Biologia molecolare dell'esercizio fisico

Gli acidi nucleici

Il DNA e RNA appartengono alla classe degli acidi nucleici. Sono una lunga catena (polimero) in cui si ripetono sub unità (nucleotidi). Ciascun nucleotide è composto da 3 parti:

Zucchero a 5 atomi di carbonio

Nel RNA contiene uno zucchero pentosio (5C), chiamato ribosio; il DNA contiene uno zucchero pentosio, chiamato deossiribosio. Entrambi gli zuccheri hanno un ossigeno che fa parte dell’anello a 5C. Questi zuccheri differiscono solo per la presenza o assenza (deossi) di ossigeno in posizione 2’. Questa distinzione influenza in maniera impressionante la funzione tra RNA e DNA. La notevole versatilità dell’RNA dipende in modo cruciale dalla presenza dell’OH in posizione 2’.

Base azotata

Le basi azotate sono molecole contenenti azoto che hanno proprietà chimiche di una base (accettano H in soluzione). Adenina (A) e guanina (G) hanno una struttura con un doppio anello di C-N e sono chiamate purine. Timina (T), citosina (C) e uracile (U) hanno una struttura con un singolo anello e sono chiamate pirimidine. T si trova solo nel DNA, mentre U solo nell’RNA. Nel DNA il numero di adenina è sempre uguale a timina, stessa cosa tra guanina e citosina. La quantità delle basi puriniche è uguale a quella delle basi pirimidiniche.

Gruppo fosfato

Il gruppo fosfato (PO₄) conferisce al DNA e RNA le proprietà di un acido (da qui il nome acido nucleico). I gruppi fosfato svolgono la funzione di collegamento tra due nucleotidi, attraverso un legame fosfodiestere, in cui un ossigeno del gruppo fosfato rimane carico negativamente; ciò comporta che i gruppi fosfato carichi negativamente sono estremamente insolubili nei lipidi, il che assicura la ritenzione degli acidi nucleici all’interno della membrana cellulare/nucleare.

Formazione del nucleotide

Una catena di DNA o RNA si forma in una serie di tre passaggi:

1. Ciascuna base è unita chimicamente a una molecola di zucchero a livello C1 dello zucchero, formando un nucleoside.
2. Quando si attacca un gruppo fosfato al C5’ dello stesso zucchero, si forma un nucleotide.
3. I nucleotidi sono uniti in seguito a reazioni di condensazione: il gruppo OH sul C3 di uno zucchero di un nucleotide forma un legame fosfodiestere 5’ → 3’ con il PO₄ di un altro nucleotide, eliminando una molecola di acqua (H₂O).

Le estremità di DNA e RNA sono distinte ed hanno proprietà chimiche diverse. Esse sono designate con 5’ e 3’:

• 5’ si riferisce al carbonio dello zucchero in posizione 5 a cui è attaccato il gruppo fosfato.
• 3’ si riferisce al carbonio dello zucchero in posizione 3 a cui è attaccato un gruppo OH.

Questa direzionalità 5’ → 3’ di un filamento di acido nucleico è una proprietà estremamente importante per la molecola. Gli RNA variano in lunghezza da meno di un centinaio fino a molte migliaia di nucleotidi. Il DNA cellulare può raggiungere una lunghezza di parecchie centinaia di milioni di nucleotidi.

Struttura del DNA

Le strutture primarie di DNA e RNA sono generalmente molto simili, ma le loro conformazioni sono molto diverse:

• RNA si trova comunemente sotto forma di una singola catena polinucleotidica (filamento).
• DNA presenta una conformazione più complessa, esso infatti si trova generalmente sotto forma di due filamenti avvolti su se stessi. Questa differenza strutturale è cruciale per le diverse funzioni dei due tipi di acidi nucleici.

Appaiamento complementare (o di Watson e Crick)

Fra le basi azotate che si trovano su filamenti opposti delle catene di DNA si formano legami a idrogeno. Essi sono legami molto deboli che comportano la condivisione di un atomo di idrogeno da parte di due atomi elettronegativi come ossigeno e azoto. I legami H forniscono un tipo di forza che tiene uniti i filamenti e sebbene molto deboli, conferiscono stabilità strutturale. La formazione di legami H è chiamata appaiamento complementare in quanto le basi azotate stabiliscono degli specifici accoppiamenti tra loro: adenina normalmente con timina per mezzo di due legami H; la guanina con citosina per mezzo di tre legami H. Tale specifico appaiamento permette ai C1’ sui due filamenti di trovarsi esattamente alla stessa distanza, ciò porta ad ottenere una struttura regolare-simmetrica della doppia elica di DNA.

