Che materia stai cercando?

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

piccolo cambiamento di forma che lo trattiene in una configurazione reattiva

che facilità la catalisi. Il substrato va in contro ad una serie di trasformazioni

dirette a convertire il SUBSTRATO  PRODOTTO. Il PRODOTTO si dissocia

dall’enzima, permettendo all’enzima di partecipare a un altro ciclo di legame

del substrato e di catalisi.

L’att.funzionale delle proteine può essere regolata a parecchi livelli diversi,

fra cui TRASCRIZIONE GENE – SINTESI PROTEICA

La regolazione dell’att.proteica da parte di MODIFICAZIONI POST-

TRADUZIONALI  dopo la traduzione le proteine possono unirsi covalentemente e

non ad altre molecole (lipidi ..> LIPOPROTEINE – zuccheri ..> GLICOPROTEINE –

ecc). Inoltre, spesso gli aa sono modificati dopo la loro incorporazione nei

polipeptidi. Queste modificazioni post-traduzionali possono avere funzioni sia

STRUTTURALI che REGOLATRICI (acetilazione, metilazione, ecc). La reaz.

regolatrice più comune è la FOSFORILAZIONE REVERSIBILE delle catene

laterali aa: CHINASI aggiungno GR.FOSFATO – FOSFATASI rimuovono fosfati.

L’aggiunta di un fosfato a una proteina può farle cambiare forma (es.

mascherando o smascherando dominio catalitico) oppure la stessa catena

laterale fosforilata può far parte di un motivo di legame riconosciuto da altre

proteine, formando es. complesso multi proteici o promuovendo dissociazione di

un complesso.

REGOLAZIONE ALLOSTERICA dell’att. proteine  l’attacco di un ligando ad un

sito di una proteina può causare un cambiamento sostanziale della

conformazione di quella proteina, come risultato di questo cambiamento

conformazionale, un sito attivo presente in un altro punto della proteina viene

alterato in modo che la sua att. AUMENTI o DIMINUISCA (es. enzimi metabolici

– proteine che regolano trascrizione).

Il ligando può essere uno zucchero o aa o altra proteina.

Regolazione post-traduzionale dell’att. proteine da parte delle CHINASI

DIPENDENTI DA CICLINA (CDK)  l’att. delle CDK è regolata:

mediante fosforilazione

o mediante modificazioni allosteriche indotte dall’interazione dell’enzima

o con una proteina regolatrice (CICLINA).

La CDK è composta da 2 domini principali: piccolo dominio N-terminale e

dominio C-terminale molto più grande.

Meccanismo di attivazione CDK (diapo24 lez.7): una molecola di ATP si lega nella

fessura del sito attivo fra i 2 domini. È questo ATP che dona il gr.fosfato ad un

polipeptide substrato. In ASSENZA CICLINA ..> CDK è inattiva: in questa

conformazione, l’ansa T si trova all’ingresso del sito attivo e blocca così

l’accesso dei polipeptidi substrato alla molecola di ATP.

In PRESENZA CICLINA: induce cambiamento conformazionale di CDK che

sposta l’ansa T dall’ingresso sito attivo, permettendo così l’accesso del

polipeptide substrato ed esponendo il sito di fosforilazione nell’ansa T. La

completa attivazione di CDK si ha, oltre x la presenza CICLINA, in seguito a

mediazione fosforilazione da parte di un’altra chinasi (CHINASI CHE ATTIVA CDK

(CAK)).

La replicazione del DNA e il mantenimento dei telomeri

Man a mano che le cell. si moltiplicano e danno origine a nuove cell., il genoma deve

essere duplicato accuratamente in modo che l’info passi alle nuove generazioni con

errori minimi.

Il processo di replicazione del DNA, avviene nel nucleo e si

realizza prima del processo di divisione cellulare (fase M:

mitosi e meiosi) cioè nella fase S del ciclo cellulare,

permettendo alle cellule figlie di ereditare la stessa quantità di

DNA.

Ogni filamento contiene in sé l’informazione genetica per la

sequenza dell’altro filamento, ognuna è complementare dell’altra. Conseguenza di

questa complementarità è che tutte le informazioni contenute nella doppia elica possono

essere duplicate

Le cell.eucariotiche devono coordinare proliferazione e differenziamento durante lo

sviluppo. La replicazione comporta decisioni su quando, dove e come iniziare la

replicazione del DNA x assicurare che venga prodotta soltanto una copia completa e

accurata del genoma prima che una cell. si divida.

La replicazione è definita SEMICONSERVATIVA  ciascuna nuova molecola di DNA è

composta da un filamento originario (parentale) e un filamento nuova sintesi.

La sintesi dei nuovi filamenti di DNA, è affidato all’enzima DNA POLIMERASI, che

procede alla sintesi in direzione 5’3’  x la sintesi utilizzano come precursori nucleotidici

i quattro deossinucleotidi trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).

I nucleotidi sono aggiunti uno alla volta all’estremità 3’-ossidrile della catena del DNA,

formando nuovi legami fosfodiestere. Tale processo è una reazione endoergonica, che

richiede quindi apporto di energia, la quale viene fornita dalla rottura dei legami con i 2

gruppo fosfato, al momento in cui vengono assemblati i vari deossinucleotidi. La scelta del

nucleotide da aggiungere alla catena è determinata dall’appaiamento complementare

della BASE con il filamento stampo.

DNA POLIMERASI  La maggior parte delle cellule contiene più di una DNA polimerasi,

ma una sola è responsabile della replicazione del DNA, mentre le altre sono coinvolte

nella rimozione del primer o nella riparazione del DNA. Nel batterio E.Coli sono state

individuate 5 DNA polimerasi e quella responsabile x la replicazione è la DNA polimerasi

III, mentre nell’uomo sono state identificate 14 DNA polimerasi. Negli eucarioti 3 DNA

polimerasi differenti sono coinvolte nella replicazione del DNA cromosomico: DNA

polimerasi alfa - DNA polimerasi δ (delta) - DNA polimerasi ε (epsilon) – (il DNA

mitocondriale viene replicato da una DNA polimerasi gamma)  queste DNA

polimerasi vengono definite REPLICATIVE x distinguerle dalle restanti polimerasi che

sono invece coinvolte nei processi di riparazione.

Le caratteristiche delle DNA POLIMERASI sono:

possono aggiungere nucleotidi soltanto in direzione 5’3’ (e non in direzione

 opposta), andando cioè a catalizzare un legame fosfodiestere fra il primo gruppo

5’-fosfato di un nuovo deossinucleotide trifosfato e il gruppo 3’-ossidrile

dell’ultimo nucleotide del filamento di nuova sintesi.

(ad eccezione della DNA polimerasi alfa coinvolta nella sintesi del PRIMER) è che

 non possono iniziare la sintesi di nuovo di DNA se non è presente un

PRIMER. Il PRIMER corrisponde a una breve sequenza di RNA a singolo

filamento. Questo filamento è complementare al filamento stampo (filamento

originale) e viene sintetizzato in direzione 5’3’. Le DNA polimerasi riconoscono il

gruppo 3’-ossidrile libero dell’estremità del primer e vi si legano.

Non hanno attività elicasica

La forma principale di replicazione che si verifica nel DNA eucaristico, alcuni virus e

batteri è una REPLICAZIONE SEMIDISCONTINUA

È una replicazione conservata da E.coli fino all’uomo, le differenze sono nei dettagli,

enzimi, proteine.

La sintesi del FILAMENTO LEADER è CONTINUA (diapo 17)  la replicazione continua

del FILAMENTO LEADER è possibile sul filamento di DNA 3’5’. In questo modo il

filamento leader avrà direzione 5’3’ e la sua sintesi avviene nella stessa direzione del

movimento della forcella di replicazione. La DNA POLIMERASI che sintetizza il

frammento leader, non si stacca fino a quando non incontra una forcella di

replicazione che si muove in direzione opposta o fino a quando non ha replicato

l’intero filamento.

La sintesi del FILAMENTO RITARDATO è DISCONTINUA (diapo 17)  sul filamento

antiparallelo andrà a costituirsi quello che viene definito come FILAMENTO RITARDATO.

La sua sintesi è di tipo DISCONTINUA, cioè si formano dei brevi segmenti (100-200 nt

negli eucarioti) in direzione opposta al movimento della forcella. Questo meccanismo

risulta essere una strategia che permette di ovviare al problema della direzionalità 5’3’ del

filamento antiparallelo di DNA. Tale direzione del filamento impedisce infatti alle DNA

polimerasi di poter sintetizzare il filamento ritardato in direzione 5’3’.

I brevi segmenti che vanno a costituirsi sono chiamati FRAMMENTI DI OKAZAKI. La

sintesi di questi frammenti richiede la ripetizione di 4 passaggi: sintesi primer –

allungamento – rimozione primer – riempimento spazio prima occupato dal primer –

unione frammenti Okazaki. Nonostante questi ulteriori passaggi, la sintesi di entrambi i

nuovi filamenti avviene contemporaneamente. I nucleotidi vengono aggiunti al

FILAMENTO LEADER e a quello RITARDATO contemporaneamente e alla stessa

velocità da 2 DNA polimerasi, una x ciascun filamento.

La replicazione del DNA nelle CELLULE EUCARIOTICHE

1. Per poter far avvenire la replicazione del DNA, il macchinario cellulare deve

accedere al DNA che è compattato in cromatina nel nucleo  le modificazioni

degli ISTONI e i fattori di rimodellamento della cromatina possono allentare la

cromatina x permettere il disassemblaggio dei nucleosomi e l’accesso allo

stampo di DNA.

2. Forcelle di replicazione  le forcelle di replicazione nelle cellule dei mammiferi non

sono distribuite diffusamente in tutto il nucleo, ma sembrano raggrupparsi in

compartimenti subnucleari distinti (chiamati fabbriche di replicazione). Queste

fabbriche contengono alte concentrazioni dei fattori di replicazione.

È ancora dibattuto se la polimerasi si sposti lungo lo stampo o se la polimerasi resti

fissa mentre si sposta lo stampo. Le prove più recenti sono a favore del modello in

cui il DNA scorre attraverso fabbriche fisse di replicazioni.

Queste forcelle di replicazione agiscono a livello di specifici punti del DNA, definiti

come ORIGINI DELLE REPLICAZIONE  un ORIGINE DELLA REPLICAZIONE è

un sito sul DNA cromosomico in cui inizia una coppia bidirezionale di forcelle

di replicazione. Negli eucarioti, la replicazione bidirezionale non inizia alle

estremità dei cromosomi lineari, ma a livello di molti siti interni. Gli esseri umani

hanno 10.000 – 100.000 origini (solo il 15% è attivo). Le sequenze di DNA delle

origini possiedono di solito molte coppie di basi A-T, in quanto queste basi

sono legate da 2 legami H rispetto ai 3 legami H della G-C, perciò sarà richiesta

meno energia x spezzare i 2 legami H.

Inoltre, importanti x le ORIGINI, sono le caratteristiche strutturali del DNA come il

superavvolgimento negativo.

La velocità globale della replicazione è determinata in gran parte dal numero di

origini usate e dalla frequenza con cui queste danno inizio alla replicazione.

3. La formazione del COMPLESSO DI PREREPLICAZIONE alle ORIGINI DI

REPLICAZIONE (diapo 16 lez.3)  una differenza importante fra la replicazione

batterica e quella eucariotica è che nelle CELL.BATTERICHE ..> non appena le

proteine iniziatrici si accumulano in corrispondenza delle ORIGINI, vengono

reclutate DNA ELICASI all’origine e la replicazione inizia. Le

CELL.EUCARIOTICHE ..> separano invece la SELEZIONE DELLE ORIGINI

dalla REPLICAZIONE, tramite la formazione di un COMPLESSO DI PRE-

REPLICAZIONE (pre-RC). La separazione di questi 2 eventi impedisce la

sovrareplicazione del genoma. Il COMPLESSO DI PRE-REPLICAZIONE si forma in

corrispondenza delle origini di replicazione e prevede il riconoscimento della

sequenza del DNA dell’origine da parte di proteine specifiche, a cui vi si

legano, formando un COMPLESSO DI RICONOSCIMENTO DELL’ORIGINE

(ORC). Il ORC si lega quindi all’origine della replicazione e recluta: Cdc6 (Ciclo di

Divisione Cellulare 6) – proteine Mcm (Mantenimento del MiniCromosoma) –

altri componenti del complesso di pre-replicazione essenziali x inizio

replicazione DNA.

La formazione e attivazione dell’ORC è controllato da un SIST. DI

ABILITAZIONE ALLA REPLICAZIONE, il quale assicura negli eucarioti che il

DNA si replichi una volta soltanto x ciclo cellulare. Questo sistema prevede

CHINASI DIPENDENTI DA CICLINE (CDK) che sono attivatori cruciali delle

transizioni del ciclo cellulare (diapo 20 lez.3).

Per attivarsi, le CHINASI devono associarsi ad una proteina regolatrice chiamata

CICLINA. Una volta attive, le CHINASI vanno a fosforilare serine e treonine

selezionate di proteine specifiche, attivando così queste proteine a svolgere

la loro funzione.

Le CDK sono attivate durante la parte finale di G1, quando inducono alla fine le cell.

a procedere attraverso il ciclo cellulare e sono inattivate durante le fasi terminali

della mitosi.

Durante la fase G1 si va a costituire il COMPLESSO DI PRE-REPLICAZIONE:

ORC si lega a ciascuna ORIGINE e recluta quindi altre 2 proteine: Cdc6 – Cdt1

(diapo 20). In associazione con queste 2 proteine, ORC funziona come una

MACCHINA MOLECOLARE dipendente da ATP che carica il complesso delle

proteine di abilitazione Mcm2-7, aventi att.elicasica. Una volta che il complesso

Mcm2-7 è stato caricato, si associa strettamente al DNA dell’ORIGINE.

Soltanto le ORIGINI abilitate che contengono Mcm2-7 possono dare inizio a

una COPPIA DI FORCELLE DI REPLICAZIONE. L’att.elicasica del complesso

svolge il DNA davanti a ciascuna forcella di replicazione. Una volta che le forcelle

sono state iniziate, Mcm2-7 viene spostato dall’origine e si muove con la

forcella di replicazione.

