Biologia Molecolare dei Procarioti

La trascrizione

Inizio della trascrizione

La regolazione inizia nella fase di inizio della trascrizione. La RNA polimerasi oloenzima è costituita da:

• Due subunità alpha
• Beta
• Beta'
• Elemento sigma

L'inizio della trascrizione ha più subfasi. La formazione del complesso chiuso (oloenzima + promotore, mediato dall'elemento sigma) è stabile. Qui il DNA è ancora come doppio filamento. Non c'è ancora melting a formare la bolla di trascrizione.

Si forma la bolla di trascrizione, complesso aperto, ancora più stabile, perché la separazione del DNA in due singoli filamenti stabilizza ancor di più questo complesso. Prima di passare al rilascio del promotore (promoter clearance, la RNA Polimerasi viene liberata dal promotore e avanza lungo il filamento di DNA, trascrivendo attivamente), c'è una fase di inizio abortivo. Qui vengono prodotti innumerevoli trascritti molto corti di 2-10pb. La polimerasi va avanti e indietro, ci sono diversi modelli a riguardo. Ma nessuno è stato confermato.

Il fattore sigma

Il fattore sigma è essenziale per la trascrizione, per conferire anche specificità a questo processo. In seguito alla clearance, il fattore sigma che fine fa? Vi rimane associato o viene riciclato da qualche altra polimerasi che così può iniziare la trascrizione?

Esperimento Travers & Bourders

Travers & Bourders, facendo un saggio di trascrizione in vitro, vanno a definire quello che è il pattern del fattore sigma. Fanno un saggio di trascrizione in vitro a bassissima forza ionica, perché in queste condizioni hanno visto che l'RNA Polimerasi restava bloccata in un complesso ternario: RNA Pol, trascritto nascente, sDNA.

Usano l'RNA Pol di E. Coli oloenzima + Fago T4 (DNA Templato). Usano ATP marcato con P32. Ora, la marcatura può essere al fosfato in alpha, e così vedrò marcato l'intero filamento in crescita. Oppure, poiché il fosfato in gamma viene conservato solo nel primo nucleotide aggiunto, marcando il fosfato in gamma posso marcare solo il filamento nascente. Fanno avvenire la trascrizione in condizione di bassa forza ionica, poiché in questo modo la RNA Polimerasi resta bloccata in un complesso ternario (RNA pol + Frammento in Crescita + Templato).

In questo modo ogni oloenzima è bloccato, questo serve a evitare che l'oloenzima si possa staccare e iniziare un nuovo evento di trascrizione. A questo punto aggiungo non l'oloenzima, ma solo la CORE polimerasi (senza fattore sigma). E vanno a vedere cosa succede se aggiungono quantità crescenti di RNA Pol Core. Ogni complesso può iniziare la trascrizione una sola volta. Vediamo che la core Polimerasi non può iniziare nuovi trascritti, ma quella che fa è "rubare" il fattore sigma che era della RNA pol bloccata (se l'associazione fosse stata molto forte non avrebbe potuto farlo) per poter trascrivere, infatti vedo che comunque ho un aumento di segnale del trascritto. Se così non fosse stato non avrei visto un aumento del segnale. Questo ha portato a postulare il sigma-factor-cycle.

Il modello sigma-factor-cycle

Il modello è rimasto in voga per 30 anni, poi alcune osservazioni hanno fatto pensare che fattore sigma non necessariamente si staccasse dal filamento in elongazione (quindi non era necessario che si staccasse affinché avvenisse l'elongazione). Il fatto che talvolta il fattore sigma si trovasse staccato poteva essere dovuto ai tipi aggressivi di analisi che venivano utilizzati, come la cromatografia per affinità. Nel 2001 un esperimento dimostra ciò, usando la FRET.

Esperimenti con FRET

1) Vanno a mettere al centro del fattore sigma un fluoroforo donatore e poi il DNA a monte della RNA polimerasi un fluoroforo accettore (quindi man mano che la RNA polimerasi scorre si allontana dal fluoroforo accettore). Non vedo FRET né che il fattore sigma resti associato alla RNA pol né che si stacchi. Funge da controllo, ma non ci dice nulla sullo stato di associazione del fattore sigma.

