Biologia Molecolare dei Procarioti

Z.

Solo quando Y raggiunge una certa concentrazione ( quindi non lo fa immediatamente ) si andrà ad

inattivare Z. Il delay mi permette prima un'espressione di Z poi un suo steady state e poi una sua inibizione.

La combinazione dei due rami fa si che ci sia prima un picco e poi un suo assestamento, ho un impulso.

Un'altra funzione è una risposta accelerato, semplicemente perchè ho una produzione iniziale molto forte

che viene contrastata dal ramo repressivo del circuito.Avrò all'inizio un'attivazione molto forte ch epoi si

combina col ramo repressivo che lo porta a uno steady state.

Questo è stato visto in un circuito dell'utilizzo del galattosio galETK, l'attivazione di questo circuito passa

attraverso due regolatori, da un lato CRP che percepisce cAMP, che attiva direttamente gal e dall'altra parte

attiva un repressore che si chiama GalS ). In un ceppo wt, ho questa espressione a impulso. Che succede se

blocco GalS, è stato mutagenizzato il binding domain di GalS ( c'è ma non può legarsi ) e quello che si vede

che gaETK è trascritto ampiamente.

Network Motifs:

Single Input modules:

È un'organizzazione molto semplice dove un regolatore X, regola un gruppo N di geni. Ho un regolatore

trascrzionale che ha N target. Che funzioni ha?

• espressione coordinata di gruppi di geni funzionalmente correlati

• Generazione di pattern du espressione coordinati nel tempo, semplicemente tutti i target di questo

regolatore non hanno lo stesso soglia di attivazione, non aìvengono tutti attivati ala comparsa del segnale.

Ma c'è chi ha bisogno di più X e chi di meno X.

Quindi questi geni hanno una soglia di X diversi, per cui ci saranno geni che si attivano prima e geni che si

attivano dopo e per questo quindi c'è una coordinazione in base all'aumento nel tempo di concentrazione di

X. Questo dipenderà dall'affinità di quella proteina per quel determinato promotore.

Dense overlapping regulons (DOR )

Situazioni complesse in cui un regolatore trascrizionale ha pi target,. Ma un target è regolato da più

regolatori trascrzionali.

In alcuni casi si hanno motivi di regolazione, visti come mattoncini che si combinano per costituire un

network di regolazione complessi. Nell'esempio di Bacillus, si combinano di versi feed forward loop in cui

l'input di uno diventa l'output dell'altro. Siamo in un develpment al network.

Esempio della sporulazione in bacillus, la sporulazione è una modificazione dello stato di crescita della

cellula dove da stato vegetativo passa a stato di spora.

In cima a tutto c'è il regolatore Spo()A che p innescato da un segnale a monte, quindi X1 regola Z1

attivandolo e attiva anche Y1 che è un repressore trascrzionale di Z1 ( è un feed forward loop incoerente di

tipo 1, quindi rispsota a impulso ), Y1 ha anche la funzione attivare con X1 , X2 ( non chiede, guarda solo

immagine slides )

Questi circuiti si ritrovano anche in network misti fatti da proteine e regolatori a RNA ( esempio MYC )

Review, Cell 2009

RNA Regolativi

Sono un gruppo eterogeneo di molecole che agiscono attraverso vari meccanismi per modulare l'espressione

di proteine. E sono coinvolti in un vasto repertorio di risposte fisiologiche.

Gruppo eterogeneo: vari aspetti quali,

• dimensioni : chiamati small RNA, che non hanno una funzione codificante ma regolativa. Ma esistono

anche RNA-antisenso anche di 10kb.

• Qualcuno li chiama non-coding-RNA che viene anche tradotto e questa proteina ha effetto regolativo

• Meccanismo: trascrizionale o post-trascrizionale. Alcuni possono regolare entrambi gli organismi, altri

solo uno dei due.

Questi RNA regolativi sono stati caratterizzati per prima nei procarioti, è stato identificato un RNA1

coinvolto nel blocco della replicazione di ColE1. Qualche anno dopo è stato trovato un corto RNA che

bloccava la trasposasi. Poi è stato identificato il primo RNA regolativo trovato in un ceppo di Coli MicF,

coinvolto nel blocco della traduzione della proteina OmpF.

RIboswitch

Caratterizzata da particolari sequenze al 5' dell'mRNA, 5'-UTR. E la caratteristica di questa sequenza è

quella di poter assumere certe conformazioni in base ai diversi segnali ambientali, quali:

• stallo dei ribosomi

• temperatura

• ligandi di varia natura.

RNA regolativi che agiscono in cis, ovvero non sono RNA a se stanti che vanno a riconoscere qualche altro

trascritto e vi si appaiano espletando una funzione regolativa. Sono un RNA che agisce sullo stesso RNA

che viene regolato.

Regolazione in cis a carico dell'operone triptofano. E' stato il primo esempio un meccanismo di regolazione

in cis.

Attenuazione trascrizionale

Viene messo in a

L'operone triptofano contiene 5 enzimi per la sintesi del triptofano. Abbiamo detto che la regolazione

dell'inizio della trascrizione del triptofano dipende da una sequenza in cis che contiene il repressore del

triptofano trpR e viene prodotto un repressore ( aporepressore , ancora non legato alla molecola di triptofano

). Più a valle c'è l'operone multicistronico del triptofano ( trpEDCBA ), poi immediatamente a monte c'è il

promotore e l'operatore. L'aporepressore ha bassa affinità per l'operatore. In presenza di triptofano, questo si

lega all'aporepressore, si forma l'olorepressore e si ha una variazione conformazionale che permette il

legame del repressore all'operatore.

