Biologia Molecolare - disciplina che si concentra sulla comprensione delle basi molecolari riguardanti la trasmissione e l'espressione dell'informazione genetica

Regolazione eucariotica

Tale regolazione si realizza attraverso l'integrazione dei ruoli di numerose proteine, dette attivatori di regolazione che, controllando sia positivamente che negativamente la trascrizione di geni specifici, sovraintendono a:

• Normale funzionamento della cellula
• Al differenziamento dei vari tessuti di un organismo
• Allo sviluppo di esso

La funzione di molti regolatori è influenzata da stimoli esterni, permettendo all'organismo di reagire a specifici segnali.

Questo complesso apparato di attivatori e co-attivatori, e repressori permette il controllo della trascrizione della maggior parte degli mRNA:

• Sia stimolando e aumentando il livello basale della trascrizione
• Che modificando lo stato della cromatina, così che le regioni di controllo di specifici geni diventino accessibili all'apparato trascrizionale solo in determinati momenti della vita della cellula e dell'organismo

Questi meccanismi di controllo sono conservati negli eucarioti: dal lievito all'uomo.

Struttura modulare dei promotori eucariotici

Un P è costituito da vari elementi che si possono suddividere in 2 gruppi distinti:

• Quelli prossimali al sito d'inizio trascrizione, fino a circa 200 pb, a cui si legano i fattori basali, la polimerasi e alcuni attivatori
• Quelli distali che si trovano anche a 100 kb di distanza, ai quali si legano i tcf

Nella regione prossimale del P vi sono elementi sul DNA a cui si legano attivatori o repressori.

Nel lievito, la maggior parte dei geni ha un elemento detto TATA box che si trova da -100 a -200 pb dal sito d'inizio della trascrizione, al quale si legano specifici attivatori per il gene posto a valle.

Negli eucarioti multicellulari il P è ricco di sequenze regolatrici costituite da molti elementi prossimali posti fino a -200 pb dal sito d'inizio.

Queste sequenze di DNA sono state individuate attraverso la delezione nella regione del P, usando un gene reporter per saggiare l'attività trascrizionale. Un P eucariotico viene posizionato a monte del GFP, proteina fluorescente verde, e il plasmide che contiene questo costrutto è trasfettato in cellule eucariotiche in coltura.

Cellule, citoplasma, GFP, nucleo.

Una serie di delezioni che coprono la regione prossimale permette di individuare le sequenze del P su cui si legano i fattori basali e di regolazione, essenziali per la sua trascrizione. Esempio: P del gene codificante la metallo-tioneina, coi relativi elementi di controllo.

TFIID, TATA, 0, 2p.

I siti di riconoscimento prossimali nel P sono formati da sequenze nt che si presentano a blocchi, box, quali:

• La CAAT box: ci si lega il tcf CBF, CAAT Binding Factor, o NF-Y; la CAAT box funziona in entrambi gli orientamenti e si ritiene che influenzi l'efficienza di un P, ma non ne determina la specificità trascrizionale.
• La GC box, GGGCGG: ci si lega il fattore Sp1, identificato come necessario per la trascrizione dei geni precoci e tardivi del virus SV-40, e coinvolto nell'espressione di molti geni necessari per la vitalità delle cellule dette housekeeping.

Per purificare la proteina si effettua cromatografia per affinità, usando sferette di agarosio con legate le sequenze GC.

Molti elementi prossimali sono presenti in geni che vengono trascritti costitutivamente, ma anche nei P di geni coinvolti nella risposta a vari tipi di stress o all'esposizione a metalli pesanti come il gene per la metallo-tioneina, che contiene:

• Siti MRE, Metal Response Element
• GRE, Gluco-corticoid Response Element
• Siti di legame per tcf, Sp1, Ap1 e Ap2

Sp1, -40, -149, 40, 40, -29, -100.

SV40, promotore precoce. Timidina kinasi. Istone H2B. CAAT, GC, ottamero di 8 pb.

Altra frequente sequenza di risposta è l'ottamero, costituito da 8 paia di basi. A questo elemento si lega la proteina Oct-1, che è un attivatore che agisce su molti geni, come quelli per l'attivazione del gene per istone H2B.