2) Questa volta mettono il fluoroforo accettore a valle di quello donatore, così che man mano che la RNA pol scorre si avvicina. Ora:

• Se fattore sigma si stacca dalla RNA polimerasi non vedo comunque FRET
• Se fattore sigma resta associato alla RNA polimerasi vedrò FRET

Conclusioni esperimento FRET

In vitro lavorano con oloenzima con sigma factor marcato e viene aggiunto un frammento di DNA templato, un promotore di E. Coli di Lac-UV5. Fanno avvenire l'interazione in soluzione. Quindi, si forma il complesso aperto, ma la RNA polimerasi non avanza (complesso aperto) perché non do nucleotidi. Aggiungo eparina, carica negativa, che mima il DNA e blocca l'RNA polimerasi in soluzione (quella che non reagisce con il templato). Poi carico in gel di poli-acrilammide NATIVO (non denaturante, mantiene le proprietà enzimatiche, il folding e le interazioni tra le varie subunità). Le bande che mi interessano sono quelle in cui vedo entrambi i colori, poi solo sul complesso aperto misuro la FRET. Poi faccio avanzare la RNA polimerasi (lo faccio su gel, perché essendo non denaturante la RNA polimerasi e tutto il complesso continua a funzionare) sul filamento di DNA. Fanno camminare la RNA pol fino al gene che voglio, in modo da spostare la RNA polimerasi fino alla posizione +11 (lo spostamento avviene in gel). Poi misurano la FRET (posso misurare così la FRET non solo quando è bloccata, ma anche dopo l'elongazione). Vedono che il fattore sigma resta associato alla RNA Pol anche durante l'elongazione.

Nota: ci sono due fluorofori accettori uno a monte (misuro la FRET su RPO) e uno a valle (misuro la FRET su RPc-clearance).

Lavoro Nudler (2001)

• Usano il templato T7A1. Nel templato c'è anche un terminatore della trascrizione.
• Sfruttando la composizione del gene che deve essere trascritto, spostano la RNA polimerasi fino alla posizione +32 (ossia loro mettono solo C, G e T. La A non la aggiungono. Fanno in modo di usare un gene che è pieno di C G e T e che dopo la 32esima base ha una A, così che si blocca).
• In western blot vedo i frammenti più leggeri (quelli che mi interessano) e quelli del controllo (più pesanti):
• Quelli più pesanti dove la RNA polimerasi scorre fino al terminatore
• I Run-OFF, quelli in cui è stato bypassato il terminatore, ma comunque la trascrizione non è andata avanti perché è finito il substrato
• Dopo aver spostato in posizione +32, avrò un frammento di 32 nucleotidi (sicuri, perché supera di decine di pb le dimensioni di un frammento abortivo). Li metto in una colonna dove ci sono degli oligonucleotidi complementari al filamento nascente coniugati con beads di avidina. In questo modo possono precipitare il complesso RNA polimerasi in attiva trascrizione + filamento nascente. Poi trattano con RNAasi, risospendono e fanno il western blot. Vanno a usare anticorpi contro tutte le subunità (alpha, beta e sigma). E vedono che questo ultimo, anche nella RNA polimerasi in elongazione, è presente. Però il segnale è più basso, segno che evidentemente l'associazione è debole (condizione necessaria per il ciclo del fattore sigma).

Come controllo positivo usano un oloenzima chiuso e vedo tutto. Come controllo negativo in cui si usa un complesso senza oligo, quindi non vedrò niente perché senza oligo non c'è filamento nascente che andrà a legarsi al filamento complementare legato a sua volta alle beads. Poi vedono anche se marca il segnale del fattore sigma se vanno a vedere che accade nella fase di crescita esponenziale dei batteri. Ottengono risultati simili alla fase di crescita stazionaria (quella che abbiamo detto sopra).

Transizione complesso chiuso-aperto

Avviene il melting locale del dsDNA. La formazione del complesso RNA pol + DNA è più stabile ad alte temperature che a basse temperature. Le prime evidenze sulla bolla di trascrizione si basano sullo shift ipercromico. C'è un aumento di assorbimento a 260 nm. In base al numero di base pairs aperti. Si stima un'apertura di 10pb. Sfruttando la metilazione del DNA denaturato/filamenti separati:

• Uso il dimetil sulfonato (DMS) per metilare l'azoto in posizione 1 dell'adenina. In seguito ciò non si può apparire con la timina. Questo permette di non far riappaiare più le basi che si sono separate al momento del melting (solo l'adenina è sensibile a questo trattamento).
• Così che, aspetto che l'RNA pol si appai al DNA, generando la bolla di separazione che separerà i due filamenti.
• Uso il DMS che metilerà le adenina, e a quel livello il filamento non si chiuderà più.
• Faccio una digestione parziale, così da avere ogni molecola digerita in una sola posizione, in modo da avere un ladder di bande a diversa altezza. In questo modo saprò esattamente dove sono state tagliate le coppie A-T e individuare la regione dove si è formata la bolla. (Solo uno dei due filamenti di DNA è stato marcato).
• Individuano l'apertura della bolla da -9 a +3, quindi 12 pb. Ma successivi esperimenti hanno dimostrato come essa sia di 17, questa iniziale sottostima sarebbe dovuto al fatto che si teneva conto solo delle adenine.

