Biologia molecolare - Polimerase chain reaction

Elementi necessari alla reazione:

1- Due oligonucleotidi complementari a due regioni che si trovano su filamenti opposti del DNA stampo ai lati della regione che si vuole amplificare

2- DNA stampo che contenga la regione da amplificare

3- Polimerasi termo stabile (non viene denaturata se portata a 95°C)

4- I 4 desossinucleotidi trifosfati

Processo di PCR prevede un certo numero di cicli. Ogni ciclo consiste di 3 passaggi:

1- Denaturazione: temp. 95°C. Il DNA stampo viene denaturato

2- Appaiamento: 55°C circa. I primers si appaiano con il DNA stampo

3- Sintesi: temp. 72°C è ottimale per il funzionamento di Taq (Termus aquaticus) polimerasi PCR

Vantaggi:

• Sensibilità
• Rapidità
• Si presta all'analisi simultanea di molti campioni (high throughput)
• Si presta all'analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione
• Si presta all'analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato

Svantaggi:

Sensibilità (rischio di contaminazioni-falsi positivi)

• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza
• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)
• Può sintetizzare frammenti relativamente corti
• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3'->5' esonucleasica)

Cella elettroforetica per gel di agarosio

Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi

DNA alogenomico t -to ANA mRRNM E6 E4109876 28S543 18S2 DNA satellite 1 7S + DNA satellite

Unità da 5 a 200 bp.

Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi