Biologia molecolare e cellulare delle piante - secondo semestre

UAA, UAG E UGA

Segnale indispensabile per la terminazione della traduzione dei Mrna

Terminatore della trascrizione

Si trova al 3’ del gene e contiene il segnale di poliadenilazione e previene la formazione di rna

antisenso: nel genoma ci sono geni sovrapposti, si hanno promotori che trascrivono in entrambi i

geni e si può formare RNAi dicer e silenziamento genico.

Fa il classico loop al 3’ che serve per la stabilità del messaggero

Origine di replicazione

- È una sequenza di DNA che da inizio alla replicazione di un cromosoma, di un plasmide o di

un virus

- Per piccoli DNA è sufficiente una sola ORI

- Per DNA grandi (come cromosomi) sono necessarie più ORI

- L’ORI determina il numero di copie di un plasmide:

1- 25-50 copie per cellula per vettori low copy derivati dal plasmide Pbr322

2- 150-200 copie per cellula per vettori high copy derivati dal plasmide Puc

- L’ORI determina anche la compatibilità dei plasmidi

Nei plasmidi è importante: indica anche la specificità della specie; se si vuole usare un plasmide nei

batteri serve un’ori che funzioni nei batteri, lo stesso per i lieviti. 5 microgrammi di plasmide si fanno

con 5-10 ml; ma se il plasmide è low copy non bastano quelle quantità (5-10 ml). Plasmidi che

funzionano nei lieviti funzionano anche nei batteri perché il clonaggio lo faccio nei batteri e quando

ho fatto il costrutto poi lo vado a testare nei lieviti.

Se usiamo PBR322 vanno raddoppiato i volumi di crescita per ottenere una buona quantità di DNA.

La maggior parte dei vettori binari sono low copy, chi ha creato plasmidi è partito con determinati

obiettivi ma doveva partire con DNA piccoli, alla fine questi plasmidi sono diventati così grandi che

spesso la Puc non funzionava perché troppo grande. Spesso, se non c’è particolare richiesta, si usa

quello che uno ha a disposizione.

Si possono avere più ORI nello stesso plasmide ad esempio se funziona sia nei batteri che nel lievito.

Negli anni 90 si utilizzava per clonare i fagi, non i batteri.

Repressore

IPTG: inibitore di un repressore, si lega al repressore di un promotore, disattivandolo e attivando la

funzione di un gene;

- Proteggono dalla degradazione del plasmide e dalla sua replicazione e proteggere dalla

sintesi proteica: quando vogliamo produrre una proteina, vogliamo che le cellule facciano

sintesi proteica e non vogliamo che le cellule vadano incontro a divisione cellulare, a

moltiplicazione cellulare, e i repressori proteggono il plasmide dalla degradazione e

ostacolano proprio la divisione cellulare a favore della sintesi delle proteine. Normalmente si

legano al repressore di un promotore disattivandolo, attivando la trascrizione di un gene.

- Azione di repressione sul promotore in assenza di induttore. Per dare inizio alla trascrizione

si aggiunge un induttore (es. IPTG) che lega il repressore e lo inattiva.

Esempi di vettori

Plasmide pRT 100 (101-102-103-104); 3340 pb

Si hanno diverse varianti, cambia la sequenza del MCS; spesso il MCS può cambiare, questo serve

perché se ho già un gene clonato in un plasmide ma non ho siti utili per clonarlo in un altro plasmide

devo riclonarlo con PCR, se invece ho plasmidi con più possibilità di taglio utilizzo questo.

Promotore 35S, ori, ampR (batteri); non viene indicato LB e RB quindi significa che non è un vettore

binario ma funziona sia nei batteri (ampR) che nelle piante (promotore 35S); il promotore è forte e

costitutivo, fa espressione proteica ad alti livelli, quindi quando viene utilizzato? Non funziona con

agrobatterio (manca LB e RB, quindi non si integra), è transiente perché non ha il marcatore di

selezione per le piante.

PFF19; 4.2 kb Sono due; PFF19G e PFF19K.

MCS, promotore, 35S enhancer

per aumentare efficienza di

trascrizione; Puc 120 (high copy),

ampR, ori; il clonaggio si fa nei

batteri ma poi si verifica il

funzionamento di un gene nelle

piante, fa transfezione transiente

(non c’è LB e RB e non c’è la

resistenza nelle piante).

pRT104C-myc; 3388 pb Myc è un tag che si mette al C-

terminale (3’), subito prima si ha

MCS e poi il tag che andrà

all’estremità 3’ del gene, ColE1 che

è ori per coli, ed è vettore per

indurre sovraespressione di una

proteina nelle piante a cui si può

fondere un tag che può essere

rilevata utilizzando anti-myc.

Questo plasmide ha due vantaggi: il

primo è che non ha LB e RB e non

ha una resistenza nelle piante ->

espressione transiente; però a

monte e a valle della cassetta

genica (promotore 35s, MSC con

proteina e tag) ci sono siti di

restrizione uguali (HindIII) con cui

possono tagliare la cassetta genica

e inserirlo in un vettore binario,

l’orientamento non ci interessa in

quanto è una cassetta genica con il suo promotore, e funzionerà dal 5’ al 3’ o viceversa.

pAVA: serie vettori di espressione transiente di proteine sovraespresse fuse ad un fluoroforo (GFP); a

seconda del numero si ha proteina fluorescente diversa per il colore: 319 GFP, 393 gialla.

Anche qui si ha promotore e la GFP, si hanno due siti di restrizione al 5’ e al 3’, quindi posso mettere

il tag al 3’ o al 5’. In basso è indicato anche il frame, in quanto la proteina dovrà essere in frame con il

tag.

