Biologia molecolare, I parte

LA REPLICAZIONE DEL DNA

La duplicazione o replicazione del dna o sintesi del dna prevede che da una molecola madre di dna

se ne formino due molecole di dna esattamente uguali alla molecola di dna madre.Se poi queste due

molecole,ognuna presente in una cellula vanno incontro a divisione cellulare,ciascuna darà origine

ad altre due molecole di dna esattamente uguali al dna parentale e così via..

La peculiarità della duplicazione del dna è che la duplicazione del dna è semiconservativa.

Semiconservativa vuol dire che le due molecole di dna sono formate ciascune da un filamento

vecchio che è quello parentale (della molecola di dna padre) e un filamento di dna di nuova sintesi.

La duplicazione del dna è semiconservativa perchè dei due filamenti di dna, un filamento viene

mantenuto ed è il filamento che deriva dal filamento di dna della cellula madre e così avviene in

tutte le sintesi di dna. In tutte le duplicazioni la molecola di dna viene duplicata e le nuove molecola

di dna duplicate avranno un filamento vecchio che corrisponde al filamento della molecola di dna

madre e una di nuova sintesi. Meselson e Stahl hanno scoperto che la duplicazione del dna era

semiconservativa. Meselson e Stahl hanno preso dei batteri di Escherichia Coli e in laboratorio

hanno fatto degli esperimenti per vedere come era il meccanismo con cui si duplicava il dna.Hanno

fatto crescere questi batteri inizialmente in un terreno contenente azoto 15, che è un isotopo

dell'azoto che è un componente delle basi azotate, un componente dell'azoto che dà se queste

molecole di dna vengono centrifugate danno origine a una banda più pesante che si posiziona nella

provetta. In realtà prima che si sapesse che la replicazione del dna fosse semiconservativa,c'erano

tre ipotesi: che la replicazione del dna fosse conservativa,semiconservativa o dispersiva.

Nella replicazione conservativa, si dovevano avere due bande una di nuova sintesi e una vecchia. In

quella semiconservativa, formata da un filamento vecchio e da uno di nuova sintesi.In quella

dispersiva un filamento formato in maniera dispersiva con una parte vecchia e una nuova. Facendo

questo primo esperimento ,loro si accorsero che dalla centrifugazione di questo dna ottenevano una

sola banda cioè c'era solo una stratificazione. Il dna si posizionava tutto solo in una banda per cui

dalla replicazione conservativa si aspettavano in realtà due bande,la replicazione conservativa è

stata subito esclusa.Rimaneva come ipotesi,la replicazione semiconservativa e quella dispersiva.

Allora hanno fatto un'altra replicazione del dna in un terreno contenente un altro isotopo dell'azoto,

l'azoto 14. Nel caso della replicazione dispersiva dovevano ottenere solo una banda,nel caso della

replicazione conservativa ne dovevano ottenere due. In realtà, loro hanno visto due bande e in

questo modo hanno avvalorato il fatto che la duplicazione del dna avviene con un meccanismo di

tipo semiconservativo,cioè le due molecole di dna che si originano da una molecola madre hanno

ciascuna un filamento vecchio e uno di nuova sintesi. (da studiare)

Le zone da cui comincia la replicazione del dna si chiamano ORI e la duplicazione del dna porta

alla formazione di queste strutture chiamate forcelle di replicazione,in cui si forma una struttura a Y.

Quando la molecola di dna si apre e i due filamenti di dna si separano perchè il dna si deve

duplicare. Si formano due strutture a Y che sono le forcelle o forche di replicazione.Una da una

parte e una dall'altra. Nella forcella di replicazione,il dna viene duplicato sia su un filamento che

sull'altro. La duplicazione del dna non avviene a caso ma avviene a partire da alcune specifiche

regioni del dna che si chiamano Origine o siti di inizio della replicazione del dna. A livello di questi

siti ORI,si ha l'apertura dell'elica di dna in cui si formano due forcelle di replicazione:una da una

parte e una dall'altra in cui si ha la nuova sintesi dei due filamenti di dna per cui alla fine si

otterranno due molecole di dna.Ciascuna delle quali ha un filamento vecchio e un filamento di

nuova sintesi. La dna elicasi,come se fosse un motorino con un buco,in cui ci passa il dna e l'elicasi

va avanti rompendo i legami a idrogeno che tengono unite le basi azotate tra i due filamenti.

L'elicasi presenta dei siti di legame per l'atp perchè per rompere i legami a idrogeno e per far si che

questi due filamenti di dna si aprono utilizza ATP. La dna elicasisi lega a un filamento di dna

procede e apre rompe i legami a idrogeno che tengono uniti le basi dei due filamenti di

dna,utilizzando ATP.Questo permette l'apertura dei due filamenti di dna e quindi permette che poi

ciascuno di questi due filamenti venga utilizzato come filamento stampo per la replicazione del

nuovo filamento di dna.

I cromosomi batterici generalmente hanno un solo sito ORI perchè i batteri hanno un genoma molto

piccolo. Quindi i batteri hanno generalmente un solo sito di origine a livello del quale si ha la

formazione della forche di replicazione, a livello della quale inizia la replicazione del dna in cui

viene formato il nuovo filamento di dna fino a che la forca di replicazione non si apre sempre di più

fino a che tutto il dna circolare non viene duplicato e alla fine si ottengono due molecole di dna

circolare esattamente uguali alla molecola di dna iniziale con una replicazione del dna di tipo

semiconservativo. Il sito ORI che è il sito di origine di replicazione del dna cioè il punto in cui si

forma la forcella di replicazione presenta una regione ricca di nucleotidi A e di T (adenina e timina)

perchè l'adenina e la timina che appartengono a due filamenti opposti di dna si uniscono attraverso

due legami a idrogeno mentre la guanina e la citosina si uniscono attraverso tre legami a idrogeno.

