Biologia Molecolare dei Procarioti

La Trascrizione:

• la regolazione inizia nella fase di inizio della trascrizione

• la RNA polimerasi oloenzima è costituita da :

◦ due subunità alpha

◦ Beta

◦ Beta'

◦ Elemento sigma

L'inizio della trascrizione ha più subfasi. La formazione del complesso chiuso ( oloenzima +

promotore , mediato dall'elemento sigma. E' stabile. Qui il DNA è ancora come doppio

filamento. Non c'è ancora melting a formare la bolla di trascrizione ).

Si forma la bolla di trasczione, complesso aperto, ancora più stabile, perchè la separazione del

DNA in due singoli filamenti stabilizza ancor di più questo complesso.

Prima di passare al rilascio del promotore ( promoter clearence, la RNA Polimerasi viene

liberata dal promotore e avanza lungo il filamento di DNA, trascrivendo attivamente ), c'è una

fase di inizio abortivo. Qui vengono prodotti innumerevoli trascritti molto corti di 2-10pb. La

polimerasi va avanti e indietro, ci sono diversi modelli a riguardo. Ma nessuno è stato

confermato.

Il fattore sigma è essenziale per la trascrizione, per conferire anche specificità a questo

processo. In seguito alla clearence, il fattore sigma che fine fa? Vi rimane associato o viene

riciclato da qualche altra polimerasi che così può iniziare la trascrizione?

Travers & Bourders: facendo un saggio di trascrizione in vitro, vanno a definire quello che è

il pattern del fattore sigma. Fanno un saggio di trascrizione in Vitro a bassissima forza ionica,

perchè in queste condizioni hanno

visto che l'RNA Polimerasi restava

bloccata in un complesso ternario:

RNA Pol, TRascritto nascente,

sDNA.

Usano l'RNA Pol di E. Coli

oloenzima + Fago T4 ( DNA

Templato ). Usano ATP marcato con

P32. Ora, la marcatura può essere al

fosfato in alpha, e così vedrò

marcato l'intero filamento in

crescita. Oppure, poichè il fosfato in

gamma viene conservato solo nel

primo nucleotide aggiunto, marcando il fosfato in gamma posso marcare solo il filamento

nascente.

Fanno avvenire la trascrizione in condizione di bassa forza ionica, poichè in questo modo la

RNA Polimerasi resta bloccata in un complessato ternario ( RNA pol+ Frammento in Crescita

+ Templato ).

In questo modo ogni oloenzima è bloccato, questo serve a evitare che l'oloenzima si possa

staccare e iniziare un nuovo evento di trascrizione. A questo appunto aggiungo non

l'oloenzima, ma solo la CORE polimerasi ( senza fattore sigma ).

E vanno a vedere cosa succede se aggiungono quantità crescenti di RNA Pol Core.

Ogni complesso, può iniziare la trascrizione una sola volta.

Vediamo che la core Polimerasi non può iniziate nuovi trascritti, ma quella che fa è " rubare " il

fattore sigma che era della RNA pol bloccata ( se l'associazione fosse stata molto forte non

avrebbe potuto farlo ) per poter trascrivere, infatti vedo

che comunque ho un aumento di segnale del trascritto. Se

così non fosse stato non avrei visto un aumento del

segnale. Questo ha portato a postulare il sigma-factor-

cycle.

Il modello è rimasto in voga per 30 anni, poi alcune

osservazioni hanno fatto pensare che

fattore sigma non necessariamente si staccasse dal

filamento in elongazione ( quindi non era necessario che

si staccasse affinchè avvenisse l'elongazione. Il fatto che

talvolta il fattore sigma si trovasse staccato poteva essere

dovuto ai tipi aggressivi di analisi che venivano utilizzati,

come la cromatografia per affinità ).

Nel 2001 un esperimento dimostra ciò, usando la FRET.

1) vanno a mettere al centro del fattore

sigma un fluoroforo donatore e a poi il DNA

a monte della RNA polimerasi un fluoroforo

accettore ( quindi man mano che la RNA

polimerasi scorre si allontana dal fluoroforo

accettore ). Non vedo FRET nè che il fattore

sigma resti associato alla RNA pol nè che si

stacchi. Funge da controllo, ma non ci dice

nulla sullo stato di associazione del fattore

sigma

2) questa volta mettono il fluoroforo

accettore a valle di quello donatore, così che

man mano che la RNA pol scorre si

avvicina. Ora:

• se fattore sigma si stacca dalla RNA

polimerasi non vedo comunque FRET

• Se fattore sigma resta associato dalla RNA polimerasi vedrò FRET

In vitro lavorano con oloenzima con sigma factor marcato e viene aggiunto un frammento di

DNA templato, un promotore di E. Coli di Lac-UV5. Fanno avvenire l'interazione in

soluzione.

