Biologia molecolare e cellulare delle piante - primo semestre

CELLULE ANIMALI

- Cellule pluripotenti: sono in grado di differenziarsi in tutti i tipi di cellule di un individuo

adulto tranne che nelle cellule extraembrionali

- Cellule multipotenti: sono in grado di differenziarsi solo in alcuni tipi di cellule come ad

esempio quelle del sangue

- Cellule unipotenti: sono in grado di specializzarsi solo in un tipo di cellule

Le colture in vitro hanno consentito:

- La ricerca di base: capire i processi biochimici, fisiologici, genetici, della pianta

- La messa a punto di tecniche: rigenerazione, micropropagazione, coltura di embrioni,

embriogenesi somatica (creare embrioni da cellule somatiche), produzione di piante aploidi

con produzione di fiori sterili ( sono diploidi solitamente, la parte aploide sono i gameti, il

granulo pollinico e il gametofito), ibridazione somatica (creazione di specie nuove a partire

da specie filogeneticamente vicine compatibili è l’ibridazione; se voglio creare specie nuove

da specie filogeneticamente lontane si fa in vitro con l’ibridazione somatica), conservazione

del germoplasma ( se va a fuoco un intero bosco posso perdere le specie presenti in quel

bosco, se si conserva il germoplasma posso recuperare le specie), la trasformazione genetica

(piante transgeniche o cellule sovraesprimenti o silenziate), che hanno permesso

avanzamenti eccezionali nei processi di produzione vegetali.

Utilizzo delle colture cellulari:

- Ricerca di base: ricerca della funzione di una proteina eventualmente per migliorarne la

funzione, scoprire la funzione di geni; espressione genica, localizzazione (se si studia una

proteina mai studiata devo capire dove agisce, se agisce nel nucleo può essere un fattore di

trascrizione ecc)

- Scopi applicativi: utilizzo pratico che derivano dalla ricerca di base: propagazione (se dopo la

ricerca si riesce a produrre una pianta una pianta con fragole grosse e dolci le voglio

mantenere, se però la propago per semi posso perdere la qualità che avevo ottenuto; si

propaga quindi in maniera da creare tanti individui geneticamente identici con qualche

eccezione perché c’è un piccolo coefficiente di mutazione somatica anche nella mitosi),

miglioramento genetico (magari per produrre piante che “ci facciano bene”) (resistenza agli

stress indotti da patogeni, poca o troppa pioggia, temperatura ecc.), produzione di

metaboliti (60% dei principi attivi dei farmaci viene estratto dalle piante; li producono

spontaneamente a certi livelli) (metaboliti: biodiesel, ecc)

Una pianta che vive “in natura” vive in un ambiente in cui nessuno dei parametri può essere

controllato (non posso controllare la luce e il buio); le piante hanno un’omeostasi particolare che

gli permette di adattarsi a cambiamenti di questo tipo; per studiare un fenomeno della pianta

devo mettermi in condizioni più controllate e questo può essere fatto in vitro dove posso

controllare le ore di luce e andare a vedere se c’è una risposta positiva o negativa e andare a

studiare il meccanismo che sta alla base. Lo stesso posso fare anche per i componenti del mezzo

di crescita: è stato usato un promotore inducibile alla tetraciclina nelle piante di tabacco.

Non tutti i tipi di tetraciclina possono legarsi al promotore e indurre l’attivazione e la trascrizione

del gene che dava la fluorescenza.

Come si fanno le colture in vitro?

Si parte da una pianta adulta che può dare origine a diverse cose: embrioni, organi, callo o

colture cellulari. Si staccheranno dei pezzi dalla pianta e questi pezzi vengono messi in coltura

(solida o liquida); a seconda di cosa si deve fare si devono usare diversi mezzi di crescita che

differiscono dal Ph, dagli ormoni che ci sono all’interno e raramente dal tipo di sali minerali e si

può arrivare fino a riprodurre organismi interi.

Si può partire da meristemi che si trovano all’apice o dalla gemma che sta all’ascella della foglia

(tessuto meristematico); si può partire anche da germogli avventizi o embrioni ma raramente.

Organogenesi: insieme di processi che determina la differenziazione e la formazione di organi.

Gli organi sono fusto radici e foglie: si possono fare i fusti che poi possono seguire il loro destino

senza rigenerare la pianta intera (foto a dx si forma un fusticino con il pomodoro), se si vogliono

le radici e basta posso crearle senza sprecare energia per creare fusto e foglie e metterle in

bioreattori dove ci sono condizioni spinte di crescita (la crescita della radice è in lunghezza, poi si

formano le radici laterali).

Embriogenesi: partendo da una cellula somatica o da un tessuto vegetale, posso produrre

strutture embrio-like dalle cellule mentre se parto da un tessuto ottengo tanti embrioni.

Organogenesi e embriogenesi possono avvenire in maniera diretta (rizogenesi si formano solo le

radici, callogenesi si formano solo i fusti) (embriogenesi si forma da un tessuto direttamente un

embrione senza passare dal callo).

L’olivo toscano è stato selezionato per anni, non sarà uguale a quelli pugliesi; l’olio viene preso

dall’oliva che è il seme, ma se prendo il seme come posso produrre altri individui? L’olivo viene

prodotto e riprodotto solo per talea, non tramite seme anche perché si perderebbero le

caratteristiche positive che si sono selezionate. In questo caso si fa organogenesi diretta. Questo

è possibile perché all’ascella di ogni foglia ci sono le gemme che contengono tessuto

meristematico. ORGANOGENESI DIRETTA

Possiamo avere organogenesi indiretta: invece di produrre direttamente l’organo prima si produce il

callo; in molti casi è utili perché dal callo posso ottenere moltissime radici, moltissimi fusti mentre in

quella diretta solo uno. Anche nell’embriogenesi indiretta si passa sempre dal callo. Questo implica

necessariamente cambiamento di terreno di crescita perché il callo cresce solo su terreno solido.

