Biologia Molecolare

Struttura e funzione dei recettori nucleari

RECETTORE 12 alfa eliche formano un sandwich elicoidale antiparallelo a tre strati: tratonucleo-centrale a 3 eliche circondato da due strati aggiuntivi che cost la cavità dove va a collocarsi illigando. Cavità idrofobica e varia in base al ligando x int con diversi ligandi.In ASSENZA di ligando i rec per gli steroidi si trovano nel citoplasma associati a Heat shock proteinHSP90.

SITI LEG DNA HRE: possono trovarsi nella regione del promotore prossimale dei geni bersaglio,oppure a distanze kb dal sito di inizio trascrizione.Sono composti da seq nucleo di 6 basi che cost motivo di riconoscimento centrale.Due seq consenso: AGAACA steroidei – AGGTCA restanti rec.Visto che la magg rec sono eterodimeri HRE sono quasi sempre composti da due motivi vicini chepossono essere: ripetiz diretta o invertita o palindrome.STEROIDI legano AGAACA palindromica →NON STEROIDEI ripetizione diretta dei due emisiti: 3-5 spaziatura VIT D/THR/RAR1

spaziatura RXRTHR/RAR/VDR eterodimeri con RXR perché aumenta efficienza di leg al DNA.

• →CO_ATTIVATORI fam p160 al N term segnale di localiz nucleare e i dom bHLH. Reg ricca diser/thr ed una glutammina al C term.I dom di attivazi trascriz si trovano al C term dove è presente un dom con attività HATLXXLL alfa-elica anfipatica nella quale le leucine formano una sup idrofobica sul lato dell'elica. Tascaidrofobica del rec formata da E',E4,E12 sup legame con i co-attivatori.

• →Co-REPRESSORI AF-2 cambia conformazione dopo int con il ligando, ha un effetto negativo sullegame dei co-repressori.I rec nucleari che mancano di questa regione funzionano da repressori costitutivi.

• →TERMINAZIONE Ubiquitina ligasi SUG1.I rec nucleari vengono fosforilati all' N-term, quelli P da MAPK sono riconosciuti come segnali per ilreclutamento dell'ub ligasi.Oligo-ub: favorire la trascrizione associaz complesso pre-inizioPoli-ub:

favorisce la degradazione delle proteine marcate con ubiquitina. È composto da un cilindro centrale costituito da quattro anelli di proteine, con un canale centrale attraverso il quale le proteine vengono trasportate per la degradazione. Il proteasoma riconosce le proteine marcate con ubiquitina e le degrada in peptidi più piccoli che possono essere riciclati o eliminati dalla cellula. L'ubiquitinazione è un processo fondamentale per il controllo della qualità delle proteine all'interno della cellula. Oltre alla degradazione, l'ubiquitinazione può anche influenzare la localizzazione cellulare, l'attività enzimatica e le interazioni proteina-proteina. Inoltre, l'ubiquitinazione è coinvolta in molti processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare, la risposta allo stress, la segnalazione cellulare e l'immunità. Malfunzionamenti nell'ubiquitinazione sono associati a diverse malattie, tra cui il cancro, le malattie neurodegenerative e le malattie autoimmuni. In conclusione, l'ubiquitinazione è un processo chiave per il controllo della qualità delle proteine e per la regolazione di numerosi processi cellulari. Il proteasoma svolge un ruolo fondamentale nella degradazione delle proteine marcate con ubiquitina, garantendo l'omeostasi proteica all'interno della cellula.ha il compito di degradare polipeptidi all'interno della cellula. Sebbene la sua funzione sia simile a quella del lisosoma, differisce da esso per alcuni motivi nel particolare, il proteasoma è un complesso proteico atto a degradare i peptidi, il lisosoma è un compartimento cellulare dotato di membrana cellulare deputato alla degradazione di svariate sostanze tramite l'azione di acidità ed enzimi proteolitici. NOTCH• LIGANDI → Sono proteine che NON vengono secrete ma che presentano un dominio idrofobico transmembrana. L'esposizione del ligando sulla membrana non è sufficiente per la sua attivazione ma il legame e ubiquitinazione ad E3 ubiquitin ligasi Neur e Mind bomb sono passaggi necessari per l'attivazione del ligando. L'ubiquitinazione e l'endocitosi mediata da Epsin (proteina che lega l'ubiquitina) sono requisiti importanti per l'internalizzazione dei ligandi e per renderli idonei al legame con Notch. Per localizzare il ligando sulla

sup della cell viene reg da prot ECHINOID che è una molec diadesione con dom CS simili alle Ig ed accompagna il ligando nelle vescicole endocitiche.

• RECETTORI→LNR 35-40aa cisteine impegnate in ponti disolfuro e da residui di asparagina ed aspartato cherichiamano uno ione calci importante per mantenere la struttura integra.
• RAM Lega co-fatt trascrizione lega CSL→TAD transcription activatin domain contatto mediante GTF e HAT x degradazione espegnimento.

NOTCH E’ UNA GLICOPROTEINA e la glicosilazione della regione extracell ha un ruolo regolatorio sulle proprietà di interazione con il ligando da parte dei suoi recettori. Ofut oltre ad agg fucosio è una chaperonina che promuove il corretto ripiegamento di Notch ed il trasporto dal RE a membrana. Itch/Deltex interagisce con Notch nel dom RAM/ANK

• TRASDUZIONE: Riarrang cromosomici che troncano il dom extracell TAN1 (Notch 1) e INT3 (Notch4) genera prot costitutivamente attive:

oncoproteine→Gamma secretasi complesso enzimatico contenente presenilina come componente catalitico.