VETTORI CON E SENZA PROMOTORE:

- MCS+YFP+TERMINATORE: in questo caso posso usarlo per studiare l’attività di un

promotore, dove si attiva, quando si attiva. Quelli che non hanno il promotore servono per

studiare proprio quel promotore.

Possono essere inseriti anche diversi tag

- Vettore con promotore; per andare a vedere l’espressione di una proteina

- Gli ultimi due esempi hanno attR1 e attR2, sono vettori gateway, quindi per ricombinazione

ESEMPI DI VETTORI BINARI

Dimensioni più grandi, sono sopra gli 8000pb; servono per espressione stabile.

pCAMBIA

Famiglia di plasmidi indicati con numero pbr322 (low copy),

kanamicina, fuori dal tDNA

quindi serve per la

resistenza alla kanamicina

nei batteri, repressore

(NheI), CaMV35S che regola

l’espressione della

resistenza al BASTA

(fosfoinotricina) quindi nel

t-DNA abbiamo già una

resistenza che consente la

selezione nelle piante.

poi si ha MCS dove non c’è

altro, si ha un unico

promotore, quello delle

piante, che regola la

selezione; utilizzando

HINDIII si può clonare la

cassetta genica del vettore

con myc (PRT104,

espressione transiente);

quindi qui con un solo

passaggio si può fare il vettore binario per espressione stabile.

PCAMBIA 1302; 10549 pb Pbr322, KanamicinaR

fuori dal LB e RB (quindi

fuori dal Tdna)

CamV35S, resistenza

all’igromicina, 35s

promotore e MCS; si

può usare il 35s come

promotore oppure

andare ad usarlo per

clonarci dentro

qualcos’altro.

PMDC32 Famiglia, hanno pbr322

(lowcopy) che serve per

stabilizzare un vettore molto

grande; kanamicinaR nei

batteri, igromicinaR nelle

piante perchè si trova nel LB e

RB (Tdna), 2x35S quindi

promotore raddoppiato con

enhancer quindi promotore

forte; si hanno le sequenze

attR1 e attR2 e gene ccdB,

vettore gateway; per inserire

sotto il controllo del

promotore 35S devo utilizzare

il sistema gateway.

Le dimensioni sono del vettore

vuoto, 11752 pb.

pEarlyGate 104 N-YFP: ha la YFP all’N-

terminale della

proteina; infatti si ha

35S, YFP in giallo, e poi

gateway in grigio dove

ci si ricombinerà il

nostro gene di

interesse e sarà in

frame con la YFP; LB-

RB, kanamicinaR nei

batteri, BAR gene che

conferisce la resistenza

al BASTA.

PEarlyGate 101 (C-YFP-HA) In posizione C-terminale

della proteina si ha YFP

e l’epitopo HA.

Si ha 35S in verde, in

grigio gateway, dove

verrà inserito il nostro

gene; subito dopo si ha

la porzione in giallo YFP

e la porzione in verde

che è HA di 11 aa e poi

termonatore; si ha LB e

RB, resistenza al BASTA,

35S.

Per descriverlo: vettore

binario, si vede RB e LB,

ha resistenza alla

kanamicina nei batteri,

non c’è ori, ha

promotore costitutivo

forte 35S sotto il cui

controllo verrà inserito

un gene che produrrà una proteina fusa a YFP e HA quindi consentirà l’espressione stabile di una

proteina rilevabile mediante fluorescenza oppure di rilevarla grazie all’epitopo HA.

pEarlyGate 201 (N-HA) N-HA: avrà all’estremità N-

terminale della proteina

l’epitopo HA (azzurro); è un

vettore binario LB e RB,

35S, HA, gateway,

terminatore.

Vettore che si usa per la

sovraespressione di una

proteina fusa all’HA, utile

per studiare gli effetti della

sovraespressione di un

gene, non si può usare un

plasmide che ha un tag

troppo grosso, che può

alterare il folding, può

coprire i domini di

interazione o catalitici,

quindi si utilizzano epitopi

piccoli come HA o FLAG che

non dovrebbero alterare il

folding e ci permettono di

fare studi più precisi con WB, immunoprecipitazione ecc.

pEarlyGate 202 (N-FLAG) Questo invece che HA, all’N-

terminale ha l’epitopo FLAG.

Si possono usare vettori transienti o stabili anche come gli RNAi vector, per indurre silenziamento

genico.

Si prende un pezzo di un gene, inutile prendere tutto il gene, al massimo 500 pb che vengono inseriti

con orientamento opposto al gene stesso.

I vettori RNAi: hanno il gene o siti in cui si inserisce il gene, 2 con orientamenti opposti e sono

sempre intervallati da un introne; questo porta quando si ha la trascrizione del pezzetto a produrre

un messaggero con due porzioni complementari, quindi forma un loop che è l’introne che però si

accoppia su se stesso, e si forma mRNA a doppio filamento: si attiva il sistema del silenziamento, si

toglie con splicing il loop, arriva dicer, lo spezzetta e i vari singoli pezzetti prodotti si vanno ad

appaiare con il messaggero della proteina, si produce un mRNA a doppio filamento, viene degradato

anche l’RNA target e quindi si ha in teoria il silenziamento genico.

In teoria perché il sistema può essere più o meno efficiente. Il silenziamento è modulabile.

pANDA

Plasmide giapponese; ha ccdb a sx e dx con introne, vettore per silenziamento genico, come

promotore si ha l’ubiquitina, che consente silenziamento genico nelle monocotiledoni (fatto in

Giappone dove la maggior pianta commercializzata è il riso, monocotiledone).

Se dobbiamo creare un R