Biologia molecolare e cellulare delle piante - secondo semestre

Vettori vegetali e cosa contengono

No, non esiste un plasmide che ha tutto. I promotori hanno un ribosomal binding site (RBS); si trova nel 5’ UTR dell’mRNA che regola la sintesi proteica grazie alla sua struttura e sequenza, tra il promotore e l’ATG e sono due sequenze: Kozak, tipica degli eucarioti, e Shine-Dalgarno, tipica dei procarioti. A noi servono entrambi in quanto i plasmidi si utilizzano nei batteri dove si va a far produrre una proteina, mentre i vettori delle piante si utilizzano nelle piante quindi il RBS ci dovrà sempre essere nei nostri vettori e in una posizione particolare.

Kozak e Shine-Dalgarno

Kozak - eucarioti: si trova sull’AUG; va da -3 a +4; è una sequenza attaccata alla sequenza di traduzione; l’adenina in -3 e la guanina in 4 sono essenziali per la traduzione. Andando a clonare un plasmide in un vettore e utilizzando un enzima di restrizione che agisce su queste due basi poi non funziona.

Shine-Dalgarno - procarioti: lo spazio ottimale tra la sequenza SD e il codone di start è di 8 nt, è seguita da AUG; possono essere da 6 a 10 nucleotidi, importante non scendere sotto 4 nt o sopra 14 nt.

Marcatori di selezione

• Essenziale per il mantenimento del plasmide nelle cellule
• Per la sua presenza i plasmidi risultano essenziali per le cellule
• Solo le cellule che contengono questo elemento, poste in selezione, possono sopravvivere

Nei plasmidi se ne possono trovare due, uno per la selezione nei batteri e uno per la selezione nelle piante.

Fusion tag

Alle proteine possono essere fuse al 5’ o al 3’ (se si inserisce al 3’ devo rimuovere il codone di stop) una proteina o un peptide con diverse funzioni. Esempi: GFP; la proteina fusa con GFP può essere localizzata grazie alla fluorescenza emessa dalla proteina stessa.

Funzioni

• Aumentare la solubilità: esempio TAT11 proteina di HIV: se viene fusa al C terminale di una proteina partner ne aumenta la solubilità; posso fondere anche all’N-terminale
• Aumentare l’efficienza di trascrizione: fondere alla proteina una proteina target con un’alta efficienza di trascrizione per aumentare l’efficienza di trascrizione della prima trasferendo questa proprietà alla proteina che voglio evidenziare fondendola con un tag
• Rilevamento: purificazione e Western blot; nell’uomo ci sono anticorpi per tutte le proteine; nelle piante le cose sono complicate, perché la stessa proteina non ha gli stessi aa nelle varie specie; non esistono anticorpi contro tutte le proteine vegetali con cui lavoro. Western: proteina prodotta, la purifico, la inietto nei conigli, produco anticorpi monoclonali oppure fondere una proteina tag universale (piccolo, 11-13 aa) che è riconosciuta da un anticorpo e quindi utilizzo anticorpo contro questo tag che mi porta dietro anche la mia proteina perché è fusa e utilizzo il tag per evidenziarla

Esempi di peptidi utilizzati come tag

Code di istidine: 6-8-10 aa: ci sono colonne di resine con vari metalli come rame, zinco, nichel che mi riconoscono con affinità le code di istidine, quindi se metto questo tag all’N-terminale o al C-terminale o intermedio (poco utilizzato) le istidine si legano al metallo e tutto ciò che non ha la coda di istidina passa attraverso un filtro di resina mentre il resto non passa, rimane attaccato alla resina e posso prenderlo, farci lavaggi, fare eluizione cambiando il pH con cui riesco a staccare la proteina e purificare la proteina oppure esiste un anticorpo contro queste istidine e quindi rilevo una proteina di cui non esiste l’anticorpo fondendola con questa coda.

T7 tag: 11-16 aa, funziona solo al 5’ (N), aumenta anche l’efficienza di espressione; in caso in cui ci siano proteine poco espresse o promotori poco forti si può rimediare fondendola con questo tag.

S-Tag: Aumenta anche questo l’espressione; 15 aa.

Flag-Tag: 8 aa; viene utilizzato per la purificazione ed esiste l’anticorpo anti-flag quindi si può usare per co-immunoprecipitazioni.

HA-tag: 9 aa; esiste l’anticorpo.

