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Biologia Molecolare dei Procarioti

Appunti Presi al computer, schemi presenti e spiegazione esaustive degli esperimenti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Roncarati dell’università degli Studi di Bologna - Unibo, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Biologia Molecolare dei Procarioti docente Prof. D. Roncarati

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ESTRATTO DOCUMENTO

• abbiamo due attivatori che legano il promotore e poi c'è un repressore. In questo caso l'attivatore 1 è il

vero attivatore mentre l'attivatore 2 ha il ruolo di contrastare il repressore che avrebbe il ruolo di

repressore sulla RNA polimerasi. Solo se ci sono entrambi si ha attivazione trascrizionale.

Regolazione dipendente da sigma54

I fattori sigma alternativi sono raggruppati nella :

• famiglia 70: capostipite è il fattore sigma vegetativo 70, a questo appartengono anche quelli heat shock,

fase stazionaria ecc. Perchè strutturalmente sono tutti simili e hanno dei sottodomini conservata. Hanno

una struttura molto simili a sigma 70 e più o meno sono le stesse interazioni con la RNA polimerasi e

anche gli elementi di sequenza sono più o meno simili come localizzati ( intorno alla -10 e -35 ).

• Famiglia 54: e a questo gruppo appartiene solo il fattore sigma alternativo sigma 54. Abbiamo dei domini

DNA di binding completamente carbossi terminali e poi un sito di interazione alla RNA polimerasi nella

porzione centrale.

Si ritrova in molti specie batterico e ha delle funzioni disparate, non hanno tutti la stessa funzione. Possono

trascrivere categorie di geni con funzioni diverse. La regolazione ha caratteristiche molto particolari.

Riconosce elementi del promotore completamente diversi dalla -10 e -35 box ( al contrario della famiglia 70

). Riconosce posizioni -12 e -24 ( GC ) rispetto al punto di inizio della trascrizione. Quindi strutturalmente

sono proteine diverse. Il funzionamento è molto classico. Il fattore sigma 54 si complessa alla RNA

polimerasi core e guida quest ultima verso promotori specifici. Si è poi visto che l'inizio di trascrizione

avviene diversamente, cioè l'RNA polimerasi compensata al fattore sigma 54 può legare il DNA e portare

l'enzima su questi promotori qua e si forma un complesso chiuso. Ma il tutto rimane bloccato li, non c'è una

progressione di inizio verso quello aperto. Il fattore sigma 54 impone dei vincoli per cui il complesso chiuso

non può isomerizzazione spontaneamente a complesso aperto ( contro quello visto nella famiglia 70 ). Per

sbloccare questa situazione di blocco serve un attivatore trascrizionale specifico che sblocchi questa

situazione e promuova la transizione da complesso chiuso a aperto e si chiamano attivatori di sigma 54.

La formazione del complesso chiuso tra un promotore e una RNA polimerasi legame sigma 54. Cosa

succede nel caso di blocco? Interviene un attivatore trascrizionale , c'è un bending che mette a contatto

attivatore con il complesso di inizio della trascrizione. Il binding site di questi attivatori si trovano

estremamente a monte dal punto di inizio della trascrizione. Attivatore si lega a -80 e -150, la proteina IHF

facilita il bending e quindi attivatore e RNA polimerasi si torva vicino e la idrolisi di ATP ( promossa

dall'attivatore )fa passare da complesso chiuso e aperto

Il binding site di questi attivatori ( detti anche bEBP, enhancer like Procarioti )si trovano enormente a monte

rispeto al sito +1 ossia -80/-150.

Il bending è promosso da proteine ( ad esempio IHF ) che facilitano il ripiegamento del DNA.

L'attivatore ha anche attività ATPasica ( cosa non presente neglia ttivatori visti fin ora ), l'idrolisi di AtP

permette di formire energia per modificare le interazioni e passare da complesso chiuso a complesso aperto.

L'attivatore spesso agiscono come oligomeri, spesso come esameri.

Domini degli attivatori di sigma 54:

• C terminale - domini di legame al DNA: perchè legano a monte il DNA e poi con il bending sono portati

vicino alla RNA polimerasi. Sono stati trovati S attivatori di sigma 54 che agiscano in soluzione e

nonleganoil DNA. Ad esempio FlgR , che è DNA-binding Independet. E si vede essere privo di dominio

di binding al DNA.

• Centrale.-Core domain : è il dominio ATPasico

• N terminale- domini per percepire il segnale : è l'attivatore trascrzionale che percepisce il segnale

ambientale, si attiva e si lega al DNA. Non è la disponibilità di sigma 54 come negli altri fattori sigma. Il

sensing è a carico dell'attivatore di sigma 54, solo quando l'attivatore è innescato si ha il meccanismo

visto. Tra i vari c'è il dominio:

◦ RR: regolatore di risposta, istidine chinasi che si autofosfortilano e fosforilano il regolatore di

rispsota ( già presente ora sull'attivaotre di sigma 54 ) e quindi si attiva l'attivatore su sigma 54.

• Sono stati trovati S attivatori di sigma 54 che agiscano in soluzione e non legano il DNA. Ad esempio

FlgR , che è DNA-binding Independet. E si vede essere privo di dominio di binding al DNA. Identificato

in Elico Bacteria Pilori, risiede nella nicchia gastrica, è molto diffuso ( più del 50% della popolazione

mondiale ), può rimanere silente per tutta la vita, però in alcuni casi si ha una certa sintomatologia

( ulcera, tumore allo stomaco. Agente biologico , cancerogeno di classe I ). E. Pilori ha un fattore sigma

vegetativo , e due fattori sigma alternativi necessario alla formazione dei flagelli.Nella ricerca di un

attivatore di sigma 54 è stata trovata una istidina chinasi flgS che è il sensore di membrana ed è in grado

di attivare il regolatore di risposta che è flgR. Con western bot si vede che questo sistema a due

componenti costituisce il vero sistema di attivazione di sigma 54.

• Si vedono delle componenti del flagello: FlGE e FlaB ( che sono sigma 54 dipendenti ) mentre FlaA

dipende da sigma 28 ( della famiglia sigma 70 ). Si vede che se in una lane per un ceppo mutante flgR

vedo solo FlaA così come se muto per flgS. Confermo che sia FlgE che FlaB dipendono da sigma 54.

• Allineamenti di sequenza mettono in evidenza che FlgR manca del dominio di binding al DNA,

sembrerebbe che questo attivatore di sigma 54 manchi di un dominio di legame al DNA: Dimostrazione

fondamentale che questo può funzionare senza DNA dipende da un saggio tramite gene reporter. Un

reporter che con un dato reporter cambia colore ( saggio cromogenico ). Uso un costrutto che ha il gene

reporter xyIE, provi il promotore flab2 da + 25 a -393. Se l'attivatore di sigma 54 funzionasse in modo

classico, questo dovrebbe legare una porzione di DNA a monte.

• fanno un altro costrutto che va da +26 a -67(promotore di FlaB)+gene reporter,cioè fondono solo il co-

promoter di flab, quindi più corte, quindi se ci fosse in questo promotore un sito di binding per sigla 54,

questo verrrebbe escluso ( , perchè abbiamo detto che gli attivatori si legano intorno alla posizione -150.).

• Si vede che l'attività del reporter non cambia e quindi flaB2 , componente del flagello, è trascritta

tranquillamente da RNA polimerasi sigm54 dipendete e quindi la flgR non lega il DNA. Quindi dipende

da flgR e flgS ( perchè poi usano mutanti dei due e non ottengono la trascrizone ) ma non lega il DNA.

Questo lo conferma il fatto che non ci sia il sito di binding C terminale e poi la sequenza up-stream non è

necessari.

Quindi esistono II sottoclassi di sigma54, quelle che legano il DNA e quelle che non lo fanno(questa classe

è molto più rara).

Quindi esistono dei dei sotto casi di sigma 54 che agiscono in soluzione. C'è sempre l'idrolisi di ATP, ma

non legano il DNA nè causano il bending. .

In che modo però è gestita la specificità?

In elicobacter pilory, c' solo una categoria di geni , che devono essere accesi tuti, non si deve fare un

distinguo tra subset di promotori sigma 54 dipendneti.

In altri casi si pensa esistano dei paraloghi di sigma 54 che sono attivati da diversi attivatori trascrzionale

che attivano in soluzione il complesso da chiuso a aperto.

Phase Variation

E' un fenomeno attraverso il quale una popolazione batterica si diversifica ( al suo interno ) fenotipicamente

per ottenere dei vantaggi selettivi. Al suo interno, non è che una popolazione batterica tutt'insieme si

differenzia e fa qualcosa altro ( come in una regolazione trascrizionale ), cellule identiche dello stesso genotipo

si diversificano tra di loro per l'espressione di qualcosa. QUindi da una popolazione clonare, identica dal punto

di vista del genotipo, abbiamo individui individui che esprimono qualcosa. E quindi ci sono dei meccanismi

capaci che batteri identici possano al suo interno diversificarsi.

La phase Variation è l'alterarnarsi di due o tre fenotipi che sono reversibili e ereditabili. La variazione

fenotipica: la diversa espressione di determinati fenotipi ( esempio esprimere o meno una proteina di

membrana ), si verifica in singole cellule di una popolazione clonare. Se io ho una popolazione identica, con

questo meccanismo posso avere all'interno della stessa popolazione individui che esprimono qualcosa e

individui che non lo fanno e posso in questo modo diversificare la popolazione e quindi la popolazione può

ottenere vantaggi selettivi. Bisogna stare attenti e distinguerlo dalla Gene Expression Noise e dalla regolazione

genica di cui abbiamo già parlato. QUesto perchè questi meccanismi non si fissano nel genoma, non sono

ereditabili.

Genetic Noise

E' il fatto che vari processi cellulari e in primis la trascrzione sono eventi che hanno una base fortemente

stocastica, è dovuta alla diffusione della RNA pol, all'attacco della RNA pol,m ai fattori di trascrzione. La base

stocastica è dovuto che se un promotore è trascritto o non è trascritto, in tutte le cellule per un certo periodo di

tempo abbiamo il promotore spento ovunque o acceso ovunque, poi cambiano le condizioni e cambia la sua

spressione. Se si fa l'analisi del promotore su un numero elevato di cellule, allora vedremo il pattern di

espressione di quel promotore nel tempo e nelle condizioni. Se vado a vedere le singole cellile, la trascrzione

basale di quel promotore varia nelle cellule, in alcune si accede in altre si spegne. Questo è dovuto dalla natura

stocastico del promotore. Prova di questo fenomeno è dovuto a un esperimento in cui si hanno cellule tutte

identiche dal punto di vista fenotipico, in cui è stato messo dentro un plasmide che contiene un promotore che

guida l'epsriessine delle GFP e lo stesso promotore che guida l'eprresione dell' RFP. Quello che mi aspetterei è

che entrambi i promotori siano espressi allo stesso modo, dovrei vedere nella stessa cellula entrambi i colori.

Ma vedo alcune cellule rosse, alcune verde e alcune gialle. A conferma che ci sia un meccanimso stocastico

che regola la trascrzione. Ed è per quello che si iniziano a fare analisi su singola cellula.

Questo però non permette alla popolazione batterica di adattarsi meglio a una con dizione esterna, è un

qualcosa di completamente casuale, perchè non è un fenomeno che si trasmette questa diversificazione alla

progenie. E' qualcosa che avviene a livello della singola cellula in modo stocastico.

Quali proteine, e quindi quali fenotipi, vengono regolati dalla Phase Variation se parliamo di microrganismi.

Tutto ciò che è collegato all'interazione con l'ospite e tutto ciò che concerne alla risposta immunitaria

dell'ospite. Se io ho meccanismi che mi fanno differenziare all'interno della popolazione clonare, fenotipi che

poi vanno a intervenire nella interazione che ho con l'ospite, potrei avere un vantaggio positivo. E' un modo per

cui una popolazione evbatterica isogenica, può ripropagarsi. Sono tuti strutture cellulari, elementi, esposti in

superficie e che sono coinvolti nell'interazione con l'ospite, per esempio la capsula, fibre, pili e flagelli.

Per esempio in Salmonella, attraverso questo meccanico , viene regolata l'esprtrssione di verti flagelli. Si è

visto che in seguito a infezione, ciò che determina la risposta immunitaria adattativo adrll'ospite, è proprio

verso queste strutture flagellarsi erspsote da salmonella. Se ho una popolazione in grado di diversificarsi,

ottengo una scappatoia per quelle cellule che si sono differenziati. Quindi sono tutti meccanismi che co sentono

a singoli individui di una popolazione di farla franca e dare la possibilità di propagarsi. Quali sono i

meccanismi molecolari che consentono la phase variation? Non possono essere mutazioni random perchè

avvengono abbastanza raramente, devono essere meccanismi che avvengono con una frequenza molto

maggiore rispetto a una semplice mutazione random. Questi sono meccanismi che avvengono con frequenza

maggiore.

Abbiamo meccanismi genetici:

• miss-pairing : appaiamento errato per scivolamento dei filamenti

• Ricombinazione omologa

• Ricombinazione sito specifica

Il primo meccansimo: è un meccansimo di phase variation.

Uno in elicobacter assicura una diversa espressione della proteina adesina che serve per l'interazione con

l'ospite e si basa sulla ripetizione di basi.

Praticamente è un fenomeno che avviene quando si hanno tratti omopolimerici nel DNA, se ci sono tratti

ripetuti di mono,bi, o trinucleotidi. Può avvenire che durante gli eventi di repliazione si abbia un appaiamento

errato tra filamento parentale e quello di nuova sinetise. Se questi appaiamenti errati avvengono, nella seconda

generazione avrò o un espansione del tratto ripetuto o una contrazione del tratto ripetuto. Se parto da una

condizione ho 3 A ripetute, se ho la replicazione correttta maneterrò sia in prima che in seconda generazione 3

A e 3T, se è invece è errato, in seconda generazione un filamento manterrà la sequenza normale, mentre l'alto

avrà un'espansione.

L'opposto sarebbe una

contrazione.

Se questa base in più/

meno casca ( disegno da

slides, lo chiede

all'esame ), abbiamo la

sequenza codificante di

un certo gene, il codone

ATG e poi il gene Disegno Per Esame

continua. Abbiamo la

sequenza di shidar-gandon, vicino il codone di inizio della traduzione.

Se l'espansione/contrazione cade nelle posizioni indicati si possono avere problemi di espressione. Che succede

se o untratto ripetuto e poi la mutazione casca tra -10 e -35? Posso ad esempio alterare il consensus e quindi la

trascrzione può avvenire in modo meno efficiente.

E' un meccanismo genetico, perchè la progenie erediterà questa fase di espressione.

Cosa succede se casca a monte della -35, potrei andare a dare fastidio al binding site di un promotore

( avvvicinarlo o ad allonatanarlo, e quindi migliorare o peggiore la trascrzione ).

Che succede se ricade nella sequenza codificante? ( ciò che va dall'inizio di trascrizone a quello di traduzione

solitamente è il 5-UTR ), così come alla fine l'RNA finisce dopo lo stop codon della traduzione e li c'è il

3'UTR. Cosa succede se avvine al 5'-UTR? Potrei avvicinare o allontanare troppo la shilddangandon e non

allineare bene mRNA e sub minore del ribosoma. Un'altra cosa è che spesso anche la stabilità di un trascritto è

governata dalla lunghezza del 5'UTR, potrei avere una diverse stanilità del'mRNA.

La cosa puù semplice è capire se avvine , la contrazione o espansione, all'interno ella ORF, se avviene

all'interno della ORF, la reading frame se ho un'espansione di uno, due o quattro nucleotidi mi salta. Spesso o

volebetieri , uno sfasamento mi porta a un codone di stop prematuro ( così da bloccare la sintesi di una proteina

danneggiata ).

