso un meccanismo di tipo

cotraduzionale,cioè mentre queste proteine vengono prodotte cioè mentre sono ancora attaccate ai

ribosomi viene presa tutta la struttura del ribosoma e trasportata nella via secretoria von un

meccanismo di tipo cotraduzionale. La via secretoria passa dal reticolo endoplasmatico all'apparato

di Golgi e poi da lì le proteine attraverso delle vescicole di secrezione vengono veicolate alla

membrana plasmatica al lisosoma oppure vengono inserite nelle vescicole di secrezione e mandate

all'esterno della cellula nell'ambiente extracellulare con un meccanismo di tipo cotraduzionale. Le

sequenze segnale sono delle piccole sequenze di aminoacidi che indicano il destino di una proteina.

Quindi mentre una proteina viene tradotta vengono generati anche anche questi peptidi segnali.

Questi peptidi segnale indicano il destino che deve seguire una proteina,perchè a seconda del

peptide segnale che hanno queste proteine verranno veicolate nei mitocondri nel nucleo oppure

verso la via secretoria, verranno trasportate verso il reticolo endoplasmatico. I peptidi segnale si

possono trovare all'estremità N terminale e generalmente quando si trovano all'estremità N

terminale di una proteina vengono tagliati. Quindi, i segnali vengono rimossi e si trovano

all'estemità Nterminale nelle proteine che vengono veicolate al reticolo endoplasmatico nei

mitocondri e nei cloroplasti nella cellula vegetali. Quando questi peptidi segnale di trovano

all'estemità N terminale quando viene raggiunta la destinazione della proteinca c'è una peptidasi un

enzima che rimuove questi peptidi segnale dal polipeptide che gli serve solo per essere veicolato.

Oppure questi peptidi segnali possono essere interni per esempio nelle proteine che vengono

trasportate dal citoplasma al nucleo e dal nucleo al citoplasma presentano questo peptide segnale

interno oppure questo peptide segnale può essere all'estremità C terminale. Spesso quando si

trovano i peptidi segnale all'estemità C terminale restano nella proteina e non vengono tagliati e di

sicuro quando questi peptidi segnali si trovano all'interno della proteina non vengono mai tagliati.

Per esempio tutte le proteine che devono entrare dal nucleo al citoplasma o dal citoplasma al nucleo

hanno segnali interni alla proteina che rimangono. Il trasporto vescicolare è un trasporto in cui le

proteine vengono trasportate all'interno di vescicole,in cui le proteine vengono trasportate dal

reticolo plamsatico al Golgi ,alla membrana plasmatica oppure dal Golgi ai lisosomi e dalla

membrana plasmatica ai lisosomi.Le vescicole sono delle strutture circolari formate da membrana

cave al loro interno e al loro interno essendo cave contengono le proteine che devono essere

trasportate da un compartimento a un altro. Queste vescicole si formano per estroflessione per

gemmazione della membrana di un compartimento donatore. Ad esempio,gemmano dal reticolo

endoplasmatico, si staccano dal reticolo endoplasmatico e si fondono con la membrana di un

compartimento accettore,che può essere l'apparato di Golgi,fondendosi questa vescicola contenente

le proteine che devono trasportata fondendosi nella membrana del compartimento bersaglio rilascia

nel compartimento bersaglio il suo contenuto.

La via citoplasmatica è quella via di smistamento delle proteine in cui le proteine vengono veicolate

dopo che sono state tradotte,dopo che la loro traduzione è terminata con un meccanismo di tipo

postraduzionale vengono veicolate nel nucleo e mitocondrio e nei persossisomi. Le proteien che

fanno parte della via citoplasmatica vengono tradotte sui ribosomi liberi nel citoplasma.QUesto

polipeptide può rimanere nel citosol oppure essere veicolato in uno degli organelli finali. Il nucleo è

circondato negli eucarioti da una membrana che non isola totalmente il nucleo dal citopalsma

perchè la membrana nucleare presenta delle aperture,che is chiamano pori nucleari. Questi pori

nucleari permettono il passaggio per diffusione di proteine senza che questo passaggio sia regolato

però le proteien devono avere un peso molecolare fino a 60Kda.Quindi, proteien che hanno peso

molecolare fino a 60 kDa possono attraversare senza nessuna sequenza segnale liberamente i pori

nucleare. Proteine che invece hanno un peso molecolare maggiore di 60kDa sono trasportate in

maniera attiva con un trasporto regolato attraverso i pori nucleari. Dal nucleo al citoplasma passano

delle molecole di acidi nucleici l'mrna,iltRNA I Mirna sotto forma di premiRNA conun meccansimo

di trasporto di tipo attivo. Quando si parla di proteine il cui trasporto attovp passa dal citoplasma al

nucleo ,queste proteine contengono delle sequenze segnale di importazione nucleare. Quindi

contengono delle sequenze aminoacidiche che gli permettono di essere riconosciuti da delle

proteine ch epoi si legheranno a queste proteine da trasportare e che porteranno queste proteine dal

citoplasma al nucleo. Questi segnali di localizzazione nucleare o di importazione nucleare si

trovano all'interno della proteina e quindi non vengono tagliati. La proteina come tutti questi tipi di

trasporto viene trasportata nel nucleo attraverso un meccanismo di tipo postraduzionale. Il trasporto

di proteine dal citoplasma al nucleo avviene grazie al riconoscimento e all'unione di queste

sequenze segnale che vengono riconosciute da parte dei recettori di trasporto nucleare. Per cui, tutte

queste sequenze di localizzazione nucleare vengono riconosciute da dei trasportatori che

riconoscono e si legano a queste sequenze segnale e quindi si legano alla proteina,che viene

chiamata cargo che deve essere trasferita dal citoplasma al nucleo. Il riconoscimento di queste

sequenze di localizzazione nucleari può essere diretto con questi trasportatori oppure può essere

mediato da una proteina adattatrice. Il riconoscimento di queste sequenze segnale interne delle

proteine che devono essere trasportate dal citoplasma al nucleo può essere diretto.Quindi, i recettori

di importazione della membrana possono riconoscere e legarsi direttamente a questa sequenza

segnale oppure può essere indiretto perchè ci possono essere delle proteine adattatrici che si legano

alle sequenze segnale della proteina che deve essere trasportata e poi è questa proteina adattatrice

che si lega al recettore di importazione nucleare. Tutto questo avviene sia in un senso che nell'altro

quindi proteine che devono essere trasportate dal citoplasma al nucleo hanno sequenze di

importazione nucleare e proteine che devono essere trasportate dal nucleo al citoplasma presentano

dei segnali di esportazione nucleare che vengono riconosciuti e a cui si legano dei recettori di

esportazione nucleare. Nel trasporto nucleo/citoplasma,citoplasma/nucleo, interviene una proteina

monomerica che si chiama RAN.Questa proteina Ran è una proteina G monomerica si chiama

proteina G perchè si lega al GTP o al GDP. É monomerica perchè è formata da una sola subunità al

contrario delle proteine G trimeriche,che sono invece formate da tre subunità alfa,beta e gamma e

sono quelle che sono legate alla trasduzione del segnale da parte dei recettori accoppiati a proteine