Quindi, si forma il complesso aperto, ma la RNA polimerasi non avanza ( complesso aperto )

perchè non do nucleotidi.

Aggiungo Eparina, carica

negativa, che mima il DNA e

blocca l'RNA polimerasi in

soluzione ( quella che non

reagisce con il templato ) .

Poi carico in gel di

poliacrilammide NATIVO ( non

denaturate, mantiene le propriterà

enzimatiche, il folding e le

interazioni tra le varie subunità).

Le bande che mi interessano sono

quelle in cui vedo entrambi i

colori, poi solo sul complesso

aperto misuro la FRET. Poi faccio avanzare la RNA polimerasi ( lo faccio su gel , perchè

essendo non denaturante la RNA polimerasi e tutto il complesso continua a funzionare ) sul

filamento di DNA. Fanno camminare la RNA pol fino al gene che voglio, in modo da spostate

la RNA polimerasi fino alla posizione +11(lo spostamento avviene in gel). Poi misurano la

FRET ( posso misurare così la FRET non solo quando è bloccata, ma anche dopo l'elongazione

). Vedono che il fattore sigma resta associato alla RNA Pol anche durante l'elongazione.

Nota: ci sono due fluorofori accettori uno a monte ( misuro la FRET su RPO ) e uno a valle

( misuro la fret su RPc-clearence)

Lavoro Nudler ( 2001 )

• usano il templato T7A1. Nel

templato c'è anche un terminatore

della trascrizione. Sfruttando la

composizione del gene che deve

essere trascritto, spostano la RNA

polimerasi fino alla posizione + 32

( ossia loro mettono solo C, G e T.

La A non la aggiungono. Fanno in

modo di usare un gene che è pieno di C G e T e che dopo la 32esima base ha una A , così che

si blocca ). In western blot vedo i frammenti più leggeri ( quelli che mi interessano ) e quelli

del controllo ( più pesanti ):

◦ Quelli più pesanti dove la RNA polimerasi scorre fino al terminatore

◦ I Run-OFF, quelli in cui è stato bypassato il terminatore, ma comunque la trascrizione

non è andata avanti perchè è finito

il substrato

• Dopo aver sposato in posizione +32,

avrò un frammento di 32 nucleotidi

( sicuri, perchè supera di decine di pb

le dimensioni di un frammento

abortivo ). Li metto in una colonna

dove ci sono degli oligonucleotidi

complementari al filamento nascente

coniugati con beads di avidina. In

questo modo possono precipitare il

complesso RNA polimerasi in attiva

trascrizione+ filamento nascente. Poi

trattano con RNAasi, risospendono e

fanno il western blot. Vanno a usare

anticorpi contro tutte le subunità ( alpha, beta e sigma ). E vedono che questo ultimo, anche

nella RNA polimerasi in elongazione, è presente. Però il segnale è più basso , segno che

evidentemente l'associazione è debole ( condizione necessaria per il ciclo del fattore sigma )

• Come controllo positivo usano un oloenzima chiuso e vedo tutto.

• Come controllo negativo in cui si usa un complesso senza oligo, quindi non vedrò niente

perchè senza oligo non c'è filamento nascente che andrà a legarsi al filamento

complementare legato a sua volta alle beads.

• Poi vedono anche se marca il segnale del fattore sigma se vanno a vedere che accade nella

fase di crescita esponenziale dei batteri. Ottengono risultati simili alla fase di crescita

stazionaria ( quella che abbiamo detto sopra ).

Transizione complesso chiuso-aperto, avviene il melting locale del dsDNA. La formazione del

complesso RNA pol + DNA è più stabile ad alte temperature che a basse temperature. Le prime

evidenze sulla bolla di trascrizione si basano sullo shift ipercromico. C'è un aumento di

assorbazna a 260 nm. In base al numero di base pairs aperti. Si stima un'apertura di 10pb.

Sfruttando la metilazione del DNA denaturato/filamenti separati:

• uso il dimetil sulfonato ( DMS ) per metilare l'azoto in posizione 1 dell'adenina. In seguito

ciò non si può apparire con la timina. Questo permette di non far riappaiare più le basi che si

sono separate al momento del melting (solo l'adenina è sensibile a questo trattamento).

• Cosi che, aspetto che l'RNA pol si appai al DNA, generando la bolla di separazione che

separerà i due filmamenti.

• Uso il DMS che metilerà le adenina, e a quel livello il filamento non si chiuderà più.