Ricombinazione Omologa

Esempio:

In I. Gonorrea, è stato dimostrato questo processo per la codifica pilina di tipo 4, che serva per l'adesione

all'ospite. Si è visto che pilE che è la sub maggiore della pilina, ha un locus di espressione , e pilE è formata

dalla parte costante e delle base variabili che vengono ricombinate e cambiate costantemente ( proprio per

creare diversità antigienica ). Ci sono diversi siti silenti, che sono questi pilS1,2,3 che attraveso un meccasnimo

di ricombinazione vengono portati n vicinanza del locus di espressione e frequentemente si hanno eventi di

ricombinazione di porzioni di pilE e quindi vengono frequentemente sostituite sul genoma e espresse

diversamente da un individuo a un altro. E' un meccanimso genetico e ereditatario. un individuo va incontro a

questa ricombinazione, si diversifica e si duplica, amplificando questa variazione.

Ricombinazione Sito specifica

Meccanismi che richiedono recombinasi sito specifiche. Controllo dell'espressione delle fimbrie ( come

sininonimi di Pili ). Il gene che codifica per la sub principale e che questo gene è controllato a monte da un

promotre tapcapping ( vedi slides) , poi ci sono altri due geni phinE, phinI. Entrambi codificano per

recombinasi sito specifiche. All'interno di phinA si vedono delle sequenze ripetute e invertite di 9 pb, che sono

ricisociute da queste recombinasi e mediano lo swapping di

Abbiamo il promotore correttamente orientato per la trascrzione di phinA, in seguito a ricombinazione, posso

avere l'inversione del promotore e quindi non esprimerò questa timbrica A. Ho un altro esempio di completo

On-Off. Ho lo spegnimento totale di questa fimbria.

Si. Visto che phinB promuove la ricombinazione in entrambi i sensi, mentre phinE medi prevalentemente

l'inversione da corretto a scorretto del promotore.

Unico meccanimso Epigenetico di Phase Variation in E. Coli

E' un ceppo patogenico di E. Coli, è un ceppo che ha tratti di virulenza. Parliamo di pili e in particolare

abbiamo phatoP, il cui promotore sia costituito da inizi di trascrizione, -10,-35. Abbiamo un binding site per

CRP. E' un promotore che viene attivato in certe posizioni da CRP e abbiamo anche diversi binding site per un

altro regolatore che si chiama RL. C'è RLP che lega 3 binding site alla volta, però lega quelli 1-2-3, poi 4-5-6.

Quando RLP lega 1-2-3 favorisce l'espressione, mentre se lega4-5-6 va a inibire per ingombro sterico il

binding del promotore. Cosa ne determina i diversi siti di binding? La metilazione di due siti di metilazione,

per la metilasi DAM che si trova o a livello del binding site 1-2 oppure 4-5. In condizioni di metilazione di un

sito, si ha legame di RLP nell'altro e il legame dell'altro sito lo protegge da un eventuale metialzione.

Struttura del co-promoter e come varia l'espressine genica.

Il cromosoma nella cellula è altamente compattato da super coiling e da interazioni con proteine specifiche che

hanno una funzione strutturale , Histone like. In COli un dozzina di proteine sono coinvolte nel compattamten

del cromosoma ( vedi slides ): sono molto rappresentate nella cellula, possono instaurare interazioni con DNA

oppure proteina-proteoina. Vengono chiamate anche NAP.

Molte si legano in modo aspecifico, ma non qualsiasi sequenza assale. ALcune hanno preferenza per sequenze

ricche di A-T, altre volte si ha l'interazione specifica con determinati binding site sul genoma. Possono sia

essere legate qua e la, sia possono intervenire in regolazione gene specifiche. Hanno una doppia natura.

Come si pensa sia organizzato il cromosoma batterico:

Coli è grande 2 micron, il diametro è 1 micron. L'operone disteso è 1,7 microno, cioè solo questo è più grande

della cellula distesa. Invece il cromosoma è di 500mm, quindi si capisce bene che ci deve essere un elevato

livello di impacchettamento. E qui sono proposti lalcuni modelli di organizzazione streuttrale del cromosoma

batterico. Si pensi che il solenoide è la molecola del DNA del genoma di coli, un oprimo livello di

organizzazione è abbastanza rilassata a solenoide, con una periodicità di 117kb.

Per avere un ulteriore livello di compattazione, intervengono le NAP, con un ruolo strutturale altamente

espressio che legano in tantissime posizioni queste sequence ricche in A-T e poi stabilendo delle interazione

DNA-proteina compattano ulteriormente il DNA. Si parla di macrodominin, che possono essere ulteriormente

compattate e entra in gioco il super coiling del DNA, con cui si ha un DNA super avvolto e molto più

compattato a dare strutture del cromosoma altamente compattate.

Si sa che il super coiling e i livelli di copmpataezione de,la cromatina batterica hanno effetti sulla regolazione

genica, super avvolgimenti di un certo tipo , possono favorire o meno l'espressione di geni e favorire il binding

delle protein. C'è un dualismo struttura-sequenza , il livello di compattamtno e il super coiling può aver effetto

sulla trascrzione.

Viene proposto che la necessità di avere un certo pattern di trascrzione sia come un organizing principle, un

principio organizzativo della compattazione della cromatina.

Abbiamo un gene regolatico , per esempio codificante un organizzatore trascrzionale, che deve andare ad agire

su un operone codificante enzimi strutturali A e allo stesso tempo regolare un operone strutturale , un altra

proteina strutturale , B, sparpagliate chissà dove nel genoma. Si è visto che il gene regolativo A, stava a una

periodicità o a una distanza. Tale che che questi si trovano nello spazio molto più vicini. Spesso e volentieri,

geni che devono essere espressi nella stessa condizioni, spesso regolati nello stesso regolatore , organizzati

nello spazio vicini seppur nel genoma siano essi molto lontani. COme quindi se la necessita di avere vicini

regolatore e target, si faccia si che nella configurazione distesa del genoma sembrino organizzati a casa ma se

assumiamo che ci sia una sreuttura compatta, essi si trovano vicini nello spazio.

I pattern di espressione sarebbero una forza che guidino l'organizzazione e l'evoluazione di un genoma. E. Coli

e Salmonella, nonostante siano evolutivamente distanziati, l'ordine dei geni è molto simile e per esempio i geni

ribosomiali ( 2 diversi set ), si trovano nei due diversi bracci del cromosoma di Coli, alla stessa distanza

dall'origine di replicazione.

Vediamo come le NAP influenzino il legame della RNA polimerasi al promotore (Vedi nomi geni dalle slides ),

tramite DNA foot printing. Abbiamo detto come HMS (?) abbia un ruolo strutturale e che leghi sul cromosoma

sequenze non altmante sepcifiche per dare luogo a questa organizzazione strutturale però in altri casi IHF ecc

abbiano caso per caso binding site molto più specifici e su questi loci abbiano il ruolo di regolatore

trascrzionaleò.

Esemprio : regolazione del promotore MIR in E. Coli, codifica pe runa nitrito reduttasi citoplasmatica NADH

dipendnete. E' importante che questo promotore dipende da due attivatori trascrzionale che sono FNR che è

attivato in anaerobiosi ( ha una poszione di legame -41,5, classe 2 attivatore , stabilisce legami alpha-NTD e cn

sigma ) , ma non è sufficiente , dipende anche da un altro regolatore che si chiama NARP ( controlla ) che

viene attivato dagli ioni nitrito, è codipendente , l'attivazione, da due attivatori ( attivatori e ioni nitrito ).

La cosa interessante è che questo promotore è il soggetto del legame di molti promotori come FIS, HIF

( impone al DNA un bending ), FNR e NARP.

Studi hanno deciso di vedere dove si leghino queste proteine sul promotore e come si influenzino

reciprocamente ( le varie proteine, cioè che succede a IHF se si lega IF ecc ).

Si fanno esperimenti di foot printing prima con proteine singole e poi si provano in combinazione.

Si sono identificati, studiando IHF, un binding site primario perchè come aggiungo proteina, vedo un sito con

maggior protezione rispetto a un altro. Poi come aumento compare un secondo sito di binding, meno efficiente.

Poi si è provato con FIS.

Cosa succede se inizio a combinare FIS, HIF e FNR e NARP.

Se aggiungi FIS e HIF, ho una protezione totale che comprend tutti i binding site visti singolarmente. QUindi

possono legare simultaneamente il DNA.

Se aggiungo anche FNR, ho un'unica grande protezione. QUindi FIS, FNR ( attivatore ) e HIF possono legare

tutti insieme questo promotore qua. Comunque questi mega complesso risulta comunque un promotore

represso, e quindi si è cercato di capire che effetto aveva l'altro attivatore trascrzionale NARP. Che succede se

aggiungo l'altro attivatore e faccio band shift. Capiscono che NARP può legare il promoter quando è presente

FIS, IHF e sia l'altro attivatore NFR.

Abbiamo detto che FIS e IHF hanno più binding site sul promotore, quindi quando NAR si leghi , potrebbe

riposizionare una di queste proteine FIS, IHF. C'è una parziale sovrappozione tra sito di legame di NARP e uno

di IHF, quindi fanno foot printing competitivo, per testare questa sovrapposizione. Usano NARP e IHF, se

metto NAR da solo vedo il suo binding site. Se lo metto da solo IHF, vedo una copertura del probe su tutti e

due i siti. Se metto NAR e IHF, IHF non si lega più a entrambi ai binding site, ma si localizza solo al numero 2,

cioè lontano da NAR. QUesto attivatore sembra ostacolare il legame di IHF. Ultimo esperimento in cui si fa

competizione tra NAR e IHF. Cosa succede se metto prima IHF ( prima di NAR , prima era stato messo NAR)

e poi NAR , vedo lo stesso risultato di prima. QUindi NAR spiazza il legame.

Modello finale dell'operatore MIR.

In condizioni spente, ho diverse NAP ossia FIS e IHF che legano tutti i loro siti e fermano una sorta di

complesso nucleoproteco represso. ANche se NFR è in grado di legare non riesce ad attivare la trascrzione.

Cosa succede se è presente anche NARP, viene spiazziato IHF e quindi si ha una ristrutturazione di questo

compelsso e si ha la trascrzione. Esempio in cui solo uno degli attivatori è un vero attivatore mentre l'altro

contrasta l'effetto repressivo. Qui solo NFR è il vero attivatore, perchè contata la RNA polimerasi.

Specificità delle interazioni DNA-Proteina

E' alla base di molti step dei processi che stiamo analizzando come trascrizione e regolazione trascrizionale.

Quali sono i determinanti della specificità nelle interazioni DNA-proteina ( guarda review delle slides ).

E'un processo fondamentale in moltissimi processi biologici e in primis nel processo della trascrizione e

nella sua regolazione.

Esiste un gran numero di DNA binding proteins con caratteristiche (però ) biochimiche e strutturali simili;

una proteina che lega il DNA avranno motivi ricorrenti, proteine della stessa famiglia conterranno un domni

conservato per legare il DNA. I binding sites sul DNA sempre trattati come stringhe lineari di nucleotidi,

senza dare molto peso alla struttura tridimensionale del DNA. In realtà recentemente è emerso che se si

vuole capire bene come avviene l'interazione specifica tra proteina e DNA, si deve considerare sia la

struttura delle DNA binding proteins che quello del DNA, in quanto entrambi contribuiscono alla specificità

del legame.

Spesso si parla di Direct Readout: riconoscimento diretto tra DNA e proteina, bassata sulla

complementarietà di caratteristiche chimico fisiche offerti dei partecipenati alla interazione ( per esempio

DNA e catene laterali delle proteine ). Una certa senza sul DNA offrirà un pattern di legame chimico fisico

diverso rispetto a un'altra sequenza di DNA.

Ma non esiste un semplice codice di riconoscimento o corrispondenza uno a uno ( non è possibile spiegare

la complessività della specificità, tenendo conto solo della lettura diretta ). Quindi Direct readout da solo

non può soddisfare tutti i requisiti di specificità

Si parla dunque di Indirect Readout : interazioni DNA-proteina che dipendono da coppie di basi del DNA

non direttamente contattate da proteine. ( Al suo interno contiene dei determinanti strutturali )

Alcuni capisaldi delle DNA binding proteins, hanno certi domini/motivi strutturali tipi di una DNA binding

proteins perchè sono plasmati perfettamente in modo tale da funzionare come moduli di legame al DNA.

Spesso altre regioni della proteina, al dì fuori del dominio strutturale svolto nella interazione, ha un ruolo

fondamentale nella specificità del riconoscimento di quel sito sul DNA e nella stabilizzazione del legame.

Nell'intorno strutturale del legame altri amminoacidi sono improntati per ricosncore e stabilizzare queste

interazioni.

Le DNA binding proteins possono essere suddivise in basi ai domini strutturali che contengono, e anche

questi sono divisi in base al contenuto a livello di struttura secondaria:

• Alpha elica

• Beta strands

• Misti ( alpha elica e beta strands )

• Multi-domain protein

Struttura alpha-elica, il DNA binding motif più rappresentato: due alpha eliche consecutive separate da una

breve sequenza di aa. Queste due alpha eliche hanno funzioni diverse: uno di riconoscimento e una che

serve a stabilizzare questa prima interazione e orienta l'apha elica nel solco maggiore del DNA. Quindi

abbiamo la raffigurazione solo del dominio strutturale coinvolto nel legame al DNA. E' questo un più tipico

esempio di lettura diretta. Molti dei regolatori trascrizionali funzionano così ( ad esempio il repressore del

triptofano, dove sono coinvolte delle riorganizzazioni delle aplha-eliche, dove la forma oloenzima poteva

legare due solchi maggiori consecutivi, mentre la forma apo non ci riusciva ).

Una variazione è un Winged Helix turn Helix, appartiene a questa classe perchè hanno anche un foglietto

beta antiparallelo aggiuntivo che interagisce con il solco minore per mediare delle interazioni con il DNA

aggiuntive ( esempio OmpR ).

Poi abbiamo motivi strutturali un pò più particolari come quello che contiene solo foglietti beta detto beta-

beta-beta-seandwich-motif scoperto in S. Aureus e ci sono foglietti beta antiparalleli. E' un dimero legato al

DNA, mancano alpha eliche e i residui importanti per il riconoscimento di legame al DNA sono aa collegati

da loop che permettono l'interazione col DNA.

Un penultimo motif è una proteina complemento misto detto Ribbon-Elix-Elix, in cui il foglietto beta forma

il Dimero seguiti da 2 alpha eliche. Le alpha eliche costituiscono il core idrofobico che permette a ciascun

monomero di interagire con l'altro, quindi l'alpha elica permette la formazione del dimero, mentre è il

foglietto

Beta ad avere interazione con il DNA. Abbiamo aa delle due alpha eliche che contribuiscono a stabilire

interazione con i gruppi fosfato del DNA. ( vedi esempio su slides )

Multi Domain proteins, un regolatore trascrzionale di E.coli ( vedi slides )in cui abbiamo un doppio helix-

tun-elix all'interno della stessa proteina. Ma qui non è un dimero e ciascun monomero porta un motivo helix

turn elix, come succede per il triptofano. Qui è un'unica proteina che ha due domini helix-turn-helix e

stabiliscono contatti diversi per il DNA, una riconsoce una certa sequenza nel solco maggiore del

DNA,mentre il secondo rimane in una posizione più defilata andando più che altro a stabilizzare quella

interazione.

Qui è un unico monomero che ha due domini helix turn elix , che hanno funzioni diversi. Il primo si innesca

nel solco maggiore del DNA mentre il secondo stabilisce legami che stabilizzano l'interazione.