L’att. di CDK può andare ad inibire indipendentemente ORC – Cdc6 – Cdt1 –

Mcm2-7. Ciò significa che quando l’att. di CDK è alta, Mcm2-7 non può più

essere caricato sulle origini nella fase S, G2 e parte iniziale della mitosi. In

questo modo, la rimozione delle proteine di abilitazione (Mcm2-7) durante la

fase S blocca la formazione dei COMPLESSI DI PRE-REPLICAZIONE e assicura

che le ORIGINI diano inizio a una coppia bidirezionale di forcelle soltanto una

volta x ciclo.

4. Svolgimento del duplex a livello delle forcelle di replicazione  le DNA ELICASI

sono enzimi che utilizzano ATP x separare i 2 filamenti della doppia elica di DNA

duplex, seguendo la direzione del movimento della forcella di replicazione.

Lo spostamento del macchinario della forcella di replicazione lungo il DNA porta alla

generazione di superavvolgimenti positivi davanti alla forcella. Questo

accumulo di tensione torsionale che ne deriva potrebbe portare al blocco del

movimento della forcella, se non fosse rilassata da una DNA TOPOISOMERASI.

Quest’enzimi di tipo I o II, sono entrambi capaci di rimuovere (rilassare) i

superavvolgimenti positivi davanti alla forcella. Tuttavia, i filamenti parentali già

replicati sulla scia della forcella, diventano superavvolti negativamente (diapo 21

lez.3). Le 2 catene di DNA figlie che si formano, restano intrecciate a causa della

mancata rimozione di tutti gli incroci fra i filamenti parentali durante la sintesi

del DNA. La topo isomerasi II è necessaria x risolvere questa struttura

aggrovigliata in 2 GENOMI FIGLI SEPARATI.

5. La creazione dell’RNA PRIMER innesca la sintesi del DNA sul filamento

leader e in quello ritardato  nei batteri, nel DNA nucleare eucariotico e in alcuni

virus, la sintesi di un RNA primer è necessaria x dare inizio alla sintesi del

FILAMENTO LEADER e a quella di ciascun FRAMMENTO DI OKAZAKI sul

FILAMENTO RITARDATO.

L’RNA primer è sintetizzato de novo. Alla sua sintesi, negli eucarioti, se ne occupa

la DNA POLIMERASI ALFA che esiste sottoforma di complesso, chiamato DNA

pol alfa/primasi, consistente in:

1) Una sub unità con att. DNA polimerasica

2) una sub unità necessaria x l’assemblaggio

3) 2 piccole proteine che insieme forniscono att.primasica

Questo complesso si lega al complesso di inizio in corrispondenza delle origini e

sintetizza un breve filamento che consiste approssimativamente di 10 basi di

RNA, seguito da 20-30 basi di DNA (DNA iniziatore) (lez.3 diapo 21 fase 5).

6. L’allungamento dei filamenti leader e di quelli ritardati richiede uno scambio

di polimerasi  la replicazione del DNA negli eucarioti richiede l’azione regolata e

coordinata di almeno 3 DNA POLIMERASI distinte (α-ε-δ). Una volta che la DNA

polimerasi δ è stata reclutata sul FILAMENTO LEADER, la sintesi è continua,

mentre la sintesi del FILAMENTO RITARDATO richiede cicli ripetuti di passaggi

dalla DNA polimerasi α alla DNA polimerasi ε, ogni volta che si inizia un

frammento di Okazaki (lez.3 diapo 22 fase 6).

La correzione delle bozze  le polimerasi non sono perfette e generano

spontaneamente errori quando copiano il DNA. Molte polimerasi hanno

associata un’ENDONUCLEASI di CORREZIONE DELLE BOZZE che elimina il

90-99% dei nucleotidi incorporati erroneamente, riducendo la frequenza

spontanea di errore della polimerasi.

La struttura della DNA polimerasi è stata paragonata ad una mano che tiene il

DNA. L’att.polimerasica si trova tra dita e pollice (lez.3 diapo 27 colore verde),

mentre il dominio esonucleasico è alla base del palmo. Quando la polimerasi sta

incorporando nucleotidi, il DOMINIO ENDONUCLEASICO è in conformazione

CHIUSA impedendo il legame del DNA a singolo filamento, ma la cambia in

una più APERTA x la correzione delle bozze. Fino a che vengono aggiunti

nucleotidi corretti all’estremità 3’ del nuovo filamento, l’estremità 3’ resta nel sito

attivo della polimerasi. L’incorporazione di una base male appaiata provoca la

fusione del DNA a doppia elica di nuova formazione. La polimerasi fa una pausa

e l’estremità 3’ del nuovo filamento viene trasferita al DOMINIO

ESONUCLEASICO, dove la base male appaiata escissa e rilasciata come

deossinucleotide monofosfato (dNMP).

Come avviene il riconoscimento di basi male appiate? La forma e le dimensioni

delle coppie di basi AT e GC sono notevolmente simili, ma differiscono da quelle

delle basi male appaiate. La geometria anormale delle basi male appaiate porta

a un impedimento sterico nel sito attivo che inibisce una catalisi efficiente.

Ruolo delle PCNA (Antigene Nucleare delle Cellule Proliferanti)  è una

componente abbondante nel nucleo delle cell.in divisione. Il PCNA ha la capacità di

interagire con molti partner proteici, svolge così ruoli nella: replicazione DNA –

riparazione DNA – rimodellamento cromatina – regolazione ciclo cellulare –

ecc.

Per quanto riguarda la replicazione del DNA, il PCNA agisce da pinza scorrevole x

far aumentare la processività della DNA polimerasi. Senza PCNA, la coppia di

torsione generata dalla produzione di DNA a doppia elica farebbe staccare la

POLIMERASI dalla forcella di replicazione. Il PCNA permette alla polimerasi di

lasciare e riprenderne la presa, impedendone il distacco dallo stampo di DNA.

La sintesi dei frammenti di Okazaki tiene il passo con la sintesi continua del

FILAMENTO LEADER, grazie al PCNA che posizionandosi rapidamente, consente

il movimento efficace della forcella di replicazione (lez.3 diapo 22 fase 6).

7. La maturazione dei filamenti nascenti di DNA  comporta parecchi passaggi

diversi:

1) Rimozione dell’RNA primer (lez.3 diapo 23 fase 6)  sono state proposte 2

vie: Ribonucleasi (RNasi) H1 taglia RNA primer  lasciando un

 nucleotide a monte della giunzione RNA-DNA. Il primer tagliato

viene poi degradato dall’attività esonucleasica FEN-1 (flap

endonucleasi 1) avente attività sia eso che endo-nucleasica e che

agisce in associazione con PCNA.

La DNA polimerasi ε provoca il distacco del filamento del

 frammento di Okazaki a valle  al quale segue l’attività

endonucleasica di FEN-1 che rimuove l’intera coda libera che

contiene RNA.

2) Riempimento delle interruzioni  le interruzioni lasciate dalla rimozione del

primer sul filamento sono riempite dalla DNA polimerasi ε, producendo

un DNA a doppio filamento contenente un nick.

3) Unione dei filamenti di Okazaki sul filamento ritardato  La legatura

avviene x azione della DNA ligasi I, che unisce i frammenti di Okazaki

catalizzando la formazione di nuovi legami fosfodiestere (lez.3 diapo

24). Le LIGASI dei mammiferi presentano un dominio che lega il DNA,

permettendo alla LIGASI di circondare il DNA substrato, stabilizzarlo in una

struttura distorta e posizionare il nucleo catalitico sul nick che opererà un

unione covalente dei filamenti di DNA (lez.3 diapo 25). La DNA ligasi I

discrimina i substrati che contengono RNA, impedendo così la legatura dei

frammenti di Okazaki prima della rimozione dell’RNA primer 5’.

8. Deposizione degli istoni  Man a mano che la forcella di replicazione procede

lungo la cromatina, i nucleosomi davanti alla forcella sono disassemblati in

tetrameri H3-H4 e in dimeri H2A – H2B x poi riformarsi dietro la forcella di

replicazione. La deposizione degli istoni avviene quindi non appena c’è

abbastanza DNA disponibile x formare un nucleosoma. La rapida deposizione

degli istoni dipendente da CAF-1 dietro la forcella di replicazione è necessaria x

impedire rotture spontanee a doppio filamento del DNA e arresto in fase S delle

cell.umane.

L’assemblaggio dei nucleosomi sul DNA di nuova sintesi avviene tramite un

meccanismo con più passaggi: gli istoni H3 e H4 formano un complesso e sono

depositati x primi, seguiti da due dimeri di istoni H2A e H2B.

9. Terminazione  negli eucarioti la replicazione continua probabilmente fino a che

una forcella non incontra un’altra forcella di un replicone adiacente che procede in

direzione opposta.

IL MANTENIMENTO DEI TELOMERI: IL RUOLO DELLE TELOMERASI NELLA

REPLICAZIONE DEL DNA – INVECCHIAMENTO – CANCRO

Il problema della replicazione delle estremità del DNA  la sintesi del FILAMENTO

LEADER può copiare il filamento stampo fino all’ultimo nt. Nel FILAMENTO RITARDATO

invece, quando viene rimosso il primer finale, resta non copiata una regione di 8-12 nt

che lascia un’interruzione al terminale 5’, in quanto non c’è un filamento a monte di

DNA su cui la DNA polimerasi ε possa sintetizzare x riempire l’interruzione. Così, nel

corso di cicli successivi di replicazione, questa interruzione porterebbe a cromosomi

progressivamente più corti. Tuttavia, questo non è chiaramente sempre il caso, in

quanto il progressivo accorciamento dei TELOMERI porterebbe all’instabilità cromosomica

e quindi alla morte cellulare x apoptosi.

Che cosa sono i TELOMERI? Sono costituiti da ripetizioni in tandem di una semplice

sequenza ricca di GUANINA. Per es. i telomeri umani sono costituiti da parecchie

migliaia di ripetizioni della sequenza TTAGGG (lez.4 diapo 2). I telomeri sigillano le

estremità dei cromosomi impedendogli di legarsi tra loro. I telomeri sono quindi

importanti x la sopravvivenza della cellula, in quanto la loro perdita porta alla fusione

delle estremità dei cromosomi, facilitando la ricombinazione genetica e scatenando

la morte cell. x apoptosi.

La soluzione al problema della replicazione delle estremità  venne dato da Carol

Greider e Elizabeth Blackburn in seguito ai loro esperimenti svolti su un protozoo ciliato

(Tetrahymena thermophila, eucariote unicellulare che vive negli stagni). In questo

organismo le ricercatrici scoprirono un’att.enzimatica che chiamarono TRASFERASI

TERMINALE TELOMERASI (successivamente divenne TELOMERASI) che catalizzava

l’aggiunta DE NOVO di RIPETIZIONI TELOMERICHE alle estremità dei cromosomi.

Oggi si sa che la telomerasi è un complesso ribonucleoproteico (RNP) (lez.4 diapo 4) 

l’enzima ha una sub unità di RNA e una sub unità proteica che agisce come trascrittasi

inversa (TRASCRITTASI INVERSA DELLA TELOMERASI [TERT]), cioè una polimerasi

che sintetizza DNA usando come stampo RNA.

Azione della TELOMERASI  https://www.youtube.com/watch?v=2xMhfdeeU8Y

Dopo il completamento della sintesi del FILAMENTO RITARDO, esso presenterà

un’estremità 5’ accorciata, mentre il filamento 3’ (vecchio filamento DNA) presenta una

sporgenza di 12-16 basi.

L’RNA della telomerasi presenta una regione complementare alle ripetizioni

telomeriche del filamento 5’. RNA fornisce lo stampo x la sintesi di riparazione del

telomero. Ciò avviene non estendendo il filamento corto 5’, ma allungando lo stampo

3’. L’estensione del terminale del telomero porta all’aggiunta di una serie di ripetizione

in tandem. Dopo l’allungamento del filamento 3’ è necessaria la sintesi del filamento

accorciato 5’ x creare DNA telomerico a doppio filamento. I meccanismi che

determinano tale sintesi sono stati studiati solo su lievito e ciliati, dove si è visto che

operano DNA pol alfa/primasi o DNA polimerasi ε (o δ).

Altri metodi di mantenimento dei telomeri  nelle cell.umane e in quelle dei funghi i

telomeri sono mantenuti anche da un meccanismo di ricombinazione e possono

essere accorciati x azione di esonucleasi.

Regolazione att. della TELOMEARSI

I telomeri vengono protetti grazie all’attivazione della telomerasi, ma non devono neppure

diventare troppo lunghi, in quel caso la telomerasi viene inibita.

Il controllo della lunghezza del telomeri avviene da parte di:

POT1 ..> proteina di protezione dei telomeri

TRF1 ..> fattore 1 che lega le ripetizioni TTAGGG

TRF2 ..> fattore 2 che lega le ripetizioni TTAGGG

Questi fattori proteici possono impedire l’accesso della telomerasi ai telomeri,

formando una struttura ripiegata della cromatina.

POT1 ..> si lega alla coda di DNA a singolo filamento 3’

TRF1 - TRF2 ..> proteine che legano il DNA telomerico a doppio filamento

Un modello propone che questi fattori agiscano: TRF1 rileva la lunghezza del filamento

del telomero, contando le ripetizioni ricche di G, e vadano a trasferire o meno POT1

all’estremità a singolo filamento a seconda dei casi:

TELOMERI ABBASTANZA LUNGHI  reclutati molti POT1 che INIBISCONO

TELOMERASI

TELOMERI TROPPO CORTI  non viene più trasferito POT1 all’estremità e la

TELOMERASI NON è PIU’ INIBITA e può quindi aggiungere di nuovo DNA al telomero.

Telomerasi invecchiamento e cancro

La maggior parte delle cell.somatiche umane non esprime abbastanza telomerasi x

mantenere una lunghezza costante dei telomeri durante i cicli di replicazione dei

cromosomi.

Alti livelli att.telomerasica in CELL. GERMINALI UMANE – CELL.EPITELIALI

PROLIFERANTI – LINFOCITI.

Debole att.telomerasica in CELL.STAMINALI ADULTE.

Att.telomearsica transitoria in FIBROBLASTI UMANI (lez.4 diapo 7).