G. Questa proteina Ran si può trova in due stati: uno stato attivo in cui la proteina Ran è legata alla

guanosina trifosfato (GTP) oppure in uno stato inattivo in cui la G proteina Ran è legato alla

guanosina difosfato. Ci sono altre due proteine,che si chiamano Gap e Gef. La sigla Gap sta per

GTPasi activated protein quindi proteina che attiva l'attività GTPasica e infatti Gap fa passare la

proteina G legata al GTP alla proteina G legata al GDP. Quindi Gap attivando l'attività GTPasica di

Ran induce l'idrolisi della guanosina trifosfato e la sua trasformazione in guanosina di fosfato.

Quindi fa passare la Ran dalla forma attiva legata alal GTP alla forma inattiva legata al GDP. Gef

invece fa passare Ran inattivo e quindi legato alla GDP in forma attivo legato a GTP,perchè Gef

vuol dire fattore di scambio della proteina GtPasica quindi Gef induce lo scambio GDP/GTP. La

Ran gef e la Ran-Gap shanno una maggiore concentrazione una nel citoplasma e una nel nucleo. Per

cui,nel citoplasma è maggiormente concentrata la Gap-Ran, quella proteina che attiva l'attività

Gtpasica di Ran e infatti fa passare Ran legato al GTP in Ran legato al GDP.QUindi, nel citoplasma

è maggiore la concentrazione di ran gap e così è maggiore la concentrazione di ran inattivo,cioè

Ran legato a GDP. Nel nucleo avviene il contrario, è presente Ran Gef.Quindi Gef induce lo

scambio di Ran legato a GDP con Ran legato a GTP. Questo è importante quando c'è il trasporto

nucleo -citoplasma delle proteine. Dal citoplasma ,la proteina che ha il segnale di localizzazione

nucleare che deve essere trasportata dal citoplasma al nucleo. Questa proteina si lega al

trasportatore di importazione nucleare.Il recettore di importazione nucleare lega la proteina che

deve essere trasportata e le fa attraversare il poro nucleare. All'interno del nucleo, il trasportatore si

lega alal Ran GTP.Il trasportatore con la proteina che ormai è nel nucleo si lega a RanGTP. IL

legame del trasportatore a RanGTP induce la dissociazione della proteina che ormai è nel nucleo dal

trasportatore . Quindi si forma il complesso RanGTP con il trasportatore che passa nel citoplasma e

nel citoplasma si ha la trasformazione di Ran legato al GTP a Ran legato al GDP.Quindi Ran passa

da essere attiva a essere inattiva. Ran inattiva induce la dissociazione di Ran dal recettore

dell'importazione nucleare che a questo punto torna allo stato libero e può riformare un'altra volta il

ciclo. La stessa cosa viene al contrario quando le proteine passano dal nucleo al citoplasma.Dal

nucleo al citoplasma RanGTP si lega alla proteina che deve essere trasportata che ha il segnale di

esportazione nucleare e al trasportatore che serve per trasportare la proteina dal nucleo al citoplama.

Si forma quindi un tricomplesso formato da RanGTP la proteina che deve essere trasportata dal

nucleo al citoplasma e il recettore di esportazione nucleare. Una volta, arrivato nel

citoplasma,questo tricomplesso passa attraverso i pori nucleari una volta arrivato nel

citoplasma,Ran GTP attivo viene trasformato attraverso la RANGap in RanGDP che induce la

dissociazione del cargo che deve essere trasportato nel citoplasma e che ormai è arrivato nel

citoplasma RanGDP e il recettore di esportazione nucleare. Cosicome vengono veicolate attraverso

un trasporto postraduzionale le proteine verso il nucleo, così anche nel mitocondrio le proteine

devono essere veicolate all'interno del mitocondrio avviene questo trasporto mediante un

meccanismo di tipo postraduzionale. All'interno di un mitocondrio,le proteine possono essere

inserite nella matrice mitocondriale oppure nella membrana esterna,membrana interna e nello

spazio intermembranario. Tutte queste proteine che devono essere veicolate all'interno del

mitocondrio qualunque sia la loro localizzazione finale contengono una sequenza segnale.Una

sequenza segnale che quando la proteina viene inserita nella matrice mitocondriale si trova

all0estremità N-terminale e viene rimossa una volta che la proteina ha raggiunto la destinazione

finale. Mentre quelle proteine che devono essere inserite nello spazio intermembranario, oppure

nella membrana esterna o membrana interna del mitocondrio presentano una sequenza segnale

interna che non viene rimossa. Sulla membrana mitocondriale esterna,ci sono due complessi

proteici sulla membrana mitocondriale interna ci sono tre complessi proteici. Sulla membrana

mitocondriale esterna c'è un complesso TOM e un complesso SAM. Il complesso TOM ha un

canale di traslocazione e serve a far passare le proteine attraverso la membrana mitocondriale

esterna mentre il complesso SAM è una specie di chaperone molecolare perchè aiuta le proteine che

devono essere inserite a ripiegarsi correttamente.Sulla membrana mitocondriale interna ci sono

invece i complesso TIM, che sono il complesso TIM22 e il complesso TIM23.Questicomplessi TIM

servono a far passare (hanno dei canali di trasferimento) le proteine attraverso la membrana

mitocondriale interna. Mentre il complesso OXA presente sulla membrana mitocondriale interna

aiuta l'inserimento di quelle proteine che devono essere inserite a livello della membrana

mitocondriale interna. Es. Trasportatori catena respiratoria (fosforilazione osssidativa),ATPasi.

Le proteien che vanno al mitocondrio e vanno nella matrice mitocondriale,nelle due membrane o

nello spazio intermembranario, vengono tradotte tutte a livello dei ribosomi liberi nel citoplasma.