EMBRIOGENESI DIRETTA

ORGANOGENESI INDIRETTA

EMBRIOGENESI INDIRETTA

CALLO

Ammasso cellulare che si forma in seguito a processi di divisione di cellule nelle tre dimensioni dello

spazio che hanno subito un fenomeno di sdifferenziamento a partire da cellule più o meno

differenziate che costituiscono l’espianto di partenza.

Questo è possibile solo utilizzando induzione con fitoregolatori (ormoni vegetali).

Si può da un callo ottenere tantissimi individui.

Come si ottiene il callo da una foglia: si prende la foglia, si sterilizza e si mette su terreno solido tutta

spezzettata. Nella zona di taglio della foglia si vedono le cellule che iniziano a sdifferenziarsi che

possono essere rossi per la presenza degli antociani. Il callo è cresciuto al buio e nel mezzo di crescita

aggiungo carboidrati (si vede che è cresciuto al buio perché non è più verde).

Il callo è generato da un opportuno rapporto di auxine e citochinine (2 millimolare di auxina e 0.03 di

chinetine per produrre il callo di tabacco).

Non esiste una sola specie di tabacco.

Ogni pianta, ogni specie, ogni ecotipo (piante della stessa specie evoluti in ambiente diverso, ad

esempio è importante nelle piante aromatiche; in provenza è famosa per il suo profumo; se si

prendono le stesse piante cresciute in Toscana, siccome il clima stimola la produzione di metaboliti

secondari, ovvero i profumi, si producono aromi diversi) possono produrre molecole diverse e

questo è importante per diverse applicazioni.

Dal callo si genera la pianta intera, e posso produrre solo quello che ci serve (solo fusto, solo radici)

IN VITRO.

EMBRIOGENESI SOMATICA

Può essere fatta anche questa diretta o indiretta a seconda se si passa o no dal callo.

Nel callo si avranno tante cellule e ognuna di questa potrà dare un embrione nuovo.

Da una singola cellula si avrà un’origine quasi sicura. Si avrà bipolarismo per cui si forma

immediatamente una pianta completa dotata di fusto (parte aerea, caudogenesi) e radici (parte

radicale, rizogenesi). Si avrà la produzione di un altissimo numero di plantule in breve tempo.

Embriogenesi somatica diretta da una sezione di fusto perché nella parte centrale si avranno le

cellule parenchimatiche non differenziate; embriogenesi somatica indiretta darà lo sviluppo di

embrioni dal callo.

Con l’embriogenesi si può fare anche l’ibridazione.

Un altro vantaggio degli embrioni somatici: gli embrioni possono essere rinchiusi in una matrice

gelificata e simulare dei semi; semina queste piante come se seminasse semi. Essendo una matrice

gelificata contiene acqua e l’umidità serve per la stimolazione e la germinazione.

INDUZIONE DI PIANTE APLOIDI

Se noi possiamo rigenerare embrioni partendo da una singola cellula, possiamo studiare le mutazioni

di un singolo gene come influisce sull’individuo e quindi non dobbiamo avere un individuo 2n ma n.

Possiamo studiare l’intera via metabolica avendo un individuo n. possiamo studiare l’intera via

metabolica se induciamo una mutazione nel gene oppure studiare il gene modulato solo da un allele

e non da due. Per produrre piante aploidi dobbiamo partire da individui aploidi che hanno subito

meiosi. Quindi si sono sviluppati metodi in coltura in vitro di antere e ovari che hanno consentito di

ottenere piante aploidi che si originano da microspore o macrospore. Questo è stato fatto in piante

aploidi di diverse specie erbacee: nel riso, patata, grano, orzo, asparago, triticale (ibrido tra la segale

e il frumento). Inoltre è stato fatto anche con piante aploidi di diverse specie arboree: pioppo,

ippocastano, vite, albero da gomma etc.

Per farlo dobbiamo partire da tessuti aploidi: nelle piante ci sono due linee aploidi, una maschile e

una femminile: microspore nell’antera (M) e il gametofito (F): qualsiasi mutazione, anche se

recessiva, si rende evidente. Se trovo nella pianta un allele recessivo che mi porta a qualche

beneficio e un’altra pianta che ha un’altra caratteristica,io seleziono queste due caratteristiche

particolari e poi posso creare un ibrido somatico tra le due e originare una nuova pianta che ha le

caratteristiche volute dall’operatore.

Il granulo pollinico è già adulto, è difficile creare piante aploidi da questo perché è disidratato,

dormiente, ha il pollen-kit, parete spessa, etc. Quindi tipicamente si prendono le antere, quando già

è avvenuta la meiosi ma quando ancora non si è formato il polline e sopra le antere si formano le

nuove piantine. Nell’ovario ci sono uno o più ovuli con il gametofito ortonucleato con la cellula

uovo, le sinergidi etc.

Dalla microspora bisogna tenere sotto controllo i fattori che lo facevano evolvere in granulo

pollinico.

Si può lavorare in vitro se vogliamo fare degli studi, ma se vogliamo poi creare nuovi individui devo

passare poi dalla pianta in vaso.

Vantaggi:

- Essendo indi