Nelle cellule della linea linfoide, al posto di Oct-1, si lega all'ottamero la proteina Oct-2, che attiva specificamente il gene per la catena leggera delle Ig: ciò indica che Oct-2 è un attivatore specifico, mentre Oct-1 può attivare geni diversi.

Entrambe le proteine si legano allo stesso elemento sul DNA e la loro attività dipende dal P a cui sono legate, da dove si legano sul P e dal numero di interazioni con altri tcf.

Attivatori inducibili e elementi di risposta

Attivatori costitutivi. Dimensioni, elemento di risposta, agente, fattore regolatore, consenso, dalton, distribuzione, consenso DNA occupato, attivatore, modulo.

• CNNGCCNNTCCNNG, HSTF, 93.000, HSE, shock termico, ubiquitaria
• GGCCAATCT, CTF/NF1, CAAT box, ubiquitaria
• TGGTACAAATGTTCT, GR, 94.000, GRE, glucocorticoidi, ubiquitaria
• GGGCGG, Sp1, 20 bp, GC box, CGNCCCGGNCNC
• MRE, cadmio, ubiquitaria
• ATTGCAT, Oct-1, 20 bp, ottamero
• TGACTCA, AP1, TRE, 39.000, JPA, linfoidi
• ATTGCAT, Oct-2, 23 bp, ottamero
• CCATATTAGG, SRF, SRE, 52.000, siero, linfoidi
• GGGACTTTCC, NFkB, kB, 10 bp, ubiquitaria
• GGGACTTTCC, NFkB, kB, 10 bp, ubiquitaria
• GTGACGT, ATF, 20 bp, ATF

Elementi distali: enhancer

Gli elementi distali, enhancer, amplificatori, contengono molti elementi o sequenze di riconoscimento alle quali si legano tcf con funzione attivatrice.

Gli attivatori che si legano ad un enhancer formano un complesso detto enhanceosoma; questo complesso proteico entra in comunicazione con le regioni prossimali del P, attraverso la formazione di un'ansa sul DNA, allorché gli attivatori legati all'enhancer interagiscano col mediatore, il quale richiama la polimerasi e ne facilita il legame al P.

Alcuni dati suggeriscono che regioni apparentemente molto distanti a livello di sequenza di DNA sono in realtà vicine fisicamente a causa della struttura ad anse dei cromosomi eucariotici, spiegando in parte l'azione degli enhancer molto lontani.

Questi elementi cis-agenti sono di solito posizionati a 700-1.000 pb dal sito d'inizio trascrizione, con lunghezza intorno alle 500 pb e contengono in media 10-12 siti di legame per tcf diversi.

Fino a -10 kpb. Fino a 10 kpb. TATA. Nel caso della regolazione dei geni per i recettori degli odori nel topo sembra esistere un enhancer che regola geni che si trovano su cromosomi diversi. Distanza. Unità di trascrizione. Enhancer. Orientamento. Unità di trascrizione.

Caratteristiche degli enhancer

1. Possono funzionare in entrambi gli orientamenti rispetto alla direzione della trascrizione.
2. Possono trovarsi sia a monte che a valle del gene che controllano.
3. Possono essere localizzati negli introni dello stesso gene che viene controllato.

Gli enhancer, oltre a sequenze specifiche per gli attivatori trascrizionali, contengono anche sequenze che, solitamente, si trovano nella regione prossimale del P, come l'Oct e i siti di legame per i vari tcf Ap1, Ap2, Sp1.

La specificità della trascrizione è controllata sia dalla regione del P che dall'enhancer.

• In alcuni casi questa specificità è data dalla regolazione a livello del P e l'enhancer è usato per aumentare il livello del messaggero prodotto.
• In altri casi il P del gene è attivato solo se l'enhancer che lo controlla è a sua volta attivato.

Vi sono 2 teorie sul tipo di informazione contenuta negli enhancer:

1. I tcf si legano ad essi in modo cooperativo, coordinato e specifico, per formare l'enhanceosoma. Si è visto che mutazioni puntiformi, che alterano il legame di un singolo componente, hanno un effetto evidente sull'azione globale dell'enhancer.
2. Gli enhancer sono visti come flessibili, ovvero come piattaforme dove vari attivatori e co-attivatori si legano in modo dipendente gli uni dagli altri e il loro effetto combinato è letto dal mediatore e dall'apparato basale di trascrizione, quando la zona dell'enhancer entra in contatto con la zona prossimale del P.