Il DNA offre panorami di diverse sequenze ma non possiamo considerala solo come una stringa lineare

passiva di lettere basata su un alfabeto composto da 4 lettere. Questo perchè il DNA è un'entità che ha una

certa struttura nello spazio e la struttura che assume è dipenednente dalla sequenza. Bisogna ricordare che la

struttura che il DNA assume è dipendente dalla sequenza. Può guidare quindi non solo il binding specifico

in base alla successione di basi ma anche in base alla struttura che il DNA assume nello spazio ( bending ecc

) e che bene si adatta alla struttura della proteina.

Possiamo parlare di variazione globale della forma ( ma anche di struttura locale del DNA ) comprende sia

variazioni della forma cilindrica generale del DNA e deformazioni a livello globale dell'elica.

Global Shape Variation: ( variazione della forma cilindrica generale del DNA e deformazione a livello

globale dell'elica)

Parliamo delle varie forme del DNA, il B DNA è quello più rappresentato, mentre abbiamo lo Z che si

ritrova in vitro in particolari condizioni saline, l'A DNA che viene ritrovato in particolari condizioni di basi e

viene persa la distinzione tra solco maggiore e minore.

Il DNA bending è una curvatura del DNA che si distribuisce per una lunghezza di svariate paia di basi,

vedremo ad esempio lo stretch di AAA ( parlando di Phase Variation, Lezione 10. Quando si parlava di

contrazione e/o espansione di tratti ripetuti ) si vede come la proteina che si lega si adatti perfettamente al

DNA, quindi una sua variazione potrebbe intervenire con il binding della proteina. E' ancora una frazione

globale.

Local Shape Variation: effetto locale di una singola posizione del DNA: Parliamo di DNA di Kink. Si

chiam perchè a livello di due basi consecutive dello stesso filamento vengono perse le interazioni di

stacking ( di impilamento ) tra le basi azotate ( si indeboliscono e si crea un bending localizzato ).

Minor groove narrowing: variazione a livello vocale perchè un brave tratto di sequenza del DNA è tale per

cui si ha un restringimento del solco minore in una precisa localizzazione del DNA. Se su guarda il

potenziale a livello dei solchi, quello del solco maggiore, diventa molto elettronegativo e può essere

sfruttato nel legame specifico DNA-proteina.

Abbiamo detto che dobbiamo considerare molteplici aspetti di questa interazione, ovvero chi si combina,

lettura della sequenza nucleotidica in quella posizione ( perchè una sequenza offrirà un certo panorama alla

proteina che vi si approccia), ma doibbiamo considerare anche che le proteina operano una certa Shape-

Readout, ossia varzioni locali del DNA permettono la stabilizzazione del binding ptoetina-DNA.

Base-REad-Out: lettura delle propietà chimico fisico offerto sequenze di DNA che si susseguono. Dalle

DNA binding proteins può leggere sia solco maggiore che minore. Le coppie di basi hanno un certo pattern

chimico fisico del solco maggiore che un pò viene perso nel solco minore.

Per esempio la coppia AT come viene letto dalla prospettiva solco maggiore.Se vado nel solco minore ho un

pattern abbastanza simmetrico di gruppi accettore e donatore di legami H, se ribalto la coppia e invece di AT

leggo TA, quest'ultima nel solco maggiore è assolutamente distinguibile rispetto ad AT, mentre nel solco

minore si crea un pò di ambiguità. Il solco maggiore mi da una maggiore specificità, riesco a distinguere

con maggiore specificità.

A livello del solco minore ho un pattern abbastanza simmetrico degli accettori dei legami idrogeno.

Se ribalto la cosa la coppia T-A è distinguibile da A-T se la guardò dal solco maggiore, se la guardò dal

cocchio minore avrò un'altra prospettiva e A-T assomiglierà a T-A. Quindi ho un effetto molto più specifico

se si lega al solco maggiore rispetto a quello minore.

Esempio: Base-Read-Out

Esempio del Fago lambda e del suo promotore.

Interazione tra il repressore del fago lambda e il proprio operatore sul DNA.

L'alpha elica è innestata nel solco maggiore e gli aa laterali interagiscono con le basi azotate del tratto di

DNA e ci sono aa di catene laterali di alpha eliche che non prendono direttamente contatto con il solco

maggiore che stabiliscono dei contatti con i gruppi fosfato e stabilizzano le interazioni. ( esempio serina

45 ).

Una proteina che lega il DNA non riconosce solo questo ( il solco maggiore ) ma questa lettura si combina

anche col local-shape read-out .

Esempio MokR, repressore di geni flagellarsi, repressore di flaH. E' rappresento un dimero di MokR e ci

sono alpha eliche stanno leggendo la sequenza di DNA, ma c'è anche un solco minore particolarmente

ristretto ( a livello locale ), e questo restringimento è dovuto alla particolare sequenza nucleotidica del tratto

di DNA e all'interno di questo solco ristretto e molto elettronegative si vanno a innestare le catene laterali

lunghe di altre alpha eliche di MokR cariche potivamente ( per via do aa quali arginine e lisine ).

In questo caso si combina sia un base-readout ma anche un loca-shape readout , perchè l'arginina che si

innesca nei solchi ristretti non lega una particolare sequenza ma è attirata dalla carica negativa di quel

particolare solco ristretto ( non è dovuta alla sequenza ma alla struttura , Shape ).

Nel caso di CRP, sul promotore LaC, si vede l'alpha elica nel solco maggiore ma anche altri contatti di aa

dell'intorno strutturale dell'alpha elica di riconoscimento. Si è visto che questa interazione porta alla

formazione di un kink, senza quale il DNA non potrebbe formare tutte queste interazioni. Quindi anche in

questo caso c'è una local shape variation. Quindi spesso e volentieri, dopo le interazioni con le proteine c'è

una shape variation che favorisce queste interazioni.

Lac Repressor: dimero del repressore Lac con alpha eliche che legano la sequenza nel solco maggiore del

DNA e poi c'è anche un Kink che promuove un bending del DNA che consente ulteriori interazioni con

catene laterali delle alpha eliche ( ad esempio si innestano catene laterali idrofobiche contenenti Leucine e

stabilizzano questo kink che fa combaciare perfettamente il dimero del repressore con il DNA) non solo

proprio in quel solco maggiore ma anche con altre aree del DNA. ANche qui abbiamo un esempio di base-

read out e di local-shape variation.

IHF in E.COli che è una proteina che è sia considerata una proteina che ha funzioni strutturali (NAP) ma

che localmente ha effetti regolativi e che spesso IHF interagendo col DNA promuove una curvatura del

DNA. Anche qui è importante non solo una sequenza che mi attiri la proteina ma allo tesso tempo la

sequenza deve essere tale da portare a un bending locale del DNA. Si combinano sia effetti di Read-Out che

di Shape-Read-Out.

H. Pylori: proteina Fur è una proteina diffusissima nel mondo batterico e solitamente funziona come

repressore trascrizionale che in presenza di ferro, lo complessa e ricoonsce delle sequenze operatrici e

legandosi a questi reprime la trascrizione di questi geni. Apo-fur bassa affinità per il DNA, se percepisce il

Fe, gli si complessa e acquisisce affinità per certe sequenze di DNA e reprime la trascrizione di questi geni.

Cosa succede in H. Pylori: la proteina non lega il DNA solo in presenza di Ferro, è in grado di legare altre

sequenze di DNA anche nel suo stato apo ( ossia senza Fe ).

FrbP è un gene che codifica per un proteina che codifica per un canale di memebrana che serva all' Uptake,

ne abbiamo un alto che si chiama pfr che codifica per una batterio ferritina che serve a complessare il ferro

per evitare che generi ros ( reazioni di fempotn like ).

Come sono regolate le due trascrizioni?

Facendo un saggio di primer-extension, se io prendo diversi campioni a concentrazioni crescenti di Fe,

quello che si dede è che il gene frpB cala. Ha senso? Si, perchè se c'è troppo ferro, è inutile che faccio

import e ne accumulo troppo. Questo in un ceppo wild type. Che succede se lo faccio in un ceppo che

manca di fur? Ho un segnale costante di frpB, indipendente dalla concentrazione di Fe, salta il controlli. I

livelli di trascritto sono molto superiori. QUesto suggerisce che fur possa funzionare come un repressore

trascrizionale, perchè se lo elimino la trascrizione di frbP la trascrizione è costitutivamente derepressa. Che

succede a pfr? Se aumenta il ferro, aumenta anche pfr. QUesto ha senso? si , perchè aumenta il ferro e io ho

bisogno di sequestrarlo per salvare la cellula. Che succede se muto fur? Ho una espressione costitutiva del

trascrittto di pfr, quindi sembrerebbe che anche in questo caso fur funzioni da repressore.

Ma è una regolazione diretta o indiretta? Per vederlo faccio foot-printing. Se faccio vedo una comparsa di

regioni di protezioni a livello di frpB da parte di fur. Che succede per la protezione di pfr da partire di fur?

Anche qui vedo una protezione.

Si vede che su frbP, l'affinità di fur aumenta di più in presenza di ferro e diminuisce in assenza di ferro (lega

ma perde un pò di affinità ). Il contrario accade a livello del promotore di pfr.

la proteina può legare determinate proteine quando è olo e altre quando è apo. In questo caso quando è

complessata al ferro può legare frpB, quando è apo ha altissima affinità per pfr e aumenta per frbP. QUindi

si sposta da un promotre all'altro in base alla concentrazione di ferro. Dipende dal suo stato di metallazione.

Si Fin qui tutto facile:

Cosa è che gestisce le interazioni fur-DNA?

Cosa succede alla proteina nel legame al DNA se c'è o meno ferro, sono stati fatti dei saggi HEMSA, sia su

frbP che su pfr in presenza di ferro o in presenza di Dipy ( chelante del ferro, che lo sequestra e rende la

preparazione di proteina completamente apo ).

Indipendemtnete dal promotore, sia che metta pfr che frbP, in assenza di ferro il comportamento è lo stesso.

In assenza di ferro vedo un'unica banda shiftata, quindi la stechiometria di legame della proteina al DNA

non è dettata dalla sequenza del promotore ma dallo stato di metallazione della proteina. In assenza di ferro,

la proteina lega come dimero.

Se aggiungo ferro, ho la oloproteina e indipendentemente dal promotore che sto analizzando, la proteina

multimerizza (lega come dimero, tetramero e ottomero ).

In condizioni di ferro la proteina lega come come dimero , se uso la olo proteina ( ossia senza Dipy ),

indipendente al promotre la proteina se c'è il ferro multimerizza.

In assenza di ferro avrà una variazione conformazionale che dimerizza e lega più pfr e meno frbp, se c'è

ferro cambia conformazione lega di più frbp e meno pfr. ( come tetramero )

Come sono fatti questi promotori: si allineano tutti i promotori che si comportano come frbp e pfr.

Attraverso un allineamento di sequenze si individuano le sequenze consensu. I promotori tipo frbP hanno

una sequenza ricca di T e A, poi è stato fatto lo stesso per individuare il consensus di pfr.

Per studiare meglio questa interazione si fa una tecnica di foot printing ad altissima risoluzione ( idrossido

radical foot printing ), che ha come aggiunta che l'agente di taglio non è la DNAsi ma una reazione che

produce radicali OH che attaccano il DNA. Anche qui dobbiamo avere un taglio parziale. Il radicale

permette un taglio più preciso rispetto alla DNAasi, essendo più piccoli. Solo le regioni internamente a

contatto DNA-proteina, risultano protette.

Oltretutto qui ho una risoluzione base per base, la DNAasi ha una certa bias.

Si vedono delle enormi differenza a livello di siti protetti di frbP e di pfr, indice che i siti di binding da parte

di fur sono diversi.

In pfr sono importanti regioni trinucleotidiche intervallate da regioni non protette ( è come se ci fossero dei

legami molto più fini ). Invece nel caso di frbP, si ritrova una serie di basi consecutive localizzate in un certo

punto che sono le sequenze di basi che ci si ritrova quando il DNA subisce un restringimento del solco

minore.

Facendo un HEMSA su pfr e su frbP in presenza di Distamycin A che va a legarsi i solchi minore del DNA

quindi facendo un Hemsa con fur a concentrazione fissa di fur ma variando distamycina.

• assenza di distamycina assenza di fur: migra tutto

• Se aggungo fur ma non distamycina: ho band shift

• Se aggiungo concentrazioni crescenti di distamycina: non ho più bandshift, vuol dire che il solco minore ,

bloccato dalla distamycina, serve per l'interazione tra fur e frbP

Se provo su pfr, non accade nulla.

La prova del nove, si fa un hemsa , in cui si usa anche un frbP in cui si ha una sostituzione I-C che modifica

il panorama di cariche del solco maggiore ( non ho più A-T ). Ho una sostituzione che mi cambia

esclusivamente il solco maggiore, ma non il solco minore. Quello che accade è che non ci sono

cambiamenti di comportamento nel band shift del mutato rispetto al wild type. QUindi il contatto proteina-

DNA è ad appannaggio del solco minore.

Cosa succede in vivo?

Se tratto le cellule in vivo tramite distamycina, e se le tratto con ferro o meno che succede?

Facendo una RT-PCR, cosa succede alla trascrzione di frbP. In presenza di ferro, repressione trascrzionale,

in assenza ho derepressione. Cosa succede se prima di mettere ferro metto distamycina ? Ho completa

derepressione di frbP che fa aumentare frbP ( quindi fur non lo lega più e non lo può reprimere, è come se

analizzasi un mutante di fur )

Cosa succede a pfr?

In assenza di ferro ho completa repressione di pfr, presenza di ferro ho depressione di pfr . Se aggiungo

distamycina non succede nulla, mantengo la repressione in assenza di ferro e la derepressione in presenza di

ferro. Ho conferma , in vivo, che fur contatta il solco minore di frbP mentre legge il solco maggiore su pfr.

Usando un tool bioinformatico AdHoc:

• fur lega come dimero pfr ( quando fur non è complessato con il ferro ), come se ci andasse a surf . Qui c'è

una componente anche di base-readout, è proprio la lettura di una certa senquenza

• Fur lega come tetramero frbP ( quando fur è complessato a ferro), qui c'è una sequenza ricca in A-T. QUi

viene prioritariamente viene letta non la composizione in base ( perchè la sequenza ricca in A-T è molto

generica ) del solco minore ma un restringimento del solco minore dovuto al particolare registrimento del

solco minore, dovuto a quella particolare senza di basi ( catene laterali ricco di lisine e arginina che vanno

a legarsi al solco minore ). Come una chela, lega

Circuiti di Regolazione e Network di regolazione trascrizionale ( tale e quale su review di Nature 2007 )

Se ci si immagina una rete di regolazione trascrzionale , ad esempio il network degli heat shock o di un

organismo intero. Esempio il network di E. Coli. Network: interazione tra regolatori trascrizionali e i loro

target.

Ci sono regolatori che regolano un solo gene come regolatori che regolano centinaia di geni. Ci sono dei

cosìdetti master regulator che stanno in cima a questa cascata di regolazione, hanno molti target regolati ma

a loro volta regolano a loro volta altri regolatori trascrzionale. Propagano la regolazione.

Abbiamo un categorizza intermedia detti regolatori intermedi che a loro volta possono essere controllati da

master regulator.

Si è notato che esiste un piccolo set di pattern di circuiti ricorrenti in questo network e quindi sono

considerati dei mattoncini con cui sono costruttivi questi network di regolazione trascrizionale. E si parla di

network motifs, i motivi su cui sono costruttivi i network totali. Quali funzione hanno? Perchè sono stati

caratterizzati questi set di circuiti?

Esistono due tipi di motivi di regolazione:

• sensosry network: network che rispondono ai segnali ambientali

• Poi abbiano i network che sono coinvolti nello sviluppo

Se abbiamo detto che un network globale pul essere scomposto in motivi ricorrenti più semplici, quali sono

e che funzione hanno?