Altri epitopi poco usati

• V5
• Pel B (è utile dove si vuole studiare proteine di secrezione)
• Xpress

Proteine intere utilizzate come tag

• GST: glutatione S-transferasi 26 KDa, serve per purificare proteine, esiste una resina che lega il glutatione, per aumentare la solubilità, c’è un anticorpo contro la GST quindi si può rilevare su Western che è quantitativo quindi si può vedere anche quanta proteina c’è. Se si studiano gli stress ossidativi, essendo il glutatione coinvolto in questo, non è il tag giusto
• MBP: 40 kDa; maltose binding protein, esiste l’anticorpo contro questa proteina quindi si può fare il Western, aumenta la solubilità
• NusA: 495 aa; si usa per aumentare la solubilità
• CBP: calmodulin binding peptide, 4 kDa
• GFP: 220 aa
• Tioredossine
• Mistic, Sumo utilizzati per studiare le proteine di membrana perché poco grandi e poco cariche che riescono ad attraversare la membrana
• DSBc

Cleavage Site

Se c’è un tag e dobbiamo rimuoverlo esistono nei plasmidi dei siti particolari che stanno o al 5’ tra il tag e la proteina clonata nel MSC oppure tra la proteina e il tag al 3’. I siti vengono riconosciuti da proteasi e peptidasi, anche se in maniera minore, rispetto a quelli che riconoscono gli enzimi di restrizione che riconoscono il DNA, esistono enzimi che riconoscono specifiche sequenze aa; mettendo codoni particolari si può inserire tra il tag e la proteina sequenze aa riconosciute da particolari proteasi.

Perché rimuovere un tag?

Se la GST è coinvolta nei processi ossidativi, poi non sappiamo se l’effetto antiossidante è dovuto al tag o alla proteina stessa. Per saggi enzimatici è sempre buona cosa rimuovere il tag. Il tag, se sono grandi rispetto alla proteina stessa, possono anche ostacolare l’accesso della proteina al sito attivo o ai domini interattivi: se due proteine devono interagire per innescare un meccanismo ma c’è una proteina più grande che ostacola il passaggio si blocca tutto.

Se si vuole fare un anticorpo, si può purificare nei batteri con un tag.

Se non rimuovo il tag, quando lo inietto nel coniglio, mi andrà a produrre anticorpi contro il tag e magari non contro la proteina quindi va rimosso.

Il tag grosso può intervenire con il folding della proteina stessa: i siti catalitici potrebbero non formarsi per interazione di aa con particolare carica.

Cosa si usa per rimuovere il tag?

Tipicamente enzimi, e un detergente.

• Enterochinasi/enteropeptidasi, taglia dopo 4 asp (aspartato) e una lis
• Fattore Xa, taglia dopo arginina
• TEV: taglia fra gln (glutammina) e gly
• Trombina: taglia tra arg e gly
• Bromido di cianogeno: detergente che taglia a livello di una metionina

Il database BRENDA contiene tutti gli enzimi che tagliano i tag.

Multiple Cloning Site

• Zona contenente diversi siti unici di taglio per enzimi di restrizione
• Tagliando in questa zona non si alterano le caratteristiche del plasmide
• Zona di clonaggio per il DNA ospite

I più moderni MSC non utilizzano più enzimi di restrizione; si utilizza ricombinazione.

All’interno si hanno zone di taglio degli enzimi di restrizione per fare clonaggio; da una decina di anni a questa parte il clonaggio avviene per ricombinazione che è più veloce del primo per far avvenire la reazione in quanto prima si doveva aspettare tanto tempo per far avvenire la reazione ma anche per usare gli enzimi di restrizione, far agire gli enzimi, ottenere la digestione, mettere su la ligation, aspettare la ligation che funzioni e poi trasformarla nei batteri; con questa nuova tecnica bastano poche ore di lavoro e si trasforma immediatamente.

Inoltre non c’è bisogno di preoccuparsi del frame: dopo la digestione si ha la ligation dei due frammenti questo deve ricostituire il frame di 3 nt. Se si digerisce e perdo un aa viene tradotta una proteina che non è quella che volevo. Uno nella progettazione deve anche pensare al frame e quindi disegnare i primer per fare PCR adeguata ed impiegare ulteriore tempo.

Gateway Technology

Il nuovo sistema si chiama Gateway Technology che si basa su siti di ricombinazione: non avviene più il taglio ma si prende un frammento e un plasmide e si fa avvenire la ricombinazione; è un sistema molto versatile: una volta inserito un prodotto di PCR in un plasmide lo stesso prodotto può essere inserito in vari plasmidi in una reazione.

Si basa su due meccanismi di reazione

• BP recombination reaction
• LR recombination reaction

La BP è il primo step, fa avvenire la ricombinazione tra un frammento di DNA ottenuto per PCR in cui alle estremità, AttB: sequenza dove deve essere inserito il prodotto di PCR mentre nel donor ci saranno le sequenze AttP: sequenza contenuta nel plasmide dove entrerà il prodotto di PCR.