Per cui,il traporto di queste proteine avviene con un meccanismo di tipo posttraduzionale.Quando

queste proteine che devono essere inserite nel mitocondrio si trovano nel citoplasma vengono legate

da degli chaperoni molecolari che impediscono che queste proteine acquisiscano la struttura

tridimensionale finale perchè se queste proteine acquisissero la struttura citoplasmatica finale nel

citoplasma,non potrebbero mai passare all'interno del mitocondrio perchè hanno bisogno di

attraversare trasportatori con la loro struttura primaria.Per cui,proteine che devono essere inserite

nella matrice mitocondriale,vengono tradotte nel citoplasma, presentano la sequenza segnale

all'estremità N termianale.Questa sequenza segnale si lega al complesso TOM presente sulla

membrana mitocondriale esterna,che riconosce e si lega a questa sequenza segnale della proteina

che deve essere inserita nella matrice. Questo complesso TOM poi si sposta in prossimità del

complesso TIM 23,che si trova invece sulla membrana mitocondriale interna. Si sposta in maniera

tale che i due canali ch esi trovano uno sul complesso TOM,l'altro sul complesso TIM23 si trovino

l'uno sopra l'altro,in maniera tale che la proteina che è stata inserita nel canale del complesso TOM ,

entra nel complesso TOM e poi viene veicolata all'interno del canale del complesso TIM23. Quando

la proteina entra tutta nella matrice mitocondriale attraverso il complesso TIM23, c'è una peptidasi

del segnale mitocondriale che taglia il peptide segnale che aveva permesso a questa proteina di

essere riconosciuta e diessere veicolata verso il miotcondrio. Per cui, il peptide segnale viene

tagliato dalla peptidasi del segnale all'interno della matrice mitocondriale. A questo punto, la

proteina viene legata a chaperoni molecolari mitocondriali che fanno si che questa proteina

acquisiscala struttura tridimensionale giusta per poter essere funzionale e la proteina mitocondriale

matura a quel punto rimane nella matrice mitocondriale.

Per far entrare una proteina nella membrana mitocondriale esterna sono coinvolti due complessi:il

complesso TOM e il complesso SAM. Tutte due proteine che si trovano sulla membrana

mitocondriale esterna. La proteina che è stata correttamente tradotta nel citosol viene trasferita

attraverso il complesso TOM nello spazio intermembrana,che è quello spazio che si trova la

membrana mitocondriale interna e la membrana mitocondriale esterna. Una volta inserita nello

spazio intermembranario, ci sono degli chaperoni molecolari che hanno la funzione di bloccare

l'acquisizione della struttura tridimensionale da parte della proteina così come avviene nel trasporto

mitocondriale cioè le proteine del trasporto alla matrice mitocondriale. Questi chaperoni molecolari

presenti nello spazio intermembranario si legano a questa proteina e bloccano l'acquisizione della

struttura tridimensionale da parte della proteina,che deve essere inserita nella membrana

mitocondriale esterna. Dopodichè questa proteina non foldata cioè non ha acquisito la struttura

tridimensionale finale cioè non è una proteina funzionale entra nel complesso SAM che aiuta a

ripiegare la proteina in maniera corretta e a inserire questa proteina nella membrana mitocondriale

esterna. I meccanismi con cui vengono inserite nella membrana mitocondriale interna, le proteine

che devono essere inserite nella membrana mitocondriale interna vengono tradotte nel citoplasma e

attraversano la membrana mitocondriale esterna grazie al complesso TOM e poi attraversano il

complesso TIM 23 che è uno dei complessi che si trova a livello della membrana mitocondriale

interna.Dopodichè quando la proteina inserisce il polipeptide segnale allìinterno della metrice

mitocondriale, questa sequenza segnale che si trova al'estremità Nterminale,quindi all'inizio della

proteina viene rimossa da una peptidasi del segnale,da un enzima che riconosce e taglia questa

peptide segnale che si trova a livello della matrice mitocondriale,per cui la proteina a questi punto si

trova a cavallo tra la membrana mitocondriale esterna e interna legatat ai due complessi,al

complesso TOM e al complesso TIM23. Questa proteina oltre a avere il peptide segnale ossia la

sequenza N terminale che la indirizza nel mitocondrio ha anche un'altra sequenza che è una

sequenza di stop del trasferimento perchè è una sequenza che è costituita da aminoacidi idrofobici

quindi è una porzione della proteina che ha la stessa struttura della membrana mitocondriale

interna,che è una struttura formata da fosfolipidi. Questa sequenza di stop del trasferimento indica

che il trasferimento di quella proteina deve essere bloccato. Quindi quando questa sequenza

costituita da aminoacidi idrofobici viene inserita all'interno della membrana mitocondriale interna

viene bloccato il trasferimento perchè questa sequenza è una sequenza di stop del trasferimento e

quindi la proteina si stacca del complesso TOM e dal complesso TIM23 e a questo punto si trova

inserita a livello della membrana mitocondriale interna.Un altro meccanismo con cui le proteine

vengono introdotte nella membrana mitocondriale interna avvengono con lo stesso meccanismo che

abbiamo visto adesso,per cui vengono coinvolti il complesso TOM eil complesso TIM 23,che si

trova sulla membrana mitocondriale interna però la proteina viene inserita nella membrana

mitocondriale interna grazie alla presenza di un'altra struttura proteica che si trova a livello della

membrana mitocondriale interna che è il complesso OXA. Per cui, succede che la proteina che è

stata tradotta nel citoplasma entra dentro al complesso TOM comincia a entrare nel mitocondrio

attraverso il complesso TOM, poi passa attraverso il complesso TIM23 viene tagliata la sequenza

segnale che si trova all'estremità Nterminale e succede che la proteina viene fatta passare totalmente

attraverso i due complessi per cui non resta attaccata alla membrana mitocondriale interna viene

rilasciata nella matrice mitocondriale dove viene legata al complesso OXA. Viene legatat al

complesso OXA che la inserisce a livello della membrana mitocondriale interna. Anche in questo

caso, questa proteina oltre a avere la sequenza segnale al'estremitàche è quella che viene tagliata e

che indirizza la proteina a livello del mitocondrio presenta anche questa sequenza alttamente

idrofobica che è una sequenza di stop del trasferimento ,che indica che quando questa sequenza

idrofobica è stata inserita a livello della membrana mitocondriale interna, il trasferimento della

proteina è stato compiuto. Questo meccanismo avviene sia per proteine che sono prodotte nel

citoplasma ma anche per proteine che vengono prodotte a livello del mitocondrio,perchè il

mitocondrio sono chiamati organelli semiautonomi perchè presentano questa molecola di dna.