La prima famiglia di motivi di regolazione, sono denomini simple regulation. E' il caso più semplice.

Abbiamo un regolatore trascrizionale Y attivato da un segale SY, Y regola la trascrizione del gene X. Cosa

succede quando arriva su Y il segnale che lo attiva: Y si attiva , è un attivatore trascrizionale e attiva quindi

X che aumenta fino a raggiungere un plateau. E' dato dal rapporto quanto ne viene prodotto/quanto se ne

degrada.

Definiamo anche il tempo di risposta: il tempo per raggiungere il livello intermedio tra iniziale e steady

states ( il tempo è espresso in generazioni ).

Negativa Auto Regulation ( NAR ): è un repressore che si autoreprimee e questo succede nella maggiorparte

dei repressori trascrizionale. Perchè si autoreprimono? La NAR, si ha che il regolatore X , attivato da SX,

reprime la trascrizione di se stesso.

Ma oerchè si ha questo? Prima funzione: accelerare il tempo di risposta del circuito. Questo perchè spesso e

volentieri, regolatori che si autoreprimono hanno un promotore abbastanza forte che ne guida la

trascrizione. Se voglio raggiungere lo stesso livello di X, con la NAR, posso mettere a monte di X un bel

promotore forte e questa concentrazione di X come arriva alla soglia di autorepressione ecco che X si

autoreprime e quindi arrivo comunque allo steady states ( sistema con registrazione ).

Se ho un promotore forte e una simple regulation raggiungerò un livello elevatissimo di X, quindi la

negative autoregulation ha la funzione di mantenere controllata ll'espressione di X. Il response time è molto

più piccolo rispeto alla simple regulation.

Ovviamente questo deriva da simulazioni matematiche pesanti, il tutto è stato poi dimostrato

sperimentalmente.

Un circuito semplice è quello in cui si ha un TetR fuso con GFP che oltre ad esprimere GFP può anche auto

inibirsi a concentrazioni troppo elevate.

La seconda funzione è ridurre le differenze cellula cellula a livello di proteina. Abbiamo parlato della

transcription noise, e dicevamo che la trascrizone è governata da aventi stocastici. Cellule all'interno di una

popolazione presentano livelli differenti di un a proteina.

Con la negative auto regulation, non appena c'è la trascrzione di questo gene, entro una certe soglia si ha

l'autorpressione di X.

Mi permette di aver molto meno variabilità.

Ultimo circuito semplice è la positive autorahilation abbiamo che il regolatore trascrzionale S, innescato da

SX, stimola la regolazione trascrzionale. (Registrazioni ).

Le funzioni so no opposte alla negative autoregualtion.

Oltre a nar c'è l'esatto contrario , ossia la PAR, in cui all'inizio con la oncentrazione di X è bassa ma poi

come arriva alla giusta concentrazione, i valori di concentrazioni di X aumentano più velocemente.

Altra funzione rispetto a NAR, è che esalta le differenze cellula cellula. Pensiamo a un gene che autoregola

trascrizionalalmente.

Posiamo avere cellule che hanno un impulso di trascrizone e quindi ( registrazione ) basta un pò di X che mi

parte ( statisticamente ) che poi si auto alimenta e abbiamo una forte espressone di X ) e ci garantirà di

distribuzione bimodale.

Assomiglia un pò alla Phase Variation, anche se non è ereditabile.

La seconda famiglia di Network Motifics sono i feedforward loops.

Sono motivi molto diffusi, e sono solitamente composti da 3 geni: un regolatore di X, che regala Y, e un

gene Z regolato si a da X che da Y.

Abbiamo in ciascuna un regolatore X che regolaZ, ma regola anche Y che a sua volta regola Z. Quindi Z è

regolato direttamente da X e indirettamente da Y.

Poichè ciascuna delle 3 interazioni può essere positiva o negativa, attivazione o repressione, esisto o 8 tipi

differenti di feed forward loop.

Altra grossa distinzione è tra feed forward loop coerenti e incoerenti, si riferisce all'effetto su Z sui due

diversi percorsi.

• S di X attiva Z ma è anche necessario un segnale di attivazione da parte di Y ( che dovrebbe essere

attivato da X stesso ) ( registrazioni )

• Incoerenti: C'è un attivazione di Z da una parte X, ma allo stesso tempo X attiva anche Y che è un

repressore di Z e per questo si parla di forward loop incoerenti.

Su Z arriva l'attivazione diretta di X e una indiretta di Y, affinché avvenga la trascrizone di Z c'è bisogno del

regolatore di X e regolatore di Y, sono entrambi necessari. Viceversa possiamo avere una logico di tipo OR,

basta uno dei due attivatori affinchè avvengono la trascrizione di Z.

Il tipo 1 può essere AND o OR.

Quali sono le funzioni dei network motifs.

Esempio con logica AND. Feed Forward Loop Coerenti.

Abbiamo X che sarà attivato a monte da un segnale Sx, che si lega al promotore di Z e anche a Y ,

attivandolo. Entrambi X e Y devono legarsi per attivare Z.

Dinamica, non appena X viene trascritto non vedo subito la trascrizione di Z, perchè deve ancora ( X )

legare e attivare Y. Quando sia X e Y hanno raggiunto un certo uvalore soglia, possono legare e attivare Z

( c'è un delay di attivazione). Ma basta che uno dei X o Y non ci sia che immediatamente ( senza delay ) o

un blocco della trascrizione.

Inoltre c'è una soglia di X che deve essere raggiunto per poter attivare anche Y, così da essere sicuri che non

si sia trattato di un evento stocastico.

Modulando la soglia di attivazione di Y, posso modulare il delay di attivazione e anche modulare la soglia di

X necessaria all'attivazione di Y e di conseguenza all'attivazione di Z.

Questo sistema è stato dimostrato matematicamente e poi sperimentalmente.

Un esempio è il circuito dell'operone LacZ.

Questo operone è codipendente dai regolatori CRP e LacI, il sistema di utilizzo di arabinosio araBAD,

questo invece è dipendente da due attivatori CRP e AraC e questo è un feed forward loop coerente di tipo 1 (

registrazione ).

Qui l'Sx è cAMP, si ede che nel caso del lacZ, è una regolazione semplice in cui c'è una connessione diretta

tra CRP ( X ) e lacZ ( Z ).

Invece nel sistema di arabinosio si ha l'aggiunta di cAMP, si ha un delay e poi la trascrizine di araBAD

( vedi immagine slides ).

Abbiamo delle cinetiche di attivazione diverse , con delay ( atrabinosio ), senza delay ( lacZ ). Invece in

spegnimento non si ha nessun delay.

Un altro esempio, con feed forward loop coerente di tipo I con logica OR. In cui basta che uno dei attivatori

sia presente su Z per avere la trascrione. Avremo gli effetti opposti alla logica AND, qui il delay è in

spegnimento ( perchè devono mancare entrambi i segnali per avere uno spegnimento, quindi il sistema deve

aspettare che manchino entrambi i segnali per avere uno spegnimento, e quindi per questo avrò il delay ).

Questo sistema è stato verificato sul circuito di geni flagellarsi. Questo operone è regolato da un attivatore

trascrizionale da FlhDC e questo attivatore trascrizionale oltre ad attivare Z, può attivare anche FliA ( sigma

alternativo ) e attivare Z.

Feed FOrward Loop Incoerenti

X attiva direttamente X ma attiva anche Y, un repressore di Z!

Hanno una certa funzione, in particolare, una delle funzioni è quello di generare una rispsota ad impulso, un

impulso trascrzionale. Come questo è possibile: Immagine 3 grafici con Sx, Y r Z. Il segnale di Sx attiva X,

X lega Z e lo attiva immediatamente. Poi cosa succede? X si lega anche al promotore di Y, un repressore di

Z.

Solo quando Y raggiunge una certa concentrazione ( quindi non lo fa immediatamente ) si andrà ad

inattivare Z. Il delay mi permette prima un'espressione di Z poi un suo steady state e poi una sua inibizione.

La combinazione dei due rami fa si che ci sia prima un picco e poi un suo assestamento, ho un impulso.

Un'altra funzione è una risposta accelerato, semplicemente perchè ho una produzione iniziale molto forte

che viene contrastata dal ramo repressivo del circuito.Avrò all'inizio un'attivazione molto forte ch epoi si

combina col ramo repressivo che lo porta a uno steady state.

Questo è stato visto in un circuito dell'utilizzo del galattosio galETK, l'attivazione di questo circuito passa

attraverso due regolatori, da un lato CRP che percepisce cAMP, che attiva direttamente gal e dall'altra parte

attiva un repressore che si chiama GalS ). In un ceppo wt, ho questa espressione a impulso. Che succede se

blocco GalS, è stato mutagenizzato il binding domain di GalS ( c'è ma non può legarsi ) e quello che si vede

che gaETK è trascritto ampiamente.

Network Motifs:

Single Input modules:

È un'organizzazione molto semplice dove un regolatore X, regola un gruppo N di geni. Ho un regolatore

trascrzionale che ha N target. Che funzioni ha?

• espressione coordinata di gruppi di geni funzionalmente correlati

• Generazione di pattern du espressione coordinati nel tempo, semplicemente tutti i target di questo

regolatore non hanno lo stesso soglia di attivazione, non aìvengono tutti attivati ala comparsa del segnale.

Ma c'è chi ha bisogno di più X e chi di meno X.

Quindi questi geni hanno una soglia di X diversi, per cui ci saranno geni che si attivano prima e geni che si

attivano dopo e per questo quindi c'è una coordinazione in base all'aumento nel tempo di concentrazione di

X. Questo dipenderà dall'affinità di quella proteina per quel determinato promotore.

Dense overlapping regulons (DOR )

Situazioni complesse in cui un regolatore trascrizionale ha pi target,. Ma un target è regolato da più

regolatori trascrzionali.

In alcuni casi si hanno motivi di regolazione, visti come mattoncini che si combinano per costituire un

network di regolazione complessi. Nell'esempio di Bacillus, si combinano di versi feed forward loop in cui

l'input di uno diventa l'output dell'altro. Siamo in un develpment al network.

Esempio della sporulazione in bacillus, la sporulazione è una modificazione dello stato di crescita della

cellula dove da stato vegetativo passa a stato di spora.

In cima a tutto c'è il regolatore Spo()A che p innescato da un segnale a monte, quindi X1 regola Z1

attivandolo e attiva anche Y1 che è un repressore trascrzionale di Z1 ( è un feed forward loop incoerente di

tipo 1, quindi rispsota a impulso ), Y1 ha anche la funzione attivare con X1 , X2 ( non chiede, guarda solo

immagine slides )

Questi circuiti si ritrovano anche in network misti fatti da proteine e regolatori a RNA ( esempio MYC )

Review, Cell 2009

RNA Regolativi

Sono un gruppo eterogeneo di molecole che agiscono attraverso vari meccanismi per modulare l'espressione

di proteine. E sono coinvolti in un vasto repertorio di risposte fisiologiche.

Gruppo eterogeneo: vari aspetti quali,

• dimensioni : chiamati small RNA, che non hanno una funzione codificante ma regolativa. Ma esistono

anche RNA-antisenso anche di 10kb.

• Qualcuno li chiama non-coding-RNA che viene anche tradotto e questa proteina ha effetto regolativo

• Meccanismo: trascrizionale o post-trascrizionale. Alcuni possono regolare entrambi gli organismi, altri

solo uno dei due.

Questi RNA regolativi sono stati caratterizzati per prima nei procarioti, è stato identificato un RNA1

coinvolto nel blocco della replicazione di ColE1. Qualche anno dopo è stato trovato un corto RNA che

bloccava la trasposasi. Poi è stato identificato il primo RNA regolativo trovato in un ceppo di Coli MicF,

coinvolto nel blocco della traduzione della proteina OmpF.

RIboswitch

Caratterizzata da particolari sequenze al 5' dell'mRNA, 5'-UTR. E la caratteristica di questa sequenza è

quella di poter assumere certe conformazioni in base ai diversi segnali ambientali, quali:

• stallo dei ribosomi

• temperatura

• ligandi di varia natura.

RNA regolativi che agiscono in cis, ovvero non sono RNA a se stanti che vanno a riconoscere qualche altro

trascritto e vi si appaiano espletando una funzione regolativa. Sono un RNA che agisce sullo stesso RNA

che viene regolato.

Regolazione in cis a carico dell'operone triptofano. E' stato il primo esempio un meccanismo di regolazione

in cis.

Attenuazione trascrizionale

Viene messo in a

L'operone triptofano contiene 5 enzimi per la sintesi del triptofano. Abbiamo detto che la regolazione

dell'inizio della trascrizione del triptofano dipende da una sequenza in cis che contiene il repressore del

triptofano trpR e viene prodotto un repressore ( aporepressore , ancora non legato alla molecola di triptofano

). Più a valle c'è l'operone multicistronico del triptofano ( trpEDCBA ), poi immediatamente a monte c'è il

promotore e l'operatore. L'aporepressore ha bassa affinità per l'operatore. In presenza di triptofano, questo si

lega all'aporepressore, si forma l'olorepressore e si ha una variazione conformazionale che permette il

legame del repressore all'operatore.

La repressione trascrizionale è debole, non è particolarmente efficiente. Se ci fosse solo questo meccanismo,

anche in presenza del repressore , non ci sarebbe un abbassamento significativo. Allora quello che si vede

( vedi whatson ed 7 ) è che c'è un 5'-UTR , il quale non è proprio un UTR perchè presenta un codone di

inzio della traduzione seguito poco dopo da una sequenza di stop. Ma a che serve?Quello che si è visto è

che quella regione la piò assumere una conformazione e assumere una struttura secondaria abbastanza

complessa. Si è suddiviso in 4 regioni e si vede che la regione 1 può applicarsi con la 2 e la 3 con la 4 e

questi possono formare una struttura harpin tipica di un terminatore instrinseco della trascrizione. Ma come

fa quella struttura a formarsi o meno in presenza o assenza di triptofano? E quello che si vede è che nella

porzione del 5' UTR dove si vede la breve sequenza traducibile è che ci sono due codoni consecutivi del

triptofano. Questo è singolare, perchè il triptofano è abbastanza raro come aa ( qui se ne trovano ben due

appaiati ).

Che succede in carenza di triptofano? La trascrizione parte, il trascritto ( quello al 5'-UTR ) emerge dalla

polimerasi e viene contattato dai ribosomi, e visto che non hanno l'aaminocil tRNA per il trotpfano, i

ribosomi stallano e 1 non si appaia con 2, e 3 non si appaia con 4 perchè 2 si appaia con 3 e quindi non si

forma la struttura di terminazione. E quindi non abbiamo questo evento di terminazione precoce.n

Quando il triptofano è abbondante abbiamo repressione trascrizionale, ma abbiamo detto che è inefficiente.

Quello che lo blocca è questo terminatore intrinseco che non fa stellare i ribosomi perchè ora il triptofano

per l'amminoacil tRNA corrispondente è presente! E quindi 3 si appaia con 4 , si forma l'harpin eLa

trascrizione finisce.

In questo modo orta si capisce come RNA regolativi possano agire in cis, e cìò dipende dalla conformazione

che la sequenza può assumere in rispsota a cambiamenti dell'omeostasi.

RNA Thermomethers

Agiscono solo a livello post-traduzionale

Il segnale che modifica la conformazione della sequenza al 5'-UTR è la temperatura. Bisogna ricordarsi

dell'importanza delle sequenze di inizio della traduzione che servono per far interagire l'mRNA alla subunità

minore del ribosoma ( Shine-Dalgandon ), se questo riconoscimento viene ostacolato si agisce

sull'efficienza di traduzione di un trascritto.