La repressione trascrizionale è debole, non è particolarmente efficiente. Se ci fosse solo questo meccanismo,

anche in presenza del repressore , non ci sarebbe un abbassamento significativo. Allora quello che si vede

( vedi whatson ed 7 ) è che c'è un 5'-UTR , il quale non è proprio un UTR perchè presenta un codone di

inzio della traduzione seguito poco dopo da una sequenza di stop. Ma a che serve?Quello che si è visto è

che quella regione la piò assumere una conformazione e assumere una struttura secondaria abbastanza

complessa. Si è suddiviso in 4 regioni e si vede che la regione 1 può applicarsi con la 2 e la 3 con la 4 e

questi possono formare una struttura harpin tipica di un terminatore instrinseco della trascrizione. Ma come

fa quella struttura a formarsi o meno in presenza o assenza di triptofano? E quello che si vede è che nella

porzione del 5' UTR dove si vede la breve sequenza traducibile è che ci sono due codoni consecutivi del

triptofano. Questo è singolare, perchè il triptofano è abbastanza raro come aa ( qui se ne trovano ben due

appaiati ).

Che succede in carenza di triptofano? La trascrizione parte, il trascritto ( quello al 5'-UTR ) emerge dalla

polimerasi e viene contattato dai ribosomi, e visto che non hanno l'aaminocil tRNA per il trotpfano, i

ribosomi stallano e 1 non si appaia con 2, e 3 non si appaia con 4 perchè 2 si appaia con 3 e quindi non si

forma la struttura di terminazione. E quindi non abbiamo questo evento di terminazione precoce.n

Quando il triptofano è abbondante abbiamo repressione trascrizionale, ma abbiamo detto che è inefficiente.

Quello che lo blocca è questo terminatore intrinseco che non fa stellare i ribosomi perchè ora il triptofano

per l'amminoacil tRNA corrispondente è presente! E quindi 3 si appaia con 4 , si forma l'harpin eLa

trascrizione finisce.

In questo modo orta si capisce come RNA regolativi possano agire in cis, e cìò dipende dalla conformazione

che la sequenza può assumere in rispsota a cambiamenti dell'omeostasi.

RNA Thermomethers

Agiscono solo a livello post-traduzionale

Il segnale che modifica la conformazione della sequenza al 5'-UTR è la temperatura. Bisogna ricordarsi

dell'importanza delle sequenze di inizio della traduzione che servono per far interagire l'mRNA alla subunità

minore del ribosoma ( Shine-Dalgandon ), se questo riconoscimento viene ostacolato si agisce

sull'efficienza di traduzione di un trascritto.

A livello post-trascrzionale l'mRNA codificante per sigma32 può assumere due diverse conformazioni in

maniera dipendente dalla temperatura. A basse temperature non devo tradurre tanto sigma 32. Si forma una

struttura secondaria che coinvolge il sito di inizio della traduzione e della Shine Dalgandon e quindi non

può essere tradotto. Nel momento in cui si aumenta la temperatura, la struttura si risolve e si permette

l'accesso al sito di inizio della tradizione.

Negli ultimi anni lo studio di questo molecole termosensori hanno avuto un boom, si è visto essere molto

importanti anche per i geni della virulenza ( ad esempio batteri che attivano geni solo dopo che dalla

temperatura esterna sono passati alla temperatura dell'ospite che gli segnala che vale la pena attivare la

traduzione di quei geni della virulenza ).

Abbiamo zipper che rispondono a salti di temperatura molto forti, solo in questo caso si ha il melting della

struttura. Ci sono zipper in grado di percepire minime strutture della temperatura. ( riascolta velocemente ).

Poi abbiamo struttura che anzichè a zipper sono, Switch in cui ci sono 2 strutture mutualmente esclusive a

bassa e alta temperatura.

Esempio Switch:

Due strutture mutualmente esclusive, in uno abbiamo un mRNA ( che regola la fase lisogenica del fago

lambda ), a 45 non è tradotto, perchè la shine-dalganon e AUG la struttura è completamente mascherata.

Mentre se si abbassa la temperatura , diventano accessibili e viene tradotto il gene.

Si visto che in Neissseria meningitidis ci sono 3 proteine che servono a evadere la rispsota infiammatoria

dell'ospite e si è visto che nel 5'-UTR si potevano ritroavare delle strutture simili a quelle che abbiamo

appena viste. Una di queste è quella di cssA, che è stato paragonato a prfA di E. Coli ( perchè gia

completamente caratterizzato ). E si vede che il modo in cui si appaiano i filamenti della struttura

secondaria. IN E. Coli sono più abbondanti gli appaiamenti deboli. Se si costruisci e un sistema reporter e si

confrontano i due, si vede che quello di E. Coli si attiva solo a 38° mentre n cssA, essendo meno stabile, la

traduzione inizia in modo graduale già a partire da 28°.-

Riboswitch

Fanno perte dell'mRNA che regolano, le strutture al 5'-UTR sono in grado id percepire ligandi e legandosi a

questa 5'-UTR ne modulano la conformazione e infatti vengono chiamati anche sensori di metaboliti.

Quale è la struttura base di un riboswitch, ha un aptmero che è quella che interagisce con la molecola se

vale e poi è seguita da una expression platform che è la parte che assume strutture alternative che hanno

effetto sulla trascrizone o traduzione.

I processi che possono essere modulati sono sia la trascrizi