Substrato presenilina APP Alzheimer.

GSK3 fosforila gamma secr può controllare in modo negativo la via di Notch.

Si pensa che il terzo taglio avvenga dopo endocitosi del recettore perché necessita dell’ubiquitinazione di una LISINA giustapposta alla membrana plasmatica.

→CSL Lega dom tramite RHR all’ N-ter, non ha zinc finger e lega con il dom BTD con tasca idrofobica i dom RAM/ANK.

In assenza di segnale lega repressori SMRT/NCor che contengono domini SANT proteici che sono caratteristici di proteine che legano la cromatina e si associano ad HDAC: Il legame con i repressori spesso non diretto ma mediato da SKIP (co-reg trascriz).

CSL prende contatto con acido nucleico del DNA tramite sua porzione N-term.

→SKIP recluta chinasi CDK8 che fosforila NICD nel dom PEST diventa sub per ubiquitina ligasi nucleare SEL10 e degradato nel proteasoma.

→MODIFICAZIONI NOTC

fosforilazione del dominio PESTUbiquit del dominio PEST e della porzione iuxta-membrana / Acetilazione del dominio ANKEFRINEIl dominio TRK degli Eph (recettori) si attiva in seguito al legame con le efrine e dà inizio ad una via di segnalazione chiamata ANTEROGRADA all'interno della cellula che esprime il recettore.Allo stesso tempo, nella cellula che esprime il ligando si attiva la via RETROGRADA.In assenza di interazione tra Eph ed efrina, sono presenti a livello della membrana sotto forma di aggregati chiamati MICRODOMINI. Questi sono localizzati nei lipid rafts.• RECETTORE → Etracell = dominio globulare con 11 beta foglietti paralleli con int G-H efrina modello chiave-serratura.Iuxtamembrana = due residui di tirosina molto conservati per autofosforilazioneDominio attività chinasica = sequenza di 60-70 aminoacidi nel C-terminale che forma un motivo SAM per la dimerizzazione dei recettori, oltre a una regione interna con dominio PDZ (sempre nel C-terminale)• LIGANDI → porzione extracellulare di 180 aminoacidi deputata al legame con i recettori.Efrine B presentano 5 siti di fosforilazione e un motivo interno con dominio PDZ perché hanno una localizzazione intracellulare.

Il dom N-term di legame alle efrine contiene un sito di legame ad alta affinità e media le interazioni tra le diverse cellule. Sono inoltre presenti due siti addizionali a bassa affinità in grado di favorire l'assemblaggio di complessi Eph-Efr multipli.

Il complesso è infatti una struttura tetramerica simile ad un anello, dove due molecole di ligando si legano a due recettori. La superficie di interazione estesa è responsabile della dimerizzazione, mentre quella più piccola è responsabile della formazione dei tetrameri circolari.

La via ANTEROGRADA dei recettori segue lo schema dei TRK. Anche la regione iuxta regola l'attività chinasi, formando un ripiegamento che interagisce con la porzione N-term del dominio chinasi, inattivandone la funzione catalitica. Si ipotizza che la fosforilazione della regione iuxta causi il distacco dal dominio catalitico attraverso un meccanismo di REPULSIONE.

La segnalazione RETROGRADA delle efrine B dipende anch'essa dalla fosforilazione in tirosina come i recettori tirosin-chinasi (RTK), mentre per le efrine A i meccanismi molecolari sono poco conosciuti: si pensa che...

avvalersi di altre proteine transmembrana come le integrine per attivare in maniera retrograda la segnalazione. La segnalazione anterograda si traduce in repulsione tra le cellule, mentre la segnalazione retrograda attraverso le efrine media attrazione/adesione cellulare. Questo gioca un ruolo importante nella guida degli assoni e nella separazione delle cellule che esprimono gli Eph da quelle che esprimono le efrine durante lo sviluppo embrionale. Inizialmente l'interazione tra Eph ed efrine è adesiva, ma successivamente diventa repulsiva. Questo è un problema perché l'adesione iniziale è intensa e ad altissima affinità. Per permettere alle cellule di separarsi, possono avvenire due processi: la trans-endocitosi o il taglio proteolitico da parte delle metalloproteasi ADAM. Tagli successivi da parte di una gamma di proteine secretorie portano all'internalizzazione delle code citoplasmatiche delle efrine B, dando inizio alla segnalazione retrograda, mentre i complessi Eph/efrina vengono internalizzati attraverso endosomi. L'adesione cellulare può risultare da una limitata attivazione della segnalazione anterograda di repulsione e può essere mediata anche da altre proteine transmembrana come le integrine.

Le proteine devono essere unfolded.

Vescicole ER TO GOLGI: tra compartimenti cellulari, fuoriescono dal compartimento con membrana per fondersi con la membrana di un altro compartimento.

Il peptide segnale 15-60aa N-term è un segnale di sorting delle proteine che indica una destinazione specifica della proteina nella cellula e al termine del sorting viene eliminato da una peptidasi.

Citosol-ER 5-10aa idrofobici

ER-Golgi 4aa al C-term che permettono il ritorno al ER

Mito alternati aa+ con aa idrofobici

Perossisomi 3aa C-term

Posizionando la N-term seq con ER signal all'inizio di una proteina citosolica indirizza la proteina nel ER.

Il peptide segnale viene riconosciuto da recettori di sorting presenti sugli organelli di indirizzamento che possono poi essere riutilizzati.

TRASPORTO CITOSOL-NUCLEO

La membrana nucleare racchiude il nucleo e costituisce il compartimento nucleare. E'