A livello post-trascrzionale l'mRNA codificante per sigma32 può assumere due diverse conformazioni in

maniera dipendente dalla temperatura. A basse temperature non devo tradurre tanto sigma 32. Si forma una

struttura secondaria che coinvolge il sito di inizio della traduzione e della Shine Dalgandon e quindi non

può essere tradotto. Nel momento in cui si aumenta la temperatura, la struttura si risolve e si permette

l'accesso al sito di inizio della tradizione.

Negli ultimi anni lo studio di questo molecole termosensori hanno avuto un boom, si è visto essere molto

importanti anche per i geni della virulenza ( ad esempio batteri che attivano geni solo dopo che dalla

temperatura esterna sono passati alla temperatura dell'ospite che gli segnala che vale la pena attivare la

traduzione di quei geni della virulenza ).

Abbiamo zipper che rispondono a salti di temperatura molto forti, solo in questo caso si ha il melting della

struttura. Ci sono zipper in grado di percepire minime strutture della temperatura. ( riascolta velocemente ).

Poi abbiamo struttura che anzichè a zipper sono, Switch in cui ci sono 2 strutture mutualmente esclusive a

bassa e alta temperatura.

Esempio Switch:

Due strutture mutualmente esclusive, in uno abbiamo un mRNA ( che regola la fase lisogenica del fago

lambda ), a 45 non è tradotto, perchè la shine-dalganon e AUG la struttura è completamente mascherata.

Mentre se si abbassa la temperatura , diventano accessibili e viene tradotto il gene.

Si visto che in Neissseria meningitidis ci sono 3 proteine che servono a evadere la rispsota infiammatoria

dell'ospite e si è visto che nel 5'-UTR si potevano ritroavare delle strutture simili a quelle che abbiamo

appena viste. Una di queste è quella di cssA, che è stato paragonato a prfA di E. Coli ( perchè gia

completamente caratterizzato ). E si vede che il modo in cui si appaiano i filamenti della struttura

secondaria. IN E. Coli sono più abbondanti gli appaiamenti deboli. Se si costruisci e un sistema reporter e si

confrontano i due, si vede che quello di E. Coli si attiva solo a 38° mentre n cssA, essendo meno stabile, la

traduzione inizia in modo graduale già a partire da 28°.-

Riboswitch

Fanno perte dell'mRNA che regolano, le strutture al 5'-UTR sono in grado id percepire ligandi e legandosi a

questa 5'-UTR ne modulano la conformazione e infatti vengono chiamati anche sensori di metaboliti.

Quale è la struttura base di un riboswitch, ha un aptmero che è quella che interagisce con la molecola se

vale e poi è seguita da una expression platform che è la parte che assume strutture alternative che hanno

effetto sulla trascrizone o traduzione.

I processi che possono essere modulati sono sia la trascrizione che la traduzione.

Abbiamo meccanismi trascrizonali:

C'è il 5' di un trascritto, che va dall'inizio di trascrizone fino alla RBS ( sequenza di legame dei ribosomi ),

questa struttura in assenza di ligando ha una certa struttura secondaria. In assenza di ligando questo gene

sarà trascritto, cosa succede in assenza di ligando, si ha un riarranghiamento della struttura secondaria al 5' e

in questo vaso si forma una struttura di terminazione. Quindi similmente all'attenuazione trascrizionale, in

questo caso caso è l'interazione con il ligando che fa assumere all'mRNA una struttura che mima una

terminazione precoce della trascrizione. Viene trascritto solo il 5-UTR.

Si può ipotizzare un evento opposto, sono èiù rari però. Ossia la struttura che blocca la trascrzione si

verifica in assenza di ligando, quando arriva il ligando la struttura si rilassa e quindi il gene può essere

trascritto completamente.

Abbiamo un effetto sulla trascrione, ma positivo.

Traduzione,

un pò come gli elementi thermometers, qui è il ligando che promuove la formazione di una struttura

trascrizionale a livello dell'mRNA completamente formato e va a mascherare o meno la RBS impedendo

cosi la traduzione. Il ligando si lega all'aptameto e poi è la parte adiacente che cambia struttura.

I riboswitch in battery gram + agiscono sulla trascrizione, mentre nei gram - si ritrovano nella traduzione

( vedi la differenza ), questo sarebbe dovuta alla differenza genomica. Nei gram + , gli operoni sono

multicistronici giganti mentre nei gram - sono molto più piccoli e geni singoli. QUindi è ovvio che è più

conveniente bloccare la trascrizione di operoni giganti piuttosto che la traduzione , è una questione di

economicità.

Grazie alla studio di strutture, si sta studiando la conformazione di questi riboswitch.

Una cosa interessante è che i riboswitch hanno una natura altamente modulabile. E questi moduli possono

essere combinati, in modo che la traduzione di questo gene possa rispondere a più ligandi. Un esempio di

riboswitch modulare è quello che risponde alla cobalamina. E' un esempio di un elemento che opera in

diverso contesti attraverso eccanismi diversi. Ha una regione conservata che lega l'adenosina cobalamina

( vedi immagine slides ).

E' al 5' UTR di due geni, questo riboswitch detto B12 BOX, opera in btuB a livello della trascrzione nei

gram+ mentre nei gram- m a livello del gene cob agisce sulla traduzione.

Tandem RIboswtich:

( in E. Coli lo stesso MetE è regolato trascrzionalmente in base alla presenza di ligandi, ma che non richiede

riboswitch ).

Studiando il 5'-UTR del gene MetH sono stati trovati due riboswitch vicini che rispondevano a due ligandi

diversi. ( vedi slides ). L'omocisteina mi produce metionina e poi può essere convertita ad S-

Adenosin-metionina. Esistono due enzimi che sono in grado di catalizzar il passaggio da omocisteina a

metionina e e poi un singolo enzima che in grado di convertirla in S adensin metionina. Si vede che al 5' di

metE, H e K c'è un riboswitch per legare SAM ( S adenosine metionina, questo ha senso perchè se c'è tanto

SAM; questo si lega al riboswitch e lo spegne, Un sistema a feed back negativo ).

La cosa interessante è che MetE ( enzima che catalizza il passaggio da homocisteina a metionina ) ha anche

un riboswitch per la adenosine-cobalamina, la quale permette che se ci sono sia SAM che Cobalamina,

MetE è spento, ma MetH che può usare la cobalamina, è acceso, è molto più efficiente!.

Per fare ciò hanno usato una tecnica detta In-Line Probing, che è una tecnica che sfrutta l'autodegradazione

dell'RNA in soluzione. L'RNA in certe conformazioni, va incontro ad autodegradazione, mentre regioni più

strutturate ( per esempio coinvolte in strutture secondarie ) sono più resistenti a questa degradazione

spontanea, in Bacillus Clausii.

Se ho un RNA in assenza di ligando, questi assume una struttura secondaria e avrò un certo pattern di bande

di degradazione, mentre il doppio filamento è più resistente a eventi di degradazione. Si marca al 5'.

Se io allo stesso RNA aggiungo anche un putativo ligando, quindi questo può causare la promozione o lo

scioglimento di una struttura secondaria ( a seconda che kl'aggiunta di un ligando mi accenda o spenga un

gene ) e quindi avrò una variazione del pattern di degradazione.

Esperimento mostrato, in line probing:

• in assenza di entrambi i ligandi: ho un certo pattern di taglio

• Aggiungo SAM: a un certo punto si vedono variazioni di bande , indic che sta cambiando la

conformazionale , in parallelo hanno usato una RNAasi T1 che taglia solo le G, in questo punto sanno

dove si trovano e hanno anche un marker di peso molecolare.

• Aggiungo solo Cobalamin: ho di nuovo un cambiamento del profilo di taglio, ma in posizioni

completamente di verso rispetto alla SAM. Indice che c'è un secondo sito su cui vada ad agire e causare

un cambio conformazionale

• Se aggiungo entrambi: vedo la combinazione dei due, che però non si influenzano a viecenda e quindi

sono indipendenti.

Bisogna fare la dimostrazione in vivo.

Fanno una RT-PCR.

Usano coppie di primer posizionati in vari punti del trascritto o in corrispondenza a ambiente del primo

riboswitch , o a monte dal secondo riboswich, uno a valle dei riboswitch e un altro proprio dentro la ORF a.

Quindi:

• se non metto nulla dovrei vedere il trascritto intero

• se aggiungo la cobalamina, dovrei avere uno stop della trascrizone a valle immediatamente del secondo

riboswitch e quindi avere un trascritto più corte. QUnid non vedo prodotto di amplificazione a vella del

riboswitch 2.

• se aggiungo SAM, allora il trascritto dovrebbe bloccarsi proprio prima del riboswitch 2.

• Se metto entrambi si ha un drastico abbassamento della trascrizone. L'effetto sembrerebbe sinergico.

Ultimo dato , più rifinito:

• amplificazione di controlllo con coppia di prime a livello del primo riboswitch qundi in tutte le condizioni

dovrei avere amplificazione.

• Se vado su UTR2 (tenendo conto che amplifico a partire da riboswitch 2 ), ho un crollo di amplifizione in

presenza si SAM, perchè termina prima di UTR2, invece aumenta se uso cobalamina, perchè riesco ad

amplificare almeno il pezzo di UTR1.

Ultimo saggio , è un saggio reporter fatto con beta gal, epr vedere se una proteina a valle di questi

riboswitch viene tradotta. E verificano che nelle condizioni sopra elencate, a seconda dei ligandi aggiunti,

avrò espressione variabile della beta gal.

La prova del nove è vedere se funzionano ancora mutagenizzando aa importanti dei due riuboswitch.

La logica di questo circuito , è quella OR.

Ne sono stati individuati anche di altri Tandem Riboswitch:

• ad esempio reposnsività a diversi ligandi

• Due tandem responsive alla stessa molecola: esempio resposivi alla glicina, si ha uno spegnimento

graduale in base a quanta glicina c'è nel mezzo e alla saturazione dei due riboswitch

Ultimo esempio

Situazioni più complesse, il trascritto del gene prfA che a basse temperature è spento ( per una struttura che

blocca la RBS ), mente in aumento della temperatura questa struttura si scioglie ( mediato da RNA

thermometer ) e la traduzione viene aumentata. Ma è presenza anche un mRNA con un riboswitch che sente

i livelli di SAM, e in seguoto alla sua percezione si struttura e va a interagire con la struttura aperta di prfA.

In questo caso ci troviamo di fronte a uno small RNA.

Esempio di Riboswitch-Ribozyyme presente in B. Subtilis che è resppnsivo al glucosio 6 fosfato.

Ha un 5' UTR con riboswitch, e in seguito all'interazione del ligando si ha un autoprocessamnto di questa

struttura. Viene persa una corta struttura del 5' e ciò che è rimane risulta più suscettibile all'attacco di una

RNAasi specifica. E come conseguenza questyp gene sarà molto meno espresso ( rispetto alla C ondizione

in cui non è rpsesente il ligando ). QUi non c'è un meccanismo che blocca la RBS ma astiste post

trascrizonalemnte sulla stablità del trascritto.

Riepilogo Lezione 13

Inizio Lezione

sRNA che legano e modulazione attività di proteine target, sono corti trascritti non codificanti che agiscono in

trans.

E' una categoria a se stante, che agiscono, non appaiandosi all'mRNA, ma interagiscono con le proteine!

Il primo esempio è il sistema CsRA, CsRB e CsRC di E. Coli. CsRB e CsRC sono i trascritti regolativi veri e

propri mentre CsRA è la proteina legata. CsRA è una proteina coinvolta in diverse funzioni fisiologiche come

l'uso del carbonio, in fase stazionaria e in condizioni di starvation. CsRA lega motivi GGA che si trovano al 5'

di certi mRNA. Legandosi in queste posizioni ne influenza la traduzione e la stabilità, contatta una sotto

popolazione di mRNA cellulari e ne modula la traducibilità.

CsRB e CsRC sono i due mRNA regolativi che agiscono su CsRA. Contengono numerosissimi motivi GGA,

che vengono riconosciuti da CsRA. In questo modo possono sequestrare CsRA. Questo mRNA regolativo

agisce a livello post traduzionale perchè controlla la disponibilità di una certa proteina, in questo caso CsRA.

E' un modo di regolarla, mimando i binding site. Questi mRNA vengono indotti nel momento in cui devo

diminuire la quantità di CsRA.

Altro caso è quello del 6S rRNA. Cosa succede quando viene trascritto?

Si struttura in modo tale da mimare un complesso aperto di trascrizione, ossia mimando un DNA in complesso

aperto di trascrizione.

Una volta trascritto, il 6S rRNA forma una specie di bolla di trascrizione, in queste condizioni sequestra l'RNA

Polimerasi. Questo succede in fase stazionaria, il 5S rRNA viene indotto dalla fase stazionaria, in cui aumenta

molto il 6S rRNA e sequestra l'RNA polimerasi + fattore vegetativo sigma 70 ma non sigma S ( quello

specifico per la fase stazionaria ).

Quando le condizioni tornano a essere favorevoli per la crescita, il corto rRNA regolativo viene trascritto dalla

polimersi, così da potersi sganciare dal rRNA , a formare così un cortissimo rRNA ( ma non se ne conosce

ancora la funzione ).

Ultimo esempio: quello in cui c'è un corto mRNA regolativo chiamato GlmZ, che si appaia la tradizione di un

mRNA chiamato glmS ( normalmente ). Normalmente la stabilità di questo RNA regolativo è destabilizzato da

una RNA chiamata YhbJ. In certe condizioni viene indotta la trascrizione di un mRNA regolativo chiamato

GlmY che mima la struttura secondaria di glmZ ( facendo da Z ) e così riduce la degradazione di GlmZ ( non

direttamente ma sequestrando la RNAsi ).

Mimano una struttura solitamente.

Base-pairing sRNA:

• cis encoded : fa riferimento al locus regolativo da quale l'RNA viene trascritto, in questo caso sono quelli

anti-senso. Sono trascritti sul locus opposto rispetto all'mRNA da regolare. ( in direzione 5'-3')

• trans encoded : RNA regolativi che vengono trascritti da un locus genomico completamente scorrelato dal

sito di regolazione.

Sono RNA regolativi che agiscono in trans, perchè sono molecole distinte rispetto al trascritto di regolazione.

Cis-encoded: codificati sul filamento opposto rispetto a quello dell'mRNA target. Sono caratterizzati da estese

regioni di complementarietà,due trascritti sono codificati dalla stessa regione(in cis) del DNA ma sono trascritti

da filamenti opposti com RNA distinti e agiscono in trans.

Tantissimi processi cellulari sono regolati in questo modo. Inizialmente sono stati identificati come RNA

antisenso : trasposasi e proteine tossisce.

Le trasposasi sono stretta regolazione dagli RMNA antisenso perchè sono attivamente trascritti. Solo in alcuni

casi il geme sarà attivo.

Sistema tossina-antitossina. Sistema in cui abbiamo un corto gene che da origine a un corto trascritto e che è

tradotto in una tossina ( proteina altamente idrofobica) per la stessa cellula o per qualcosa all'esterno.

Solitamente viene prodotta anche un antitossina accoppiato, e spesso altro non è che un antisenso. In questo

modo si mantiene spente la produzione di questa proteina.

Alcuni regolatori trascrizionali quali GadX e GadY sono regolati da sRNA on E. Coli. In Anabaena abbiamo il

trascritto furA, omologo di FuR.

Proteine coinvolte nel metabolismo e nella virulenza sono regolari da sRNA. Ad esempio diverse forme di

asRNA sono state viste regolare, mediante riboswitch, i geni coinvolti nel metabolismo.

Come possono essere organizzati nel genoma questi rRNA antisenso.

Gli RNA regolativi non sono necessariamente short ma abbiamo anche sRNA molto più grandi.

L'asRNA può appaiarsi alla ORF e modulare la trascrizionale.