Perché nel DNA non si formano coppie A-G o C-T?

Alcune di queste coppie non si formano in seguito alla difficoltà di accoppiarsi formando dei legami H, mentre in altre come G-T l’accoppiamento è possibile: la formazione di legami H tra G e T produce una coppia con forma simile a quella di Watson e Crick. Tuttavia se dovessero verificarsi dei cambiamenti da G-C a G-T nel DNA, la sequenza di basi potrebbe cambiare drasticamente ad ogni divisione cellulare. Nella realtà esistono dei meccanismi di correzione/riparazione del DNA che riconoscono le coppie di basi che non sono di Watson e Crick, correggendo la maggior parte degli errori.

L’impilamento delle basi

Le basi azotate non sono polari, quindi risultano essere idrofobiche e quindi praticamente insolubili in ambiente acquoso. Una volta però che sono attaccate ad uno zucchero e fosfato (formando un nucleotide), le basi diventano solubili in acqua, ma anche così la loro insolubilità pone delle forti limitazioni alla conformazione globale del DNA in soluzione: le basi appaiate tendono ad impilarsi l’una sull’altra per mezzo di una torsione elicoidale, eliminando tutto lo spazio libero disponibile fra le basi, escludendo così la massima quantità di acqua all’interno della doppia elica. Una molecola di DNA ha quindi un nucleo idrofobico composto dalle basi impilate. Da tale conformazione ne deriverà che lo zucchero-fosfato (essendo idrofili) tenderanno a orientarsi all’esterno dell’elica, dove possono interagire con l’acqua. L’impilamento delle basi fornisce buona parte della stabilità chimica della doppia elica.

Struttura della doppia elica di Watson-Crick

I due filamenti di DNA si avvolgono l’una sull’altra formando una doppia elica. Si usa il termine scala per descrivere tale struttura, ma l’assenza di spazio tra le coppie di basi, dovuto a impilamento basi, richiede un’analogia migliore come “pila di monete”. La sequenza di basi costituisce il codice genetico, che varia da una molecola all’altra di DNA. I due filamenti della doppia elica hanno una polarità 5’ → 3’: un’estremità di un filamento avrà un gruppo fosfato 5’, l’altra estremità un gruppo ossidrile 3’. Watson e Crick stabilirono che la formazione di legami a H può avvenire solo se la polarità dei due filamenti è opposta. Quindi i due filamenti della doppia elica hanno andamento antiparallelo (5’ → 3’ e 3’ → 5’) - caratteristica importante per la replicazione del DNA.

Scanalatura principale e secondaria

La disposizione spaziale non uniforme degli zuccheri che si legano alle basi, porta alla formazione della:

• Scanalatura principale: ha un ruolo significativo nelle interazioni sequenza-specifiche DNA-proteine. I bordi delle purine-pirimidine sono accessibili al solvente: gli atomi N e O delle basi esposti al solvente nella scanalatura principale possono formare legami H con catene laterali degli aa di una proteina. Lo schema di questi gruppi che possono formare legami H è diverso per le coppie AT, TA, GC, CG. Ciò permette di essere portatrice di un messaggio (dato dalla sequenza di basi del DNA) in una forma che può essere letta dalle proteine che legano il DNA.
• Scanalatura secondaria: è meno informativa in quanto lo schema di legami H è sempre lo stesso indipendentemente dall’orientamento della coppia di basi, c’è solo una differenza tra AT e CG.

Tipi fondamentali di struttura della doppia elica

• DNA B (di Watson e Crick): è un’elica destrosa che gira in senso orario. Le basi sono impilate quasi perfettamente perpendicolari all’asse longitudinale. La scanalatura principale è ampia, mentre quella secondaria è molto più stretta. Il DNA B si trova in condizioni di alta umidità (95%) e di salinità relativamente bassa, condizioni che si ritrovano all’interno della cellula e ne consegue che la forma predominante in vivo sia DNA B.
• DNA A: se si diminuisce il contenuto acqua e si aumenta la salinità si ottiene la forma DNA A. L’elica è destrosa con le basi inclinate rispetto all’asse. La scanalatura principale è stretta, mentre quella secondaria è larga. È improbabile che DNA A sia presente in lunghe sezioni all’interno delle cellule, ma l’RNA adotta un’elica A nel doppio filamento.
• DNA Z: si formò per la prima volta in condizioni di alta salinità o in presenza di alcol. Definita in questo modo perché ha un andamento a zig-zag. Ha un’elica sinistrosa che gira in senso antiorario. La scanalatura principale è così poco profonda da essere quasi inesistente, mentre quella secondaria è molto profonda e stretta. Oggi si pensa che il DNA Z sia presente transitoriamente in brevi sezioni all’interno delle cellule e abbia un ruolo nella regolazione dell’espressione genica.