L’espressione continua delle telomerasi, e non la sua espressione periodica, è

necessaria x il mantenimento stabile della lunghezza dei telomeri nelle

cell.somatiche umane. Telomeri umani si accorciano a 50-150 bp/estremità/divisione.

Il limite di Hayflick  cell.animali in cultura hanno una capacità limitata di replicazione e

il punto in cui le cell. smettono di divedersi è chiamato LIMITE DI HAYFLICK.

Ad oggi è stato proposto che tale limite sia conseguenza del progressivo accorciamento

dei telomeri.

Dopo il limite di Hayflick, l’accorciamento dei telomeri scatena uno stato irreversibile

di invecchiamento cell., stato in cui la cell. continua a vivere senza dividersi

ulteriormente.

Prova diretta di una relazione fra accorciamento telomeri e invecchiamento 

numerose prove sono a sostegno di un modello in cui i telomeri funzionano da dispositivi

di conteggio molecolare che registrano il numero di divisioni cellulari scatenando

quindi l’arresto proliferativo quando i telomeri si accorciano ad una lunghezza

specifica.

Tuttavia le osservazioni effettuate hanno dimostrato una relazione più complessa tra

LUNGHEZZA TELOMERI – ESPRESSIONE TELOMERASI – DURATA VITA CELLULA.

Infatti, in alcuni casi la breve lunghezza dei telomeri non è stata correlata con l’ingresso

nella senescenza cellulare.

L’accorciamento telomeri e quindi l’entrata nella senescenza cellulare può essere

un meccanismo importante che protegge gli organismi multicellulari dal cancro 

una delle caratteristiche cell.cancerose è che diventano immortali e possono crescere in

modo incontrollato. Nella maggior parte di queste cell.cancerose umane (90%), la

telomerasi è stata riattivata.

È quindi possibile che la telomerasi sia un bersaglio migliore della terapia

anticancro che della terapia antinvecchiamento.

L’esercizio fisico costante influenza l’età biologica?

Relazione tra LUNGHEZZA TELOMERI – ESERCIZIO AEROBICO COSTANTE

I telomeri sono considerati bio-marcatori dell’invecchiamento mitotico della cellula.

L’esercizio fisico aerobico prolungato e costante, e una elevata capacità aerobica

(VO2max) sono associati ad un’aspettativa di vita più lunga, ma più in generale gli effetti

positivi dell’esercizio sull’invecchiamento sono sempre più evidenti.

I dati ottenuti suggeriscono che il VO2max è associato positivamente con la lunghezza

dei telomeri delle cellule muscolari, inoltre i risultati ottenuti suggeriscono che

l’allenamento aerobico potrebbe avere effetti protettivi mantenendo l’integrità dei

telomeri nell’anziano.

Tuttavia fino ad ora, la correlazione tra lunghezza dei telomeri e allenamento, e

lunghezza dei telomeri e VO2max è risultata poco consistente.

Metodo: diapo 10 lez.4

I GENOMI DEGLI ORGANELLI: CLOROPLASTI – MITOCONDRI

Entrambi contengono la propria info genetica. I genomi sono di solito, ma non sempre,

circolari. Nella forma circolare, i genomi dei mitocondri e cloroplasti sembrano

notevolmente simili ai genomi batterici. Questa somiglianza, insieme ad altre osservazioni,

ha portato all’idea che sia i mitocondri che i cloroplasti siano derivati da organismi

primitivi che vivevano liberi ed erano molto simili ai batteri. I genomi degli organelli sono

ereditati in modo indipendente dal genoma nucleare ed esibiscono un’eredità uni

parentale, in cui i tratti sono trasmessi alla progenie soltanto dalla madre.

DNA cloroplasti  si trova nelle piante – codifica enzimi coinvolti nella fotosintesi –

questo DNA è generalmente considerato una molecola di DNA a doppio filamento, gli

ultimi studi considerano come una parte sia in realtà lineare e soltanto una piccola parte a

forma circolare – è privo di proteine associate caratteristiche del DNA eucaristico.

Dna mitocondriale  codifica enzimi coinvolti nella produzione ATP – è di solito una

molecola di DNA circolare a doppio filamento che non è compatta da istoni – negli

animali ha una lunghezza di 16-18 kb – ci sono più copie di mtDNA nel mitocondrio

LA REPLICAZIONE DEL mtDNA

Al momento non c’è un consenso generale sul modo di replicazione del DNA degli

organelli.

Modelli della replicazione del mtDNA  il modo in cui il mtDNA si replica resto ad oggi

oggetto di dibattito. Sono stati proposti 2 modelli x il meccanismo di replicazione:

Modello dello spostamento del filamento (modello asimmetrico) (lez.4 diapo

 13)  è generalmente il più accettato. La replicazione è unidirezionale lungo il

cerchio, con una forcella di replicazione x filamento. Un filamento è chiamato

FILAMENTO LEGGERO (L) e l’altro FILAMENTO PESANTE (H).

Per ciascun filamento si ha un punto di innesco che costituiscono le 2 origini O e

H

O .

L

La replicazione inizia in una regione chiamata ansa di spostamento o D (regione

di 500 – 600 nt). Per poter indurre la replicazione, queste regioni necessitano di un

RNA primer che si pensa sia un trascritto di RNA sintetizzato in un’altra

posizione del mtDNA dalla RNA POLIMERASI MITOCONDRIALE.

Dopo che sono stati copiati circa 2/3 del mtDNA ad opera della DNA polimerasi γ,

usata esclusivamente x la replicazione e correzione bozze del mtDNA, la forcella di

replicazione passa sull’origine principale della sintesi del filamento L. Soltanto dopo

che il filamento H spostato passa oltre l’origine del filamento L, inizia la sintesi di un

nuovo filamento H a partire da OL. La sintesi è continua lungo tutto il cerchio su

entrambi i filamenti.

Modello del filamento accoppiato (o simmetrico) (lez.4 diapo 14)  modello più

 recente. La replicazione del filamento ritardato (filamento L) inizia a livelli di siti

multipli, coinvolgendo probabilmente la sintesi discontinua di brevi frammenti di

Okazaki e richiedendo primer multipli. Quindi in questo modello, la sintesi

accoppiata del filamento leader (H) e del filamento ritardato rappresenta un

meccanismo di replicazione del DNA semidiscontinuo e bidirezionale.

LA RIPARAZIONE E LA RICOMBINAZIONE DEL DNA

Abbastanza spesso si verificano forme di danno al DNA che non sono correlate al

processo di replicazione. Questi danni sono indotti dall’esposizione a numerosi tipi di

agenti diversi (radicali liberi O2, radiazioni ultraviolette, sost.chimiche). Il danno al DNA

costituisce una minaccia continua x l’integrità del genoma. Per risolvere questo problema

le cellule hanno evoluto una gamma di ENZIMI DI RIPARAZIONE del DNA e di

POLIMERASI DI RIPARAZIONE.

I processi di riparazione e ricombinazione hanno molte caratteristiche in comune e

sono intimamente intrecciati fra loro e con la replicazione del DNA.

REPLICAZIONE ALTA FEDELTA’ del DNA  è importate x mantenere l’info genetica x

molte generazioni.

REPLICAZIONE BASSA FEDELTA’ DNA  è utile x l’evoluzione specie e x generare la

diversità che porta ad un aumento della sopravvivenza quando gli organismi sono

soggetti a cambiamenti dell’ambiente.

I tipi di mutazioni al DNA

MUTAZIONE  derivano da cambiamenti nella sequenza dei nucleotidi DNA o da

delezioni, inserzioni, riarrangiamenti sequenze DNA.

A seconda dell’origine della causa mutazione, distinguiamo:

MUTAZIONI SPONTANEE  mutazione che si verifica come risultato di processi

 naturali che avvengono all’interno della cellula (es. errori replicazione DNA –

ROS metabolismo cell.).

MUTAZIONI INDOTTE  si verificano come risultato di interazioni del DNA con un

 agente o mutageno esterno che provoca danno al DNA (es. raggi X – UV –

mutageni chimici –ecc).

Ci sono alcuni punti cromosomici in cui le mutazioni si verificano con una frequenza

maggiore rispetto ad altre regioni DNA.

A cosa servono le mutazioni? ..> Fonte principale della variazione genetica che

spinge i cambiamenti evolutivi – conseguenze deleterie.

Distinzioni a livello molecolare dei tipi di mutazioni

MUTAZIONI PUNTIFORMI  in queste mutazioni si ha la sostituzione di una

 coppia di nucleotidi con una coppia diversa. Influenzano la sequenza DNA ma

non la struttura. Possono derivare da errori durante la replicazione o mutazioni

in situ di una base.

Si possono avere (diapo 2 lez.5):

Transizioni  quando c’è la sostituzione di una BASE PIRIMIDINICA con

o un’altra o una BASE PURINICA con un’altra. Le mutazioni spontanee

tendono ad essere TRANSIZIONI. Es. in una sostituzione di A con G, si crea

temporaneamente una coppia di basi GT mal appaiata. Durante il ciclo

successivo di replicazione, se l’appaiamento errato non viene corretto,

questa TRANSIZIONE viene incorporato permanentemente nella sequenza

DNA. L’appaiamento sbagliato si risolve in una coppia di basi GC in una

molecola figlia (MUTATA) (diapo 3 lez.5) e in una coppia di basi AT

nell’altra molecola figlia (NORMALE).

Trasversioni  sostituiscono una PIRIMIDINA con una PURINA o

o viceversa.

Nel genoma umano avvengono più TRANSIZIONI che TRASVERSIONI.

Le reazioni di mutazione che determinare la sostituzione di una coppia di basi sono:

Deamminazione (diapo 6 lez.5)  è la reazione più frequente e

o importante di danno idrolitico che si può verificare spontaneamente x

l’azione dell’acqua o perché indotto da un mutageno chimico. Si ha, ad es.,

la sostituzione di un GR.AMMINICO della citosina con O2, convertendola in

URACILE (base presente solo nell’RNA)

Quando una coppia di basi UG sostituisce la coppia CG, ciò provoca soltanto

una piccola distorsione strutturale nella doppia elica DNA. È improbabile che

questo tipo di cambiamento blocchi completamente il processo della

replicazione o della trascrizione, ma può portare alla produzione di un

RNA mutante o di una proteina alterata.

Alchilazione  agenti alchilanti come la NITROSAMMINE portano alla

o 6

formazione di O -metilguanina. Questa base sbagliata si accoppia spesso in

modo sbagliato con T, portando al cambiamento di una coppia di basi GC

in una coppia AT quando il DNA danneggiato si replica.

Ossidazione  potenti agenti ossidanti sono radiazioni ionizzanti e agenti

o chimici che generano radicali liberi. Le specie reattive dell’O2 possono

generare 8-oxoguanina ..> base G danneggiata che contiene un atomo

extra di O. 8-oxoguaninua può formare COPPIA DI BASI di

HOOGSTEEN con A (diapo 8 lez.5). Ciò da origine a una TRASVERSIONE

GC  TA, che è una delle mutazioni più comuni presenti nei cancri umani.

Effetti fenotipici delle MUTAZIONI PUNTIFORMI:

Nessun effetto

o Alterazione nucleotide cruciale in una regione regolatrice di un gene

o Alterazione nucleotide cruciale nello stampo di una molecola

o funzionale di RNA

Alterazione nucleotide cruciale in un gene che codifica x una

o proteina ..> le sostituzioni nucleotidiche in un gene che codifica x una

proteina possono cambiare o no l’aa nella proteina codificata (diapo 4 lez.5):

SILENTI  Nel caso delle MUTAZIONI SILENTI si ha il cambiamento

 sequenza nucleotidica senza cambiare la sequenza aa.

MISSENSO  si hanno mutazioni nucleotidiche che cambiano la

 sequenza aa. Un cambiamento nella sequenza aa di una proteina

può alterarne le proprietà biologiche (es. anemia falciforme, presenta

cambiamento singolo aa).

NONSENSO  mutazioni nucleotidiche che creano un nuovo

 codone di STOP.

ESPANSIONI DELLE RIPETIZIONI TRINUCLEOTIDICHE  Alcune regioni del DNA

 hanno una insolita instabilità genetica a causa della presenza di ripetizioni

trinucleotidiche. Le espansioni possono acquisire conformazioni a triplica elica,

assumere strutture secondarie insolite del DNA che interferiscono con la

trascrizione e replicazione del DNA (es. Atassia Friedreich, distrofia miotonica,

sindrome dell’X fragile, ecc).

INSERZIONI o DELEZIONI DNA  aggiunta o delezione di uno o pochi

 nucleotidi. Avviene con una frequenza minore di quella delle sost.nucleotidiche

(es. fibrosi cistica).

Nel caso di aggiunta o delezione di nucleotidi in un numero non multiplo di 3 (diapo

9 lez.5), viene spostato (shift) l’ordine di lettura (frame) in cui il ribosoma

legge le triplette dei codoni nell’mRNA e, di conseguenza, altera tutti gli aa a

valle del sito di mutazione.

GRANDI RIARRAGIAMENTI CROMOSOMICI

Le classi generali del danno al DNA

MUTAGENO (diversi mutageni ambientali, es.sost.chimiche tabacco)  è un agente

chimico che causa un aumento frequenza di mutazioni.

DANNO AL DNA  consiste in un cambiamento che introduce una deviazione dalla

solita struttura a doppia elica. Esistono 3 classi principali di danno al DNA:

CAMBIAMENTI DI SINGOLE BASI  colpisce la sequenza di DNA, ma ha

 soltanto un effetto minore sulla struttura generale. Vedi MUTAZIONI PUNTIFORMI.

DISTORSIONE STRUTTURALE  modificano la struttura stessa del DNA e

 possono impedire la trascrizione o bloccare la replicazione. Sono prodotte dalla

LUCE ULTRAVIOLETTA (UV) la quale viene assorbita selettivamente dalle cellule,

inducendo effetti deleteri. Lesioni più frequenti del DNA indotte da UV sono

l’induzione di DIMERI di pirimidine fra 2 T adiacenti (diapo 13 lez.5) ..> DIMERI

DI CICLOBUTANO-PIRIMIDINA (CPD), perché si forma un anello ciclobutanico fra

gli atomi di C 5-6 di T adiacenti.