Questa molecola di dna che codifica per determinati geni ad esempio codifica per quei geni che

servono al mitocondrio. Quindi ci sono delle proteine che servono al mitocondrio per esempio

alcune proteine che devono essere inserite nella membrana mitocondriale interna che vengono

trascritte e poi tradotte a livello del mitocondrio,perrchè il mitocondrio contiene una molecola di

dna che ha l'informazione genica necessaria per trascrive e poi tradurre queste proteine,che sono

inserite nella membrana mitocondriale interna. Si chiamano organelli semiautonomi e non

totalmente autonomi perchè il mitocondrio riesce a produrre da sè soltanto una parte di tutto

l'apparato proteico di cui ha bisogno. Quelle proteine che vengono tradotte a livello mitocondriale

vengono inserite nella membrana mitcondriale interna grazie al complesso OXA. Per quanto

riguarda lo spazio intermembrana, la proteina arriva dal citoplasma perchè è stata tradotta nel

citoplasma attraversa le due membrane mitocondriali esterna e interna grazie al complesso TOM

che si trova nella membrana mitocondriale esterna e al complesso TIM 23 che si trova sulla

membrana mitocondriale interna viene tagliat la sequenza segnale all'estremità N termianle che è

quella che indirizza le proteine nel mitcondrio.Dopodichè qusta proteina viene staccata dai

complessi TOM e TIM23 e viene rinserita nella membrana mitocondriale interna. Quando però si

tratta di proteina che devono essere inserite nello spazio intermembranario, questa sequenza che è

sempre una sequenza di stop del trasferimento viene riconosciuta da specifici enzimi che tagliano la

proteina a livello di questa sequenza di stop del trasferimento. Per cui l proteina viene tagliata alla

fine di questa sequenza del trasferimento. Quindi la proteina si stacca dalla membrana

mitocondriale interna e rimane all'interno dello spazio intermembranario.

La via secretoria o vescicolare ha una grossa differenza rispetto alla via citoplamatica perchè le

proteine che vengono veicolate nei distretti cellulari attraverso la via citoplamatica vengono

trassportate con un meccanismo di tipo post traduzionale. Quindi, prima vengono tradotte nel

citoplasma e poi vengono veicolate nei distretti del nucleo e del mitocondrio. Le proteine che invece

fanno parte della via secretoria o vescicolare vengono trasferite con un meccanismo di tipo

cotraduzionale.Quindi cotraduzionale significa che vengono trasferite nei vari distretti mentre

vengono tradotte. La via secretoria o vescicolare è costituita da tutte quelle proteine la cui

traduzione inizia nel citoplasma e termina a livello del reticolo endiplasmatico rugoso. Quindi,le

proteine che fanno parte della via secretoria cominciano a essere tradotte sui ribosomi liberi nel

citoplasma e poi a un certo punto viene preso tutto l'apparato traduzionale e viene trasferito sul

reticolo endoplasmatico rugoso dove termina la traduzione della proteina. Da qui poi queste

proteine vengono trasferite a un'altra struttura cellulare che è il complesso di GOLGI. Il complesso

di Golgi che è spazialmente separato dal reticolo endoplasmatico e dal complesso di Golgi le

proteine vengono veicolate in tre distretti differenti,che sono i lisosomi,la membrana plasmatica

oppure vengono inserite in delle strutture circolari costituite da membrana che si chiamano

vescicole. Queste vescicole contengono delle proteine cosiddette proteine di secrezione perchè sono

proteine che non devono restare all'interno della cellula ma devono essere secrete all'esterno. Ad

esempio,gli ormoni(insulina e glucagone) e tutte le proteine che svolgono la funzione all'esterno

(ad esempio il collagene che fa parte della via secretoria) si trovano in vescicole che si fondono con

la membrana plasmatica e rovesciano il contenuto della vescicola all'esterno. Le proteine che

vengono veicolate attraverso la via vescicolare cominciano a essere tradotte sui ribosomi liberi del

citosol e poi vengono trasferite al livello del reticolo endoplamsatico. A livello del reticolo

endoplamsatico le proteine possono essere proteine che fanno parte della membrana del reticolo

endoplamsatico e quindi vengono traslocate sulla membrana del reticolo endoplasmatico oppure

proteine solubili che non hanno come localizzazione finale il reticolo endoplasmatico ma il lume

quindi le strutture del reticolo endoplasmatico,che sono circondate dalla membrana. Sono proteine

solubili che attraversano completamente la membrana del reticolo e sono rilasciate nel lume del

reticolo. Il lume del reticolo è quella zona di spazio compresa tra le membrane che formano il

reticolo stesso. Nella via citoplasmatica la proteina viene completamente tradotta nel citosol,nel

citoplasma e poi trasferita nella destinazione finale con una traslocazione di tipo posttraduzionale

mentre le proteine che fanno parte della via secretoria o vescicolare comiciano a essere tradotte sui

ribosomi liberi nel citoplasma fino a che non viene tradotto un peptide segnale all'estremità N

terminale e questo peptide segnale viene riconosciuto da un'altra proteina che si chiama particella di

riconoscimento del segnale che si lega a questo peptide segnale e trasloca tutta la struttura

traduzionale quindi ribosoma completo e l'rna messaggero legato al ribosoma e anche la catena

polipeptidica nascente, trasferisce tutta questa struttura sul reticolo endoplamsatico. In particolare

succede che quando l'rna messaggero maturo passa dal nucleo al citoplasma attraverso i pori

nucleari,l'rna messaggero comincia a essere tradotto e si forma l'apparato traduzionale. Se si tratta

di una proteina che non deve essere veicolata al reticolo endoplasmatico quindi non fa parte della

via secretoria, questo rna messaggero viene completamente tradotto in proteina.Se invece l'rna

messaggero che viene tradotto codifica per una proteina che invece fa parte della via secretoria

succede che subito a livello dell'estremità Nterminale della proteina nascente si forma un piccolo

frammento di aminoacidi che costituisce la sequenza segnale che indica che quel polipeptide che

viene formato è un polipeptide che poi darà origine a una proteina che nadrà a far parte della via

secretoria.Per cui, questo peptide segnale viene riconosciuto da una proteina che si chiama

particella di riconoscimento del segnale che si lega al peptide segnale.La particella di

