Biologia Molecolare - Organizzazione Genica e Trasposizione

ORGANIZZAZIONE GENICA

Il genoma umano è composto da 46 distinti cromosomi (22 paia di autosomi più una coppia di

cromosomi sessuali), con un totale di approssimativamente 3,2 miliardi di paia di basi,

contenenti all'incirca 20000-25000 geni che consentono la produzione di oltre 100000

proteine diverse (un gene può produrre infatti più di una proteina, con un processo di splicing

alternativo).

Contrariamente a quanto si possa pensare, la complessità organica non è legata al contenuto

totale di DNA o al maggior numero di geni; di fatti solo l'1,5% della totale lunghezza del DNA

umano si basa su esoni codificanti proteine; la maggior parte del DNA è invece costituito da

DNA non codificante. Soltanto una piccola parte del DNA umano è quindi codificata (bassa

densità genica), ed i geni sono frammentati all'interno del DNA non codificante. La maggior

parte del DNA non codificante rappresenta DNA di regolazione; tra le sequenze non codificanti,

questo DNA, detto intronico, è quello più importante.

Il DNA si ricombina secondo meccanismi di ricombinazione omologa (processo di meiosi) e

non omologa (processo di trasposizione); per quanto riguarda quest'ultimo meccanismo,

un'elevata quantità di DNA è mobile, capace di replicare se stesso e inserirsi in modo casuale,

favorendo la specie e creando la possibilità di consentire un aumento dell'espressione genica

mantenendo costante il numero dei geni.

Le proteine sintetizzate sono di diverse tipologie: la fetta più ampia è costituita dalle cosiddette

proteine orfane, ovvero con funzione ancora sconosciuta, costituenti il 42% delle proteine

totali; altre tipologie di proteine sintetizzate sono le proteine che legano il DNA, gli enzimi, le

proteine strutturali (del citoscheletro), ed altre proteine in percentuali più basse. Come detto

precedentemente, solo una piccola percentuale del DNA è funzionale (preposto alla sintesi di

RNA); di questo si distinguono i geni di I, II, e III tipo: i geni di I tipo codificano per RNA

ribosomiale, in particolare l'rRNA 28s, 18s e 5,8s, e vengono trascritti dall'RNA polimerasi I; i

geni di II tipo codificano per RNA messaggero, ovvero quello preposto alla sintesi delle

proteine, e vengono trascritti dall'RNA polimerasi II; i geni di III tipo codificano per RNA

transfer e RNA ribosomiale 5s. I geni di II tipo si dividono a loro volta in esoni ed introni; i

primi sono rappresentati da non più di 1000 paia di basi, mentre i secondi costituiscono la parte

non codificante di un gene e sono più lunghi rispetto agli esoni, da poche migliaia a molte

centinaia di migliaia di basi; entrambi vengono trascritta dall'RNA polimerasi II. Un gene,

costituito in media da 27000 paia di basi, è caratterizzato da una sequenza esonica di solo

1000-1500 paia di basi, codificante proteine di circa 500 aminoacidi. Le uniche proteine a non

essere codificate dai geni di II tipo sono le proteine istoniche.

Il DNA degli eucarioti è distinto in 3 parti in relazione al numero di sequenze ripetute. Con un

classico esperimento di dissociazione-riassociazione, il DNA viene frammentato attraverso

enzimi detti di restrizione; questi piccoli frammenti sono sottoposti poi ad alte temperature per

un lungo tempo (circa 100°C); durante tale processo i due filamenti si staccano per rottura dei

legami a idrogeno che li tengono uniti. Il campione viene poi sottoposto a lento

raffreddamento per dare la possibilità ai frammenti di riappaiarsi; al termine di questa fase, il

genoma si riassocia in 3 livelli di temperatura caratteristici. Una prima parte, costituita da circa il

30% del DNA totale, immediatamente si riassocia, grazie all'elevato numero di frammenti

uguali che consente la riassociazione anche a condizioni sfavorevoli; questa porzione di DNA

costituisce il DNA altamente ripetuto. Una seconda parte, costituita da circa il 20% del DNA

totale, si riassocia a temperatura intermedia, e costituisce il DNA mediamente ripetuto. Una

terza ed ultima parte, costituente la porzione più ampia del DNA totale (circa il 50%), si

riassocia a temperature più basse, e costituisce il DNA non ripetuto.

Come detto, il DNA non ripetuto rappresenta la porzione più ampia dell'intero DNA. Di

questo, solo il 10% circa è codificante. E' costituito per il 5-10% circa da geni solitari (presenti

come unica quota) o da geni ripetuti in numero molto limitato (non più di una decina di

volte). I geni di questo tipo codificano per proteine omologhe; esempi sono i geni che

codificano per le per le catene pesanti della miosina, per l'actina e per le heat shock

β-globine,

proteins. Per formare proteine omologhe questi geni vengono duplicati; la duplicazione si pensa

derivi da 2 meccanismi di formazione delle famiglie: l'errore durante la replicazione e la

ricombinazione aberrante. Nel primo caso, la DNA polimerasi nel copiare il filamento parentale

fa un errore, si interrompe e ricomincia a copiare lo stesso pezzo per la seconda volta; nelle

cellule figlie ci sarà in una il normale cromosoma parentale, nell'altra il cromosoma nuovo che

presenterà la sequenza genica duplicata in tandem). Nel secondo caso viene considerato un

movimento del processo meiotico in cui avviene il crossing over e i cromatidi si appaiano in

maniera coincidente; nella ricombinazione aberrante la sovrapposizione non avviene in maniera

corretta, il crossing over avviene ma lo scambio non sarà equo; un cromatide sarà arricchito di

un gene, lasciandone privo l'altro; l'evoluzione avrà poi favorito lo sviluppo della cellula che

presenta entrambi i geni.