Oppure possiamo vedere un RNA antisenso che spazia non solo per la ORF ma per tutto l'operone

multicistronico , in cui avremo se tutto va bene, l'appaiamento Whatson e Crik perfetta.

Ma anche la posizione relativa tra senso e anti senso può essere molto variegata. In particolare , in un caso

complesso, avremo su uno dei filamenti un promotore che guida la trascrizione di orfA e quello sul lato

opposto che guida la trascrzione di orfB e si vede che tra i due si crea overlapping transcription di orf B su

orfA, e il potenziale appaiamento può portare a un effetto reciproco. Bisogna capire se questi geni siano

coespressi. Il 5'-UTR di orf-B può fingere da antisenso di orfA. Può avvenire anche il contrario. Posso avere

casi in cui il 5'-UTR di ORF B può andare ad appaiarsi col 3' del trascritto di orf-A

Meccanismi di regolazione

Anche i meccanismi di regolazione messi in atto dagli arRNA antisenso sono estremamente eterogenee.

Primo passaggio, si può regolare la trascrizione attraverso du meccanismi:

• il primo: sull'inizio di trascrizione, dove l'RNA antisenso è solo un sottoprodotto della trascrizione. Il vero

effetto è sortito dalla trascrizione convergente ( uno su un filamento, l'altro su quello opposto ). Abbiamo

due promotori che si fronteggiano, ciascuno ha la sua sequenza codificante a valle. Uno dei due promotori è

più forte dell'altro e quindi la trascrizione ( ad esempio ) da P a R avviene molto più facilmente che il

contrario. Quindi la trascrizione di P, va a dar fastidio alla trascrizione di R. Sono due inizi di trascrzione che

si danno fastidio. L'RNA antisenso è solo un effetto collaterale, sono due eventi di trascrzione che si danno

fastidio e solo quell'io più forte è tradotto. Oppure possiamo avere una collisione tra i due macchinari

trascrizionali e si va a limitare la trascrizine di entrambi.Oppure se sono molto vicini, il recluemntro del

macchinario di trascrizione su uno, impedisce il reclutamento sull0altro. Sono i due inizi di trascrizione, per

come sono messi, a dar fastidio e non l'antisenso.

• il secondo: abbiamo un'attenuazione trascrizionale,avvienesulla terminazione della trascrizionale. Abbiamo

un lungo operone multicistronico e sul filamento inferiore abbiamo due promotori che innescano la

trascrizione di due corti asRNA esattamente complementari all'RNAsenso. Una volta trascritto un asRNA,

questo si appia alla regione complementare e crea una struttura secondaria che ricorda un terminatore delle

trascrizione ( a forcina ). Non è un terminatore intramolecolare, ma un terminatore precoce è una struttura in

trans che mima un terminatore della trascrizione e destabilizza il complesso della trascrizione.

Abbiamo esempi in cui è la stabiltà dell'mRNA messaggero a essere influenzato dall'appaiamento con sRNA.

Esempio del gene isiA coinvolto nella captazione della luce. In seguito all'appaiamento tra mRNA e sRNA

antisenso si ha una destabilizzazione perchè il duplex viene più facilmente riconosciuto e degradato da

particolari RNAsi che riconoscono dsRNA.

Potrebbero esserci sRNA che causano effetti opposti, ossia un aumento della stabilità della trascrzione. Ad

esempio in E. Coli, c'è un esempio quasi unico in cui sono. Coinvolti gadX, gadW e GadY.

gadX e gadW vengono trascritti come un unico operone bicistronico. E' un molecola di mRNA particolarmente

instabile quando non interagisce con un asRNA che è Galy che è trascritto nella porzione non codificante delle

due orf ( sul filamento opposto ). In seguito all'appaiamento, la DNAsi 3 taglia nel punto dell'appaiqmento

creando due frammenti mRNA più corti che sono pià stabili rispetto al trascritto bicistronico. Abbiamo la

stabilizzazione delle due porzioni codificanti. Una possibile spiegazione è che vengono elimanti dei

determinanti di stabilità, che se presenti potrebbero attirare delle RNAsi cellulari e causare la degradazione del

trascritto bicistronico. Invece cosi vengono tolti di mezzo.

Ancora un esempio è dato da un asRNA di 3.5 kb , che. Antisenso rispetto a una porzione lunga del genoma

che comprende diverse porzioni codificanti e quindi si genere una porzione senso-antisenso lunghissima che

non può più essere riconosciuta dalla RNAasi E ( che è specifica per le sRNA ).

Blocco della traduzione

In questo caso, viene trascritto un asRNA che si appaia alla porzione dell'mRNA che contiene le regioni

improntati per l'inizio della traduzione e posso avere una modulazione negativa dell'inizio della traduzione.

Anche in questo caso, un appaiamento senso-antisenso, può avere un effetto sulla traducibilità di quel

processo.

Esempio in S. Aureus. In un certo locus abbiamo una sequenza codificante Spra1 e sul filamento opposto

abbiamo la trascrizione di un asRNA che si sovrappone al senso per una porzione 35 nt a livello del 5'-UTR.

Si è visto che la porzione del 5' dell'asRNA non si sovrappone al 3' del senso ma al 5' dell' mRNA! Questa

ultima contiene la Shine-Galdon e lo start codon della traduzione e si ha una regolazione negativa della

traduzione ( agisce come un trans-econded RNA, perchè non si appaia alla regione di sovrapposizione ossia 5'

asRNA con 3'-mRNA ).

Teoria dell'Excludone

Studiato su Lysteria.

Si è visto che in diversi esempi in questo genoma si ritrovavano da una parte sul rimanete il promotore che

guida la trascrizione dell'mRNA arfD e sull'altro filamento c'è un trascritto tricistronico che non è

assolutamente sovrapposto all'altro ( arfC,B e A ). Ma ha notato anche un lungo asRNA che possiede una

lunghissima regione 5' non tradotta che potrebbe funzionare da antisenso sul filamento contente arfD.

Si vede che arfC,b e A hanno come prodotti proteine che hanno effetto opposto a arfD e quindi questi lunghi

asRNA potrebbero servire a regolare l'espressione di questi geni che hanno funzioni opposte, da una parte

interferendo con il filamento senso e dall'altro aumentando le copie di mRNA di arfC,B e A, perchè forniscono

più materiale (mRNA codificanti).

Esempi:

• promotore, che trascrive un operone tetracistronico e questi elementi codificano per effettori del flagello. Sul

filamento opposto c'è un promotore che contiene un repressore dei geni flagellarsi e anche un promotore che

da origine a un lsRNA ( come prima su ) che è anche antisenso al filamento contenente l'operone

tetracistronico. Praticamente da una parte va a potenziare la trascrizone dell'operone repressore e ad

abbassare quello del tetracistronico

• Stessa cosa per un promotore codificante per una permeasi, invece sul filamento opposto un canale di

export. E anche in questo caso un lsRNA che da una parte va a potenziare la trascrizone di uno (perchè

fornisce materialmente molto più trascritto ) , dall'altro va a bloccare quello sul filamento opposto.

Il trascritto del verde e del viola ( long RNA ) si sommano e danno più trascritto, mentre sull'altro filamento , il

viola funziona da anti senso e ne blocca la trascrizione.

• è possibile fare RNA-sequencing strand specifici

• Tiling-assays: microarray ad alta risoluzione, che si possono sfruttare nuleofili su un chip , tutti sovrapposti,

è possibile sapere anche il filamento di provenienza

con queste tecniche si è visto che la trascrizione su filamenti antisenso è più abbondante di quel che si pensava.

In E. Pylori , il 46% delle proteine ha un trascritto anti-senso.

Identificazione del trascrittoma anti-senso su e. coli. Usando un anticorpo per riconoscere asRNA lungo

almeno 40 pb. E hanno usato questo per fare un immunoprecipitazione.

Si è fatto questa IP in un ceppo wt e un ceppo mutato RNAsi III ( la quale tende a tagliare dsRNA ) per avere

molto piu trascritto dsRNA.

( vedi registrazione: per il controllo che hanno fatto per evitare la formazione di artefatti: in seguito alla

lisi cellulare, gli RNA si liberano in soluzione e e ci potreebbe essere un appaiamento POST-Cellulare. Ma

come siamo sicuri che avvenga di sicuro in vivo? In un campionato e hanno aggiunto separatamente due RNA

artificiali, mentre nel campione in parallalelo hanno messo due molecole di RNA, le hanno scaldate e poi

abbassate la temperatura gradualmente, Uesto da modo alle molecole di diffondere e appaiarsi ) E inseguendo

l'IP sia in un campione che in un altro ( dove si è promosso l'appaiamento e dove no ). E si vede che nel

campione due , dove gli RNA li hanno già messi hanno un segnale elevatissimo)

Cis e Trans-ecoded fanno riferimento al locus genomico dal quale vengono trascritti.

sRNA trans-encoded

Vengono trascritti a partire da promotori dedicati e l'intero gene è localizzato in un locus diverso del genoma

rispetto alla localizzazione del o dei target.

La molecola di RNA prodotta non va ad agire sul filamento opposto ma va in giro a riconoscere e legare

altri mRNA che hanno una sequenza parzialmente complementare, modulando l'espressione genetica.

Caratteristiche generali:

• sono limitatamente complementari alla sequenza di RNA target ( non sono perfettamente complementari

come i cis-encoded )

• hanno quasi sempre un effetto negativo sulla regolazione del target, e ci sono pochissimi esempi di un

effetto regolatorio positivo

• Non c'è correlazione tra localizzazione del genoma e target gene ( non è più semplice come nei cis dove

basta vedere cosa c'è sul filamento opposto! )

• spesso un singolo sRNA ha più targets

• agiscono sulla stabilità del trascritto e sulla sua traduzione, non ci sono tutti quei meccanismi a livello

trascrizionale come i cis-encoded

• La maggior parte dei trans-encoded sRNAs sono sintetizzati in specifiche condizioni di crescita ( anche

molti cis-encoded RNA sono soggetti a una stretta regolazione )

Meccanismi di regolazione

I meccanismi sono post trascrizionali, e quasi sempre hanno un effetto negativo.

Esempio un gene che codifica per un ORF e su un altra parte del genoma un trascritto regolativo che va ad

agire negativamente sulla traduzione.

L'asRNA andrebbe a mascherare l'RBS.

L'asRNA potrebbe degradare l'mRNA target, perchè crea una perdita di stabilizzazione dell'mRNA.

Effetto positivo, in questo caso l'RNA target ha una certa struttura al 5' che lo rende poco traducibile

( questo ricorda i cis-agenti), ma qui non avviene un cambiamento strutturale guidato da un segnale esterno,

ma dipende dall'interazione con questo RNA regolativo che smaschera la RBS.

In queste regolazioni interviene una proteina detta Hfq, è di 11kDA che si assembla a formare un anello

esamerico che ricorda una ciambella. Ricordo le proteine SM-like coinvolte nello splicing.

Questa proteina si è vista essere essenziale nella regolazione mediata da sRNA trans-encoded in molti

microrganismi, ma sono stati trovati anche microrganismi che non hanno Hfq ma nonostante questo hanno

questo tipo di regolazione.

Si sa che Hfq:

• facilita l'interazione tra Target e DNA regolato. Questa proteina che è una RNA chaperone favorisce

l'interazione.

• rimodella struttura secondarie RNA, questi trans-encoded hanno come altra caratteristica quella di

possedere strutture secondarie particolari

• Funziona come piattaforma per scansionare appaiamenti tra RNA e sRNA

• Protegge RNA dalla degradazione da parte di RNAasi cellulari

• Recluta il macchinario di degradazione attraverso un RNAasi particolare, che è l'RNAsE

Un esempio di questi trans-econded è sgRS: è un RNA regolativo sintetizzato in risposta all'accumulo

intracellulare di Glucosio-6-Fosfato (GSP). Risponde allo stress di zuccheri fosfati. Quando la cellula

incamera glucosio, questo è fosforilato a G6P e deve essere elaborato attraverso la glicolisi e utilizzato per

produrre energia, se, se ne accumula troppo , si innescano delle reazioni tossiche per cui la cellula smette di

crescere.

C'è un regolatore trascrizionale SgrR, che in seguoto alla percezione di accumulo di GSP, attiva la

trascrizione di SgrS. Cosa succede? SgRS si associa alla RNA chaperon HfQ ( stabilizza SgRS ), ed è

presente anche un'altra proteina che è la RNAsi E, si forma un complesso ribonucleopropteico, che viene

portato sul target tramite l'asRNA che riconosce il target parzialmente complementare. Chi è questo target?

PtsG, codifica per un trasportatore del glucosio. Quindi se si accumula G6P, la prima cosa che fa la cellula è

inattivare i trasportatori di glucosio 6 fosfato.

Come avviene il silenziamento di questo trascritto: l'appaiamento tra sgrS e l'mMRA di PtsG, avviene in

corrispondenza del 5'UTR dell'mRNA e così si ha un ingombro sterico a livello delle sequenze importanti

per la traduzione e quindi un blocco o diminuzione della tradizione.

Esperimenti che dimostrano come si forma il complesso sopradetto, come avviene il riconoscimento

sRNA-ptSg e il meccanismo di downregolazione.

Primo esperimenti:

Si utilizzano RNA estratti da diversi ceppi di Coli. Il primo ceppo è RNAsiE con un flag (FLAG), e poi

hanno usato una RNAsiE che è mutante per HfQ, invece fatto un altro ceppo in cui c'è RNAsiE tronca.

Questo perchè già c'erano dati che dicevano che una regione C-Terminale della RNAsiE era coinvolta nella

formazione di questo complesso. Poi c'è un altro ceppo cresciuto in terreno normale oppure in un terreno in

cui si inotroduce una moleola che induce stressa da G6P ( alpha-methyl-glucoside, uno zucchero non

metabolizzabile ). Usando probe specifici per PtsG, sia che sgRs, vanno a vedere i livelli di RNA nei diversi

campioni:

• wt: in assenza di stress, non c'è sgRS ( perchè si accumula solo in stresso da G6P ) e ptSg è espresso

normalmente

• Stress: invece aumenta SgrS ma viene inibito il canale del glucosio, PtsG, come ci si aspettava.

• Cosa succede in un ceppo RNasi E wt ma HfQ mutato:

◦ Condizioni normali: quello osservato nel wt

◦ Condizioni di stress: si accumula un pò di sgRs, ma molto poco rispetto al wt. Non. Non C'è HfQ

( che abbiamo detto stabilizzare l'RNA regolativo ), e quindi non si accumula molto. E non si ha la

downregolazione di PtSg

• Cosa succede se HfQ è normale, ma RNAsi deleta per la regione C terminale:

◦ In condizioni normali: ho quello che osservo nel wt

◦ In condizioni di stress: non si ha la downregolazione di PtSg, confermando la necessità della regione

terminale della C-terminale.

Fanno Co-Ip

Come hanno fatto questa Co-Ip, qui torna utile la RNAsiE con il FLAG, si può così immunoprecipitare

RNAsiE senza anticorpo contro RNAsi E. Immunprecipitano e poi caricano tutto su SDS-Page e fanno

western blot per vedere cosa si è tirata dietro la RNAsiE. Volevano dimostrare ad esempio l'interazione tra

RNAsiE e HfQ.

• Ub (unbound): tutto quello che non si lega in colonna, che non è riconosciuto dall'anticorpo, scivolerà

via. E si vede che nell'unbound ovviamente non trovo RNAsi E, perchè l'RNAsi è si è legata l'aa anti flag

• Bound: ritrovo la RNAsiE con FLAG

• Vedono poi che coimmunoprecipitano RNAsi E con HfQ

• Controllo negativo: usano anticorpo contro CRP e se lo ritrovano praticamente all'altezza dell'unbound e

quindi è un controllo negativo

• Enolasi: è una proteina che si trova spesso associata all'RNAsi E e assieme ad altre proteine va a formare

il degradosoma batterico

Cosa succede se rifaccio l'esperimento con la RNAsiE deleta:

• frazione immunoprecipitata: non immunoprecipito nè RNAsiE ( perchè manca il C terminale col Flag ),

nè HfQ. Confermando che si associ al C-terminale.