• Faccio una digestione parziale, cosi da avere ogni molecola digerita in una sola posizione, in

modo da avere un ladder di bande a diversa altezza. In questo modo saprò esattamente dove

sono state tagliate le coppie A-T e individuare la regione dove si è formata la bolla. ( solo

uno dei due filamenti di DNA è stato marcato ).

• Individuano l'apertura della bolla da -9 a +3, quindi 12 pb. Ma successivi esperimenti hanno

dimostrato come essa sia di 17, questa iniziale sottostima sarebbe dovuto al fatto che si

teneva conto solo delle adenine.

Specificità del binding:

• Vi sarebbero quattro regioni del fattore sigma, altamente conservate in tutti i batteri. A

partire dall'N terminale abbiamo l'S1 ( con due sub regioni ), S2 ( con quattro sub regioni ), l'

S3 ( nessuna sub regione ), S4 ( con una sub regione). Questi sono distanziati da un certo

numero di aa meno conservati.

• Si è visto che la sottoregione 4.2 riconosce il box -35, mente la 2.4 riconosce il box -10. La

distanza ottimale tra queste due regioni sarebbe di 17 pb, al fine di garantire un incastro

perfetto.

Come lo dimostrano?

Attraverso un GST-pull down. In cui testano le subunità 4.2 e 2.4 fusa con la GST e mettendo

una molecola di glutatione nella colonna di affinità e poi facendo dei test con competitori

( infatti il templato di prova pTACC contenente il -35 del triptofano e il -10 del Lac è 100%

consensus ed è marcato ) non marcati. E poi vedono diminuire la radiattività in presenza di

competitori non marcati, confermano la specificità o meno del legame ( vedi slides e/o articoli

forniti )

Riepilogo

L'interazione specifica della RNA polimerasi è favorita dal fattore sigma.

fattore sigma che è diviso in vari sotto domini, le interazioni cruciali si hanno nella regione sigma 4.2 ( -35 ) e

sigma 2.4 (-10).

Inizio Lezione Terza

Un altro elemento importante che caratterizza il promotore, ma non tutti. Si chiama Upper Element. Non si

trova in tutti i promotori, ma solo nei promotori molto forti. Quelli altamente trascritti. Infatti questo elemento

conservato fu trovato allineando le sequenza aa di promotori molto forti. Si trova a monte della box -35 tra le

posizioni -60 e -40 rispetto al sito +1 dell'inizio della trascrizione. L'upper element è importante per

l'interazione iniziale dell'RNA polimerasi con il promotore ( ma non importante come la box -35 e -15 per

l'interazione del fattore sigma con questi elementi ), è il dominio carbossi terminale delle subunità alpha della

polimerasi a contattare l' Up Element . L' Up Element serve a stabilire ulteriori contatti tra l' RNA Polimerasi e

il promotore. La cosa particolare è che sono le co-subunità alpha della RNA Polimerasi a contattarlo, sigma

non c'entra nulla.

Come è stato dimostrato?

Il principio è basato su saggi di trascrizione in vitro, con diverse forme di RNA polimerasi e diverse forme di

DNA templato.

"Nei saggi di trascrizione ho delle RNA polimerasi che sono state purificate e poi si da il DNA templato,

dopodichè si danno nucleosidi trifosfato marcati. Poi si fa una corsa elettroforetica e si va alla lastra

radiografica."

Prima serie di esperimenti

Usano un DNA templato con un terminatore della trascrizione: questo per avere trascritti di lunghezza definita.

Il tutto clonato in un plasmide. Quindi avremo nelle frazione " RNA polimerasi ( wt o sue varianti ) + DNA

templati con terminatore clonati in un plasmide".

Come sono fatti i DNA templati che usano:

Nel controllo usano un DNA templato con il promotore wild type del gene dell'rrNBP1, un RNA ribosomiale

altamente trascritto. Prendono il promotore di questo gene come standard. Quindi questo promotore

( indicando nella corsa elettroforetica come -88 ) (contiene88pb) al fine di comprendere ( prendere dentro) il

putativo Up Element.

Poi fanno un templato mutato a livello del putativo up elemento ( vene chiamato Sub-Substituted , dove l'Up

Element viene sostituito con una sequenza a caso ).

Poi abbiamo il -41, un promotore tronco, il quale perde del tutto l'up element ( mentre prima veniva solo

mutato ). Questa sonda contiene solo il promotore e le due box necessarie a legare il fattore sigma.

Il primo set di trascrizione in vitro viene fatto con RNA polimerasi wild type ( oloenzima wild type ).

Che bande vedono:

• Lane-88: una banda corrispondente al promotore -88 ( quello wild type, no mutazioni o delezioni ).

