Biologia Molecolare - disciplina che si concentra sulla comprensione delle basi molecolari riguardanti la trasmissione e l'espressione dell'informazione genetica

I

SV40 (promotore precoce) Ei

I I I

11

Tlmldlna klnasl Ei

I ■ I

11

11

Istone H2B • □ I

CAAT GC

Ottamero è~ ' 8pb.

Altra frequente sequenza di risposta mer& O~ costituito da p

agisce

è

A questo elemento si lega la proteina t-1 che un attivatore che su molti

H2B. '

come quelli per l'attivazione del gene per istone

NE:lle cellul_

e della line~ linfoide, al posto di Oct-1, si lega all'ottamero la proteina ~ che

➔ Oct-2lÌ?n

attiva specificamente gene per la catena leggera delle lg ciò indica che

11

attivatore specifico, mentre Oct-1 può attivare geni diversi. ➔

DNA

si legano allo stesso elemento ~ s u l la loro

Entrambe le proteine è'aftipo

°'a'àzfon~'è P che

legata a dove si legano sul e al numero di Interazioni inataurimo

con altri tcf. Attivatori lnduclb/11 e elementi di risposta

Attivatori costitutivi Dimensioni

Elemento

Agente Fattore

Consenso (dalton)

Distribuzione di risposta

Consenso regolatore

DNA occupato

Attivatore

Modulo CNNGCCNNTCCNNG HSTF 93.000

HSE

ubiquitaria Shock termico

GGCCAATCT

2211!)

CTF/NF1

CAAT bOX TGGTACAAATGTTCT GR 94.000

GRE

Glucocortlcoldl

ubiquitaria

GGGCGG

20 bp

SP1

GCbOX CGNCCCGGNCNC

MRE

Cadmio

ubiquitaria

ATTGCAT

20 bp

Oct-1

Q!tame1O TGACTCA AP1

TRE 39.000

JPA

linfoidi

ATTGCAT

23 bp

Oct-2 CCATATTAGG SRF

SRE

ottamero 52.000

Sie/O

linfoidi

GGGACTTTCC

10 bp

NFkB

kB

' ubiquitaria

GGGACTTTCC

10 bp

NFkB

kB ubiquitaria

GTGACGT

20 bp

ATF

ATF

r;;'\ distali, ENHANCE~

Gli elementi ~etti (~mplific~t~ conteng?no mo~ti el~menti o

'\..!JJ sequenze di riconoscimento alle quali sI legano 14Q!Jcon funzione att,vatnce. ➔

enniiic_e_o_s_

o_r@

_

Gli attivatori che si legano ad un enhancer formano un complesso detto

questo complesso proteico entra in comunicazione con le regioni prossimali del P,

attraverso la formazione di un~sul DNA, allorché gli attivatori legati all'enhancer

interagiscano col mediatore, il quale richiama la ~ l e ne facilita il legame a~ ®

Alcuni dati suggeriscono che regioni apparentemente molto distanti a livello di sequenza di

DNA sono in realtà vicine fisicamente a causa della struttura ad anse dei cromosomi eu,

in parte l'azione degli enhancer molto lontani.

spiegando

elementi cis-agent~sono sito

Questi di solito posizionati a 700-1.000pb dal d'inizio

siti

trascrizione, con lunghezza intorno alle §.Q_Qpb e contengono in media 10-12 di legame

per tcf diversi. ----

Fino a - 10 kpb

Nel caso della +

Fino a 10 kpb

regolazione dei •--~--1

TATA

geni peri Es E

u

,,LI 7/"'Q--

ra, ....

recettori degli ,~ ~

odori nel topo

sembra esistere

un enhancer

che regola geni

si trovano

che

su cromosomi

diversi. 4

Distanza

A. mww@

I ~ Unità di trascrizione

Enhancer l

1 ~ l

B. Orientamento 1

trascrtzlane

Rh@Nbè

Èrihàllcet~ ~. gJ

Unità

i <

a

f»l:t:e9 Lr - I

~

Caratteristiche enhancer:

1. possono funzionare in entrambi gli orientamenti rispetto alla direzione della

trascrizione

2. possono trovarsi sia a monte che a valle del gene che controllano

3. possono essere localizzati negli introni dello stesso gene che viene controllato.