Poiché si formano legami covalenti fra T adiacenti dello stesso filamento, ciò

distrugge le coppie di basi complementari che formano la doppia elica. I

dimeri di T distorcono così la struttura del DNA duplex.

Induzione di DIMERI DI PIRIMIDINA è un difetto più grave del cambiamento di una

singola base.

Il danno al DNA può essere causato anche da AGENTI INTERCALANTI come il

BROMURO DI ETIDIO, contengono parecchi anelli policiclici (diapo 14 lez.5).

Questi anelli piatti si inseriscono fra le basi del DNA, legandosi alle basi e

impilandosi con esse, esattamente come le basi si legano e si impilano fra loro nella

doppia elica.

A causa della seguente distorsione della doppia elica, gli agenti intercalanti

possono causare inserzione o delezione di una o più coppie di basi durante la

replicazione del DNA.

Il danno al DNA può essere causato anche da ANALOGHI DELLA BASE, sono

abbastanza simili alle basi normali da essere assunti dalle cellule e incorporati nel

DNA durante la replicazione, ma a causa delle loro differenze strutturali, formano

coppie di basi in modo inappropriato (es. 5-bromouracile (analogo della T), va a

formare una coppia sbagliata con G).

DANNO ALL’OSSATURA DNA  comprendono:

 Formazione SITI ABASICI  generati spontaneamente dalla formazione di

o addotti instabili delle basi.

ROTTURE a DOPPIO FILAMENTO (diapo 17 lez.5)  possono essere

o indotte da radiazioni ionizzanti (es. raggi X, materiali radioattivi) e altri

composti chimici. Radiazioni ionizzanti possono attaccare (ionizzare) il

deossiribosio dell’ossatura DNA direttamente o indirettamente, generando

specie reattive O2.

Sono il tipo più grave di danno al DNA.

Risposte della cellula al danno al DNA

• Risposte che AGGIRANO IL DANNO (diapo 19 lez.5)  Le DNA polimerasi ad

ALTA FEDELTA’, copiano accuratamente lo stampo non danneggiato, ma sono

incapaci di aggirare lesioni del DNA. A tal scopo vengono utilizzate dalla cell.

DNA polimerasi specializzate a BASSA FEDELTA’ (inclini all’errore). Queste DNA

polimerasi sostituiscono temporaneamente quelle re plicative, inducendo un

processo di SINTESI TRANSLESIONE: non essendo la POLIMERASI

REPLICATIVA in grado di aggirare una lesione, quando la FORCELLA

REPLICATIVA incontra una lesione sul filamento di DNA si blocca. A questo punto

la POLIMERASI REPLICATIVA o si stacca o semplicemente trasloca a valle della

lesione e viene sostituita da una delle DNA polimerasi specializzata, conservate

in un compartimento subnucleare vicino alla forcella di replicazione in stato di

arresto. Questa polimerasi mette in atto la SINTESI TRANSLESIONE che permette

di aggirare il danno ed estendere il filamento fino ad una posizione a valle,

dove a questo punto si verificherà il ritorno della POLIMERASI REPLICATIVA e il

rilascio della POLIMERASI SPECIALIZZATA. La replicazione ad alta fedeltà del

DNA riprende.

Le DNA polimerasi specializzate sono inclini all’errore e possono perciò generare

mutazioni x sostituzione di basi o mutazioni frameshift. La polimerasi eta è una

dna polimerasi specializzata che è esente dall’essere incline all’errore.

• Risposte che INVERTONO DIRETTAMENTE IL DANNO  nella maggior parte

degli organismi (ma non esseri umani) il danno al DNA dovuto a radiazioni UV può

essere riparato direttamente  PROCESSO DI FOTORIATTIVAZIONE (o

riparazione alla luce).

Negli esseri umani un esempio di inversione diretta dl danno al DNA è la

6

RIPARAZIONE DELLA BASE METILATA O -METILGUANINA  enzima

METILTRASFERASI catalizza rimozione GR.METILICO dalla G. Una volta che

accetta il gruppo, l’enzima non può più essere utilizzato (processo molto costoso x

la cellula).

• Risposte che RIMUOVONO LA SEZIONE DANNEGGIATA di DNA e la

sostituiscono con DNA NON DANNEGGIATO utilizzano sistemi di

ESCISSIONE o RICOMBINAZIONE  i sist. di riparazione che rimuovono il DNA

danneggiato comprendono:

Riparazione cambiamenti singole basi

o Distorsioni strutturali

o Rotture a doppio filamento del DNA

o

Caratteristica chiave di queste vie è che nel processo di riparazione sono coinvolte

interazioni dinamiche multiple fra proteine, in cui il DNA viene passato in modo

ordinato da una proteina (o complesso proteine) a quello successivo.

RIPARAZIONE DEI CAMBIAMENTI DELLE SINGOLE BASI

Esistono 2 vie principali di riparazione dei cambiamenti delle singole basi:

Riparazione x ESCISSIONE DELLE BASI  comporta la correzione di

 cambiamenti di singole basi dovute a conversione. La riparazione x

ESCISSIONE è iniziata da enzimi chiamati DNA GLICOSILASI  tagliano il

legame n-glicosidico che lega DEOSSIRIBOSIO a BASE

(DANNEGGIATA), andando quindi a produrre escissione della base,

costituendo un SITO ABASICO nel DNA. Esistono DNA glicosidasi che

riconoscono e riparano BASI: OSSIDATE/RIDOTTE – METILATE –

DEAMINATE – MALE APPAIATE.

Meccanismo di riparazione x ESCISSIONE BASI (diapo 23 lez.5)  il

meccanismo di riconoscimento lesione è ancora poco conosciuto. Nel caso

dell’enzima GLICOLICASI, 8-OXOGUANINA DNA glicolicasi 1, esso è in

grado di riconoscere il danno al DNA da parte dell’oxoguanina. Quest’enzima

agisce legandosi dapprima in maniera non specifica al DNA. Quando

l’enzima incontra una base oxoG appaiata con C, l’oxoG viene estrusa

dalla doppia elica in una tasca specifica x G. Successivamente oxoG

viene inserita in profondità in una tasca di riconoscimento della lesione

(tasca oxoG) dell’enizma. Gli aa che rivestono questa tasca prendono

contatto direttamente con oxoG, fornendo un mecc. di riconoscimento

specifico.

Se l’enzima incontra una coppia di basi normali GC i contatti fra l’enzima e la

base C portano all’estrusione transitoria della G in una tasca specifica x

G dell’enzima, ma non può accedere alla tasca oxoG e quindi rientra

nella doppia elica DNA.

Dopo l’escissione segue la riparazione del filamento DNA  la riparazione

può corrispondere ad un singolo nucleotide (pezza breve) o a 2-10 nt

(pezza lunga). Entrambi i sistemi di riparazione sono caratterizzati dal:

trasferimento del DNA dalle ENDONUCLEASI che tagliano la base

danneggiata, alla DNA polimerasi e alla DNA ligasi che eseguono la

SINTESI DI RIPARAZIONE.

Riparazione delle BASI MALE APPAIATE  una deficienza ereditaria nel

 meccanismo di riparazione delle basi male appaiate, provoca un ↑frequenza

mutazioni e una suscettibilità a certi tipi di cancro (fra cui cancro del colon).

La riparazione delle basi male appaiate dipende da numerosi fattori (DNA

polimerasi δ, pinza replicazione PCNA, caricatore pinza RFC, ecc).

Passaggi riparazione basi male appaiate:

RICONOSCIMENTO DELL’ERRORE  il riconoscimento del filamento

o figlio nei mammiferi che porta l’errore è sconosciuto. Un modello

propone che le estremità 5’ di un frammento Okazaki e il

macchinario polimerasi associato all’estremità 3’ del filamento

nascente possano servire da marcatori x la discriminazione del

filamento che presenta l’errore.

LA RIPARAZIONE COMPORTA LA RIMOZIONE DEL NUCLEOTIDE

o MALE APPAIATO e la RIMOZIONE DI UNA GRANDE REGIONE

DNA CHE CONTIENE APPAIAMENTO SBAGLIATO (diapo 29 lez.5)

 meccanismo ancora oggetto di studio; un modello è quello

dell’INTERRUTTORE MOLECOLARE” che propone MutSα legato ad

ATP e associato con MutLα, vada formare una pinza scorrevole

sul DNA male appaiato (analoga a PCNA). Altro modello suggerisce

che MutSα rimanga fermo sul sito dell’appaiamento sbagliato.

Che si muova o rimanga fermo, comunque sia il complesso MutSα –

MutLα in qualche modo scatena l’attivazione del macchinario di

riparazione: l’esonucleasi EXO1 produce un taglio a singolo

filamento iniziando la riparazione sul lato 3’ o 5’ dell’appaiamento

sbagliato. EXO1 in associazione con PCNA rimuove quindi

progressivamente la porzione del filamento fra il NICK e

APPAIAMENTO SBAGLIATO. La sintesi di riparazione che

sostituisce il filamento escisso con nuovo DNA è mediata dalla

DNA polmerasi δ e dai fattori ad essa associati. La DNA ligasi

salda il nick con legame fosfodiestere.

RIPARAZIONE DELLE DISTORSIONI STRUTTURALI : riparazione per ESCISSIONE DI

NUCLEOTIDI

I difetti della riparazione per escissione dei nucleotidi sono la causa della malattia

ereditaria XERODERMA PIGMENTOSO, caratterizzata da una sensibilità insolitamente

alta alla luce UV.

Meccanismo di riparazione (diapo 32 lez.5):

Riconoscimento del danno al DNA  attraverso legame cooperativo di RPA,

 XPA, XPC e complesso TFIIH (composto da numerosi polipeptidi, fra cui XPB

– XPD) che si assemblano in ordine casuale.

Svolgimento della doppia elica DNA  da parte di XPB-XPD che hanno

 att.elicasica 5’3’.

Incisioni DNA  viene prodotta un’incisione sul lato 3’ del danno da parte

 ENDONUCEALSI (XPG) e un’altra incisione sul lato 5’ del danno da

ENDONUCLEASI (XPF-ERCC1). Successivamente il DNA viene trasferito alla DNA

POLIMERASI ε o DNA POLIMERASI δ o PCNA o ecc, x la sintesi di riparazione.

La scelta del tipo di polimerasi dipende dal tipo di cellula, anche se la DNA

POLIMERASI ε è probabilmente quella usata più comunemente. L’interruzione che

resta è saldata dalla DNA ligasi I.

La via di riparazione responsabile del riconoscimento delle lesioni all’interno genoma si

chiama RIPARAZIONE GLOBALE DEL GENOMA (GGR), mentre la via di riparazione

accoppiata alla trascrizione (TCR) identifica lesioni sul filamento trascritto dei geni attivi.

RIPARAZIONE ROTTURE A DOPPIO FILAMENTO: mediante RIMOZIONE DEL

DANNO DNA

Le rotture a doppio filamento sono riparate da:

RICOMBINAZIONE OMOLOGA  ripara le rotture a doppio filamento recuperando

o l’info genetica da un cromosoma omologo danneggiato. Ha un ruolo minore

negli eucarioti multicellulari, essa infatti agisce secondariamente rispetto alla NON

OMOLOGA e la funz.principale è quella di riparare le rotture a doppio filamento

a livello delle forcelle di replicazione.

La RICOMBINAZIONE OMOLOGA, svolge molti ruoli essenziali negli organismi

eucaristici (mantiene integrità genoma mediando la segregazione appropriata dei

cromosomi durante meiosi – dà spesso origine al crossing over fra i geni presenti

su 2 cromosomi – ecc).

La RICOMBINAZIONE OMOLOGA ha un ruolo importante nella riparazione delle

rotture a doppio filamento DNA: la sottoposizione delle cell. a radiazioni

ionizzanti (o altri agenti) che inducono rotture doppio filamento, scatena un

aumento dell’att.chinasica di ATM (serina-treonina chinasi nucleare),

trasduttore chiave del segnale. ATM viene reclutato nel sito di danno e fosforila

alcune delle proteine coinvolte nella riparazione del DNA. Un bersaglio

importante è la p53 (tumor suppressor, proteina che sopprime tumori). Esseri

umani sprovvisti della ATM soffrono di atassia telangectasia, caratterizzata da

↑sensibilità radiazioni, cancro, invecchiamento prematuro, ecc.

Nei punti di rottura del doppio filamento si creano delle FOCI DI REPLICAZIONE,

dove oltre a reclutare ATM, sono contenute la maggior parte delle proteine di

riparazione Rad52 presente nella cellula. A livello del punto di rottura viene

reclutato il complesso MRN, costituito da 3 proteine, e inizia la RIPARAZIONE: il

DNA viene processato dall’att.esonucleasica 3’5’ del complesso MRN x formare

code a singolo filamento (diapo 34 lez.5). Le code 3’ invadono SEQUENZE

OMOLOGHE INTATTE. Lo scambio dei filamento genera una molecola ibrida fra il

DNA duplex DANNEGGIATO – DNA NON DANNEGGIATO (ETERODUPLEX).

La GIUNZIONE HOLLIDAY è un intermedio in cui i 2 duplex che ricombinano

sono uniti covalentemente da crossing over di singoli filamenti. La

GIUNZIONE HOLLIDAY è risolta in 2 duplex da un complesso enzimatico chiamato

RESOLVASOMA.

RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA DELLE ESTERMITA’  riunisce le rotture a

o doppio filamento tramite la legatura diretta delle estremità del DNA senza

necessità di omologia di sequenza. È la via più utilizzata nei mammiferi ed è attiva

durante tutto il ciclo cellulare.

La riparazione delle rotture a doppio filamento è fondamentale x mantenere

l’integrità del genoma, ma lo stesso processo di riparazione può portare a

mutazioni (es. 2 estremità spezzate possono essere legate insieme dal

macchinario di riparazione indipendentemente dal fatto che derivino dallo

stesso cromosoma e l’unione NON OMOLOGA DELLE ESTREMITA’ porta spesso

a inserzioni o delezioni del punto di rottura). I passaggi chiave sono: azione

nucleo litica – polimerizzazione – legatura. In seguito a rottura a doppio

filamento, le estremità spezzate del DNA sono riconosciute da 2 eterodimeri

delle proteine Ku70 – Ku80. Gli etero dimeri costituiscono delle impalcature che

mantengono vicine le 2 estremità rotte, permettendo agli altri enzimi di agire.

