Biologia Molecolare

Interazioni nelle vie di segnalazione GPCR

La sub alfa e gamma sono ancorate alla sup citoplasmatica della membrana plasmatica con una breve coda lipidica legata alla regione N-term della sub alfa e C-term della sub gamma. Ogni proteina trimerica è quindi una proteina a sé stante, possedendo un N e C term propri.

L'apertura degli switch a seguito dell'interazione L-R porta all'esposizione della tasca che racchiude il GDP. Le regioni della proteina Galfa deputate all'interazione con il recettore sono le code N e C term. Le sub alfa e beta-gamma possono muoversi sulla membrana plasmatica grazie all'affinità per i lipidi e possono interagire con proteine relè, anch'esse ancorate alla membrana. Le diverse proteine G si distinguono per gli effetti che inducono nella cellula bersaglio: sono esse stesse relè e possono agire con effettori ionici oppure altri relè enzimi sulla membrana cell bersaglio: AC e PLC.

Adenilato ciclasi

L'adenilato ciclasi ha una tasca c1a-c2a che offre siti di legame per l’ATP e per le subunità alfa delle proteine Galfa stimolatorie ed inibitorie. La concentrazione di cAMP è controllata dalla cAMP fosfodiesterasi che idrolizza il legame fosfodiesterico del cAMP formando 5’-AMP. Come interazione con AC può essere sia stimolatoria che inibitoria? Sebbene entrambe contengano i domini alfa3-beta5 e domini interruttori simili, questi domini si trovano in posizioni diverse nelle due molecole. In Gs, si trovano vicini in modo da legarsi contemporaneamente ad un’unica regione dell'AC, mentre in Gi sono lontani e non permettono il legame contemporaneo, risultando in inibizione.

PKA è un enzima inattivo come oloenzima tetramerico formato da due subunità catalitiche e due subunità regolatorie, la cui funzione è quella di mantenere uno stato bloccato le subunità catalitiche. cAMP lega le regolatorie e causa la dissociazione dalle catalitiche: ogni regolatoria ha un sito per cAMP che si lega in modo sequenziale e cooperativo. Il primo legame al sito B favorisce il secondo legame al sito A grazie al cambiamento conformazionale. Dopo la liberazione delle subunità regolatorie, le catalitiche sono attive e possono fosforilare i loro substrati utilizzando l'ATP per trasferire un fosfato sui residui di serina o treonina di proteine come glicogeno, lipidi, CREB.

Fosfolipasi C-beta, G0 e Gq

Le risposte attivate da questa via sono simili a quelle attivate dall’acetilcolina e dalla vasopressina. PCL-beta 1-4 è attivata da Galfaq, mentre PCL-beta 2-3 da Gbeta-gamma. Galfaq attiva PCL attraverso il dom C2 e le beta-gamma agiscono il dom PH.

GRK è un enzima con organizzazione tripartita con al centro un dominio catalitico fiancheggiato ai due lati da domini regolatori. L’interazione di queste molecole con il dominio PH induce la traslocazione delle GRK alla membrana dove si trovano i recettori (GRK1 e 2). Beta-arrestina, una proteina adattatrice (1 e 2 ubiquitarie, SAG + 3 retina), ha due domini proteici composti da foglietti beta antiparalleli. Arrestina desensibilizza tramite ingombro sterico che impedisce il legame con le proteine G e può essere considerata un'etichetta di riconoscimento per lo smistamento, permettendo che il recettore venga internalizzato tramite vescicole clatrina. Possono anche reclutare direttamente MAPk ed EK. Angiotensina SII ha la capacità di richiamare beta-arrestina al recettore ma non di attivare proteine G o ERK.

RTK

Domini recettore EGF extracellulare

Questi possono essere presenti singolarmente o in diverse combinazioni, contribuendo alla specificità di interazione R-L. In seguito al legame al ligando, avviene un'oligomerizzazione e si stabilisce un’interazione tra i domini citoplasmatici di molecole di recettore diverse, causando un incremento dell'attività chinasica e fosforilazione dei recettori stessi. Anche eterodimeri con membri diversi della stessa sottofamiglia risultano in una maggiore varietà di segnale. La fosforilazione dei residui di tirosina nella porzione citoplasmatica crea siti per i relè. Senza fosforilazione si ha il blocco conformazionale del dominio catalitico che interferisce con l'attività enzimatica.

Il dominio transmembrana (LAB) contiene mutazioni che stabilizzano la conformazione del recettore in forma di dimero, e possono essere alla base dell'attivazione costitutiva. Un corretto allineamento dei dimeri è garantito anche dalla regione transmembrana.

PLC-gamma e PI3K

La PLC-gamma viene reclutata da RTK attivato attraverso il dom SH2, si lega a fosfotyr del recettore e si ancora alla membrana con PH. La sua attivazione avviene mediante fosforilazione, portando all'idrolisi del fosfatidilinositolo derivato da PI3K attivata da tutti RTK. PDK1 e PKB (akt) sono due proteine chinasi; PDK1 fosforila akt in thr308 attivata fosfo ed inibisce BAD. L'attività di PI3K è bloccata da PTEN e SHIP. PTEN è una dual protein/lipid phosphatase con delezioni o metilazioni del promotore x mutazioni.