Gli ·enhancer:

- oltre a sequenze specifiche per gli attivatori trascrizioneli,

- contengono anche sequenze che, solitamente, si trovano nella rlglone prossimal4t

del"F>, come l'Oct e i siti di legame per i vari tcf Ap1, Ap2, Sp1.

La specificità della trascrizione è controllata sia dalla regione del P che dall'enhancer. è

- In alcuni casi questa specificità è data dalla regolazione a livello del P e l'enhancer

usato per aumentare il livello del messaggero prodotto. è

il

- In altri casi P del gene è attivato solo se l'enhancer che lo controlla a sua volta

attivato.

Vi sono 2 teorie sul tipo di info contenuta negli enhancen

l

1. tcft,i legano ad essi in modo cooperativo, coordinato e specifico, per formare

l'enhanceosoma. il

Si è visto che mutazioni puntiformi, che alterano legame di un singolo

componente, hanno un effetto evidente sull'azione globale dell'enhancer.

flex~

bl~ b11b0a~ ,

2. Gli en_han~er ~ono ~lsti com~ owero come~ agli altri e il

dove van attivatori e co-attIvaton sI legano modo dipendente gli uni

in

I è

loro effetto combinato letto dal mediatore e dall'apparato basale di trascrizione,

quando la zona dell'enhancer entra in contatto con la zona prossimale del P.

agli

definithSILENCER

Vi sono altri elementi che funzionano in modo simile enhancer,

➔

legando però repressori, e non attivatori come gli enhancer possono trovarsi a valle o a

monte dei geni che controllano.

Questi repressori agiscono in modi diversi:

- Possono mascherare la regione di attivazione agli attivatori

competere col legame sul mediatore.

- O

Altro gruppo di elementi di controllo che agiscono in cis sul DNA è rappresentato dagli

➔ elementi posizionati in modo tale da influenzare l'azione degli enhancer

' ISOLAI.ORI

contigui.

Vi sono casi usati per isolare in una direzione l'azione di un enhancer che potrebbe

sQ11D

influenzare due P diversi.

Hanno doppia funzione:

- Impediscono l'attivazione o repressione di un gene da parte di un enhancer o di un

silencer

- Agiscono come "marcatori" di confine, tra una zona di eterocromatina e una zona di

eucromatina.

Un isolatore contiene siti di legame per proteine che, nel caso della struttura della

cromatina, impediscono propagarsi e l'espandersi di regioni eterocromatiche .

il ........................................... .

A .-.

La~ ne rego1atort

di t~ss~sp~lff4i o duisposrdl~ i integra co~uella degli

basah net controllare con precisione e senza am uità la

attivatori generale e fattori

trascrizione di un determinato gene.

+ sul

il

è

Questo meccanismo combinatorio risultato del legame specifico DNA

attivatori trans-agenti,

degli 6

STRUTTURA MODU LARE E DOMINI DEI TCF (TRANS-AGENTI)

(repressore

Nel ciclo vitale del fago lambda si è visto che la proteina Cl di lambda) attiva

➔ Cl legata a OR2 attiva la trascrizione, interagendo col

la trascrizione del suo stesso gene

poi ➔

complesso dell'RNA il sito di attivazione del repressore Cl non è lontano dai domini

con cui Cl si lega al DNA. sjtp ltqaawe al

dj

attivatori

~nch~ gli tlella trascrizione degli~ ontengono un e u_n

DNA

pJio_ctLaj!ivazione, ma questi due domini appartengono a due reg ioni diverse della proteina.