Specificità del binding

Vi sarebbero quattro regioni del fattore sigma, altamente conservate in tutti i batteri. A partire dall'N terminale abbiamo l'S1 (con due sub regioni), S2 (con quattro sub regioni), l'S3 (nessuna sub regione), S4 (con una sub regione). Questi sono distanziati da un certo numero di aa meno conservati. Si è visto che la sottoregione 4.2 riconosce il box -35, mente la 2.4 riconosce il box -10. La distanza ottimale tra queste due regioni sarebbe di 17 pb, al fine di garantire un incastro perfetto.

Dimostrazione della specificità

Attraverso un GST-pull down. In cui testano le subunità 4.2 e 2.4 fusa con la GST e mettendo una molecola di glutatione nella colonna di affinità e poi facendo dei test con competitori (infatti il templato di prova pTACC contenente il -35 del triptofano e il -10 del Lac è 100% consensus ed è marcato) non marcati. E poi vedono diminuire la radioattività in presenza di competitori non marcati, confermano la specificità o meno del legame (vedi slides e/o articoli forniti).

Riepilogo

L'interazione specifica della RNA polimerasi è favorita dal fattore sigma. Fattore sigma che è diviso in vari sotto domini, le interazioni cruciali si hanno nella regione sigma 4.2 (-35) e sigma 2.4 (-10).

Inizio Lezione Terza

Un altro elemento importante che caratterizza il promotore, ma non tutti. Si chiama Upper Element. Non si trova in tutti i promotori, ma solo nei promotori molto forti. Quelli altamente trascritti. Infatti questo elemento conservato fu trovato allineando le sequenze aa di promotori molto forti. Si trova a monte della box -35 tra le posizioni -60 e -40 rispetto al sito +1 dell'inizio della trascrizione. L'upper element è importante per l'interazione iniziale dell'RNA polimerasi con il promotore (ma non importante come la box -35 e -15 per l'interazione del fattore sigma con questi elementi), è il dominio carbossi terminale delle subunità alpha della polimerasi a contattare l'Up Element. L'Up Element serve a stabilire ulteriori contatti tra l'RNA Polimerasi e il promotore. La cosa particolare è che sono le co-subunità alpha della RNA Polimerasi a contattarlo, sigma non c'entra nulla.

Dimostrazioni tramite saggi di trascrizione in vitro

Il principio è basato su saggi di trascrizione in vitro, con diverse forme di RNA polimerasi e diverse forme di DNA templato.

"Nei saggi di trascrizione ho delle RNA polimerasi che sono state purificate e poi si dà il DNA templato, dopodiché si danno nucleosidi trifosfato marcati. Poi si fa una corsa elettroforetica e si va alla lastra radiografica."

Prima serie di esperimenti

Usano un DNA templato con un terminatore della trascrizione: questo per avere trascritti di lunghezza definita. Il tutto clonato in un plasmide. Quindi avremo nelle frazioni "RNA polimerasi (wt o sue varianti) + DNA templati con terminatore clonati in un plasmide".

Descrizione dei DNA templati usati

• Nel controllo usano un DNA templato con il promotore wild type del gene dell'rrNBP1, un RNA ribosomiale altamente trascritto. Prendono il promotore di questo gene come standard. Quindi questo promotore (indicato nella corsa elettroforetica come -88) (contiene 88pb) al fine di comprendere (prendere dentro) il putativo Up Element.
• Poi fanno un templato mutato a livello del putativo up elemento (viene chiamato Sub-Substituted, dove l'Up Element viene sostituito con una sequenza a caso).
• Poi abbiamo il -41, un promotore tronco, il quale perde del tutto l'up element (mentre prima veniva solo mutato). Questa sonda contiene solo il promotore e le due box necessarie a legare il fattore sigma.

