Biologia molecolare degli eucarioti

ALCHILANTI AGENTI

Si trovano nell'acqua, nel cibo, nell'aria. Possono essere:

• prodotti dagli organismi (es: piante)
• di origine antropica (es: combustione di derivati del petrolio, tabacco)
• endogeni (es: S-adenosilmetionina, serve per metilare una serie di proteine)

Aggiungono dei gruppi alchilici a livello dei gruppi più attivi degli anelli aromatici, ci sono delle posizioni più predisposte ad essere metilate rispetto ad altre. Reagiscono con l'azoto e l'ossigeno.

Monofunzionali → molecola dona gruppo alchilico solo a una singola posizione.

Bifunzionali → hanno due gruppi alchilici che possono essere donati, se sono donati a basi vicine possono portare alla formazione di legami covalenti tra i filamenti.

Il danno da alchilazione è abbastanza frequente, per questo le cellule presentano due diverse vie di riparazione:

1. Riparazione diretta: Nella cellula esistono degli enzimi in grado di rimuovere il gruppo alchilico.
2. Riparazione...

1. mediante excisione (BER, NER, MMR)

1. Meccanismi di riparazione diretta

Esistono delle famiglie di enzimi agiscono rimuovendo il gruppo alchilico- AlkB Rimuovono il danno trasferendo un gruppo -OH, deidrogenasi riduce il gruppo metilico che viene eliminato sotto forma di acido carbonico- MGMT Trasferisce il gruppo metilico stesso Ripara il danno più frequente: metilazione dell’ossigeno in posizione 6 della guanina trasferisce il gruppo metilico a livello di una sua cisteina L’enzima MGMT è molto importante perché si è osservato che in alcuni tumori resistenti agli agenti alchilanti vi è un aumento nel numero di copie di questo enzima Sviluppo di inibitori della MGMT da associare agli agenti alchilanti nella terapia Questi meccanismi hanno una particolare specificità per particolari atomi che vengono metilati

2. Meccanismi di excisione

• BER

Ha inizio con il riconoscimento di un’alterazione dovuta al fatto che la base che porta il

gruppo metilico non si appaiapiù con la base complementare in maniera corretta

A valle, avviene la rottura del legame che unisce la base allo zucchero (legame glicosidico) da parte di una DNAglicosilasi → induce un ripiegamento che ribalta verso l’esterno la base alterata e poi taglia il legame glicosidico

Successivamente, intervengono delle nucleasi per tagliare il ribosio e il legame fosfodiesterico rimuovendo l’interonucleotide e lasciando un’interruzione (nick) in corrispondenza della base complementare

A questo punto interviene una polimerasi replicativa che inserisce il nucleotide complementare e una ligasi che chiude il legame fosfodiesterico all’estremità 5’-fosfato, in questo modo viene ripristinato il filamento

Ogni step genera degli intermedi tossici e mutageni (siti apurinici/apirimidinici, SSBs), per questo motivo è essenziale che il BER sia sottoposto a uno stretto controllo

• NER Sistema di riparazione principale

dell'alterazione a livello della doppia elica grazie al complesso formato dalla proteina XPC e da HR23B che legano il nucleotide alterato. Reclutano poi una serie di altri fattori come XPA, RPA, XPG e anche un fattore di trascrizione dell'RNApolimerasi II, TFIIH. Questo complesso induce l'apertura della doppia elica che espone un tratto dove si trova la regione danneggiata, si forma una sorta di bolla. A questo punto avviene l'intervento di un complesso in grado di indurre il taglio nel filamento da parte di ERCC1-XPF e XPG. Questi fattori tagliano una regione di 25-30 nucleotidi, in questo modo rimane una regione di DNA stampo a singolo filamento che funge da stampo per l'azione di polimerasi di tipo riparativo. A partire dall'estremità 3'OH viene risintetizzato il filamento complementare, rimane un nick che viene chiuso dalla ligasi. NER e BER sono dei meccanismi fedeli in quanto utilizzano il filamento non danneggiato come stampo. Il NER funziona sia

nelle cellule proliferanti che nelle cellule post-mitotiche

Esistono almeno due forme:

• una agisce su tutto il genoma, compresa l'eterocromatina
• una ripara le porzioni attivamente trascritte → TC-NER, ripara in modo più efficiente

Il complesso TC-NER è sostanzialmente identico nella parte che ripara il danno, ma si distingue per la presenza di due proteine, CSA e CSB, che collegano l'apparato del NER canonico con l'apparato di trascrizione (mutazioni provoca sindrome di Cockayne)

la polimerasi incontra un nucleotide modificato e si blocca, avviene quindi l'attivazione di CSA e CSB che riparano il danno