Per cui si consuma meno energia a rompere due legami a idrogeno tra l'adenina e la timina piuttosto

che tre legami a idrogeno che sono quelli che tengono uniti la citosina e la guanina. Questo è il

motivo per cui sia nei siti ori,siti di origine di replicazione dei batteri, che negli eucarioti ci sono

queste zone ricche di adenina e timina. A questa sequenza di A e di T si uniscono delle proteine

iniziatrici che destabilizzano questa struttura ricca di adenina e timina per cui la destabilizzazione di

questa struttura di adenina e timina provoca la formazione di una piccola forca di replicazione. Su

questa forca di replicazione,viene caricato questo enzima che poi servirà per rompere i due

filamenti di dna cioè la dna elicasi,che è quell'enzima che serve per rompere utilizzando ATP i due

filamenti di dna. Vengono caricate due elicasi, una per ogni forca di replicazione,l'elicasi comincia a

separare i due filamenti di dna e questa separazione dei due filamenti di dna fa si che possa

cominciare la duplicazione del dna. Un batterio capisce quando è il momento di replicare il proprio

genoma quando “legge “ il grado di metilazione sul sito dell'origine. Per cui, se i nucleotidi del sito

ORI sono metilati allora quello è il segnale che la duplicazione del dna è avvenuta tanto tempo fa e

quindi si può partire per un'altra duplicazione del dna. Altrimenti se la duplicazione del genoma

batterico è avvenuta da poco tempo,i siti ORI sono in uno stato EMIMETILATO ossia in uno stato

ipometilato a bassa metilazione,che induce il legame di una proteina inibitrice che si chiama seq-A

che blocca il legame delle proteine iniziatrici nella regione in prossimità della sequenza A-T.

Soltanto quando tutta l'origine di replicazione del genoma batterico ritorna totalmente metilata.

Allora quello è il segnale che può partire nuovamente un'altra duplicazione del dna. Quando inizia

la duplicazione di una molecola di dna prima che ne inizia un'altra,la cellula deve essere sicura che

sia passato abbastanza tempo dalla replicazione cellulare successiva.Quindi,nei procarioti, funziona

che quando la replicazione è avvenuta da un tempo sufficientemente lungo e che ne possa iniziare

un'altra sono metilate.Quando il genoma è completamente metilato ,comincia la duplicazione del

dna. Quando invece si è in una situazione di ipometilazione,di bassa metilazione di questi siti ORI

non si può formare la forcella di replicazione .A questi siti ORI si lega una proteina che si chiama

seq-Ache blocca l'attacco delle proteine iniziatrici.Queste proteine in presenza della proteina seqA

non si possono più legare al sito ORI della sequenza ricca di A-T ,che si deve separare per formare

la forcella di replicazione e quindi non si forma la forcella di replicazione e la dna elicasi non viene

caricata e non si ha la replicazione del dna. Soltanto quando tutta la regione ORI viene

completamente metilata e quindi significa che è passato abbastanza tempo dall'ultima duplicazione

del dna,la completa metilazione di queste origini di replicazione induce la dissociazione della

proteina seq-A in modo tale che le proteine iniziatrici si possono legare al sito di origine e

cominciare la dissociazione dei due filamenti di dna con il legame della dna elicasi alla forcella di

replicazione e permettere l'inizio della replicazione del dna. Nei procarioti, vi è un solo sito di

origine di replicazione perchè il genoma dei procarioti è un genoma molto piccolo rispetto a quello

degli eucarioti. Infatti quando una cellula si duplica, nelle nostre molecole di dna ,nella nostra

molecola di dna ci sono più siti di replicazione danno origine a multiple bolle di replicazione e

multiple forcelle di replicazione.Per cui se i procarioti ne hanno una sola,tutti gli eucarioti in

generale che hanno un genoma molto grande non basterebbe una sola origine di replicazione,ce ne

sono multiple. Per cui,lungo un filamento di dna ci sono più bolle di replicazione e più forcelle di

replicazione che avanzano,si allargano sempre di più via via che la duplicazione del dna va avanti

fino a che due bolle di replicazione non diventano vicine e si uniscono ,si ha la fusione delle

molecole di dna di nuova sintesi.Per cui,alla fine, si ottiene la formazione di due molecole di dna a

partire da una molecola di dna madre. Queste due molecole di dna sono formate ciascuna da un

filamento vecchio parentale e un filamento di dna nuova sintesi che è stato sintetizzato durante

l'apertura della forcella di replicazione. In un cromosoma a tempi differenti, vengono duplicate

regioni differenti di dna. Per cui, è vero che noi abbiamo più di un sito di origine di replicazione ma

non è che vengono tutti aperti contemporaneamente ma vengono aperti temporaneamente con una

sequenza ben precisa. Tutte le cellule eucariote,a differenza dei batteri che hanno un solo sito di

origine di replicazione in cui comincia la replicazione del dna, hanno multipli siti di origine di

replicazione e vengono aperti e utilizzati con una sequenza