Il DNA può subire una separazione reversibile dei filamenti

Da un filamento di DNA si può produrre l’altro. In questo modo si permette al DNA di essere replicato – trascritto (producendo una copia di RNA del DNA) – tradotto (decodificando il messaggio dell’RNA per produrre una proteina). Durante la replicazione e trascrizione del DNA, i filamenti devono separarsi transitoriamente e reversibilmente (denaturazione). Ciò può essere indotto anche in laboratorio: i legami H possono essere rotti e i filamenti separati scaldando la molecola di DNA, ma lasciando intatti i legami fosfodiestere. Inducendo calore si raggiunge un punto in cui l’agitazione termica supera la forza di legami H delle interazioni idrofobiche ed altre forze che stabilizzano la doppia elica. Poiché la coppia CG presenta un’interazione con 3 legami H, invece dei 2 della coppia AT, più alto è il contenuto di GC di una data molecola DNA, più alta è la temperatura richiesta per la denaturazione. Quando si raffreddano lentamente le soluzioni riscaldate di DNA denaturato, spesso i singoli filamenti incontrano i loro filamenti complementari e formano una nuova doppia elica (rinaturazione). Dalla rinaturazione si ha la possibilità di permettere l’ibridazione, cioè l’appaiamento complementare di filamenti provenienti da due fonti diverse.

Altri fattori che favoriscono la denaturazione sono: diminuzione della concentrazione salina, aumento del pH, solventi organici (es. formammide) distruggono i legami H fra filamenti di DNA.

Strutture secondarie insolite di DNA

Il DNA non è una stringa statica e lineare di informazioni genetiche, ma presenta eterogeneità e flessibilità. Si possono avere diversi tipi di strutture secondarie insolite.

Struttura scivolata

Si è ipotizzato che le strutture scivolate si trovino a livello delle ripetizioni in tandem. Una ripetizione in tandem consiste in due o più copie approssimativamente adiacenti di uno schema di nucleotidi (es. la sequenza: 5’- TAGC TAGC TAGC -3’ contiene quattro ripetizioni in tandem di “TAGC”). Le strutture scivolate si trovano a monte di sequenze regolatrici (es. trascrizione geni). È possibile che queste strutture abbiano importanza per le interazioni DNA-proteine. Si conosce un certo numero di malattia neurologiche ereditarie provocate dall’espansione di queste sequenze.

Struttura cruciforme

Le strutture cruciformi sono formazioni appaiate ad ansa-stelo che sono state riscontrate in vitro all’interno di ripetizioni invertite di sequenze nucleotidi. Le ripetizioni invertite sono sequenze di basi azotate che si leggono esattamente allo stesso modo da 5’ → 3’ e in direzione opposta. Le strutture cruciformi possono agire da elementi regolatori nella replicazione del DNA e nell’espressione dei geni in vari sistemi procariotici ed eucariotici.

Struttura tripla elica

Un terzo filamento di DNA si unisce ai primi due. Il DNA a tripla elica si forma a livello dei tratti purina-pirimidina ed è favorito dalle sequenze che contengono una simmetria ripetuta speculare. Il terzo filamento può originarsi da un singolo tratto di purine-pirimidine o da una sequenza separata. Il filamento di purine del DNA di Watson-Crick si associa al terzo filamento tramite legami H di Hoogsteen nella scanalatura principale. Le coppie di basi AT e GC di Hoogsteen hanno schemi alterati di legami H rispetto alle coppie di basi di Watson-Crick: nella coppia di basi di Hoogsteen, l’adenina è ruotata di 180° e la GC forma soltanto due legami H, rispetto ai tre della coppia Watson-Crick. DNA a tripla elica è presente in genetiche, come atassia di Friedreich, patologia causata da un’espansione di un trinucleotide 5’-GAA-3’ sul cromosoma 9. Un individuo normale ha 8-30 copie di questa ripetizione trinucleotidica, mentre i pazienti con atassia ne hanno fino a 1000. Maggiore è il numero di copie, più precoce è l’insorgenza e la rapidità di progressione della malattia.