• MMR

Questo sistema di riparazione è attivo solo in fase S tardiva

È deputato soprattutto alla riparazione dei mismatch

È poco caratterizzato negli eucarioti superiori

Delle proteine riconoscono il danno (MUTSα e MUTLα), reclutano poi delle nucleasi che tagliano il tratto del filamento che contiene

Portare alla perdita di porzioni cromosomiche

Si attivano due sistemi di riparazione dei danni:

1. Ricombinazione omologa (HR)
2. Non-Homologus End Joining (NHEJ)

Ciascuno di questi sistemi di riparazioni sembra essere declinato in diverse varianti (es: sembra che delle molecole di RNA possano venire utilizzate come stampo nel caso di HR)

1. HR

Necessita di avere come filamento stampo il cromatide fratello

Può avvenire solo in fase di duplicazione del DNA → fase S tardiva e G2

Inizia con il riconoscimento del danno da parte del complesso MRN (pare che MRN sia importante anche per dei sistemi di riparazione che coinvolgono il NHEJ)

In questo complesso sono presenti delle proteine che hanno un'attività endonucleasica che viene rafforzata anche dal reclutamento dell'esonucleasi Exo1 che genera delle estremità 3' sporgenti da un lato e l'altro della rottura

MRN smangia il filamento 5' sporgente generando un singolo filamento che termina con un 3'-OH,

Il quale viene riconosciuto da Rad51 che riveste il filamento → questo filamento nucleo-proteico fa una sinapsi con il cromatide fratello, lo invade e avviene la sintesi di DNA che ricostituisce la porzione smangiata.

Le molecole sono connesse tra loro in una struttura a croce detta giunzione di Holliday e la migrazione del chiasma.

Infine, avviene la risoluzione della giunzione ad opera dell'eterodimero MUS81-MMS4.

Negli eucarioti, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57, BRCA1, e BRCA2 sono implicati nell'invasione del frammento, ma i loro ruoli precisi non sono ancora chiari.

2. NHEJ

Avviene in tutte le fasi del ciclo cellulare, in particolare in fase G1.

Le estremità rotte vengono ligate → se è avvenuta l'azione delle nucleasi a livello delle estremità, questo sistema riparativo non è in grado di ripristinare l'informazione mancante.

Non è un sistema fedele (error-codon), produce delezioni e alterazioni.

Esiste un pathway canonico e altri.

pathway alternativi più o meno compresi

Il sensore della rottura è un complesso di proteine formato dall'eterodimero Ku70-Ku80 che ha una particolare struttura ad anello che lega l'estremità del DNA. Ku70-Ku80 funziona in associazione alla chinasi DNA PK che agisce fosforilando Ku70-Ku80 e altre proteine.

Interviene la nucleasi Artemis che processa le estremità rotte e infine il complesso XRCC4-ligasi 4 che porta alla chiusura e la ligazione della rottura.

Il NHEJ viene attivato in risposta a una serie di modificazioni post-traduzionali, in particolare fosforilazioni.

NHEJ alternativo

Partecipa il complesso MRN. La rottura viene processata dal complesso MRN smangiando il filamento 5' fosfato fino a trovare delle regioni di micro-omologia che consentono l'appaiamento dei filamenti complementari e la chiusura della rottura. Genera delle delezioni più importanti rispetto al NHEJ canonico.

Un aspetto chiave che consente la discriminazione dei pathway

HR e NHEJ si basa sulla regolazione del complesso MRN, il quale viene reclutato sulla rottura a doppio filamento → opera end-resection con Exo1 oppure si lega Ku70-Ku80 impendendo l’accesso di MRN.

La regolazione della scelta del pathway si basa sul controllo del complesso MRN. Studi recenti hanno dimostrato che Ku70-Ku80 è estremamente abbondante nella cellula e per questo prevale su MRN legandosi sempre alle rotture a doppio filamento → se deve avvenire la ricombinazione omologa, viene scalzato dal DNA secondo diversi modelli in modo tale da lasciare l’accesso per MRN.

Sintesi translesione: Sistema di tolleranza → consente alla cellula di replicare il DNA senza la riparazione del danno (in genere alle basi), fa sì che non avvenga il blocco della forca replicativa che potrebbe generare rotture a singolo filamento.

E’ un meccanismo molto conservato, esiste sia nei procarioti che negli eucarioti. Si basa sull’azione di particolari DNA polimerasi.

riparative che hanno una bassa fedeltàIl complesso di ripa