Dominio

G

Un attivatore trascrizionale è la rotein di ~

richiesta per attivare la trascrizione ei geni per

l'uso dello zucchero galattosio nel lievlto S. Dominiod

cerevisiae, legandosi al P del gene GAL 1. al DNA

Presenta 2 domini funzionali separati:

il DNA come un dimero

- Uno che lega la trascrizione interagendo

- L'altro che attiva la polimerasi.

col complesso di inizio e

Come si vede in figura Gal4 si lega a 4 siti che

contengono ciascuno una sequenza di 17nt e

che fanno parte della regione UAS, situata a

circa -270pb a monte del sito d'inizio della

1.

trascrizione del gene GAL

Con Gal4 la trascrizione di questo gene

aumenta di circa 1.000 volte.

Vi sono stati eriment1 he hanno chiarito il funzionamento di Gal4, definendo la natura

generale degli a 1va on e la trascrizione negli eu:

rep~~el'_ (laol)tsi

1) Usa~do ~o~e il gene batterico per la B-galattosidasi sono

proteina\

ar:iahzzat1 gli effetti d1 diverse proteine artificiali che avevano come base la

Gal4.

<!a14 wtsi lega al suo sito specifico

la trascrizione del gene

ed attiva

lacZ.

è

Ciò facilmente visibile perché le

cellule delle colonie di lievito, in cui

sono presenti i vettori che

il gene reporter e le

contengono

varianti di Gal4 da ~are

divent~no di color~e iÌ gene

- viene espresso.

la regione col

Se si elimina

dominio di attivazione

trascrizionaleQ ~

lega

· al DNA

ma non attiva la tras · ion •' • . .

➔ individuat attivazione

il dominio di

è

si o cosl

trascrizionale di Gal . e 7

è il

2) Qui si dimostrato che dominio di legame al DNA e il dominio di attivazione di un

tcf sono distinti e funzionalmente intercambiabili.

è

Davanti al gene reporter lac~ Dominio

stata posta la sequenza di DNA di legame ~

riconosciuta dal repressore alDNA

~

battericoJ-exA. laèZ

~=., :;;:; ·r;:=µw:ç #

Una proteina artificiale, in cui il @

,,_

dominio di legame al DNA di Sito di

è

Gal4 stato sostituito dal

dominio di legame al DAN di

LexA, può legarsi alla sequenza

di DNA riconosciuta da LexA,

ma non attiva la tra~ ione,

poiché priva del do~ io di

att~ one trà~ zionale.

Se si produrre, tramite

fa

tecnologie del DNA

ricombinante, una proteina

ibrida, col dominio di legame al DNA di LexA fuso al dominio di attivazione, la

➔

trascrizione viene ~ normalmente. questo esperimento, in cui,un

\.repressore è stato trasformato in un attivatore, ha dimostrato che gli attivatori

sono composti da due domini separati.

trascrizionali

La colorazion@è dovuta alla presenza della sostanza nelle piastre di agar, dove

X-gal

\

I

. vengono fatti crescere i lieviti trasformati.

X-gal è formato da un galattoside legato a un indolo e, se il gene lacZ trascritto, la 8-

è

, galattosidasi prodotta separa galattoside dall'indolo che, venendo ossidato, determina la

il

caratteristica colorazione blu delle colonie. 8

DOMINI FUNZIONALI DEI TRANS-ATTIVATORI: DOMINI DI LEGAME AL

DNA

Questi domini di legame sono costituiti da strutture ad a-elical che riconoscono la

sequenza specifica di DNA interagendo col solco f u ~ ella doppia elica.

Tale solco, avendo più atomi in grado di ricevere o donare legami H, ha un "linguaggio"

del solco minore per formare legami ad lata affinità coi residui aa, che si

più ricco

affacciano sull' a-elica.

Le interazioni specifiche tra DNA e proteina sono dovute a legami a H e ad interazion