Viene fatto, dopo la Co-Ip, sia il western blot per vedere la composizione proteica ma anche in Northern

Blot , per vedere se l'RNA regolativo riesce ad associarsi ( con la Co-Ip è possibile sperare RNA e proteine

in due frazioni e vedere sia Western che Nothern ).

Ritrovano che l'RNA regolativo SgRs si associ a RNAsi E e HfQ.

Se usano il ceppo deleto per immunoprecipitare in northern blot, non riescono a vedere più HfQ nè SgrS. Se

usano un ceppo deleto per HfQ, vedono RNasi E e non vedono più nè HfQ nè SgrS. Questo significa che

l'RNA regolativo si associ a RNAsiE tramite HfQ.

Ultimo esperimento:

Fanno un esperimento di Co-Ip sul ceppo RNAsiE wt seguito da Northern Blot. Dividono il campione in 2,

in cui usano una DNAsi/RNAsi ( Nucleasi di Micrococco, la stessa utilizzata per identificare gli istoni da

parte di Roeder ).

Senza Nucleasi: hanno RNasi, HfQ, Enolasi, RNA regolativo

Con Nucleasi: ho RNAsiE, e continuo ad avere enolasi e HFQ, ma non RNA regolativo. Questo nci dice che

HFQ si lega direttamente a RNAsi E, non è mediata, l'interazione, dall'RNA regolativo.

E questo ha portato alla stesura di un modello, in cui in seguito all'accumulo di G6P, si innesca questa

regolazione, si accumula SgRS che si associa a HfQ, che può interagire con la C-terminale di RNAsiE e

questo complesso viene portato sul target grazie al riconoscimento tra SgrS e il target. In questo complesso

sono comprese anche altre proteine che fanno parte di un complesso di proteine spesso coinvolte nel

degradosoma.

Come avvine eil riconoscimento tra RNA regolativo e target. Una caratteristica cruciale è la limitata

complementarietà. Questo ci sta, perchè un RNA regolativo deve avere una moltitudine di target.

Schema interazione mRNA ptsG e RNA regolativo, si vede una parziale complementarietà. Uno studio fine

è stato fatto che ha dimostrato gli appaiamenti cruciali per un appaiamento specific sono localizzati solo in

posizione 178-176.

Nel modello iniziale abbiamo visto come si forma il complesso, come avviene l'appaiamento e ora vediamo

come avveine la regolazione. Anche in assenza di HfQ e di RNAsiE che interagiscono, ho comunque il

blocco della traduzione, mentre la degradazione non è necessaria affinchè ci sia l'impedimento della

espressione do quel gene. Quindi vediamo che in un ceppo con RNAsiE wt, abbiamo sia blocco della

traduzione che degradazione del tras ritto, mentre in un ceppo con RNAsiE tronca anche se non c'è

degradazione del trascritto ho comunque blocco della traduzione di PtsSG.

Il meccanismo principale è il blocco della traduzione, l'appaiamento avviene proprio sulla Shine-Dalgarno

( a livello del 5'-UTR).

Quindi sicuramente abbiamo un blocco della traduzione, la degradazione dell'RNA target è necessaria per

una down-regolazione ( permanente ) ma basta comunque sequestrare la shine-dalgarno. E' possibile fare

un western-blot e vedo il trascritto proteico e vedo che sia in presenza di RNAsiEwt che tronca, non

comunque proteico, quindi la RNAsiE non è essenziale per il blocco della traduzione

Si prende un ceppo di coli con RNAsi E wt e uno con RNAsi E tronca e poi si induce la regolazione da

parte di quell'asRNA, inducendo lo stress da glucosio 6 p. In presenza di RNAsi E non ho più il trascritto, in

assenza di della porzione carbossiterminale di RNAsi E, il trascritto non è più degradato ma comunque la

traduzione viene bloccata.

Quindi l'RNA regolativo SrgS agisce in primis inibendo la traduzione dell'mRNA di ptsG, la degradazione

da parte di RNAsi assicurerebbe il gene silencing al 100%.

Altro esempio

Un RNA regolatorio che colpisce target funzionalmente correlati. Abbiamo l'RNA Rhyb la cui trascrizione è

regolata da Fur ( attivo o meno, in presenza/assenza di Fe ). In presenza di Fe , l'oloproteina reprime la

trascrizione di RhyB. In carenza di ferro, si ha derepressione di RhyB che si accumula e si associa a Hfq

( una RNA chaperon ) e va a contattare diversi mRNA che hanno funzioni correlate ( tutte proteine che

usano Fe come cofattore ).

SgrS abbiamo detto agire a stress di accumulo di G6P che causa una inibizione della crescita e quindi la

cellula deve far fronte a questa traduzione. Una strategia sarebbe quella di SgrS sarebbe quello di bloccare

un canale specifico del glucosio ( ptsG ). Ma esistono altri possibili target? Abbiamo detto ad esempio

RhyB. Per questo sono stati fatti altri lavori in cui tramite micro array si vanno a cercare altri target di Sgrs

confrontando un ceppo con SgrS KO e uno con SgrS WT. Ritrovano, in condizioni di stress, ptsG nel

mutante ( se manca SgRS è ovvio che ptsG non sara downregulato ).

Trovano un altro candiadato che è mnXYZ, un mRNA tricistonico. L'insieme di queste proteine forma un

trasportatore di zuccheri broad-range, in particolare manX è la componente citosolica mentre Y e Z è iuna

componente di membrana.

Quindi visto che ptsG è un trasportatore di zuccheri e manXYZ anche, allora forte SgrS potrebbe agire

anche su quest ultimo in modo diretto.

Esperimenti per dimostrare la regolazione post-traduzionale di manXYZ da parte di SgrS-

Costruiscono un sistema reporter in cui fondono ManX con lacZ.

Come è fatto:

• promotore costitutivo in modo da escludere ogni possibile regolazione trascrizionale

• Si usa il 5'-UTR wt di manX, che va dall'inizio di trascrizione fino all'inizo del 5' UTR, poi manX e infine

lacZ ( in frame )

• Costruiscono un secondo reporter che peò invece di manX avrà ptsG

Questi costrutti reporter sono messi in cupe wt di Coli o in un ceppo mutante per l'RNA regolativo SgrS.

Esperimento:

• in assenza di stress: non si ha riduzione del segnale di lacz a valle di manX, sia nel wt che nel mutante.

Perch non c'è nessun tipo di stress.

• In presenza di stess: nel wt diminuisce il segnale di lacz a valle di manX, nel mutante SgrS non

diminuisce

Esperimento due:

• Controllo in cui manca SgrS e al posto suo c'è un vettore vuoto, e quindi non vedo abbassamento di

manX

• Poi SgrS viene fornito in transì, attraverso plasmide inducibile, e si vede un abbassamento del segnale. E

il fatto che si accumuli SgRs e si abbassi il segnale dei due trasportatori, significa che SgrS è sufficiente

per la regolazione della tradizione di manZ in assenza di altri fattori stress indicibili. Mi conferma che la

regolazione è proprio dovuta a SgrS.

Dopo quello detto la lezione 15, si fa un altro saggio per vedere se la regolazione della traduzione di manX

da parte di SgrS influenza la stabilità del trascrizione manXYZ. Si mette un promotore costitutivo a monte,

per sganciarci da effetti trascrizionali, poi si mette tutto l'operone sia il 5'-UTR, il promotore che l'ORF

dell'intero operone tricistonico. Si vede quanto è stabile, attraverso un northern blot.

Analizzano prima il costrutto WT con SgrS wt, poi in un contesto in cui è mutato SgRs e si verifica in

condizioni normai che di stress. Abbiamo un decadimento di manY ( nella situazione wt ), questo perchè lo

stress induce la repressione del canale codificato dall'operone tricistoncio.

In assenza di SgrS, in condizioni di stress, non si ha un decadimento di manY. Viene notata anche una banda

più piccola di 1.8kDa che corrisponde al doppietta menYZ, la vanno a sequenziare e trovano dei frammenti

( marcati al 5' ) e sono tutti monofosafto, questo vuol dire che sono prodotti di degradazione derivati dal

processamento del trascritto completo. Vedono anche la particolare composizione in basi ricca di U, che

sono le regioni predilette dall'RNAsi E. Questi dati sembrano suggerire che SgrS stimola la degradazione di

manXYZ.

Tramite esperimenti si vede che l'appaiamento di SgrS-manX è confinato alla regione di inizio di traduzione

(5'-UTR). Per testare , riducono la 5'-UTR wild type, in modo da trovare quale era la porzione che serve a

contattare la RNAsiE. Quindi l'area di appaiamento è intorno alla RBS.

Viene poi mostrato l'aapaimnto tra ptsG e SgRs( target già noto = con SgrS e si vede che l'appaiamento

casca proprio sopra la RBS. L'appaiamento avviene a valle della RBS, già dentro la ORF.

Si vede che SgrS usa uno stretch di nucleotidi sia per riconsocere ptsG che ManX.

Per dimostrare l'appaiamento fanno una RNAse foot-printing, RNA-RNA.

Si usano agenti che taglino preferenzialmente RNA a singolo filamento, in questo modo si vedrà la regione

coinvolta nell'appaiamento.

• pannello C:

◦ Interazione di manx ( marcato )e sghrS ( non marcato )

T1: reazione per generare un ladder di marcatura, in particolare l'RNAsiT1 taglia solo le G,

‣ permette di orientarci e sapere dove avviene il punto di soluzione

◦ RNA posto in una soluzione alcalina: in modo he l DNA si digerisca in tutti i punti

◦ ManX da solo, soggetto a taglio con PbAc ( piombo acetato ). Taglia più velocemente asRNA che

dsDNA. Vedo il pattern di taglio che mi aspetto. Da solo ha un pattern di taglio va non spietato.

◦ Aggiungo SgrS non marcato, quello che succede ho molto più taglio

◦ Aggiungo manX e HfQ, risultati come manX da solo

◦ Mettono tutto assieme, ho un aumento della regione di taglio.

• PannelloC2 ( marco SgrS per vedere dove si lega)

◦ SgrS da solo, ha una forte stabilità, perchè è altamente strutturato in soluzione

◦ SgrS e ManX(non marcato), ho un aumento ella regione di protezione

• PannelloC3:

◦ Marco PtSG, conferma la situazione di appaiamento

◦ ANche in questo caso vedono che è confermato questo tipo di appaiamento. In vitro queste molecole

possono interagire e sanno anche dove.

Dimostrazione generica della cosa

Fanno saggi con reporter LacZ, in questo caso in un background mutante epr SgRs, SgrS viene fornito con

un plasmitde , wt. Poi viene fornito anche minutanti di sgRS, con doppia mutazione per appaiamenti come

PtsF. Si è visto che SgrS ha delle G necessarie per l'appaiamento con PtsG ( che cade all'interno della RBS ),

infatti è questo il mutante che usano. Poi ne usano un altro che invece impedisce l'interazione con SgRS

• uso SgRs wt:

• SgrS1: da fastidio all'appaimento con PtsG, però manX scende comunque e

• SgrS6: ha mutazioni per l'appaiamento con manX e infatti viene meno down regulato

• Rifanno il contrario per PtsG, e in questo caso se uso il mutante che non si appaia a manX, PtsG scende.

• manxC143T: è una mutazione compensatoria, costruiscono un reporter che ha la C mutata che torna ad

appaiarsi con la G. Cioè ristabiliscono il sito di Binding per SgRS a manX! La mutazione compensatoria

porta a una downregolazione di manX.

La repressione della traduzione di manXYZ, è necessaria la degradazione del trascritto? Si era già visto che

con PtsG non fosse necessito.

Usano i costrutti già visti, un ceppo sgrS- e usano background WT oppure con RNAsiE mutata per la

porzione C-terminale.

Si vede che sia con RNAsiE wt che mutata, si ha la downregolazione senza la degradazione del trascritto

( perchè la RNAsiE è mutata! ) e lo stesso vale sia per ptsG che per manX.

Come è fatto l'operone manXYZ

RBS-manX-62nt-RBS-Y-3nt-Z

La regione intergenica di 62nt contiene l'RBAs per manYZ e quindi la traduzione di manX e manYZ è

indipendente. Mentre la distanza tra manY e Z è solo di 3 nucleotidi e non c'è nessuna RBS tra quei 3 nt. E

quindi la traduzione di questi ultimi è accoppiata.

Quindi come avviene la regolazione della seconda parte ? ossia di YZ. Si sa che l'SgRs si lega vicino alla

prima RBS portando alla degradazione all'altezza di manX e indirettamente anche di YZ. QUesta è l'ipotesi

più semplice.

Per dimostrare questo utilizzano degli altri costrutti reporter. Uno wt per il 5'UTR-ha tutto manZ-il primo

pezzo della porzione manY e il reporter lacZ.

Poi fanno un costrutto che contiene anche Z e poi lacZ. Verificano che entrambi i costrutti funzionano,

perchè vengono down regolati da SgrS. Però qui siamo in costrutti wt, in cui il 5'-UTR di manX funziona

ancora.

Quindi usano un ceppo wt e un ceppo con RNAsiE inattivata. Nel Wt vediamo la stessa cosa di prima, cosa

succede in un background con RNAsi mutata? Si ha o stesso risultato. Quindi non è più spiegabile per

quella semplice ipotesi di prima? Perchè YZ non richiedono RNAsiE, nonostante SgrS si leghi più a monte.

Quindi SgrS dovrebbe avere anche un effetto sulla traducibilità. QUello che fanno, è un ceppo in cui

bloccano il sito di binding di SgrS su manX e vedono che manY viene comunque downregolato! Quindi

manY e X sono indipenendenti.

Quindi altra ipotesi, sgrS, si appaia anche nella regione di 62nt tra X e YZ, in questo modo ho due eventi

indipendenti di regolazione a opera dello stesso RNA regolativo.

Usano quindi dei costrutti che contendano il promotore costituitvo-la regione intergentica di 62nt-manY-

lacZ.

Si vede che :

• nel wt : ho down Regolazione

• Nella regione con 62nt: ho downregolazione

• Se comincio a tagliare un po di regioni di quelle contenute nella 62: non ho più downregolazione e quindi

in questa regione deve esserci il punto di binding.

Trovano il sito di binding, un allineamento abbastanza imperfetto , intervallato da mismatch. Si evidenziano

le regioni di appaiamento improntati e si vede che ci sono due regioni di appaiamento una per ptsG e una

pèer manX, che sono un pò sovrapposte.

Lo dimostrano attraverso RNA-RNA foot printing.

Usano vari costrutti reporter (vedi slides ) che sono quelli con le regioni di appaiamento tra SgrS e ManX,

poi uno che ha la regione intergenica tra X e Y e poi una con una regione intergenica mutata.

Fanno un altro esperimento in cui usano sgrS wt e mutati per diversi binding site ( S1, S24 che non possono

legarsi a manY, ma possono con manX ). In questo caso si vede che ho la downregolazione sia nel wt che

nei mutati, eprchè interferisco con il binding su manY e non su manX, invece se interferisco sul binding su

manX ma non su many ho perdita di downregolazione. Se usano una mutazione compensatoria, viene

ristabilita la downregolazione.Si vede che l'appaiamento tra SgrS e ManY è parecchio a monte rispetto alla

ShienDalgamdo, avviene tra -45 e -30. Quindi qui ci spostiamo sempre più a monte.