riconoscimento del segnale riconosce questa sequenza all'n terminale di questo polipetide

nascente,riconosce che quel peptide segnale è il peptide per il segnale che quella proteina che sta

nascendo deve essere veicolata nella via secretoria e quindi vi si lega. Questa particella di

riconoscimento del segnale è affine e si lega a un recettore per la particella di riconoscimento del

segnale che si trova sulla membrana del reticolo endoplasmatico. Quando tutto l'apparato

traduzionale è trasferito dal citoplasma sul reticolo endoplamsatico succede che continua la

traduzione del polipeptide che entra nel lume del reticolo e il peptide segnale viene tagliato da una

peptidasi del segnale che si trova in prossimità della proteina che deve essere inserita.,sulla

membrana del reticolo plasmatico vicino alla proteina che vien inserita. Quindi taglia l'estremità N

terminale del peptide segnale e a questo punto la proteina si trova nel lume del reticolo.Per entrare

nel lume del reticolo c'è un traslocatore che si trova vicino al recettore a cui si lega la particella di

riconoscimento del segnale.Per cui il recettore che si llega alla particella di riconoscimento del

segnale si trova vicino sulla membrana del reticolo a un traslocatore, una proteina di membrana che

può avere una conformazione aperta o chiusa. Quando è chiusa non passa nessun polipeptide

mentre quando è aperta permette il passaggio del polipeptide attraverso la membrana del reticolo e

quindi il polipeptide entra nel lume. Poi c'è una peptidasi del segnale che taglia il peptide segnale

presente all'estremità N terminale che quindi viene rimosso dal polipeptide ch eè stato tradotto.

Questi traslocatori infatti sono delle strutture proteiche che si trovano vicine al recettore a cui si lega

la prticella di riconoscimento del segnale e che possono essere presenti in due conformazioni: una

conformazione chiusa e una aperta. La conformazione chiusa non permette l'inserimento di nessun

polipeptide èerò quando il recettore della particella di riconoscimento del segnale si lega alla

particella di riconoscimento del segnale induce l'apertura di questo trasportatore che quindi passa da

una conformazione chiusa a una aperta permettendo l'inserimento del polipeptide nascente nel lume

del reticolo. Queto trasportatore si può aprire sia centralmente( può avere una struttura a ciambella)

e quando si apre centralmente permette il passaggio di una proteina che attraversa tutta la

membrana del reticolo plamatico e entra nel lume oppure si può aprire lateralmente e quando si apre

lateralmente permette il trasferimento e quindi il posizionamento della proteina a livello della

membrana del reticolo endoplasmatico. Quindi, in questo modo vengono rilasciate le proteine

all'interno del lume dle reticolo endoplamsatico. Il meccanismo con cui delle proteine entrano nella

membrana del reticolo endoplasmatico è questo perchè queste proteine che devono entrare a far

parte della membrana del reticolo endoplasmatico presentano due sequenze segnale: un peptide

segnale che si trova all'estremità N terminale e che è quello che permette il riconoscimento del

polipeptide e quindi la sua traslocazione dal citoplasma sulla membrana del reticolo e poi un'altra

sequenza che si chiama sequenza di stop del trasferimento che come tutte le proteine che devono

essere inserite all'interno della membrana di qualunque membrana si tratti sono delle sequenze di

stop del trasferimento formate da aminoacidi idrofobi,che quindi hanno una natura giusta per essere

inseriti all'interno di una struttura idrofoba come è una membrana.Quindi queste proteine vengono

inserite nel traslocatore,il peptide segnale viene tolto da una peptidasi del segnale e la proteina viene

inserita viene fatta passare all'interno della membrana del reticolo fino a che non si trova la

sequenza di stop del trasferimento,che indica che la proteina deve essere inserita nella membrana in

questo modo. La regione carbossiterminale all'esterno e la regione NH2terminale nel lume del

reticolo. All'interno della membrana plasmatica ci possono essere proteine monopasso cioè proteine

che attraversano la membrana una volta sola oppure proteine multipasso che attraversano la

membrana più di una volta. Le proteine multipasso o a passo multiplo sono quelle proteine che

vengono inserite all'interno delle membrane plasmatiche più di una volta. Queste proteine sono

caratterizzate dall'avere una sequenza di inzio del trasferimento e una sequenza di stop del

trasferimento ripetute tante volte che permettono alla proteina di attraversare la membrana più di

una volta. Tutte le proteine che vengono tradotte a livello del reticolo endoplasmatico sono proteine

che o possono rimanere nel reticolo e quindi far parte del lume quindi entrare a far parte del lume

del reticolo oppure far parte della membrana del reticolo endoplasmatico oppure sono proteine che

non devono restare nel reticolo endoplasmatico ma devono essere trasferite all'apparato di Golgi.

Vengono tradotte nel reticolo endoplasmatico ma poi sono trasferite al Golgi. Tutte le proteine che

però vengono tradotte a livello del reticolo subiscono un sacco di modificazioni mentre vengono

tradotte a livello del reticolo endoplasmatico tra cui l'N glicosilazione. L'N glicosilazione è l'attacco

di un astruttura glucidica di zuccheri alla proteina nascente. L'N glicosilazione si chiama N

glicosilazione perchè la catena di zuccheri viene legata al gruppo amminico della caterna lateraledi

un aminoacido ben preciso che è l'ASPARAGINA. Però questa asparagina non è una asparagina

qualunque ma deve essere una asparagina che è inserita in una sequenza consenso definita

altrimenti verrebbero nglicosidate tutte le asparagine che si trovano all'interno di una proteina. La

sequenza consenso definita è questa:Asparagina-X-Serina o Asparagina-X-Treonina,dove X è un

aminoacido qualunque L'alberello di zuccheri che viene legato al'estremità N della catena laterna

dell'asparagina è un alberello formato da 14 zuccheri. Questi 14 zuccheri sono due molecola di N-

acetilglucosammina, 9 molecole di mannosio e 3 molecole di glucosio. Quindi l'Nglicosilazion eè

l'attacco di una struttura zuccherina format ada 14 molecole di zucchero che vengono legate al

gruppo amminico della catena laterale di un residuo di asparagina e questi residuo di asparagina

deve essere inserito in una sequenza consenso ben definita che è Asparagina-X-Serina oppure

Asparagina-X-Treonina,dove X può essere un amminoacido qualunque. Questi alberello di zuccheri