La struttura terziaria del DNA: superavvolgimento di DNA

Molte molecole di DNA sono circolari, senza estremità 5’-3’ libere. A causa della polarità delle estremità, 5’ può unirsi soltanto all’estremità 3’ per chiudere covalentemente un cerchio. Il DNA circolare a doppio filamento è quindi composto essenzialmente da due cerchi di DNA a singolo filamento attorcigliati l’uno intorno all’altro. Queste molecole di DNA diventano spesso superavvolte, sotto tensione torsionale. I superavvolgimenti che si costituiscono sono una struttura attorcigliata tridimensionale, energeticamente più favorevole. Lo stato superavvolto è intrinsecamente meno stabile del DNA rilassato. La tensione presente all’interno delle molecole superavvolte di DNA porta talvolta a denaturazione localizzata, in cui i filamenti localizzati si separano per un breve tratto. Ciò ha implicazioni importanti per alcuni processi cellulari come la replicazione e trascrizione.

Le topoisomerasi rilassano il DNA superavvolto

Le forme di DNA che hanno la stessa sequenza ma differiscono per il numero di linkage sono dette isomeri topologici (topoisomeri). Le topoisomerasi, sono invece enzimi che convertono (isomerizzano) un topo isomero del DNA in un altro, modificando il numero di linking. Le DNA topoisomerasi si dividono in due categorie principali:

• Tipo I: hanno la capacità di rilassare il DNA superavvolto e non richiedono energia dell’ATP. Si suddividono in:
  • Tipo IA: rilassa solo superavvolgimenti negativi.
  • Tipo IB: rilassa sia superavvolgimenti negativi che positivi.
  Questi enzimi agiscono producendo una rottura transitoria a singolo filamento nel DNA (il taglio di un legame fosfodiestere fra nucleotidi adiacenti), e mentre avvolgono le estremità rotte, fanno passare l’altro filamento attraverso la rottura.
• Tipo II: sono di solito ATP-dipendenti. Questi enzimi producono rotture transitorie a doppio filamento nella doppia elica e fanno passare un’altra doppia elica attraverso l’interruzione temporanea. Questi enzimi hanno la capacità di rilassare DNA superavvolto sia negativamente che positivamente e possono anche snodare molecole aggrovigliate di DNA. La topo isomerasi II procariotica (girasi) ha la proprietà speciale di essere capace di introdurre superavvolgimenti negativi.

Le topoisomerasi di entrambi i tipi, hanno ruoli importanti in molti processi cellulari, fra cui la condensazione e segregazione dei cromosomi, replicazione e ricombinazione del DNA. Il superavvolgimento del DNA sembra avere un ruolo importante nella replicazione, trascrizione e ricombinazione. Praticamente tutto il DNA contenuto nelle cellule procariotiche ed eucariotiche è superavvolto negativamente. In certi casi il DNA può essere avvolto attorno a proteine. Il superavvolgimento negativo immette energia nel DNA (data proprio dalla torsione della struttura), rendendo più facile aprire le origini della replicazione e i promotori dei geni. L’energia potenziale di tale superavvolgimento favorisce anche la formazione di strutture insolite di DNA (es. cruciformi). Il superavvolgimento positivo rende molto più difficile aprire la doppia elica e blocca perciò i processi essenziali del DNA. Un superavvolgimento positivo si crea davanti alle forcelle di replicazione e dei complessi di trascrizione. Questi effetti del superavvolgimento nei processi genetici sono evidenti nei procarioti, ma di meno negli eucarioti.

L'organizzazione del genoma: dai nucleotidi alla cromatina

Le cellule eucariotiche devono adattare approssimativamente fino a 2 metri di DNA non compattato nel loro nucleo sferico. Ciò viene compiuto dal compattamento delle molecole lineari di DNA nella cromatina. Il compattamento del genoma in cromatina forma il substrato importante per i processi vitali della replicazione, ricombinazione, trascrizione, riparazione del DNA e segregazione dei cromosomi.

Struttura della cromatina

Per prima cosa il DNA si avvolge intorno ad un complesso di istone chiamato...