RAS/MAPK

La proteina Ras è monomerica con attività GTPasica di 189aa ed è ancorata alla membrana plasmatica tramite la porzione C-term che lega cisteine, palmitato, farnesile. Funziona come proteina G ma è monomerica e utilizza due proteine accessorie per attivarsi: sos e Grb2, reclutate alla membrana attraverso legame con proteine di ancoraggio IRS1 e FRS2. Grbs lega le tyr fosforilate del rec, Sh2 lega sos in SH3 proline, lega Ras, apertura switch e scambio GDP-GTP.

14-3-3 è un dimero che lega raf nei residui di raf serina 259,621 che sono fosforilati.

JAK/STAT

Attivata da citochine. Il collegamento è più rapido perché le citochine inducono una fosforilazione in tyr che influenza la localizzazione subcellulare e la funzione del fattore di trascrizione stesso. Le chinasi JAK sono associate a un recettore a livello di un aggregato intracellulare ricco di proline. A seguito dell’avvicinamento, due recettori fosforilano il recettore e si autofosforilano. Poi fosforilano in tyr STAT (fattore trascrizionale) con dom SH2. In forma inattiva, si trovano nel citoplasma. Gli STAT fosforilati si staccano dal recettore e dimerizzano con altri STAT, entrando nel nucleo dove attivano la trascrizione dei geni caratterizzati dalla presenza nel promotore di GAS (gamma interferon activation site), parte integrante dell'attivazione del programma genico indotto dalla risposta alle citochine.

TGF-beta

Ciascun monomero è composto da una serie di foglietti beta che si protendono in modo antiparallelo da una regione alfa elica. I beta sono interconnessi da tre ponti disolfuro che formano una struttura nota come "cysteine knot". I monomeri sono costituiti da un peptide di circa 11aa derivante da un precursore più grande che presenta all’N-term la sequenza segnale per indirizzare la proteina alla via secretoria, seguita dal prodominio di una lunghezza di 50-375aa.

I ligandi, come TGFbeta1-3 e BMP11, vengono sintetizzati e mantenuti in complessi inattivi che richiedono un ulteriore taglio proteolitico. Vengono secreti in una forma legata non covalente al pro-dominio chiamato LAP che si lega a sua volta con ponti di solfuro alla proteina LTBP. Il taglio proteolitico permette il rilascio del peptide attivo.

Recettore

Entrambi i tipi di recettori sono costituiti da proteine di circa 500aa. Il ligando si presenta come dimero e recluta quindi due recettori di tipo I e due recettori di tipo II con stechiometria 1:2:2, poiché ogni monomero è in grado di reclutare entrambi i recettori. TGF-beta lega ALK5 (rec I) e TRbeta (II), mentre i BMP usano recettori diversi. I residui aa che formano la "tasca idrofobica" che media l’interazione tra i ligandi e i recettori I sono altamente conservati in tutti i ligandi TGF-beta, indicando un meccanismo di interazione comune con i recettori I.

Esempio di co-recettore: Beta-glicano per TGF-beta (III) è un proteoglicano di condroitin solfato/eparan solfato di superficie che facilita il legame di TGF al recettore II. Endoglina TGF utilizza ALK1 invece del preferenziale ALK5 per risposte specifiche. Le "trappole" come Noggin, con N-term, assumono una conformazione estesa che avvolge ciascuno dei due monomeri di BMP7, occupando i siti deputati al contatto con i recettori. Il controllo positivo sull'attivazione della via è la localizzazione intracellulare del complesso rec-ligando.

Le molecole che trasducono il segnale nel citoplasma svolgono anche il ruolo di effettori, entrando nel nucleo e legandosi al DNA per regolare la trascrizione genica. R e co-SMAD sono formate da 500aa e contengono due domini strutturali MH1 e 2. R al C-term dominio SxS è il bersaglio della fosforilazione da parte dei recettori. Solo le R vengono attivate tramite fosforilazione. Il dominio MH1 delle co-SMAD e di R ha la funzione di legare il DNA. Nel MH1 c’è la sequenza segnale per l’importo nucleare delle R, importante per permettere alle SMAD di svolgere la funzione di effettore. MH1 e 2 presentano anche domini PY importanti per l’interazione con le Smurf.

SARA è una proteina adattatrice in grado di aumentare la concentrazione locale di SMAD 2 e 3 in prossimità della membrana plasmatica attraverso interazioni idrofobiche mediate dal dominio FYVE, in grado di legare i fosfoinositidi e permettere il suo ancoraggio sulla membrana degli endosomi, favorendo il reclutamento di smad 2 e 3 da parte dei recettori. La fosforilazione porta a destabilizzazione dell’interazione con SARA, permettendo così il distacco della R-Smad dal complesso con il recettore. La fosforilazione causa l’esposizione di un segnale di localizzazione nucleare e aumento dell’affinità per le Smad4 co-Smad. La fosforilazione delle R-Smad è necessaria alla loro localizzazione nel nucleo, esponendo un'alfa elica H2 ricca di LISINE all’interno del dom MH1. La parte terminale di questa alfa elica KKLKK – le lisine mantengono nel nucleo – è presente in tutte le R-Smad ed agisce da segnale di localizzazione.