Risultati del primo set di trascrizione in vitro

• Lane-88: una banda corrispondente al promotore -88 (quello wild type, no mutazioni o delezioni). L'esperimento è fatto in doppio per dare più consistenza ai dati. All'altezza attesa ho una banda molto intensa.
• Lane-Sub: Poi usano il promotore che porta la sostituzione (nelle altre due lane). Cambia drasticamente l'intensità del segnale. Questo significa che l'up element mi stimola fortemente la trascrizione (a parità di RNA polimerasi).
• Lane-41: ho sempre un trascritto all'altezza attesa paragonabile al segnale di quello sostituito. Seconda evidenza che l'up element mi stimola fortemente la trascrizione di quel promotore.
• Uso un templato completamente diverso: è LacUV5 in cui sono sicuro che non c'è nessun up element (mi aspetto anche una dimensione diversa di banda perché la distanza promotore-terminatore è molto diversa). Quello che vedo è che un segnale del promotore è più alto, perché il trascritto è più grande (qui ogni trascritto è marcato con radioattivo. Li distinguo in base al peso e alla lane in cui sono stati caricati).

Controllo Negativo: carico in una lane il plasmide vuoto, e non vedo nulla. RNA-1: un segnale più in basso, che si origina dalla origine di replicazione del plasmide. Ogni origine di replicazione ha un proprio numero di copie, regolato da un meccanismo particolare che coinvolge anche la trascrizione di un corto RNA. È un normalizzatore di caricamento del templato. (Sarebbe l'input)

Esperimento con forma tronca di RNA Polimerasi

Che succede se faccio lo stesso identico esperimento ma uso una forma tronca di RNA polimerasi tronca che viene chiamata alpha-235 (ha le subunità alpha prive degli ultimi 94 aa, che elimina la coda carbossi terminale).

Quello che accade:

• -88 (wt): vedo la banda all'altezza attesa, ma molto più bassa come intensità.
• Sub (quello sostituito): segnale uguale da prima
• -41: anche questo resta come prima (è ovvio, visto che prima non c'era proprio la sequenza per legare la coda carbossi terminale)
• Anche il controllo un segnale più basso, sempre in correlazione al fatto che l'up element ha un effetto di enhancing della trascrizione.

Esperimento con mutazione puntiforme

Altro esperimento: Si usa il wild type più RNA polimerasi con una singola sostituzione della arginina con cisteina in posizione 265 delle subunità alpha, perché si era visto altamente conservato (R265C mi conferma che la preparazione del mutante (quella per i 94 aa eliminati non ci fosse un inibitore della transizione).

• Controllo WT+ R265C: vedo un segnale paragonabile al wild type, questo perché la RNA Pol wt attua un recovery. Questo mi assicura che non ci fosse una contaminante nella preparazione del mutante, perché se ci fosse stato il contaminante anche in questo caso avrei dovuto osservare un abbattimento del segnale.
• R265C con -88: vedo un risultato simile a quello che osservavo quando utilizzava la RNA-Pol tronca. Solo che qui è una mutazione puntiforme. Deve esserci una quindi una composizione in basi ben definita per poter avere questa stimolazione della trascrizione.

Ultimo esperimento: Sonda chimerica

Fanno una sonda chimerica in cui fondono il frammento co-promotore che va da -37 a +40 di LacUV5 (promotore con sequenze box -10 e -35 molto forte) e la posizione Up Stream (-37 a -88) di RNBP1. Quindi vogliono vedere se ha un elemento privo di Up Element glielo metto si ha una forza stimolazione della trascrizione, e così è. In questo modo dimostro che quest ultimo stimoli la trascrizione. Anche in questo caso faccio una mutazione con una singola mutazione per variazione amminoacidica vedendo un abbattimento di livelli di trascrizione.

Esperimento di interazione diretta con DNAase-1 footprinting

Per dimostrare ora un esperimento di interazione diretta vanno a fare un DNAase-1 footprinting. Si usa una sonda a dsDNA che viene marcato su un solo filamento. Dopodiché lo mischio con la proteina marcata che voglio saggiare e poi faccio una digestione parziale con DNAsi 1 (in modo che il doppio filamento venga tagliato in ogni singola posizione, in modo da avere tutti i possibili siti di taglio rappresentanti).

Dopodiché faccio purificazione su DNA e faccio un SDS-PAGE (gel ad altissima risoluzione che separa frammenti che differiscono da 1 a 3 basi). (Devo marcare un solo filamento, perché altrimenti potrei avere una sovrapposizione di segnale tra i due filamenti).

• Controllo negativo: dsDNA senza che ho aggiunto la proteina, quindi avrò delle aree di taglio più ampie (sempre meno informazioni rispetto a quelle che ottengo quando la proteina è presente).