A seguito della ricombinazione il nuovo plasmide ricombinato viene chiamato vettore entry; dopo la ricombinazione si hanno le sequenze L1 al 5’ e L2 al 3’. BP: prodotto di PCR all’interno di un vettore.

LR: le sequenze R si troveranno nel vettore definitivo, che serve per far avvenire l’espressione. LR: avviene una ricombinazione tra entry e destination (vettore di destinazione finale) e alla fine otterremo il vettore di espressione. L nell’entry, R nel vettore di destinazione.

La ricombinazione produce un vettore di espressione che contiene il gene di interesse.

Anche in questo caso si deve mettere un certo rapporto molare tra inserto e vettore e tra il vettore 1 e 2; ovviamente l’efficienza non è del 100%; la reazione non avviene su tutti i vettori; si avrà un certo numero di vettore di espressione dove il gene è stato inserito correttamente e altri vettori rimasti in cui non è avvenuta ricombinazione, ma avranno la stessa resistenza all’antibiotico.

Gene ccdB

Nelle sequenze R c’è il gene ccdB: gene per la letalità; le cellule competenti che si utilizzano nei clonaggi in quelle che contengono queste muoiono e non danno ricombinazione; gli altri in cui è avvenuta la ricombinazione non hanno questo gene e rimangono vitali, senza bisogno di mettere la resistenza ad un antibiotico aggiuntivo.

Le sequenze B di ricombinazione sono lunghe quanto LB e RB di agrobatterio (25 nt): ipotesi di microomologia, ricombinazione omologa.

Il B1 si ricombina con P1, B2 con P2; L1 con R1 e L2 con R2; questo determina anche l’orientamento del gene stesso: se si mette P1 a dx e B1 a sx il gene viene inserito alla rovescia, sennò per essere inserito normalmente deve avere P1 e B1 dalla stessa parte.

Il gene ccdB si utilizza anche per vedere i donor che sono stati ricombinati: quelli ricombinati non hanno ccdB e quindi sopravvivono al taglio e vengono selezionati; quelli non ricombinati non sopravvivono e quindi si tolgono i donor non ricombinati.

ccdB: gene che codifica per la proteina che interferisce con la DNA girasi di E.coli, quindi impedisce la crescita: il DNA non si apre, non si srotola e la cellula muore. I batteri che si usano il laboratorio sono tutti ingegnerizzati: questo fenomeno avviene per le linee di batteri tipiche che vengono utilizzati in batterio: DH5, TOP10.

Il donor che ha la ccdB dentro deve essere prodotto nei batteri: quindi ci sono linee batteriche insensibili a questa proteina e che mi producono il plasmide originario senza essere affette dall’effetto inibitorio della proteina stessa.

PCR-> RICOMBINAZIONE e gene inserito nel DONOR-> ENTRY VECTOR

che può essere messo in interazione con qualsiasi tipo di plasmide. BP clonasi: è una miscela che si compra; in un giorno si ha tipicamente il clonaggio. ccdB survival: cellule competenti di batterio che sono insensibili a ccdB, utilizzati per produrre i vari plasmidi.

Codone di start

Il più comune codone (92%) di start in E.coli è AUG (met). Circa l’8% dei codoni di start sono costituiti da GUG, mentre UUG e AUU sono usati raramente.

Codoni rari

La frequenza con cui in E.coli si ritrovano i diversi codoni non è la stessa: ci sono alcuni codoni espressi in maniera bassa per cui se nella sequenza nucleotidica ci sono quei codoni lì, la proteina può essere prodotta a bassi livelli, oppure non prodotta oppure mutata.

Se particolari codoni sono rari, anche i corrispondenti tRNA sono rari, per questo manca l’aa che devono inserire.

Se uno deve fare espressione di una proteina in E.coli bisogna che analizzi attentamente la sequenza nt del gene. Codoni rari possono causare terminazione prematura della sintesi proteica: quando mancano i tRNA la sintesi si blocca.

Se ci sono cluster, tanti tRNA rari, si possono avere errori nella traduzione.

Come si risolve?

Ci sono database, uno prende la sequenza del gene dal database e questi dicono già se ci sono tRNA rari, oppure si può fare una sovraespressione dei tRNA rari ma questo rende più complicato perché significa ridurre la quantità di nutrienti disponibili per la propria proteina.

Esempi di codoni rari: CTA (leucina), ATA (isoleucina) e CCC (prolina). La prolina ha 4 codoni che codificano per lei stessa; nel caso in cui abbiamo CCC si può fare una mutazione nella sequenza del gene e sostituire la C con uno degli altri nt.

Codoni di stop

• UAA
• UAG
• UGA

Segnale indispensabile per la terminazione della traduzione dei mRNA.