è formato da 14 zuccheri di cui 2 molecole di N-acetilglucosammina, 9 molecole di mannosio e 3

molecole di glucosio. Il polipeptide nascente lo Nglicosila un enzima che si chiama

OLIGOSACCARIDE TRASFERASI che si trova in prossimità del punto in cui viene inserito nel

reticolo plasmatico il polipeptide che sta nascendo ossia il punto in cui c'è il trasportatore che fa

entrare le proteine o nel lume o nella membrana del reticolo. L'enzima oligosaccaride transferasi

prende questo alberello di 14 zuccheri e lo trasferisce all'asparagina inserita nella sequenza

consenso ben definita in maniera tale che la proteina venga N glicosilata. Questo alberello di

zuccheri si trova attaccato a una struttura idrofoba che atttraversa tutta la membrana del reticolo

endoplamsatico che si chiama DOLICOLO. È il dolicolo che funziona da donatore di questo

alberello di 14 zuccheri. Il dolicolo è una struttura idrofoba caratterizzata dalla ripetizione di 17 o

21 volte di queste unità isopreniche che attraversano la membrana del reticolo endoplasmatico e che

attacca l'alberello di zuccheri grazie a un punto di fosfato. Quindi l'oligosaccaride transferasi è

quell'enzima che si trova in prossimità del trasportatore e che induce l'Nglicosilazione del

polipeptide nascente. Prende la struttura zuccheri formata dall'unione di 14 zuccheri,lo prende da un

donatore di zuccheri che è il dolicolo. IL dolicolo è questa struttura isoprenica che attraversa la

membrana plasmatica e che lega questa struttura di zuccheri attraverso un ponte di fosfato. Questo

zucchero comincia a formarsi sempre attaccato al dolicolo però dalla parte citoplasmatica.Quindi è

dalla parte citoplasmatica che il dolicolo prima si lega a due gruppi fosfato poi gli vengono attaccati

i primi 7 zuccheri 5 molecole di mannosio e 2 molecole di Nacetilglucosammina dalla parte del

citoplasma dopodichè si ha il capovolgimento di questa struttura per cui il dolicolo con legati questi

7 zuccheri verso il lume del reticolo endoplasmatico e quando si trova nel lume del reticolo

endoplasmatico ccontinua l'aggiunta di questi zuccheri con l'aggiunta di questa struttura zuccherina

formata da 14 zuccheri.Le tre molecole di glucosio sono importanti perchè è attraverso queste tre

molecole di glucosio che inizia il cosiddetto controllo di qualità delle proteine all'internodel reticolo

endoplasmatico. Le proteine all'interno del reticolo vengono Nglicosilate e poi subiscono a livello

del lume del reticolo il cosiddetto controllo di qualità.Il controllo di qualità è un meccanismo

attraverso cui degli chaperoni molecolari che si trovano nel lume o nella membrana del reticolo

endoplasmatico permettono alle proteine che sono state tradotte di acquisire la struttura

tridimensionale corretta in maniera tale che queste proteine possano funzionare. Il mitocondrio ha

degli chaperoni molecolari mitocondriali e anche il reticolo endoplasmatico ha dei propri chaperoni

molecolari perchè le proteine che vengono tradotte a livello del reticolo endoplasmatico devono

funzionare e per poter funzionare devono acquisire la struttura tridimensionale.Per acuisire la

struttura trdimensionale vengono utilizzate all'inizio queste tre molecole di glucosio Queste tre

molecole di glucosio che si trovano alla fine dell'alberello.Delle tre molecole di glucosio ne

vengono staccate due per cui la proteina che deve subire le modifiche in maniera tale che possa

acquisire la struttura tridimensionale resta con una sola molecola di glucosio. Questa molecola di

glucosio serve per legare la proteina che deve essere ripiegata in modo giusto a uno chaperone

molecolare presente nel reticolo endoplasmatico,di cui la calnessina fa parte. La calnessina è solo

un esempio di chaperone molecolare che si trova a livello del reticolo endoplasmatico.Questi

chaperoni molecolari a livello del reticolo riconoscono le proteine che devono essere foldate quindi

devono acquisire la struttura tridimensionale giusta per renderle funzionali attraverso una molecola

di glucosio che è rimasta dalla catena zuccherina che era stata attaccata dalla glicosil transferasi.

Dopodichè lo chaperone molecolare fa passare una proteina allo stato tridimensionale la fa

diventare funzionale e poi la proteina viene mandata dove c'è bisogno. Quindi rimane nel lume se è

una proteina del lume oppure viene mandata all'apparato di Golgi se è una proteina che non deve

rimanere nel reticolo. Se la calnessina non ce la fa una prima volta a far acquisire la struttura

tridimensionale alla proteina del reticolo, succede che questa proteina viene nuovamente legata alla

calnessina che ritenta di far acquisire a questa proteina la struttura tridimensionale giusta. Quando la

calnessina o lo chaperone molecolare fa acquisire la struttura tridimensionale corretta alla proteina

viene tolta anche l'ultima molecola di glucosio. Per cui la proteina che ha raggiunto la struttura

tridimensionale corretta non ha più nè l'alberello di zucchero legato all'asparagina e non ha più

nessuna molecola di glucosio. Infatti l'ultima molecola di glucosio che gli era servita a legarsi allo

chaperone molecolare viene tolta. Se però la proteina non acquisisce la struttura tridimensionale

corretta viene tentato un altro ciclo di riacquisizione della struttura tridimensionale,la molecola di

glucosio che gli era stata tolta viene reinserita.IN questo modo il polipeptide può essere di nuovo

riattaccato alla calnessina e la calnessina o lo chaperone molecolare può ritentare l'acquisizione

della struttura tridimensionale da parte del polipeptide. Se dopo tre volte,la proteina non ha

acquisito la struttura tridimensionale corretta,la proteina viene trasportata dal lume del reticolo nel

citoplasma attraverso un trasportatore e qui la proteina viene poliubiquitinata.Quindi le vengono

attaccate numerose molecole di ubiquitina.La poliubiquitinazione delle proteine è il meccanismo di

riconoscimento che quella proteina deve essere degradata.Quindi la proteina poliubiquitinata viene

trasferita al proteasoma,struttura citoplasmatica che lega le proteine poliubiquinate e le degrada in

amminoacidi singoli,che poi la cellula può riutilizzare per esempio per la sintesi di altre proteine.