L’eterodimero Ku recluta nel sito del danno:

NUCLEASI (Artemis/DNA-PKcs)  rimuove DNA danneggiato o in

o eccesso nel sito di rottura.

POLIMERASI (DNA polimerasi μ-λ)  riempiono le interruzioni o

o estendono sporgenze 3’ o 5’.

LIGASI (DNA ligasi IV)  riunisce estremità rotte.

o LA TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

Si stima che molti eucarioti abbiano 20000-25000 geni, alcuni dei quali sono espressi

(trascritti) sempre in tutte le cellule, mentre altri sono espressi quando le cell. entrano in

una particolare via di differenziamento o quando cambiano le condizioni interne o esterne

della cellula.

TRASCRIZIONE  processo di copiatura del DNA x generare un RNA a singolo

filamento con una sequenza identica ad un filamento del DNA duplex. L’info viene

riscritta (trascritta), ma utilizzando lo stesso linguaggio dei nucleotidi.

La regolazione della trascrizione dei geni che codificano x proteine, da parte della

RNA POLIMERASI II (RNA pol II). RNA pol II si trova nel NUCLEOPLASMA ed è

responsabile della trascrizione della grande maggioranza dei geni, fra cui quelli che

codificano mRNA – piccoli RNA nucloelari (snoRNA) – piccoli RNA nucleari (snRNA) –

microRNA.

Esistono altre polimerasi importanti:

RNA polimerasi I  risiede nel NUCLEOLO ed è responsabile della sintesi

 precursore dell’RNA ribosomale grande.

RNA polimerasi III  si trova nel NUCLEOPLASMA ed è responsabile della sintesi

 tRNA – RNA ribosomale – alcuni snRNA.

Durante la trascrizione, la RNA pol II si associa transitoriamente al DNA stampo, ma

anche a molte proteine diverse, fra cui i FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE 

questi fattori legano sequenze specifiche del DNA e vanno a interpretare l’info

presente nei promotori dei geni – elementi regolati e trasmettono la risp.

appropriata al macchinario di trascrizione della RNA pol II.

Ciò che accende un gene particolare in una cellula è la combinazione unica di

ELEMENTI REGOLATORI – FATTORI DI TRASCRIZIONE.

Gli ELEMENTI REGOLATORI dei geni sono sequenze di DNA cis-agenti specifiche che

sono riconosciute da fattori di trascrizione trans-agenti. Gli ELEMENTI REGOLATORI

cis-agenti si possono classificare in base alla loro vicinanza dal punto di inizio della

trascrizione:

Elementi promotori  il promotore di un gene, si tratta dell’insieme di elementi

 regolatori cis-agenti che sono necessari x l’inizio della trascrizione o che

fanno aumentare la frequenza di inizio soltanto quando sono posizionati

vicino al sito di inizio della trascrizione. La regione del promotore comprende:

Nucleo del promotore (diapo 4 lez.10)  è una sequenza di circa 60 bp di

o DNA sovrapposta al sito di inizio della trascrizione che serve da sito di

riconoscimento x la RNA pol II e x i fattori generali di trascrizione. Gli

ELEMENTI DEL PROMOTORE non funzionano più anche se vengono

spostati di poco rispetto al sito di inizio della trascrizione.

Il fattore di trascrizione responsabile del riconoscimento di tutti gli

ELEMENTI NOTI del NUCLEO PROMOTORE è TFIID (ad eccezione del

motivo BRE, riconosciuto da TFIIB). Alcuni degli ELEMENTI NOTI del

NUCLEO PROMOTORE sono:

TATA box  è il sito di legame x la proteina TBP, sub unità importante

 del complesso TFIID. TATA box può funzionare in assenza dei

motivi BRE, Inr, DPE.

elemento iniziatore (Inr)  riconosciuto da altre 2 subunità di TFIID.

 Può funzionare indipendentemente da TATA box. Anche se si è

visto avere un’azione sinergica nei promotori che contengono TATA,

facendo aumentare l’efficienza dell’inizio della trascrizione.

motivo BRE  è riconosciuto da TFIIB e non da TFIID.

 elemento a valle promotore (DPE)  funziona nei promotori privi

 di TATA, ma richiede presenza di Inr.

elemento del motivo dieci (MTE)  sebbene possa funzionare

 indipendentemente dalla TATA box o DPE, il sito esibisce un forte

sinergismo con entrambi questi elementi.

Ognuno di questi ELEMENTI si trova soltanto in una parte dei nuclei del

promotore. Un particolare NUCLEO DEL PROMOTORE può contenerne

alcuni, tutti o anche nessuno (es. TATA box è presente nel 32% dei potenziali

NUCLEI DEL PROMOTORE).

Elementi prossimali al promotore  un tipico gene di un eucariote

o multicellulare, contiene parecchi ELEMENTI PROSSIMALI DEL

PROMOTORE. Si trovano a monte del nucleo promotore e presentano siti

di riconoscimento x fatt.trascrizione come CAAT box – GC box – ecc.

Gli ELEMENTI PROSS. DEL PROMOTORE fanno aumentare la frequenza

di inizio trascrizione, ma soltanto quando si trovano vicino al sito di

INIZIO TRASCRIZIONE. I FATT.TRASCRIZIONE che si legano agli

ELEMENTI PROSSIMALI PROMOTORE non sempre attivano o reprimono

direttamente la trascrizione, ma potrebbero servire da elementi di

collegamento che reclutano ELEMENTI REGOLATORI A LUNGO

RAGGIO.

Elementi regolatori a lungo raggio  i geni che codificano x proteine degli

 eucarioti contengono di solito ulteriori sequenze regolatrici che possono funzionare

a distanza di 100.000 basi o più dal PROMOTORE DEL GENE. Questi ELEMENTI

REGOLATORI A LUNGO RAGGIO sono fondamentali x mediare i complessi

schemi di espressione genica che si creano in tipi cellulari diversi durante lo

sviluppo.

Gli ELEMENTI REGOLATORI A LUNGO RAGGIO negli eucarioti comprendono:

ENHANCER e SILENZIATORI un tipico gene che codifica x una proteina ha

o molte probabilità di contenere parecchi ENHANCER che agiscono a

distanza. Sono localizzati a 700 – 1000 o più basi di distanza dal sito di

inizio trascrizione. La caratteristica distintiva è che si possono trovare sia

a monte che a valle del gene. Un tipico ENHANCER è lungo 500bp e

contiene una media di 10 siti di legame x parecchi fattori di trascrizione

diversi. Gli ENHANCER fanno aumentare attività del promotore in tutti i

tessuti o tessuto-specifici o in certi stadi dello sviluppo.

Gli elementi simili che reprimono att. di un gene sono SILENZIATORI.

ISOLATORI  un ISOLATORE è una sequenza di DNA di solito lunga da

o 300 a 2000 bp che ha 2 funzioni distinte:

Marca il confine della cromatina (diapo 8 lez.10)  marca il confine

 fra regioni di ETEROCROMATINA e EUCROMATINA.

Attività di blocco di un enhancer  impedisce attivazione o

 repressione inappropriata dei geni circostanti bloccando l’azione

di ENHANCER e SILENZIATORI.

L’isolatore contiene di solito un gruppo di siti di legame x proteine che legano

sequenze specifiche di DNA. Gli isolatori sono riconosciuti da almeno 3

proteine diverse che legano il DNA: fattore che lega CCCTC (CTCF),

media att.blocco enhancer – fattori stimolatori a monte (USF) 1-2, si

legano all’isolatore e reclutano parecchi enzimi che modificano la

cromatina.

REGIONI DI CONTROLLO DEL LOCUS (LCR)  le LCR sono sequenze di

o DNA che organizzano e mantengono un dominio funzionale di

cromatina attiva e fanno aumentare la trascrizione dei geni a valle.

REGIONI DI ATTACCO ALLA MATRICE (MAR)  è stato proposto che la

o matrice nucleare serva da organizzatore strutturale all’interno del

nucleo della cellula. Ad es. è stato ipotizzato che l’interazione diretta delle

regioni di attacco alla matrice (MAR) con la matrice nucleare organizzi la

cromatina in domini ad ansa e mantenga i territori dei cromosomi. Ci

sono più di 200 tipi di proteine associate alla matrice nucleare, alcune delle

quali sono comuni a tutti i tipi cell., mentre altre sono tessuto-specifiche.

L’organizzazione tridimensionale della cromatina nel nucleo cell. ha un

ruolo centrale nel controllo della trascrizione. Dopo l’estrazione degli

istoni la cromatina si organizza in anse e la formazione di ciascuna ansa

dipende da elementi specifici di sequenza di DNA, chiamate REGIONI DI

ATTACCO ALLA MATRICE (MAR). Si pensa che le MAR organizzino il

genoma approssimativamente in 60.000 anse di cromatina con una

dimensione media di 70.000 basi. I geni attivi tendono a far parte di

domini ad ansa piccoli (fino 4kb), mentre le regioni inattive della cromatina

sono associate a domini più grandi (fino 200kb).

Le MAR si trovano di solito vicino ad ENHANCER nelle sequenze

fiancheggianti 5’ e 3’. Si pensa che queste regioni conferiscano specificità

tissutale e controllo durante lo sviluppo dell’espressione genica,

reclutando fattori trascrizione – fornendo parecchi enzimi di

rimodellamento della cromatina.

È stato proposto che esistano 2 tipi di siti di legame alla matrice all’interno

delle anse:

MAR strutturali (costitutive)  servono da ancore.

o MAR funzionali (facoltative)  sono più dinamiche e aiutano a

o portare geni sulla matrice nucleare.

IL MACCHINARIO GENERALE (BASALE) della TRASCRIZIONE

Dal 5 al 10% della capacità totale di codifica del genoma degli eucarioti è rivolto a

proteine che regolano la trascrizione, circa 3000 negli esseri umani. Queste proteine si

dividono in 3 classi principali:

1. Il macchinario generale (basale) della trascrizione: riguardano i diversi

componenti delle grandi macchine multi proteiche delle RNA POLIMERASI,

necessari x il riconoscimento promotore – catalisi della sintesi RNA.

2. Fattori generali di trascrizione: proteine che legano sequenze specifiche di

DNA che si legano ai PROMOTORI DEI GENI e agli ELEMENTI REGOLATORI A

LUNGO RAGGIO e mediano l’attivazione o la repressione specifica della

trascrizione.

3. Coattivatori e corepressori trascrizionali: proteine che fanno aumentare o

diminuire l’att.trascrizionale tramite interazioni proteina-proteina senza legarsi

direttamente al DNA. COATTIVATORI e COREPRESSORI servono da

impalcatura x reclutamento proteine aventi att. enzimatiche o hanno essi

stessi att.enzimatiche che alterano la struttura cromatina.

1. I COMPONENTI DEL MACCHINARIO GENERALE DELLA TRASCRIZIONE

RNA pol II  polimerasi composta da 12 subunità. Sintetizza RNA e esegue

 correzione bozze del trascritto nascente.

Struttura della RNA polimerasi II ..> ha 2 strutture distinte e può essere

dissociata in un nucleo catalitico di 10 SUBUNITA’ e in un ETERODIMERO

composto dalla sub unità Rpb4 e Rpb7 che insieme formano il COMPLESSO

Rpb4/7 (diapo 16 lez.10). Il nucleo dell’enzima della RNA pol II è cataliticamente

attivo ma richiede il complesso Rpb4/7 e i fattori generali di trascrizione x

iniziare la trascrizione a partire da DNA del promotore.

Rpb4/7 ha un ruolo nell’esportazione nucleare dell’mRNA e nella riparazione del

DNA accoppiata alla trascrizione.

Nucleo catalitico della RNA polimerasi II (diapo 17 lez.10)  le 2 subunità Rpb1 e

Rpb2 formano la MASSA CENTRALE dell’enzima e una FESSURA carica

positivamente. Gli ac.nucleici occupano la profondità della fessura. Un lato

della fessura è formato da un grande elemento proteico mobile, la PINZA. Il

CENTRO ATTIVO si forma tra la PINZA – PARETE proteica che blocca l’estremità

fessura – ELICA PONTE (colore verde diapo 17 lez.10) che attraversa la fessura.

Un PORO sotto il sito attivo si allarga verso l’esterno come un imbuto alla rovescia.

2+

Il bordo del poro include uno ione metallico (Mg ). Un secondo ione metallico si

può legare debolmente più avanti nel poro.

Rpb4/7 si trova sulla superficie del nucleo dell’enzima, sotto la pinza.

Altro dominio della RNA pol II è il dominio mobile C-terminale (CTD) di Rpb1

(diapo 17 lez.10).

Il dominio C-terminale (CTD)  si connette alla Rpb1. È necessario x la

modificazione dell’mRNA: durante il ciclo di trascrizione, il CTD subisce

fosforilazione catalizzata da enzimi att.chinasica, tra cui TFIIH, mentre la

defosforilazione è catalizzata da una fosfatasi.

L’inizio trascrizione richiede un CTD non fosforilato, mentre allungamento richiede

CTD fosforilato. Quando è fosforilato CTD può legare i fattori di modificazione

dell’mRNA durante gli eventi terminazione. Per il reinizio della trascrizione, CTD

deve essere di nuovo defosforilato.

Fattori generali di trascrizione  elenco vari fatt. diapo 15 lez.10. Sono

 responsabili del riconoscimento promotore e svolgimento DNA del promotore.

RNA pol II è assolutamente dipendente da questi fattori x inizio trascrizione.

Formazione del COMPLESSO DI PRE-INIZIO (diapo 18 lez.10)  il primo fattore di

trascrizione che si associa al DNA stampo è TFIID. TFIID è un complesso

composto dalla proteina TBP che lega TATA e 14 fattori associati a TBP, definiti

TAF. TBP è una proteina che lega una sequenza specifica di DNA che riconosce

la TATA box. La TBP si lega al DNA e lo piega (diapo 18 lez.10).