Terminatore della trascrizione

Si trova al 3’ del gene e contiene il segnale di poliadenilazione e previene la formazione di RNA antisenso: nel genoma ci sono geni sovrapposti, si hanno promotori che trascrivono in entrambi i geni e si può formare RNAi dicer e silenziamento genico. Fa il classico loop al 3’ che serve per la stabilità del messaggero.

Origine di replicazione

• È una sequenza di DNA che dà inizio alla replicazione di un cromosoma, di un plasmide o di un virus
• Per piccoli DNA è sufficiente una sola ORI
• Per DNA grandi (come cromosomi) sono necessarie più ORI
• L’ORI determina il numero di copie di un plasmide:
  • 25-50 copie per cellula per vettori low copy derivati dal plasmide Pbr322
  • 150-200 copie per cellula per vettori high copy derivati dal plasmide Puc
• L’ORI determina anche la compatibilità dei plasmidi

Nei plasmidi è importante: indica anche la specificità della specie; se si vuole usare un plasmide nei batteri serve un’ORI che funzioni nei batteri, lo stesso per i lieviti. 5 microgrammi di plasmide si fanno con 5-10 ml; ma se il plasmide è low copy non bastano quelle quantità (5-10 ml).

Plasmidi che funzionano nei lieviti funzionano anche nei batteri perché il clonaggio lo faccio nei batteri e quando ho fatto il costrutto poi lo vado a testare nei lieviti.

Se usiamo PBR322 vanno raddoppiati i volumi di crescita per ottenere una buona quantità di DNA. La maggior parte dei vettori binari sono low copy, chi ha creato plasmidi è partito con determinati obiettivi ma doveva partire con DNA piccoli, alla fine questi plasmidi sono diventati così grandi che spesso la Puc non funzionava perché troppo grande. Spesso, se non c’è particolare richiesta, si usa quello che uno ha a disposizione. Si possono avere più ORI nello stesso plasmide ad esempio se funziona sia nei batteri che nel lievito. Negli anni 90 si utilizzava per clonare i fagi, non i batteri.

Repressore

IPTG: inibitore di un repressore, si lega al repressore di un promotore, disattivandolo e attivando la funzione di un gene;

• Proteggono dalla degradazione del plasmide e dalla sua replicazione e proteggere dalla sintesi proteica: quando vogliamo produrre una proteina, vogliamo che le cellule facciano sintesi proteica e non vogliamo che le cellule vadano incontro a divisione cellulare, a moltiplicazione cellulare, e i repressori proteggono il plasmide dalla degradazione e ostacolano proprio la divisione cellulare a favore della sintesi delle proteine. Normalmente si legano al repressore di un promotore disattivandolo, attivando la trascrizione di un gene.
• Azione di repressione sul promotore in assenza di induttore. Per dare inizio alla trascrizione si aggiunge un induttore (es. IPTG) che lega il repressore e lo inattiva.

Esempi di vettori

Plasmide pRT 100 (101-102-103-104); 3340 pb. Si hanno diverse varianti, cambia la sequenza del MCS; spesso il MCS può cambiare, questo serve perché se ho già un gene clonato in un plasmide ma non ho siti utili per clonarlo in un altro plasmide devo riclonarlo con PCR, se invece ho plasmidi con più possibilità di taglio utilizzo questo.

Promotore 35S, ori, ampR (batteri); non viene indicato LB e RB quindi significa che non è un vettore binario ma funziona sia nei batteri (ampR) che nelle piante (promotore 35S); il promotore è forte e costitutivo, fa espressione proteica ad alti livelli, quindi quando viene utilizzato? Non funziona con agrobatterio (manca LB e RB, quindi non si integra), è transiente perché non ha il marcatore di selezione per le piante.

PFF19; 4.2 kb. Sono due; PFF19G e PFF19K. MCS, promotore, 35S enhancer per aumentare efficienza di trascrizione; Puc 120 (high copy), ampR, ori; il clonaggio si fa nei batteri ma poi si verifica il funzionamento di un gene nelle piante, fa transfezione transiente (non c’è LB e RB e non c’è la resistenza nelle piante).

pRT104C-myc; 3388 pb. Myc è un tag che si mette al C-terminale (3’), subito prima si ha MCS e poi il tag che andrà all’estremità 3’ del gene, ColE1 che è ori per coli, ed è vettore per indurre sovraespressione di una proteina nelle piante a cui si può fondere un tag che può essere rilevata utilizzando anti-myc. Questo plasmide ha due vantaggi: il primo è che non ha LB e RB e non ha una resistenza nelle piante -> espressione transiente; però a monte e a valle della cassetta genica (promotore 35s, MSC con proteina e tag) ci sono siti di restrizione uguali.