SMISTAMENTO DELLE PROTEINE

Il reticolo endoplasmatico rugoso si chiama rugoso per il fatto di avere dei ribosomi che visti al

microscopio elettronico appaiono come puntini neri. Il reticolo endoplasmatico rugoso differisce dal

reticolo plasmatico liscio che non ha i ribosomi. Per cui,la sintesi delle proteine a livelo del reticolo

avviene sul reticolo endoplasmatico rugoso. Il reticolo endoplasmatico liscio ha altre funzioni tipo

per esempio quello di detossificare dai farmaci oppure contiene i depositi di calcio,importanti per la

trasduzione del segnale ed è deputato alla sintesi dei lipidi. Il reticolo plasmatico sia liscio che

rugoso è costituito da tutta una serie di membrane che partono dalla membrana nucleare. Quindi la

membrana nucleare e il reticolo endoplasmatico sono in stretto contatto tra loro,perchè dove finisce

la membrana nucleare comincia la membrana del reticolo plasmatico rugoso o liscio. Mentre l'altro

compartimento membranario che è l'apparato di Golgi è quello che si trova più vicino alla

membrana plasmatica e di fronte al reticolo endoplasmatico con il quale non è in contatto,perchè le

membrane dell'apparato di Golgi sono spazialmente separate da quelle del reticolo.Nonostante

questo il reticolo plasmatico e l'apparato di Golgi possono essere messi in comunicazione tramite la

formazione delle vescicole.Le vescicole sono delle strutture circolari rivestite da membrana che

gemmano da un apparato donatore che in questo caso è il reticolo endoplasmatico e vengono

veicolate verso un compartimento accettore che in questo caso è l'apparato di Golgi. Dall'apparato

di Golgi gemmano tutta una serie di vescicole che possono andare o alla membrana plasmatica e

quindi il contenuto di queste vescicole costituisce strutturalmente la membrana plasmatica oppure

queste vescicole vengono fuse con la membrana plasmatica e il loro contenuto viene riversato

all'esterno oppure dall'apparato di Golgi le vescicole trasportano il materiale a un organello cellulare

che è il lisosoma. La via secretoria è di due tipi che sono la via secretoria costitutiva e la via

secretoria regolata.La via secretoria costitutiva è una via secretoria che avviene sempre,che avviene

in qualunque momento della vita cellulare. La via secretoria regolata è la via secretoria che ha

bisogno di essere regolata da altre molecole e che quindi non avviene sempre. Le vescicole di

trasporto sono vescicole che possono trasportare il materiale dall'interno all'esterno della cellula ma

possono anche trasportare materiale dall'esterno della cellula verso l'interno.Quando viene trasferito

materiale prodotto all'interno della cellula verso l'esterno si parla di via secretoria biosintetica che

trasferisce le proteine che sono state prodotte all'interno della cellula verso l'esterno attraverso un

meccanismo che viene chiamato esocitosi. La cellula può anche prendere materiale dall'esterno e

inserirlo all'interno della cellula.In questo caso si parla di endocitosi. L'endocitosi è quel

meccanismo in cui si ha l'invaginazione della membrana plasmatica.Questa invaginazione induce la

raccolta di materiale che si trova all'esterno della cellula.Questa invaginazione della membrana

plasmatica verrà poi chiusa a formare una vescicola intracellulare che contiene il materiale che la

cellula ha preso dall'esterno e che poi verrà degradato dai lisosomi.

Dal reticolo endoplsmatico gemmano delle vescicole che sono trasportate all'apparato di Golgi.

Dall'apparato di Golgi generaano le vescicole che vanno o verso la membrana plasmatica e qui il

contenuto delle vescicole può diventare unncostituente della membrana plasmatica oppure queste

vescicole si possonofondere alla membrana plasmatica e riversare il contenuto

all'esterno.Dall'apparato di Golgi,ci può essere una via cosiddetta retrograda, una via in cui le

proteine attraverso le vescicole vanno dall'apparato di Golgi verso il reticolo

endoplasmatico.Dall'apparato di Golgi queste vescicole possono andare anche ai lisosomi,formando

delle strutture vescicolari che si chiamano endosomi. Queste vescicole non si spostano in maniera

casuale ma in maniera regolata perchè la loro direzionalità dipende dal loro rivestimento. A

seoonda del rivestimento proteico che hanno queste vescicole queste vescicole sanno dove

direzionarsi. I rivestimenti proteici di queste vescicole sono tre e sono la clatrina e due proteine che

si chiamano CopI e CopII .Le vescicole ricoperte da clatrina si spostano dalla membrana plasmatica

verso i lisosomi.Le vescicole ricoperte di CopI fanno la cosiddetta via retrograda dall'apparato di

Golgi verso il reticolo endoplasmatico e le vescicole ricoperte da CopII fanno la via reticoloe

endoplasmatico apparato di Golgi. Le vescicole rivestite da clatrina sono quelle vescicole che

gemmano dall'apparato del Golgi e vanno verso la membrana plasmatica nella via secretoria

oppure che gemano dalla membrana plasmatica nella via endocitica. Sia per il meccanismo di

endocitosi e esocitosi le vescicole sono rivestite da clatrina. Queste vescicole rivestite da clatrina

sono formati da queste strutture particolari che sono chiamate TRISKELI e ogni trischelio è formato

dall'unione di tre catene pesanti e tre catene leggere. Un trischelio quindi è il monomero che forma

il rivestimento di clatrina e un trischelio è formato dall'unione di tre catene pesanti e tre catene

leggere. Queste trischeli si associano fra loro a formare questa struttura a esagoni e pentagoni che

ricorda quello di un canestro. Queste vescicole so formano da una membrana donatrice.La proteina

che deve essere trasportata (cargo) si lega a un proprio recettore presente sulla membrana

donatrice.Quando la proteina da trasportare si lega al proprio recettore presente sulla

membrana,vicino al recettore vi si legano delle proteine che vengono chiamate proteine adattatrici

che servono a aattaccare i trischeli di clatrina. Questi trischeli di clatrina si lega alle proteine

adattatrici che si trovano in prossimità del recettore di quella proteina che deve essere trasportata e

che deve essere inserita nella molecola che deve gemmare da quel compartimento. Via via che le

molecole o le proteine che devono essere trasportate si legano ai proprio recettori si formano una

estroflessione della membrana che rimane attacca alla membrana plasmatica o danatore attraverso

uno stelo. Questo stelo è formato da una proteina che si chiama dinamina che circonda questo

restingimento della membrana plasmatica prima della vescicola e la dinamina si attorciglia sempre

di più su questo stelo e permette la dissociazione della vescicola rivestita da clatrina dalla

membrana doantrice. Per cui, dalla membrana donatrice fino a che a un certo punto per azione dell

dinamina questa strozzatura viene rotta e si ha una liberazione della vescicola rivestita da clatrina.