Abbiamo detto che ci sono due punti di appaiamento per sgrS, cosa succede se si lega su entrambi o solo su

uno dei due? Vedono come cambia la crescita in base al terreno che usano terreno non stressante: vedono

che in tutti i casi la cellula cresce tranquillamente

Terreno stressante:

◦ Ceppo wt: cresce tranquillamente

◦ Se elimino sgRs: la cellula non cresce

◦ Muto manXYZ, ma muto sgRS: la cellula ce la fa, perchè tanto manca il traposrtatore che

porterebbe troppo zucchero inducendo lo stress

◦ Mutante sgrS uno dei due Binding site: ho un fenotipo intermedio. Il legame di sgRS a entrambi i

siti, mi potenzia la regolazione

◦ Stessa cosa se muto il gene manXYZ, mutando il binding site vicino manY: stesso fenotipo

intermedio

Modello, la tradizione di manZ, dipende da manY. SgrS si lega a regioni molto a monte, in due punti

diversi, rispetto alla RBS.

abbiamo detto che SgrS si lega in modo assolutamente canonico alla RBS di PtsG, mentre su manX, SgrS

si lega da una parte vicino alla regione codificante e dall'altra parte a monte dell'RBS.

Come fa? Teorie :

• si crea un ingombro sterico

• Vengono bloccate delle translation enhancer sequences

sRNA con più di una funzione

Esempio: sgrS. Si è notato che sgrS ha anche un sito di inzio della traduzione! E cosa fa la proteina? In un

qualche modo va a bloccare il trasportatore di membrana codificato da ptsG, quindi lo stimolo ambientale

porta a uno stress che innesca sgRS ce da una porte downregola ptsG e manX, questo RNA regolativo viene

anche tradotto che va in qualche modo va a bloccare la proteina già prodotta da ptsG. Ha una dual function.

Abbiamo detto che gli RNA regolativi, funzionano solitamente con effetto negativo. Ma si è visto che sgrS è

in grado di andare anche a regolare positivamente YigL. Il G6P si accumula, si ha stress, e si innescano i

processi negativi già visti ( il regolatore trascrizionale sgrR che attiva sgrS).

Si vede , però anche, che sgrS insieme a Hfq blocca la degradazione mediata da RNAsiE della seconda parte

di un operone bicistronico portando alla traduzione di YigL , una fosfatasi, che rimuove il grippo fosfato da

G6p, por

I CRISPR-RNA

Non sono degli RNA regolatori veri e proprio, ma al giorno d'oggi sono ampiamente sfruttati in ambito di

ricerca anche come modulatori della espressione genica. Nnn solo come tool di genome editing negli

eucarioti ma anche nei Procarioti per modulare l'espressione genica in modo molto specifico.

Ci sono un numero elevatissimo di possibili applicazioni di CRISPR-RNA.

La caratterizzazione nei batteri

Per iniziare il discorso dei CRISPR-RNA, dobbiamo introdurre il trasferimento genetico orizzontale

( trasferimento dell'informazione tra diverse specie, correlate o non correlate. Non è trasmesso alla progenie,

non è verticale). L'acquisizione di geni che garantiscono resistenza, non è solo un processo negativo, ma

nell'ottica dell'evoluzione di un genoma, è una caratteristica estremamente importante. Basti pensare

all'antibiotico resistenza che può essere acquisita/sviluppata da un batterio. Sono tratti spesso trasmessi

orizzontalmente perhè conferiscono un vantaggio selettivo.

Quali sono i meccanismi:

• trasformazione: quando si parla di up take di DNA dall'ambiente, DNA esogeno e può intrigarsi o

acquisito

• Trasferimento da una cella donatrice a una ricevente, attraverso un plasmide coniugativo, una parte del

materiale può trasferirsi alla cellula ricevente

• La....trasferimento di materiale genetico, mediata da fagi. I fagi passando da una cellula all'altra possono

portarsi dietro il DNA del precedente dell'ospite.

Solitamente questi processi sono negativi per la cellula, però una parte di questi contribuiscono un

vantaggio selettivo. Quali sono, e qui si inserisc CRISPR, i meccanismi che i batteri e archea hanno

sviluppato per evitate questo trasferimento genetico orizzontale.

In particolare vediamo rappresentata l'iniezione fagica di una cellula batterica. Quindi tutti i sistemi presenti

nell'infezione fagica:

• blocco dell'assorbimento/attacco della particella fagica. Visto che il riconoscimento avviene tramite

recettori specifici, i fagi hanno uno spettro molto ristretto di recettori per infettare un numero di ospiti

molto ristretto. Quali sono i meccanismi quindi, mascherare questi recettori oppure mutazioni di questi

recettori per poter non essere più riconosciute dalla particella fagica.

• Blocco del trasferimento di DNA all'interno della cellula, sempre attraverso proteine

• Sistemi di restrizione e modificazione (?): ovvero gli enzimi di restrizione, altro non sono che proteine

prese da batteri che posseggono questi sistemi. Sono enzimi che hanno domini separati o sono più domini

diversi di una unica proteina, ma hanno sia un dominio in grado di digerire il DNA riconoscendo una

specifica sequenza, e hanno anche a un dominio che modifica il DNA batterico ( ad esempio

metilazione ). Cosi che venga digerito solo quello. Non-self. Questi enzimi di restrizione, sono proteine

che riconoscono sequenze palindromiche, contattano queste sequenze e le tagliano in modo pari o

sfalsato. E questi sono di normale utilizzo in laboratorio. Ad esempio EcoR1 (le prime tre lettere dicono

da dove provenga un enzima di restrizione )

• Penultimo sistema di difesa: aborting infection. Quello che accade è che quando viene percepita

l'infezione, la cellula attiva dei sistemi che porta alla morte di se stessa in modo che non ci sia la

progressione di questo fago. Solitamente sono proteasi o proteine di questo tipo che digeriscono proteine

e enzimi chiavi della cellula stessa.

• Ultimo sistema: CRISPR, sistema genetico di interferenza per difendersi dall'infezione di DNA esogeno.

Contrasta almeno due fasi del trasferimento genetico orizzontale quali coniugazione e anche trascrzione.

Il nome CRISPR si riferisce alla struttura del locus CRISPR. La storia di CRISPR è incredibile, fino al 2005

non si sapeva che roba fosse. Dal 2006, in poi, è diventato d'uso comune come gli enzimi di restrizione. E'

un sistema che è stato individuato e capito e nel giro di 10 anni si è diffuso.

Questa venne scoperta per caso nel 1987, quando si tentava di clonare un gene e fu notata per la prima volta

una sequenza da una struttura ripetuta di 29nt intervallata da sequenze uniche.

Nel 2002, dal confronto di tantissime sequenze genomiche è stato coniato il termine CRISPR, che fa

riferimento alla particolare sequenza del locus.

Abbiamo una ripetizione di sequenze ripetute, sempre identiche, intervallate da sequenze uniche dette

spacer. Poi nel locus CRISPR abbiamo una leader sequence al 5' e una serie di geni conservati detti Cas

Genes, che codificato per Cas Protein. Solo nel 2005, è stata caratterizzata la corrispondenza tra la sequenza

degli spacer e la sequenza appartenete a fagi e plasmidi. QUindi le sequenze improntati erano non le

sequenze ripetuti, ma gli spacer che corrispondevano perfettamente a sequenze di plasmidi e fagi. E' stata

proposto il ruolo di CRISPR nella difesa da invasione di DNA esogeno, nel 2006 c'è una dimostrazione

formale di questo processo.

Lavoro in S. Thermophilus. Un batterio può contenere più loci CRISPR al suo interno ro, thermophiluys ne

ha 4. Hanno una struttura comunque simili, hanno una serie di Cas Proteins e l'array vero e proprio CRISPR

( le repeat intervallate da spacer ). All'estremità 5' abbiamo la leader sequence. Possono essere diverse le

Cas proteins contenute in ciascuno dei loci CRISPR, così come il numero degli spacer e dei repeat può

essere molto diverso.

Caratteristiche:

• abbiamo un set di Cas Genes, che possono essere a monte di CRISPR o in mezzo di un sett di geni

• Abbiamo una sequenza leader, che può essere lunga da 20pba 100 kb

• Abbiamo l'array vero e proprio che inizia sempre con una sequenza ripetuta e poi ci sono gli spacer. Le

sequenze ripetute possono essere pochissime. Il numero di repeat può essere molto variabile, da 1-2 fino a

588. Così come ci sono organismi che , come ( vedi slide ), che hanno 18 locus CRISPR ( e rappresenta

l'1% del suo genoma )

• Essendo un sistema di difesa, è soggetto spesso a trasferimento orizzontale. Batteri completamente

diversi possono avere lo stesso identico locus CRISPR, e questo è stato acquisito per fenomeni di

trasferimento orizzzontale.

Articolo del 2007, dimostra come CRISPR sia un sistema immunitario, adattivo e genetico.

Il sistema che viene usato è lo S. Thermophilus e in particolare si sono concentrati su uno dei 4 loci

CRISPR, già questo locus era stato caratterizzato dal punto di vista della sequenza e quindi su come fosse

organizzato. Dalla Cas proteins presenti all'array vero e proprio ( 32 spacer eqispaziati ).

Avendo già un'idea di come potrebbe funzionare questo sistema qua, hanno messo su un sistema ospite

patogeno, con un paio di fagi 858 e 272, ai quali lo S thermophilus è estremamente sensibile. Vanno alla

ricerca di cloni batterici in grado di resistere a questi fagi, hanno anche grafica to questa cosa qui e si vede

che il wild type è sensibile a 858 e a 275. Questo valore viene settato come valore massimo di infezione.

Quindi hanno continuato a infettare S thermophilus e hanno isolato e sequenziato le colonie che resistevano

all'infezione. Quello che trovano:

• un batterio che continua a essere sensibile a un fago 275 ma non a quello 858, andando a vedere il locus

CRISPR quello che vedono è che rispetto al locus crispr wild type, a monte del primo spacer, a valle della

leader sequence si sono inserite delle sequenze nuove intervallate da spacer. QUindi in seguoto a questo

esperimento, si sviluppavano cloni batterici resistenti e parallelamente si avevano modificazioni del

genoma con acquisizione di nuovi spacer nei loci spacer e questa acquisizione non avviene casualmente

ma avviene sempre a valle della sequenza leader, mai in fondo o in mezzo. L'acquisizione degli spacer è

pilotata, quindi l'array CRISPR evolve, si adatta. Cresce sempre al 5', perchè nuovi spacer vengono

incorporati al 5' dell'array. Un array di questo tipo non può crescere all'infinito. La perdita di spacer,

avviene sempre all'estremità opposta da dove viene aggiunta. Se l'aggiunta avviene sempre in questo

modo, l'ordine degli spacer hanno un ordine cronologico che aumenta dal 5' al 3', a quindi un senso che

vengano persi quelli al 3', in quanto corrispondenti a sequenze che corrispondono a invasori che il

batterio ha incontrato molto molto tempo addietro.

• Trovano batteri che sono resistenti anche a entrambi i fagi.

• Che vedono, trovano uno spacer S3 che è identica a sequenze presente in entrambi i fasi, così da risultare

il batterio resistente a entrambi.

Addirittura, si è riuscito a fare in modo di far incorporare spacer diversi nel batterio. Accendo acquisito più

spacer, questo clone batterico, è diventato fortemente resistente all'infezione da parte di entrambi i fagi.

Questo esperimento è stato in grado di dimostrare che il contenuto in spacer è in grado di determinare la

resistenza a un determinato fago.

Se tolgo o introduco spacer, posso andare a variare la resistenza a un fago? Attraverso tecniche di

ricombinazione vanno a delegare completamente il conentuo in spacer di questo wild type +S1S2 ossia di

un batterio che precedentemente era risultato essere resistente a fago 858 perchè aveva lo spacer S1S2 e

vedono come venga ripristinata la sensibilità al fago.

Vedono inoltre anche come sia importante il contesto genetico in cui sia inserito la sequenza spacer, infatti

se inseriscono S1 e S2 più a valle rispetto a primo, vedono che nonostante ci siano gli spacer, questi siano

comunque sensibili ai fagi. Modulando il contenuto in spacer di questo array posso andare a variare la

sensibilità a un determinato fago. Alcune sequenze sono completamente identiche a entrambi ai fagi, altre

invece hanno degli spacer che differiscono per pochi nucleotidi ma nonostante ciò i batteri saranno resistenti

all'uno ma non all'altro. Questo dimostra che deve esserci una perfetta corrispondenza tra spacer e sequenza

fagica per poter garantire la resistenza. Il fago può evadere da una resistenza di questo tipo, andando a

mutare le sequenze che vengono riconosciute da CRISPR.

Altro esperimento che dimostra come la resistenza a un determinato fago è definìta dal contenuto in spacer.

Abbiamo una prima fase di immunizzazione, in cui il batterio per la prima volta si trova ad affrontare un

DNA esogeno, invasore. Queste sequenze di DNA esogene vengono riconosciute da un sistema di Cas

proteine, un gruppo di proteine che in qualche modo processano questo DN esogeno e ne deriva una corta

sequenza che è lo spacer che viene incorporato nell'array CRISPR. Questa è la prima fase di

immunizzazione che permette al batterio di acquisire nuovi spacer per una successiva infezione. Qui il DNA

invasore nuovamente penetra nella cellula, viene espresso l'intero trascritto del locus CRISPR che viene

chiamato pre-CRISPR-RNA e poi viene processato da un insieme di CAS protein, però sta di fatto che da

questo processing vengono prodotti i singoli CRISPR-RNA maturi che vanno a riconoscere il DNA invasore

per complementarietà tra spacer e sequenze da cui derivano e portano sul DNA invasore una serie di

proteine che tagliano il DNA invasore che viene degradato. QUindi CRISPR-RNA maturi fanno da guida pe

il sistema di Cas protein coinvolte nell'interference.

E qui vediamo rappresentato un appaiamento tra CRSIPR-RNA e DNA invasore.

Il CRISPR-RNA

Sul DNA invasore abbiamo una sequenza che viene chiamata proto-spacer, la sequenza complementare al

CRISPR-RNA.

Nel lavoro in cui si scopre anche la corrispondenza tra sequenze spacer presenti e resistenza a determinati

fagi, si è arrivati anche a cosa corrispondevano questi spacer ( erano ORF, promotori , ecc ). Quello che si è

notato poi è che ciò che guida o che sembra guidare l'acquisizione di un determinato tratto di genoma

invasore per farlo diventare spacer, non è tanto la sequenza stessa quanto una sequenza che si trova accanto

al proto-spacer, detta PAM.

Il complesso tra diverse Cas proteine e un CRISPR-RNA che va a riconoscere un certa sequenza, un

protospacer sul DNA invasore, che sara accanto a una sequenza PAM. C'è un sottotipo che nontargetta il

DNA invasore, ma il suo mRNA ( il sistema III ). Come fa il sistema CRISPR-Cas a distinguere tra DNA

self e DNA non self, deve essere in grado a discriminare tra se stesso e DNA invasore. Cosa gli impedirebbe

a questo CRISPR-RNA di riconoscere lo spacer del batterio? Cosa gli permette di riconsocere solo il proto-

spacer, viene giocato il ruolo chiavo dal motivo PAM. Il CRISPR-RNA è costituito dal RNA che si appaia al

proto-spacer, poi nel CRISPR-RNA vengono mantenute parti di questi repeat. Sul target DNA si ha

appaiamento tra CRISPR-RNA e protospacer, mentre non si ha appaiamento tra le repeat che si porta dietro

e sequenze vicine allo spacer. Mentre se il CRISPR-RNA si appaia con gli spacer endogeni, si appiano

anche le repeat, e questo è un segnale che dice al CRISPR-RNA che sta appiandosi a una sequenza


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in biologia molecolare e cellulare
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher antoniocarusillo93 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia Molecolare dei Procarioti e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Roncarati Davide.

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