Silencer e isolatori

Vi sono altri elementi che funzionano in modo simile agli enhancer, detti silencer, legando però repressori, e non attivatori. Come gli enhancer possono trovarsi a valle o a monte dei geni che controllano.

Questi repressori agiscono in modi diversi:

• Possono mascherare la regione di attivazione agli attivatori.
• O competere col legame sul mediatore.

Altro gruppo di elementi di controllo che agiscono in cis sul DNA è rappresentato dagli isolatori, elementi posizionati in modo tale da influenzare l'azione degli enhancer contigui.

Vi sono casi usati per isolare in una direzione l'azione di un enhancer che potrebbe influenzare due P diversi.

Hanno doppia funzione:

• Impediscono l'attivazione o repressione di un gene da parte di un enhancer o di un silencer.
• Agiscono come “marcatori” di confine, tra una zona di eterocromatina e una zona di eucromatina.

Un isolatore contiene siti di legame per proteine che, nel caso della struttura della cromatina, impediscono il propagarsi e l'espandersi di regioni eterocromatiche.

La regolazione di tessuto-specificità o di risposta di un gene si integra con quella degli attivatori generali e fattori basali nel controllare con precisione e senza ambiguità la trascrizione di un determinato gene.

Questo meccanismo combinatorio è il risultato del legame specifico sul DNA degli attivatori trans-agenti.

Struttura modulare e domini dei TCF trans-agenti

Nel ciclo vitale del fago lambda si è visto che la proteina CI di lambda, repressore, attiva la trascrizione del suo stesso gene. CI legata a OR2 attiva la trascrizione, interagendo col complesso dell'RNA polimerasi; il sito di attivazione del repressore CI non è lontano dai domini con cui CI si lega al DNA.

Anche gli attivatori della trascrizione degli eucarioti contengono un dominio di legame al DNA e un dominio di attivazione, ma questi due domini appartengono a due regioni diverse della proteina.

Un attivatore trascrizionale è la proteina Gal4, richiesta per attivare la trascrizione dei geni per l'uso dello zucchero galattosio nel lievito S. cerevisiae, legandosi al P del gene GAL1.

Presenta 2 domini funzionali separati:

• Uno che lega il DNA come un dimero.
• L'altro che attiva la trascrizione interagendo col complesso di inizio e la polimerasi.

Come si vede in figura Gal4 si lega a 4 siti che contengono ciascuno una sequenza di 17 nt e che fanno parte della regione UAS, situata a circa -270 pb a monte del sito d'inizio della trascrizione del gene GAL1.

Con Gal4 la trascrizione di questo gene aumenta di circa 1.000 volte.

Vi sono stati esperimenti che hanno chiarito il funzionamento di Gal4, definendo la natura generale degli attivatori e la trascrizione negli eucarioti.

1) Usando come gene reporter il gene batterico per la β-galattosidasi sono stati analizzati gli effetti di diverse proteine artificiali che avevano come base la proteina Gal4.

Gal4 wt si lega al suo sito specifico ed attiva la trascrizione del gene lacZ. Ciò è facilmente visibile perché le cellule delle colonie di lievito, in cui sono presenti i vettori che contengono il gene reporter e le varianti di Gal4 da analizzare, diventano di colore blu se il gene viene espresso.

Se si elimina la regione col dominio di attivazione trascrizionale, Gal4 lega il DNA ma non attiva la trascrizione. Si è così individuato il dominio di attivazione trascrizionale di Gal4.

2) Qui si è dimostrato che il dominio di legame al DNA e il dominio di attivazione di un tcf sono distinti e funzionalmente intercambiabili.

Davanti al gene reporter lacZ è stata posta la sequenza di DNA di legame riconosciuta dal repressore batterico LexA.

Una proteina artificiale, in cui il dominio di legame al DNA di Gal4 è stato sostituito dal dominio di legame al DNA di LexA, può legarsi alla sequenza di DNA riconosciuta da LexA, ma non attiva la trascrizione, poiché priva del dominio di attivazione trascrizionale.

