Biologia molecolare - Polimerase chain reaction

Polimerase Chain Reaction (PCR)

Polimerase Chain Reaction (PCR) è una procedura per ottenere in grande quantità una specifica sequenza di DNA in vitro. Questa tecnica può amplificare un tratto di DNA per più di un milione di volte.

Elementi necessari alla reazione:

• Due oligonucleotidi complementari a due regioni che si trovano su filamenti opposti del DNA stampo ai lati della regione che si vuole amplificare.
• DNA stampo che contenga la regione da amplificare.
• Polimerasi termostabile (non viene denaturata se portata a 95°C).
• I 4 desossinucleotidi trifosfati.

Processo di PCR

Il processo di PCR prevede un certo numero di cicli. Ogni ciclo consiste di 3 passaggi:

• Denaturazione: Temp. 95°C. Il DNA stampo viene denaturato.
• Appaiamento: 55°C circa. I primers si appaiano con il DNA stampo.
• Sintesi: Temp. 72°C è ottimale per il funzionamento di Taq (Thermus aquaticus) polimerasi.

PCR vantaggi:

• Sensibilità
• Rapidità
• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput).
• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione.
• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato.

PCR svantaggi:

• Sensibilità (rischio di contaminazioni-falsi positivi).
• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza.
• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers).
• Può sintetizzare frammenti relativamente corti.
• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica).

Cella elettroforetica per gel di agarosio

Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi.

DNA alegenomico t -to ANA mRRNM E6 E4
109876 28S543 18S2
DNA satellite 1 7S +DNA satellite
Unità da 5 a 200 bp. Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi.

Trasferimento secondo Southern (Southern blot)

Southern Blot altra forma di ibridazione su membrana: il dot blot (sia con campioni di RNA che di DNA).

A B C D
1 2
3 4
Dot blot