L'esperimento è fatto in doppio per dare più consistenza ai dati. All'altezza attesa ho una banda molto intensa

• Lane-Sub:Poi usano il promotore che porta la sostituzione (nelle altre due lane ). Cambia drasticamente

l'intensità del segnale. Questo significa che l'up element mi stimola fortemente la trascrizione ( a parità di

RNA polimerasi ).

• Lane-41: ho sempre un trascritto all'altezza attesa paragonabile al segnale di quello sostituito. Seconda

evidenza che l'up element mi stimola fortemente la trascrizione di quel promotore.

• Uso un templato completamente diverso: è LacUV5in cui sono sicuro che non c'è nessun up element ( mi

aspetto anche una dimensione diversa di banda perchè la distanza promotore-terminatore è molto diversa ).

Quello che vedo è che un segnale del promotore è più alto, perchè il trascritto è più grande ( qui ogni

trascritto è marcato con radiattivo. Li distinguo in base al peso e alla lane in cui sono stati caricati ).

• Controllo Negativo: carico in una lane il plasmide vuoto, e non vedo nullla.

• RNA-1: un segnale più in basso, che si origina dalla origine di replicazione del plasmide. Ogni origine di

replicazione ha un proprio numero di copie, regolato da un meccanismo particolare che coinvolge anche la

trascrizione di un

corto RNA. E' un

normalizzatore di

caricamento del

tempalto. (sarebbe

l'input)

Che succede se faccio

lo stesso identico

esperimento ma uso

una forma tronca di

RNA polimerasi tronca

che viene chiamata

alpha-235 ( ha le

subunità alpha prive

degli ultimi 94 aa, che

elimina la coda

carbossi terminale ).

Quello che accade:

• -88 ( wt ): vedo la

banda all'altezza

attesa, ma molto più

bassa come

intensità.

• Sub ( quello sostituito ): segnale uguale da prima

• -41: anche questo resta come prima ( è ovvio, visto che prima non c'era proprio la sequenza per legare la

cabotassi terminale )

• Anche il controllo un un segnale più basso, sempre in correlazione al fatto che l'up element ha un effetto di

enhancing della trascrizione.

Altro esperimento:

Si usa il wild type più RNA polimerasi con una singola sostituzione della arginina con cisteina in posizione

265 delle subunità alpha, perchè si era visto altamente conservato ( R265C mi conferma che la preparazione

del mutante ( quella per i 94 aa eliminati non ci fosse un inibitore della transizione ):

• Controllo WT+ R265C: vedo un segnale paragonabile al wild type, questo perché la RNA Pol wt attua un

recovery. Questo mi assicura che non ci fosse una contaminante nella preparazione del mutante, perchè se ci

fosse stato il contaminante anche in questo caso avrei dovuto osservare un abbattimento del segnale.

• R265C con -88: vedo un risultato simile a quello che osservavo quando utilizzava la RNA-Pol tronca. Solo

che qui è una mutazione puntiforme. Deve esserci una quindi una composizione in basi ben definita per

poter avere questa stimolazione della trascrizione.

Ultimo esperimento:

Fanno una sonda chimerica in cui fondono il frammento co-promotore che va da -37 a +40 di LacUV5

( promotore con sequenze box -10 e -35 molto forte ) e la posizione Up Stream ( -37 a - 88 ) di RNBP1. Quindi

vogliono vedere se ha un elemento privo di Up Element glielo metto si ha una forza stimolazione della

trascrizione, e così è.

In questo modo dimostro che quest ultimo stimoli la trascrizione.

Anche in questo caso faccio una mutazione con una singola mutazione per variazione amminoacidica vedendo

in abbattimento di livelli di trascrizione.

Per dimostrare ora un esperimento di interazione diretta vanno a fare un DNAase-1 footprinting.

Si usa una sonda a dsDNA che viene marcato su un solo filamento. Dopodichè lo mischio con la proteina

marcata che voglio saggiare e poi faccio una digestione parziale con DNAsi 1 ( in modo che il doppio

filamento venga tagliato in ogni singola posizione, in modo da avere tutti i possibili siti di taglio

rappresentanti )

Dopodichè faccio purificazione su DNA e faccio un SDS-PAGE ( gel ad altissima risoluzione che separa

frammenti che differiscono da 1 a 3 basi) .

( Devo marcare un solo filamento, perchè altrimenti potrei avere una sovrapposizione di segnale tra i due

filamenti ).

Ho:

• Controllo negativo: dsDNA senza che ho aggiunto la proteina, quindi avrò della aree di taglio più ampie

( semp