Dopo il legame di TFIID, TFIIB si unisce al complesso in crescita. TFIIB si lega

soltanto ad un’estremità di TBP e simultaneamente ad una sequenza di DNA

ricca di GC che segue TATA. Così il complesso formato TFIIB-TBP-DNA indica la

direzione dell’inizio trascrizione da parte della RNA pol II e anche quale

filamento della doppia elica del DNA deve agire da stampo. Il dominio N-

terminale di TFIIB si lega alla RNA pol II ed è essenziale x il suo reclutamento.

Vengono reclutati anche altri fattori generali di trascrizione x completare la

formazione del COMPLESSO PRE-INIZIO: TFIIF va a formare un forte complesso

con la polimerasi. L’aggiunta di legame di TFIIF va a promuovere il reclutamento di

TFIIE che a sua volta recluta TFIIH. TFIIH contiene almeno 9 subunità proteiche

con funzioni diverse. Le funzioni svolte da TFIIH:

è la proteina chinasi che fosforila il CTD della RNA pol II.

o Ha att.elicasica dipendente da ATP

o È coinvolto anche nella RIPARAZIONE DNA.

o

Il NUCLEO PROMOTORE + FATTORI TRASCRIZIONE + RNA POL II in

associazione con il MEDIATORE, formano il COMPLESSO DI PRE-INIZIO (PIC).

Azione del COMPLESSO PRE-INIZIO  lo svolgimento del DNA a doppio filamento

(promotore) richiede idrolisi ATP in una reaz. mediata dalla sub unità

ATPasi/elicasi di TFIIH con l’aiuto di TFIIF. Il filamento stampo scende quindi nel

sito attivo della RNA pol II.

Mediatore  complesso di 20 subunità che trasduce info regolatrici da attivatori

 e repressori alla RNA pol II. Esclusivo degli eucarioti. Serve da ponte molecolare

che connette i FATT.TRASCRIZIONE legati ad un enhancer o altri elementi

regolatori a lungo raggio, con la RNA POL II (diapo 19 lez.10). Il MEDIATORE è

un componente del COMPLESSO PRE-INIZIO e parecchi delle sue sub unità

sono necessarie x la trascrizione di quasi tutti i geni. Oltre a promuovere

assemblaggio COMPLESSO PRE-INIZIO, il MEDIATORE stimola anche

att.chinasica di TFIIH.

2. FATTORI DI TRASCRIZIONE

La regolazione dell’att. dei geni a livello trascrizionale avviene di solito tramite

cambiamenti della quantità o dell’att. di FATTORI DI TRASCRIZIONE. Naturalmente, i

geni che codificano x i FATT.TRASCRIZIONE devono essere a loro volta indotti o

repressi da altre proteine regolatrici. Oppure i fatt. trascrizione possono essere

attivati/deattivati mediante proteolisi, modificazioni covalenti, attacco ai ligandi.

I FATT.TRASCRIZIONE mediano l’attivazione o repressione trascrizionale di geni

specifici, tramite interazioni specifiche con ELEMENTI REGOLATORI del DNA e

tramite INTERAZIONI CON ALTRE PROTEINE  i FATT. TRASCRIZIONE che agiscono

come ATTIVATORI ..> ↑velocità trascrizione; al contrario i FATT.TRASCRIZIONE che

agiscono come REPRESSORI.

Ruoli svolti dai FATT.TRASCRIZIONE:

Stimola il reclutamento-legame dei FATT.GENERALI DI TRASCRIZIONE e RNA

 pol II al NUCLEO DEL PROMOTORE x formare un COMPLESSO PRE-INIZIO.

Induce cambiamento conformazionale o modificazione post-traduzionale che

 stimola att.enzimatica del macchinario generale trascrizione.

Interazione con COMPLESSI RIMODELLAMENTO e MODIFICAZIONE della

 cromatina x permettere migliore accessibilità del DNA stampo ai

FATT.GENERALI TRASCRIZIONE.

Questi diversi ruoli possono essere svolti direttamente mediante:

• interazioni con COATTIVATORI o COREPRESSORI TRASCRIZIONALI

• interazione PROTEINA-PROTEINA con il macch.generale trascrizione  i

fatt.trascrizione agiscono come PROTEINE MODULARI che presentano più

domini, i 3 principali sono (diapo 21 lez.10):

dominio che lega DNA

o dominio di trans attivazione

o dominio di dimerizzazione

o

Ma sono presenti anche fatt.trascrizione che hanno domini regolatori che legano i

ligandi (es. domini che legano ormoni).

Dominio che lega DNA

Il FATT.TRASCRIZIONE si posiziona su una sequenza specifica di DNA. Il dominio del

fatt.trascriz. interagisce specificatamente con le basi del DNA, stabilendo un legame

ad alta affinità che dipende da:

formazione LEGAMI H specifici  gli aa possono formare legami H specifici con

 atomi esposti sui lati delle coppie basi o lungo pavimento della scanalatura

principale o secondaria del DNA. Prima del lega tra FATT.TRASCRIZIONE – DNA

i loro gr.polari formano legami H con molecole H2O circostanti che sono poi

sostituiti dai legami H che si formano tra PROTEINA-DNA. La sostituzione di queste

molecole conferisce stabilità al complesso.

La perdita di legami H PROTEINA-DNA porta a una grave perdita di specificità del

fatt.trascrizione x specifico ELEMENTO REGOLATORE del DNA.

Lo schema di riconoscimento più comune fra FATT.TRASCRIZIONE – DNA è

un’interazione fra domini alfa-elica proteina – circa 5 coppie basi DNA nella

scanalatura principale.

MOTIVO  diversi motivi che legano sequenze specifiche di DNA: elica-giro-elica –

 dominio dita zinco – cerniera lampo di leucina – elica-ansa elica.

Elica-giro-elica (HTH)  presente nella maggior parte delle proteine regolatrici dei

procarioti. È un semplice ripiegamento di aa composto da 3 alfa-eliche centrali che

formano un fascio elicoidale destrogiro (diapo 23 (A) lez.10).

La TERZA ELICA (ELICA DI RICONSOCIMENTO) forma l’interfaccia principale fra

PROTEINA – DNA inserendosi nella scanalatura principale del DNA (diapo 23 (B)

lez.10).

Altre forme varianti del motivo HTH a 3 eliche possono contenere ulteriori configurazioni

come il motivo HTH winged ..> si distinguere x la presenza dell’ala, che è una forcina di

filamenti β C-terminale che si ripiega contro la fessura poco profonda del nucleo

parzialmente aperto composto dalle 3 eliche (diapo 23 (A) lez.10).

Dominio a dita di zinco (Zif)  uno dei motivi più diffusi. Il disegno bidimensionale della

sua struttura assomiglia ad un dito. Un dito è formato da cisteine – istidine non contigue

2+

che legano covalentemente al centro lo ione zinco (Zn ), facendo ripiegare un breve

tratto catena aa in un dominio compatto ad ansa e stabilizzato. Il LATO SX dito si

ripiega su se stesso x formare foglietto β, mentre il LATO DX si avvolge ad α-elica

(diapo 24 lez.10). Il dito inserisce la porzione alfa-elica nella scanalatura principale

DNA. Fra i moduli a dita zinco è presente REGIONE LINKER di 7-8 aa (diapo 24 lez.10). Il

numero dita varia nei diversi fattori trascrizione che contengono dita di zinco (es. dominio

che lega il DNA del rec. dei glucocotricoidi, TFIIIA ha 9 dita).

Motivo a cerniera lampo di leucina basica (bZIP)  non è così comune come gli altri

domini. Il bZIP non è il dominio del fattore di trascrizione che lega il DNA e non ha contatto

diretto con il DNA, ma ha invece un ruolo strutturale indiretto nel legame al DNA,

facilitando la dimerizzazione di 2 fattori di trascrizione simili. L’unione di 2

FATT.TRASCRIZIONE contenenti bZIP porta al posizionamento corretto dei 2 domini

adiacenti che legano il DNA nel complesso dimerico.

Il motivo bZIP è costituito da un tratto aa che si ripiega in una catena alfa-elica con

LEUCINE ogni 7 aa (diapo 25 lez.10). Le LEUCINE formano una striscia idrofobica sulla

faccia dell’alfa elica. Due catene polipeptidiche con questo motivo si avvolgono l’una

intorno all’altra x formare un dimero con disposizione coiled coil. Gli aa sporgono come

denti da una alfa-elica e si adattano in fori complementari fra i denti dell’elica

partner, come una cerniera lampo. Il dimero forma una struttura a forma di Y e

un’estremità dell’alfa-elica sporge nella scanalatura principale del DNA. Ciò permette alle

2 regioni basiche (ricche di arginina e lisina) di prendere contatto con DNA (diapo 25

lez.10).

Motivo elica-ansa-elica basico (BHLH)  è distinto da HTH e forma 2 eliche anfipatiche

che contengono tutti gli aa carichi su un lato dell’elica, separate da un’ansa non

elicoidale. Come motivo bZIP, BHLH non è il dominio del fattore di trascrizione che lega il

DNA e non ha contatto diretto con il DNA, ma ha invece un ruolo strutturale indiretto nel

legame al DNA, facilitando la dimerizzazione di 2 fattori di trascrizione simili.

L’unione di 2 FATT.TRASCRIZIONE contenenti BHLH porta al posizionamento corretto

dei 2 domini adiacenti che legano il DNA nel complesso dimerico. I domini che legano

il DNA sono ricchi di aa basici e possono interagire direttamente con il DNA acido.

Dominio di trans attivazione

È coinvolto nell’attivazione della trascrizione tramite interazioni proteina-proteina. I

domini di trans attivazione possono funzionare reclutando o accelerando

l’assemblaggio dei FATT.GENERALI TRASCRIZIONE sul promotore del gene.

A differenza dei DOMINI CHE LEGANO DNA, sono caratterizzati da motivi ricchi di aa

acidi (blob acidi).

Dominio di dimerizzazione

La maggioranza dei FATT.TRASCRIZIONE lega il DNA sotto forma di omodimero o

etero dimero e di conseguenza possiede un dominio che media dimerizzazione fra 2

proteine simili o identiche.

3. COATTIVATORI E COREPRESSORI TRASCRIZIONALI

I FATT.TRASCRIZIONE si legano al DNA in maniera sequenza-specifica e marcano un

gene x l’attivazione o la repressione tramite il reclutamento di COATTIVATORI o

COREPRESSORI. COATTIVATORI-COREPRESSORI sono proteine che fanno ↑ o ↓

att.trascrizionale, senza legarsi direttamente al DNA. Questi fattori si legano invece

direttamente ai FATT.TRASCRIZIONALI e servono da impalcatura x il reclutamento di

altre proteine aventi att.enziamatica o sono loro stessi che hanno att.enzimatica ed

alterano la struttura della cromatina.

I COATTIVATORI si possono suddividere in 2 classi principali:

Complessi di MODIFICAZIONE della cromatina  complessi multi proteici che

 modificano gli istoni dopo la traduzione, in modo da permettere ad altre

proteine di accedere più facilmente al DNA. Le code terminali degli istoni H2A.

H2B, H3, H4 che sporgono dal nucleo dell’ottamero (diapo 31 lez.10). Le

modificazioni post-traduzionali alle quali gli istoni sono soggette, alterano

l’accessibilità della cromatina al macchinario generale della trascrizione,

funzionando come interruttori on/off che determinano se un gene è attivo o

inattivo.

Le modificazioni post-traduzionali che possono avvenire sono: acetilazione di

lisine – metilazione di lisine e arginine – ubiquitinazione di lisine –

fosforilazione di serine e treonine.

I livelli delle modificazioni specifiche degli istoni sono mantenuti dalle att.

bilanciate degli enzimi di MODIFICAZIONE e DEMODIFICAZIONE (diapo 32

lez.10). L’attività di queste 2 tipologie di enzimi possono essere regolate da

cambiamenti della distribuzione intracellulare, indirizzamento cromatina o

azione di inibitori.

Queste modificazioni sono usate come punti di riconoscimento da parte di altre

proteine che legano la cromatina e danno inizio a processi come il

compattamento cromatina o regolazione trascrizione.

ISTONE ACETILTRASFERASI  quest’enzima dirige l’acetilazione degli istoni.

Quando un istone è acetilato, un GR.ACETILE (CH3CO) viene aggiunto al

GR.AMMINICO di uno o più residui di LISINA, rimuovendo così la carica

positiva (diapo 33 lez.10). L’aggiunta del GR.ACETILE carico negativamente

riduce la carica positiva totale degli istoni e porta ad una minore affinità delle

code degli istoni x il DNA carico negativamente.

L’effetto finale dell’acetilazione dei residui di lisina, si pensa possa servire a fornire

una superficie specifica di legame che può servire a reclutare REPRESSORI o

ATTIVATORI dell’att. dei geni  ATTIVAZIONE/REPRESSIONE TRASCRIZIONE.

ISTONE METILTRASFERASI  dirige la metilazione degli istoni. A differenza

dell’acetilazione che avviene soltanto su LISINE, la metilazione avviene sia su

residui LISINA che ARGININA. Ai residui di LISINA vengono aggiunti 1,2,3

GR.METILICI (CH3). I GR.METILICI ne aumentano la massa ma non ne alterano

la carica elettrica (diapo 34 lez.10). L’ARGININA può essere modificata x aggiunta

GR.METILICO. La specificità del sito metilazione di lisine e arginine può avere

effetti distinti sulla trascrizione: ATTIVAZIONE che REPRESSIONE es. diapo 34

lez.10. Queste modificazioni portano alla trasformazione della cromatina da

chiusa in aperta. La metilazione degli istoni è generalmente associata al

reclutamento di altre proteine, che possono quindi combinarsi x formare una

struttura alterata cromatina.

ENZIMI CHE CONIUGANO UBIQUITINA  aggiunta CATENE POLIUBIQUITINA ..>

indirizza proteina verso degradazione da parte del proteasoma. Aggiunta

MONOUBIQUITINA può alterare funzione proteina senza segnare la

distruzione. Un ENZIMA CONIUGAZIONE catalizza formazione legame

peptidico fra UBIQUITINA – GR.AMMINICO di una catena laterale di un residuo

di lisina in una proteina bersaglio.

CHINASI  determina una fosforilazione specifica su treonina o serina. L’aggiunta

gr.fosfato determina aggiunta carica negativa. La fosforilazione istone linker H1 o

rimuove H1 dal DNA o ne rende meno stretto il legame e in entrambi i casi è

associata ad attivazione del gene. La fosforilazione dell’istone H3 è associata

anche ad attivazione di geni specifici.