Se si produce, tramite le tecnologie del DNA ricombinante, una proteina ibrida, col dominio di legame al DNA di LexA fuso al dominio di attivazione, la trascrizione viene attivata normalmente. Questo esperimento, in cui un repressore è stato trasformato in un attivatore, ha dimostrato che gli attivatori trascrizionali sono composti da due domini separati.

La colorazione è dovuta alla presenza della sostanza X-gal nelle piastre di agar, dove vengono fatti crescere i lieviti trasformati. X-gal è formato da un galattoside legato a un indolo e, se il gene lacZ è trascritto, la β-galattosidasi prodotta separa il galattoside dall'indolo che, venendo ossidato, determina la caratteristica colorazione blu delle colonie.

Domini funzionali dei trans-attivatori: domini di legame al DNA

Questi domini di legame sono costituiti da strutture ad α-elica che riconoscono la sequenza specifica di DNA interagendo col solco maggiore della doppia elica.

Tale solco, avendo più atomi in grado di ricevere o donare legami H, ha un “linguaggio” più ricco del solco minore per formare legami ad alta affinità coi residui aa, che si affacciano sull'α-elica.

Le interazioni specifiche tra DNA e proteina sono dovute a legami a H e ad interazioni idrofobiche che la proteina forma con la sequenza di DNA.

Il riconoscimento coinvolge sequenze specifiche sul DNA, mentre per poter essere individuata nella vasta complessità di sequenze di un genoma, una sequenza nt di riconoscimento dovrebbe essere lunga almeno 7 nt; infatti la specificità viene aumentata dal fatto che gli attivatori dimerizzano e quindi le sequenze di riconoscimento sono costituite da elementi doppi sul DNA.

La cristallografia a raggi X ha risolto un numero enorme di strutture di proteine che legano il DNA e, confrontando questi domini, gli attivatori sono stati raggruppati in diverse categorie, in base ai “motivi” coi quali si legano al DNA.

Elica-giro-elica e omeodominio

Uno dei primi ad essere individuato negli studi sui repressori batterici dell'operone del batteriofago λ e nel repressore Cro del fago λ.

La struttura generica di HTH è costituita da 3 α-eliche ripiegate, in cui la terza α-elica, detta elica di riconoscimento, si posiziona nel solco maggiore del DNA.

I residui aa dell'elica R, che si affacciano sul DNA, interagiscono specificamente con le basi della sequenza di riconoscimento; la sostituzione di una di queste basi abbassa notevolmente l'affinità della proteina per quella sequenza.

Vi sono anche varianti di questa struttura, per esempio:

• Vi sono casi in cui le α-eliche possono essere sempre un'elica R che interagisce nel solco maggiore della doppia elica.
• Altra variante è data dalla struttura che presenta un'ala, wing, formata da due foglietti.

Di questa famiglia di attivatori fa anche parte l'omeodominio, motivo costituito da 60 aa, individuato in Drosophila, ed è caratteristico dei regolatori dei geni omeotici che controllano lo sviluppo dell'intero organismo, ma è presente anche in regolatori trascrizionali di mammiferi, incluso l'uomo, che controllano più di un centinaio di geni.

L'HO è costituito da 3 α-eliche strutturate come nel dominio HTH, in cui l'elica R contatta il solco maggiore, riconoscendo una sequenza di DNA. Oltre a queste contiene anche un braccio flessibile, non strutturato, che interagisce specificamente col solco minore del DNA per la specificità e stabilità del legame. Le interazioni col solco minore saranno essenziali.

3'. 5'.

Dominio a dita di zinco finger

Individuato nel fattore TF3A di Xenopus laevis, necessario per la trascrizione dell'rRNA.

L'espressione “dita di zinco” deriva dallo schema della sua struttura, dove un atomo di zinco coordina 4 residui di cisteine e/o istidine, formando un'ansa che ricorda la forma di un dito.

La sequenza aa presenta, a livello di struttura 1°, 2 cisteine e 2 istidine distanziate tra loro di 3, 13 e 3 residui.

Nella struttura 2° le 2 Cys e 2 His vanno a legare un atomo di zinco, formando un'ansa di circa 12-13 aa.

La risoluzione della struttura tridimensionale ha rivelato che l'ansa è divisa in due domini diversi, formando una struttura a foglietto beta e un'alfa-elica.

Nella struttura 2° e tridimensionale