Questa vescicola rivestita da clatrina poi andrà nel compartimento dove deve essere indirizzato

prima però perde le proteine adattatrici e il rivestimento di clatrina in maniera che sia le proteine

adattatrici che la clatrina che erano state utilizzate per formare la vescicola possano essere

riutilizzate per formare altre vescicole.A seconda di quello che trascportano,queste vescicole

gemmano in punti diversi. La gemmazione delle vescicole è regolata da un fosfolipide,che è il

fosfatildinositolo. Il fosfatildinositolo (PIP) è un fosfolipide che ha come scheletro il glicerolo e al

glicerolo sono legati due acidi grassi attraverso il gruppo carbossilico e al terzo atomo di carbonio è

legato l'inositolo che è legato al glicerolo attraverso il gruppo fosfato. Per cui il fosfolipide diventa

fosfatilinositolo. Il fosfatildinositolo presenta una struttura ciclica a sei atomi di carbonio che può

essere fosforilata in varie posizioni. Per cui,grazie all'zione di chinasi e può essere fosforilata grazie

all'azione di fosforilasi e si formano un sacco di tipi di fosfatildinositolo. LA presenza a livello delle

membrane dei compartimenti donatori da cui gemmano le vescicole regolano la gemmazione di

determinati tipi di vescicole che contengono determinati tipi di proteine. A secpnda delle proteine

che sono contenute nelle vescicole e che regolano vari processi es. Endocitosi,esocitosi costitutiva e

esocitosi regolata queste vescicole gemmano in punti differenti che sono regolati dal tipo di

fosfolipide presenti inquella zona. Quidni,il tipo di fosfolipide presente in una membrana regola il

tipo di vescicola cioè regola cosa deve contenere quella vescicola. Le vescicole migrano da un

compartimento donatore e migrano a un compartimento accettore. La fusione delle vescicole con il

compartimento accettore viene regolata da tre tipi di proteine che sono le proteine Rab, effettori di

Rab e le proteine Snare. Le proteine Rab sono un tipo di proteine sono delle Gproteine

monomeriche e sono delle proteine che si trovano sulle vescicole. Chiaramente ci sono più di 60

isoforme di queste proteine Rab proprio perchè ogni tipo di vescicola ne ha una. Gli effettori di Rab

sono delle proteine che prendono contatto con Rab e si trovano invece nelle membrane di

destinazione. Sulle membrane che devono accettare le vescicole.Le proteine Snare invece sono due

proteine di due tipi che sono le T-snare e le V-snare. Le V-Snare sono presenti nelle membrane delle

vescicole perchè V sta per vescicola mentre le T-Snare sono delle proteine che stanno sulla

membrana bersaglio,t sta per target. La fusione delle vescicole con una membrana accettrice viene

regolata da questi tre tipi di proteine. Una vescicola che contiene il cargo legato al proprio recettore

presenta le Vsnare proteine che si trovano nella vescicola e proteine Rab che sono delle Gproteine

monomeriche,che allo stato attivo sono legate al GTP .Queste vescicole vengono indirizzate in base

al loro rivestimento sulla membrana di destinazione dove ci sono gli effettori di Rab,quelle proteine

che si legano a Rab.Infatti Rab prende contatto con gli effettori di Rab presenti sulla membrana

bersaglio.In questo modo,si ha prima l'attracco e poi il cosiddetto ormeggio. Per cui l'effettore di

Rab fa avvicinare la vescicola alla membrana di destinazione,avvicinando la vescicola alla

membrana di destinazione a questo punto le altre proteine,le Vsnare che si trovano sulla vescicole

prendono contatto con le T-snare che invece si trovano sulla membrana di sestinazione.Il contatto V-

snare T-snare induce il contatto tra la membrana di destinazione e la vescicola e induce la fusione

delle due membrane,la fusione fa si che la membrana della vescicola diventi una porzione della

membrana di destinazione e il cargo cioè la proteina si ritrova nel punto in cui è destinata. Nel

passaggio di queste vescicole dal reticolo endoplasmatico al Golgi si forma una struttura

membranaria intermedia che si chiama Ergit ossia compartiemnto intermedio tra il reticolo

endoplasmatico e l'apparato di Golgi. Quindi dal reticolo endoplasmatico si formano delle vescicole

che vanno verso il Golgi e queste vescicole fanno parte della via biosintetica secretoria e dal Golgi

possono riformarsi delle vescicole che riportano le proteine verso il reticolo endoplasmatico in una

via che viene chiamata via di recupero . Proteine che devono stare nel reticolo che hanno bisogno di

modifiche posttraduzionali che devono avvenire dopo che questa proteina èstata tradotta.Queste

modifiche posttraduzionali avvengono nel Golgi, quindi le proteine devono per foza passare dal

reticolo al Golgi e poi se la loro localizzazione finale è il reticolo vengono importate nuovamente a

livello del reticolo.Per cui tra il reticolo e l'apparato di Golgi ci sono due vie attraverso cui le

proteine vengono trasportate dal reticolo al Golgi e sono proteine che fanno parte della via

biosintetica e fanno parte della via di recupero in cui le proteien che prima sono state trasportate dal

reticolo al Golgi vengono rimandate attraverso una via cosiddetta di recupero vengono rimandate al

reticolo. Le vescicole sono trasportate legate a microtubuli. I microtubuli sono una componente del

citoscheletro cellulare. Il citoscheletro cellulare è una struttura formata da tre tipi di

filamenti:filamenti di actina,filamenti intermedi e microtubuli. I microtubuli sono delle strutture

tubulari che servono a trasportare vescicole e nella formazione del fuso mitotico. I microtubuli

trasportano queste vescicole tramite delle proteine che sono le proteine motrici. Le proteine motrici

sono delle proteine che servono al trasporto di organelli,vescicole da una parte all'altra della cellula.

Una delle proteine motrici più importanti è la miosina che induce la contrazione muscolare. Quindi

tra il reticolo plasmatico e il Golgi ci sono due vie: una via biosintetica secretoria in cui il

rivestimento delle vescicole è dato da CopII e una via di recupero in cui il rivestimento è dato da


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Zoe34

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Firenze - Unifi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Zoe34 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Firenze - Unifi o del prof Fiaschi Tania.

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