ADP-RIBOSILTRASFERASI  è il trasferimento enzimatico di un residuo di

+

ADP-ribosio da NAD ad un aa specifico della proteina ricevente da parte di

una ADP-ribosiltrasferasi. Gli istoni sono modificati a livello ac.glutammico.

SUMOILAZIONE  SUMO è un piccolo modificatore simile all’UBIQUITINA. È una

proteina di 97 aa che viene aggiunta tramite la sua estremità carbossilica al

gr.amminico di una LISINA della proteina bersaglio. Di solito i residui di lisina che

sono soggetti a sumoilazione si trovano all’interno di sequenze consenso. La

sumoilazione è associata a repressione trascrizionale. Svolge anche tante altre

funz. (es. importante nella regolazione trasporto proteine, segregazione cromosomi

durante mitosi, ecc). Sebbene SUMO possa operare in tutta la cellula, le sue att.

principali si concentrano nel nucleo.

Le varianti dell’ISTONE LINKER  i mammiferi contengono 8 sottotipi dell’istone

H1. L’espressione di ciascun sottotipo di istone H1 dipende dal tipo di tessuto –

fase ciclo cellulare – stadio di sviluppo. Es. quando la proteina omeodominio

Msx1 forma un complesso con l’istone linker H1b, il complesso si lega all’elemento

enhancer del gene MyoD e inibisce l’espressione genica di tale gene. Ciò

impedisce il differenziamento delle cell.progenitrici del muscolo perché MyoD

è un regolatre del differenziamento delle cell.muscolo scheletrico. La diminuita

produzione istone H1b e Msx1 durante lo sviluppo rilascia la repressione del

gene MyoD, permettendo il progredire del differenziamento delle cell.

m.scheletrico (diapo 40 lez.10).

Complessi di RIMODELLAMENTO della cromatina  complessi multi proteici che

 contengono attività di svolgimento del DNA dipendenti da ATP. Questi

complessi utilizzano l’energia derivante dall’idrolisi dell’ATP x cambiare contatti fra

ISTONI – DNA, permettendo così ai fatt.trascrizione di legarsi agli elementi

regolatori del DNA.

I complessi rimodellamento della cromatina possono mediare almeno 4

cambiamenti diversi della struttura cromatina:

Scivolamento dei nucleosomi  cambiamento posizione di un nucleosoma

o sul DNA.

Nucleosomi rimodellati  DNA diventa più accessibile ma gli istoni

o rimangono attaccati.

Spostamento dei nucleosomi  dissociazione completa DNA e ISTONI.

o Sostituzione dei nucleosomi  sostituzione di un ISTONE del nucleo con

o una VARIANTE ISTONICA.

Sono state caratterizzate parecchie famiglie diverse di COMPLESSI

RIMODELLAMENTO CROMATINA dipendenti da ATP, che hanno meccanismi di

rimodellamento diversi.

Famiglia dei complessi rimodellamento cromatina SWI/SNF (SWItch/SNiFf)  è

enorme complesso di Mda composto almeno da 11 polipeptidi diversi, presente nel

lievito gemmante (diapo 41 lez.10). L’omologo nelle cell.uomo si chiama BAF e

contiene 2 subunità ATPasiche, Brahma umano (hBRM) e Brahma-related gene

1 (BRG1).

RSC è un altro complesso di rimodellamento cromatina correlato a SWI/SNF.

Caratteristica distintiva di SWI/SNF è la presenza di bromo domini.

Meccanismo azione di SWI/SNF: provocano scivolamento e diassemblaggio

dei nucleosomi (diapo 41 lez.10)  con la loro att. ATPasica idrolizzano ATP e

l’energia viene usata x modificare il percorso del DNA intorno agli istoni. Circa

50bp di DNA sono svolte dai bordi del nucleo soma. Ciò porta all’esposizione del

DNA sulla superficie nucleosomale e allo scivolamento dei nucleosomi verso

nuove posizioni. Dopo che il rimodellamento ha alterato il percorso del DNA

intorno agli istoni, i fatt.trascrizione – macchinario generale trascrizione possono

accedere al DNA. Spesso si ha una cooperazione tra SWI/SNF e ISTONE

ACETILITRASFERASI (HAT) nel rimodellamento struttura cromatina.

La famiglia del complesso rimodellamento cromatina ISWI (Imitation Swi2) i

membri di tale famiglia riposizionano i nucleosomi facendo scivolare gli

ottameri di istoni lungo il DNA senza apparente perturbazione della loro

struttura. Questo processo porta i nucleosomi in posizioni diverse sul DNA senza

disassemblarli o produrre le forme alterate di nucleosomi tipiche dell’azione di

SWI/SNF (diapo 43 lez.10).

La famiglia del complesso rimodellamento cromatina SWR1  SWR1 può

essere indirizzato alle regioni genomiche appropriate dalla sub unità Bdf1 (bromo

domain factor 1), che contiene 2 bromodomini. Tale complesso determina

sostituzione degli istono con una variante istonica nell’ottamero del nucleo

(diapo 44 lez.10).

L’ASSEMBLAGGIO DEL COMPLESSO DI TRASCRIZIONE: il MODELLO

DELL’ENHANCEOSOMA – MODELLO “COLPISCI E FUGGI”

L’ordine del reclutamento di varie proteine che regolano la trascrizione dipende

dalla STRUTTURA CROMATINA del PROMOTORE DEL GENE – FASE del CICLO

CELL. – MOLTI ALTRI FATTORI:

1° ES.  SWI/SNF è reclutato da una proteina stivatrice legata ad una ergione

o regolatrice a monte del gene lievito HO. Dopo che SWI/SNF ha rimodellato il

promotore del gene HO, viene reclutato un COMPLESSO ISTONE ACETIL-

TRASFERASICO (HAT). L’azione cooperativa di HAT con SWI/SNF facilita il

legame di un fattore trascrizione gene-specifico, seguito dai fattori generali di

trascrizione e dalla RNA pol II.

2° ES.  intero complesso di preinizio si assembla sul promotore del gene

o alfa1-antitripsina prima del reclutamento dei complessi di rimodellamento

della cromatina o delle HAT.

3° ES.  PROMOTORE GENE dell’INTERFERONE UMANO BETA (IFN-BETA). Un

o complesso attivatore del DNA (enhanceosoma) si lega ad una regione libera

da nucleosomi e a monte del promotore del gene di IFN-BETA. Ciò porta al

rapido reclutamento di HAT e all’acetilazione dei nucleosomi a livello della

TATA box nel promotore del gene. Successivamente SWI/SNF fa scivolare una

serie di nucleosomi via dalla TATA box, permettendo l’accesso del

macchinario generale trascrizione.

I singoli fattori di trascrizione in genere si legano ad elementi regolatori del DNA come

PROMOTORI ed ENHANCER con specificità relativamente bassa.

Sono stati proposti 2 modelli x spiegare il legame dei FATT.TRASCRIZIONE e x

ASSEMBLAGGIO DEI COMPLESSI DI TRASCRIZIONE:

MODELLO ENHANCEOSOMA  le interazioni fra i FATT.TRASCRIZIONE

 promuovono l’assemblaggio cooperativo sul DNA dell’ENHANCEOSOMA, dandogli

un’eccezionale stabilità.

L’enhancer inducibile consiste in siti multipli di legame x fattori di trascrizione

NF-kB – fattore att. della trascrizione 2 (ATF2) – c-Jun. Tutti insieme i siti,

facilitano il processo di attivazione.

MODELLO COLPISCI E FUGGI  l’attivazione della trascrizione riflette la

 probabilità che tutti i componenti richiesti x l’attivazione incontrino un

particolare sito sulla cromatina (il “colpo”) e che il loro legame sia transitorio

(la “fuga”). Persino interazioni transitorie di questo tipo sembrano siano capaci di

promuovere rimodellamenti della cromatina che durano alcune ore.

Questi 2 modelli sembrano NON escludersi a vicenda  fusione dei 2 modelli.

IL MECCANISMO DELLA TRASCRIZIONE da parte della RNA POLIMERASI II

Dopo l’ASSEMBLAGGIO COMPLESSO DI PREINIZIO, segue un PERIODO ABORTIVO

prima che la polimerasi esca dalla regione del promotore (CLEARANCE DEL

PROMOTORE) ed entri nella FASE DI ALLUNGAMENTO. Il processo di base della sintesi

dell’RNA si suddivide in più stadi: selezione di un nucleoside trifosfato (NTP)

complementare allo stampo di DNA – catalisi della formazione del legame

fosfodiestere – traslocazione dell’RNA e DNA.

L’ALLUNGAMENTO: la POLIMERIZZAZIONE dell’RNA  la sintesi dei precursori

dell’mRNA da parte della RNA pol II consiste di 4 fasi principali: INIZIO – CLEARANCE

PROMOTORE – ALLUNGAMENTO – TERMINE. La transizione da INIZIO ad

ALLUNGAMENTO è segnata da un cambiamento dei fattori associati alla RNA pol II.

L’allungamento della trascrizione è il processo x cui la RNA pol II si sposta lungo la

regione codificante del gene dopo aver iniziato la sintesi dell’mRNA a partire dal

promotore. Il DNA in ingresso viene svolto davanti al sito attivo della polimerasi e viene

riavvolto dietro di esso x formare il duplex in uscita. Nella regione svolta, il filamento

stampo di DNA forma un duplex ibrido con l’mRNA in crescita.

Correzione delle bozze  Nella DNA polimerasi in crescita, il DNA in crescita si sposta

fra siti attivi molto lontani x la sintesi del DNA e x il taglio durante la correzione delle

bozze. Nella RNA pol II, l’RNA in crescita resta nel singolo sito attivo che passa da

SINTESI RNA a TAGLIO. Sia la POLIMERIZZAZIONE dell’RNA che TAGLIO, richiedono

2+

uno ione metallico (es. Mg ), ma il coordinamento di un altro ione metallico fa passare

att. della RNA pol II da POLIMERIZZAZIONE ..> TAGLIO. Il sito attivo modulabile

della polimerasi permette una correzione efficiente delle bozze dell’mRNA perché il

taglio dell’RNA crea una nuova estremità 3’ dell’RNA a livello del metallo, da cui può

continuare la polimerizzazione.

Possono avvenire 2 tipi di reazioni di correzione bozze:

Rimozione di un nucleotide incorporato in modo sbagliato direttamente dopo

 la sua aggiunta.

Taglio di un dinucleotide dopo incorporazione sbagliata e arretramento di un

 nucleotide.

Allungamento della trascrizione attraverso la barriera dei nucleosomi  Sebbene la

cromatina sia rimodellata in seguito all’inizio della trascrizione, il DNA della regione

codificante dei geni trascritti resta compattato nei nucleosomi. Man mano che la RNA pol II

si sposta lungo la regione codificante del gene, l’enzima incontra un nucleosoma che

viene superato mediante 2 possibili meccanismi distinti:

Mobilizzazione dei nucleosomi  i nucleosomi sono traslocati senza che

 l’ottamero del nucleo sia rilasciato in soluzione. Il DNA è spostato dai

nucleosomi e questi sono trasferiti in una regione di DNA già trascritta dalla

RNA pol II (diapo 53 lez.10). Questo processo può essere facilitato dal fattore di

allungamento FACT.

La rimozione del dimero H2A-H2B  i nucleosomi sono distrutti sui geni attivi

 trascritti dalla RNA pol II x la rimozione dei dimeri H2A – H2B (diapo 54 lez.10).

Questo modo di superare la barriera dei nucleosomi richiede un certo numero di

fattori di allungamento ausiliari: FACT – ALLUNGATORE – TFIIS. Il fatto che in

vitro molte molecole di RNA pol II siano bloccate dai nucleosomi, indica come nel

superamento della barriera dei nucleosomi si richieda l’azione coordinata di

ulteriori fattori non identificati.

I PROCESSI DI MODIFICAZIONE dell’RNA e la

REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE dei GENI

MODIFICAZIONI CO-TRASCRIZIONALI del PRE-mRNA NUCLEARE

Il pre-mRNA eucariotico è modificato covalentemente in 3 modi prima di essere

esportato dal nucleo. Questi 3 eventi di modificazione sono collegati intimamente con la

trascrizione e richiedono il dominio carbossiterminale (CTD) della RNA polimerasi II. Il

CTD funziona da piattaforma di atterraggio x i FATTORI DI MODIFICAZIONE dell’RNA,

in modo da posizionare questi fattori vicino al loro RNA substrato. Il legame di questi

FATT.MODIFICAZIONE è regolato dalla fosforilazione di aa specifici del CTD ..>

SERINE in posizione 2 e 5. Durante l’inizio della trascrizione il CTD viene fosforilato sulla

serina 5’ di ciascuna ripetizione, scatenando un cambiamento conformazionale del

CTD che permette il legame dell’enzima che aggiunge il cappuccio 5’ nel primo

evento di modificazione dell’RNA.

Le 3 modalità con cui il pre-mRNA viene modificato sono:

Ai trascritti viene aggiunto un CAPPUCCIO all’estremità 5’ con un nucleotide

 guanosinico metilato

Gli introni sono rimossi dallo splicing

 Le estremità 3’ sono tagliate ed estese con una coda di poli (A)

La sequenza lineare dei nucleotidi di un tratto di DNA non corrisponde direttamente

alla sequenza lineare dell’mRNA (e della proteina).

INTRONI  Si definiscono INTRONI le regioni non codificanti di un gene che, insieme

agli esoni, vengono trascritte dalle RNA polimerasi. La trascrizione di una sequenza di

DNA porta quindi alla formazione di un trascritto primario (pre-mRNA) che deve essere

sottoposto a splicing, il processo che porta alla rimozione degli introni e alla

formazione degli mRNA maturi. Tali sequenze restano fisicamente sperate dopo

l’escissione (diapo 3 lez.11). Gli introni possono contenere importanti elementi di

regolazione della trascrizione (enhancer, silenziatori); di solito non sono però

funzionali e vengono degradati, ma alcuni di essi codificano x RNA funzionali (snoRNA

o miRNA).