Il DNA altamente ripetuto è costituito da sequenze nucleotidiche, di lunghezza variabile da

poche decine a poche centinaia, che si ripetono senza interruzione in tandem per migliaia di

basi. E' tutto DNA non codificante. Si divide, sulla base del numero di volte in cui queste

sequenze si ripetono, in DNA satellite, DNA minisatellite e DNA microsatellite. Il DNA satellite

è quella porzione di DNA che costituisce i centromeri; è costituito da sequenze di 50-100

nucleotidi che si ripetono migliaia di volte; si avvolgono in nucleosomi aventi il CENP-A. Il

DNA minisatellite è caratterizzato da sequenze nucleotidiche più piccole (10 nucleotidi) che si

ripetono poche migliaia di volte; è caratteristica dei telomeri, ed in particolare nell'uomo la

sequenza che si ripete da 1000 a 4000 paia di basi è TTAGGG. Il DNA microsatellite è

costituito da sequenze nucleotidiche ancora più brevi (5-6 nucleotidi), ripetute poche centinaia

di volte; questa tipologia di DNA è dispersa in tutto il genoma ma in punti caratteristici; durante

la meiosi questo tipo di DNA si scambia più velocemente rispetto al resto del cromosoma nei 2

cromatidi, costituendo quindi le sequenze che determinano l'identificazione dell'individuo.

Il DNA mediamente ripetuto è costituito da una parte codificante e da una parte non

codificante. La porzione codificante è costituita da superfamiglie geniche in cui la

ricombinazione aberrante si è estremamente affermata e le sequenze ripetute supera le decine,

associate in cluster; esempi sono la superfamiglia delle immunoglobuline o i geni che codificano

per gli istoni; è costituita inoltre da geni di III tipo codificanti per gli tRNA, amplificati in

tandem per decine e centinaia di volte in maniera variamente distribuita nel genoma, formando

cluster, e da geni di I tipo codificanti per gli rRNA, ripetuti da centinaia a migliaia di volte e

raggruppati in cluster solo nei cromosomi 13, 14, 15, 21 e 22; la presenza dei geni di I tipo in

questi cromosomi non è casuale, poiché costituisce una stabilizzazione del genoma stesso;

infatti, questi cromosomi si trovano molto vicini e durante l'interfase sono altamente trascritti

per produrre rRNA (costituiscono il nucleolo, regione nel nucleo cellulare in cui l'attività

trascrizionale a carico dei geni di I tipo è molto elevata). La porzione non codificante del DNA

mediamente ripetuto (l'80% circa di tutto il DNA mediamente ripetuto) è costituita dagli

pseudogeni e dai trasposoni. Gli pseudogeni sono sequenze nucleotidiche simili ad un gene, ma

che hanno perso la capacità di essere espressi; si suddividono ulteriormente in pseudogeni

maturati e pseudogeni non maturati; gli pseudogeni maturati sono sequenze mai trascritte pur

possedendo tutte le caratteristiche tipiche di un gene, fatta eccezione della presenza di introni e

sequenze promoter; si ipotizza siano sequenze retrovirali che hanno infettato in modo

permanente ed innocuo il DNA; gli pseudogeni non maturati sono sequenze geniche che hanno

tutte le caratteristiche di un gene attivo, ma non sono funzionali perché hanno accumulato

mutazioni nel sito promoter tali da non essere riconosciuti, oppure perché posseggono

mutazioni a livello delle sequenze esoniche, originando mRNA interrotto; i trasposoni

costituiscono invece gli elementi mobili del DNA e rappresentano il 45% di tutto il DNA; sono

sequenze nucleotidiche che possono passare da 1 cromosoma a un altro, risultando importanti

soprattutto per il processo evolutivo, in quanto comportano un rimescolamento delle sequenze

geniche. TRASPOSIZIONE

La trasposizione è un fenomeno presente in tutte le specie,mediato dai trasposoni, gli elementi

mobili del DNA, costituenti circa il 45% del DNA totale. Contribuisce al riarrangiamento genico

che sta alla base dell'evoluzione. E' un ricombinazione non omologa, perché non avviene nella

meiosi e non coinvolge scambio equivalente di DNA. I trasposoni sono costituiti da sequenze

geniche codificanti, capaci di duplicazione autonoma; codificano per proteine che riconoscono

il gene di provenienza ed agiscono su di esso promuovendone la duplicazione; la sequenza

duplicata viene poi inserita a caso nel DNA. Il genoma in questo modo si arricchisce

continuamente di materiale genico; l'inserimento casuale determinano riassortimento genico,

che può apportare modifiche anche importanti come la perdita di attività di una proteina, il

miglioramento o il peggioramento della funzione di una proteina, la perdita di produzione di

una proteina, e quindi determinando patologie o guadagni funzionali.

Si distinguono 3 classi di trasposoni: i trasposoni a DNA ed i retrotrasposoni virali e non virali.

Mentre i trasposoni a DNA sono caratteristici dei procarioti, i retrotrasposoni rappresentano i

trasposoni più abbondanti negli eucarioti. La trasposizione è un fenomeno sporadico e casuale,

scatenato nel momento in cui l'RNA polimerasi II viene reclutata sul gene di trasposizione, in

modo accidentale.

I trasposoni a DNA sono costituiti da una parte centrale di 1000-2000 paia di basi, codificante

per una proteina, la trasposasi, responsabile del riconoscimento del gene, della replicazione e del

suo reinserime