ESONI  Spesso, erroneamente, viene affermato che gli esoni costituiscono la parte

codificante del genoma; questo è vero solo in parte: se è infatti vero che tutta la

sequenza che codifica una proteina deve risiedere su uno o più esoni, non è invece

sempre vero che un esone sia codificante: esoni non codificanti sono stati individuati in

molti geni umani.

Gli esoni possono includere sia sequenze che codificano per amminoacidi sia

sequenze non tradotte. Gli esoni e in alcuni casi anche gli introni o parti di essi

vengono uniti insieme per formare un mRNA finale funzionale; difatti bisogna

specificare che l'mRNA maturo non è sempre costituito esclusivamente da tratti

esonici, ma può presentare talvolta porzioni introniche.

SPLICING RNA  è il processo in cui INTRONI sono rimossi da un trascritto primario di

RNA in punti definiti precisamente e le estremità dell’RNA rimanente sono riunite x

formare un mRNA continuo (rRNA, tRNA).

Lo splicing, quindi l’escissione introni e unione esoni, è diretta da sequenze speciali a

livello delle giunzioni introne-esone chiamate SITI DI SPLICING (diapo 3 lez.11): sito di

splicing 5’ segna la giunzione esone-introne all’estremità 5’ dell’INTRONE –

all’estremità 3’ dell’INTRONE si ha il sito di splicing 3’ che segna la giunzione con

l’esone successivo.

In base al meccanismo di splicing si riconoscono 5 classi principali di INTRONI:

INTRONI AUTOCATALITICI di gruppo I

 INTRONI AUTOCATALITICI di gruppo II

 INTRONI dei tRNA nucleari

 INTRONI degli ARCHEI

 INTRONI SPLICEOSOMALI del pre-mRNA nucleare

INTRONI AUTOCATALITICI di gruppo I e gruppo II

Sono grandi RNA catalitici distinti tra loro x struttura – meccanismo di splicing.

Introni di gruppo I effettuano l’AUTOSPLICING in una via in 2 passaggi ben

caratterizzata e distinta che si basa su una GUANOSINA ESTERNA (G) come

cofattore  il 90% di tutti gli introni si trovano nei funghi, vegetali, alghe rosse e verdi.

Questi introni sono diffusi nei genomi dei mitocondri, cloroplasti e nei genomi nucleari di

diversi eucarioti.

Gli INTRONI NUCLEARI di gruppo I sono limitati all’rRNA, mentre negli organelli si

trovano nell’rRNA, tRNA e mRNA.

Gli introni di gruppo I effettuano AUTOSPLICING servendosi della GUANOSINA (G).

Soltanto 7 nt sono conservati negli INTRONI DI GRUPPO I.

L’RNA si ripiega in uno schema tridimensionale complessi di eliche impilate fianco a

fianco, che porta i 2 esoni in stretta vicinanza. Il successo della catalisi dipende dal

ripiegamento corretto dell’introne che è mediato da cofattori proteici che lo aiutano a

ripiegarsi.

Processo di autosplicing (diapo 7 lez.11):

L’autosplicing è iniziato dal 3’-OH libero del GTP che si lega in una tasca del

 nucleo catalitico dell’INTRONE ..> SITO DI LEGAME di G. La struttura terziaria

pone il 3’-OH in una posizione favorevole x attaccare il gruppo fosfato del sito di

splicing 5’ (di solito U).

1° transesterificazione  l’attacco di 3’-OH del GTP dà inizio a tale reazione. Il

 GTP aggiungendosi all’estremità 5’ dell’introne, porta al rilascio l’ESONE a monte

(diapo 7 lez.11). La G appena aggiunta lascia il sito di legame G all’estremità 5’

dell’introne e al suo posto va a legarsi sempre un nucleotide G.

2° transesterificazione  è iniziato da un attacco dell’estremità 3’ dell’esone

 rilasciato sul sito di splicing 3’.

Lo splicing dà origine a 2 prodotti: RNA maturo con i 2 ESONI legati insieme e

l’INTRONE escisso che viene degradato.

L’autosplicing negli INTRONI di GRUPPO II  introni gr.II sono meno comuni di quelli

gr.I. Si trovano nei genomi dei mt, clorpolasti di alcuni protisti, funghi, alghe, piante e nei

genomi batterici.

L’autosplicing segue una via diversa da quella degli introni di gr.I, ma simile al

meccanismo di splicing del pre-mRNA utilizzato dallo spliceosoma. La giunzione di

splicing 5’ e 3’ degli introni gr.II sono conservate. RNA si ripiega in una struttura che

2+

forma un sito attivo che contiene ioni Mg essenziali x la catalisi. La struttura

conservata assomiglia ad un “fiore” con 6 domini a doppia elica che si irradiano da una

ruota centrale (diapo 11 lez.11). Lo splicing avviene x 2 reaz. in sequenza di trans

esterificazione (diapo 11 lez.11):

1° trans esterificazione  il 2’-OH di una ADENOSINA (A) sporgente che fa parte

 dell’introne va a legarsi al sito di splicing 5’, determinando il taglio dell’esone 5’

(esone 1) e la formazione di una struttura a cappio data dal legame

dell’estremità 5’ dell’INTRONE con il 2’-OH dell’A che si trova vicino

all’estremità 3’ dell’INTRONE.

2° trans esterificazione  il sito di splicing 3’ dell’esone 5’ tagliato va a legarsi

 all’altro esone (esone 2), rilasciando l’introne a cappio. Successivamente il

cappio sarà degradato.

In vivo x uno splicing efficiente, molti introni di gr.II, come quelli di gr.I, richiedono proteine

che ripieghino l’RNA nella struttura cataliticamente attiva.

INTRONI MOBILI di gruppo I e II  gli introni gr.I e II, oltre ad essere capaci di

autosplicing, hanno la capacità insolita di spostarsi all’interno del genoma,

distinguendosi così da altre classi di introni.

Alcuni possono spostarsi efficientemente in una posizione omologa in un allele che è

privo dell’introne ..> processo di homing. Poiché portano con sé il proprio apparato di

splicing, questi elementi possono potenzialmente diffondere dal genoma di un organello a

quello nucleare o viceversa, o persino passare in un organismo diverso. La loro inserzione

in un nuovo locus avrebbe effetti minimi sull’espressione genica, purchè siano ancora

sottoposti a splicing in modo efficiente:

Processo di HOMING in INTRONI di GR. I  lo spostamento di questi introni è

o mediato da un’endonucleasi sito-specifica x il DNA che va a riconoscere la

sequenza di giunzione fra ESONE 1 – ESONE 2 nell’allele ricevente privo di

introne, e produce una rottura a doppio filamento a livello del sito di

inserzione dell’introne o vicino ad esso. Dopo il taglio del DNA, l’introne è

copiato dall’ALLELE DONATORE a quello RICEVENTE in seguito a

meccanismo di riparazione delle rotture a doppio filamento che coinvolge

diversi enzimi cellulari. L’ENDONUCLEASI sono di solito codificate dall’introne

capace di autosplicing.

Processo di RETROHOMING in INTRONI di GR. II  gli introni gr.II codificano una

o DNA endonucleasi e una trascrittasi inversa. Il retrohoming è iniziato da un

complesso che contiene proteine codificate dall’introne e il cappio di RNA

dell’introne escisso (diapo 14 lez.11). L’ENDONUCELASI taglia DNA allele

ricevente, in questo modo consente l’inserzione dell’RNA dell’introne fra E1 e

E2 di un allele senza introni. Dopo la rottura a doppio filamento, l’estremità 3’ del

filamento antisenso tagliato è usata come primer x la trascrizione inversa

dell’RNA intronico inserito. Il processo di integrazione è completato dalla sintesi

del secondo filamento e da mecc. di riparazione che coinvolgono enzimi cell.

INTRONI DEGLI ARCHEI

Gli introni degli archei sono sottoposti a splicing da parte di un meccanismo specifico

degli archei.

Il mecc. di somiglianza dello splicing a cui sono sottoposti gli archei, ha qualche

somiglianza con quello dei tRNA eucaristici, ma è completamente diversa da quella degli

INTRONI SPLICEOSOMALI.

Tutti gli introni degli archei sono rimossi enzimaticamente da un meccanismo che richiede:

ATP – ENDORIBONUCLEASI – LIGASI. I trascritti degli introni genera un motivo

sporgenza-elica-sporgenza in corrispondenza della giunzione esone-introne. Questo

motivo viene riconosciuto dall’ENDORIBONUCLEASI-LIGASI che tagli in corrispondenza

proprio dell’esone-introne (diapo 15 lez.11). Successivamente gli ESONI sono legati da un

meccanismo sconosciuto e talvolta dopo la legatura gli introni escissi si circola rizzano.

INTRONI DEL tRNA NUCLEARE

Introni dei tRNA eucaristici  La presenza o l’assenza di un introne definisce 2 classi

di geni nucleari dei tRNA eucaristici i cui trascritti hanno necessità diverse x lo

splicing. Tutti i genomi nucleari eucariotici noti contengono almeno alcuni geni dei tRNA

nei quali sono presenti introni. Questi introni sono piccoli (10-60 nt).

Meccanismo generale di splicing tRNA:

I pre-tRNA che contengono introni sono tagliati da un’ENDORIBONUCLEASI di

o splicing del tRNA ai confini 5’ e 3’ della sequenza intercalata, producendo metà

appaiate del tRNA con estremità con fosfato (P).

Le metà appaiate sono unite da una tRNA ligasi in una reaz. dipendente da

o GTP e ATP.

INTRONI SPLICEOSOMALI del PRE-mRNA NUCLEARE

Gli INTRONI SPLICESOMALI sono le sequenze intercalate più comuni presenti nei

trascritti dei pre-mRNA nucleari di tutti gli eucarioti multicellulari. Il meccanismo

fondamentale dell’escissione degli introni è identico a quello degli introni capaci di

autosplicing di gruppo II, ma gli introni dei pre-mRNA non si ripiegano in struttura

secondarie o terziarie. La struttura tridimensionale necessaria x lo splicing è generata in

un enorme complesso RNA-proteine chiamato SPLICEOSOMA (diapo 17 lez.11).

Componenti dello SPLICEOSOMA  apparato di splicing contiene 5 RNA diversi e più

di 200 proteine addizionali (spliceosoma macchina molecolare più grande e complessa

oggi nota). La funz. esatta di tutte le proteine e le loro interazioni restano ancora da

definire.

La composizione dello spliceosoma cambia man a mano che procede lo splicing,

alcuni componenti sono rimossi e altri sono aggiunti quando la particella si

assembla e nel corso della catalisi delle reazioni.

I componenti principali dello SPLICEOSOMA sono: 5 complessi formati da piccoli RNA e

proteine snRNP (snurp). Sono stati purificati e identificati 6 piccoli RNA principali (da

U1 a U6) sono composte da snRNA ricchi di URIDINA (U).

snRNA U1, U2, U3, U4, U5 ..> sono associate ad una serie di 7 proteine comuni

o del nucleo (Sm) e a parecchie proteine specifiche delle varie particelle.

snRNA U6 ..> è associato a proteine del nucleo simili alle Sm e a parecchie

o proteine specifiche della particella.

Le proteine Sm formano un complesso a forma di ciambella che si lega ad un

elemento ricco di U dell’snRNA (diapo 17 lez.11).

Le snRNP si assemblano in un processo in più passaggi orchestrato in modo complesso

che avviene in diversi compartimenti subcellulari. Il processo è mediato dalla proteina

SMN (proteina di sopravvivenza dei n.motori) ed è difettoso nell’atrofia muscolare

spinale.

Assemblaggio MACCHINARIO DI SPLICING  il macchinario di splicing è reclutato sui

trascritti che contengono introni durante la trascrizione e il complesso che lega il

cappuccio è importante x questo reclutamento. L’assemblaggio dello SPLICEOSOMA

avviene in più passaggi ..> ciclo di splicing (diapo 20 lez.11):

formazione del complesso E (complesso di impegno)  la snRNP U1 si lega al

 sito di splicing 5’ (5’SS) – il fattore ausiliario della snRNP U2 (U2AF) si lega al

sito di splicing 3’ nel seguente modo: la sub unità più grande si lega al tratto di

polipirimidina (Py) – la sub unità più piccola all’AG.

formazione del complesso A (pre-spliceosoma)  la snRNP U2 interviene

 andandosi a legare al punto di ramificazione, formando così il pre-spliceosoma.

formazione complesso B  il complesso A è raggiunto dalla tri-snRNP U4-U5-U6

 x formare il complesso B.

formazione complesso C (spliceosoma attivo)  lo spliceosoma attivo si origina

 in seguito a diversi riarrangiamenti del complesso B dato da interazioni RNA-

RNA e RNA-proteine: snRNP U6 va a legarsi con snRNP U2 e con l’estremità 5’

dell’introne, sostituendo così la snRNP U1 che invece si distacca, come anche

la snRNP U4 (diapo 20 lez.11). Il complesso C così formato andrà a catalizzare le

2 reazioni di trans esterificazione dello splicing (diapo 20 lez.11):

1. Il 2’-OH dell’adenosina sporgente dal punto di ramificazione attacca il

fosfato al sito di splicing 5’. Ciò porta al taglio dell’ESONE 5’

dall’INTRONE e alla legatura dell’estremità 5’ dell’INTRONE al 2’-OH del

punto di ramificazione, costituendo un legame 2’-5’ fosfodiestere come

gli introni di gr.II.

2. Il 3’-OH dell’ESONE DISTACCATO attacca il fosfato all’estremità 3’

dell’introne. Ciò porta alla legatura dei 2 ESONI e al rilascio

dell’INTRONE sottoforma di cappio.


ACQUISTATO

13 volte

PAGINE

70

PESO

515.41 KB

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in scienze motorie per la prevenzione e la salute
SSD:
Università: Carlo Bo - Uniurb
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher AndriMariot di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare dell'esercizio fisico e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Carlo Bo - Uniurb o del prof Guescini Michele.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Corso di laurea magistrale in scienze motorie per la prevenzione e la salute

Riassunto esame Neurofisiologia, prof. Cuppini
Appunto
Anatomia 2
Appunto
Meccanismi Molecolari degli Stati Patologici - Appunti
Appunto
Appunti - Fisiologia clinica dell'esercizio
Appunto