Biologia molecolare - Appunti

Enzimi e la loro funzione

Un enzima è una proteina in grado di catalizzare una reazione chimica. Il processo di catalisi indotto da un enzima (come da un qualsiasi altro catalizzatore) consiste in un'accelerazione della velocità della reazione e quindi in un più rapido raggiungimento dello stato di equilibrio termodinamico. Un enzima accelera unicamente le velocità delle reazioni chimiche, diretta e inversa (dal composto A al composto B e viceversa), senza intervenire sui processi che ne regolano la spontaneità. Il suo ruolo consiste nel facilitare le reazioni attraverso l'interazione tra il substrato (la molecola o le molecole che partecipano alla reazione) ed il proprio sito attivo (la parte di enzima in cui avvengono le reazioni), formando un complesso. Avvenuta la reazione, il prodotto viene allontanato dall'enzima, che rimane disponibile per iniziarne una nuova. L'enzima infatti non viene consumato durante la reazione.

Gli enzimi portano a termine una gran quantità di funzioni all'interno degli organismi viventi. Una delle caratteristiche più importanti degli enzimi è la possibilità di lavorare in successione, creando un pathway metabolico. Nei pathways, ogni enzima utilizza il prodotto della reazione precedente come substrato. È la presenza degli enzimi a determinare i passaggi del pathway: senza enzimi, il metabolismo non passerebbe attraverso gli stessi passaggi e non sarebbe in grado di generare prodotti ad una velocità sufficiente per le esigenze della cellula. Ad esempio, un pathway come la glicolisi non potrebbe esistere in assenza degli enzimi che la compongono.

Funzioni importanti degli enzimi

Il glucosio, ad esempio, è in grado di reagire direttamente con l'adenosintrifosfato (ATP) per essere fosforilato su uno o più carboni, ma in assenza di enzimi questo avverrebbe a velocità tanto ridotte da essere insignificante. La rete del metabolismo cellulare dipende dunque dal set di enzimi funzionali presenti. Un'altra importante funzione degli enzimi è correlata alla digestione negli animali. Enzimi come le amilasi e le proteasi sono in grado di ridurre le macromolecole (nella fattispecie amido e proteine) in unità semplici (maltosio e amminoacidi), assorbibili dall'intestino. In alcuni casi gli enzimi necessari alla digestione possono essere prodotti da organismi ospiti del tubo digerente: nei ruminanti, ad esempio, la cellulasi necessaria alla degradazione della cellulosa è prodotta da alcune specie batteriche.

Essi sono anche fondamentali per la trasduzione del segnale e la regolazione dei processi cellulari. In particolare, questi processi sono coordinati solitamente da chinasi e fosfatasi. Gli enzimi sono anche in grado di generare movimento, come avviene ad esempio con la miosina, che idrolizza l'ATP generando la contrazione muscolare o con il trasporto di molecole nei vari dipartimenti cellulari attraverso il citoscheletro. Altre ATPasi, localizzate presso le membrane cellulari, sono le pompe ioniche, coinvolte nel trasporto attivo.

Enzimi nei virus e altre funzioni esotiche

I virus contengono numerosi enzimi che permettono loro di infettare le cellule. Tra di essi figurano le integrasi e le retrotrascrittasi. Gli enzimi sono anche coinvolti in funzioni più esotiche, come la generazione di luce nella lucciola, resa possibile dalla presenza della luciferasi. L'attività degli enzimi è determinata dalla struttura quaternaria (ovvero la conformazione tridimensionale) degli enzimi stessi.

La maggior parte degli enzimi presenta dimensioni decisamente maggiori dei substrati su cui agiscono. Solitamente la regione dell'enzima coinvolta nell'attività catalitica è molto ridotta (conta spesso solo 3-4 amminoacidi). La regione contenente questi residui catalitici, nota come sito attivo, si occupa di prendere contatto con il substrato e di portare a termine la reazione. Gli enzimi possono anche contenere regioni che legano cofattori necessari per la catalisi. Alcuni enzimi presentano anche siti di legame per piccole molecole, spesso prodotti diretti o indiretti della reazione catalizzata. Tale legame può incrementare o ridurre l'attività dell'enzima, attraverso una regolazione a feedback negativo.

Proteine e loro classificazione

Le proteine sono composti organici tra i più complessi, costituenti fondamentali di tutte le cellule animali e vegetali. Dal punto di vista chimico, una proteina è un polimero (o anche una macromolecola) di residui amminoacidici, uniti mediante un legame peptidico, spesso in associazione con altre molecole e/o ioni metallici (in questo caso si parla di proteina coniugata). Da questo punto di vista le proteine possono essere classificate in due grandi famiglie: le proteine globulari e le proteine a struttura estesa o fibrosa.

Queste due organizzazioni riflettono le due grosse separazioni funzionali che le contraddistinguono:

• Le proteine estese o fibrose svolgono funzioni generalmente biomeccaniche, esse per esempio rientrano nella costituzione delle unghie, dei peli, dello strato corneo dell'epidermide, ecc., opponendo una valida difesa contro il mondo esterno.
• Al contrario, le proteine globulari sono coinvolte in specifiche e molteplici funzioni biologiche, spesso di notevole importanza per l'economia cellulare, per esempio sono proteine gli enzimi, i pigmenti respiratori, molti ormoni e gli anticorpi, responsabili della difesa immunitaria.

Struttura delle proteine

La proteina può essere paragonata ad una struttura tridimensionale articolata su 4 livelli, in relazione fra di loro.

Struttura primaria

La struttura primaria è formata dalla sequenza specifica degli amminoacidi, dalla catena peptidica e dal numero stesso delle catene.

Struttura secondaria

La struttura secondaria consiste nella conformazione spaziale delle catene; ad esempio la conformazione a spirale (o ad alfa elica), mantenuta e consentita dai legami a idrogeno, quella planare (o a foglietto beta), quella a tre filamenti intrecciati (propria del collagene) o quelle globulari appartenenti al gruppo KEMF (cheratina, epidermina, miosina, fibrinogeno).

Struttura terziaria

La struttura terziaria (dal punto di vista della termodinamica è la forma con la più bassa energia libera) è rappresentata dalla configurazione tridimensionale che la catena polipeptidica assume nell'ambiente in cui si trova. Viene consentita e mantenuta da diversi fattori, come i ponti disolfuro e le forze di Van der Waals. Ma fondamentali all'aggregazione sono le chaperonine, proteine chiamate anche "dello stress" o "dello shock termico", per il loro ruolo nella rinaturazione delle proteine denaturate. Gran parte delle strutture terziarie può essere classificato come globulare o fibrosa.

Struttura quaternaria

La struttura quaternaria è quella che deriva dall'associazione di due o più unità polipeptidiche, unite tra loro da legami deboli (e a volte ponti disolfuro) in un modo molto specifico, come ad esempio avviene nella costituzione dell'enzima fosforilasi, costituito da quattro sub-unità, o dall'emoglobina, la molecola responsabile del trasporto dell'ossigeno nell'organismo. Le proteine che contengono anche una parte non polipeptidica, gruppo prostetico, sono dette proteine coniugate.

La conformazione spaziale di una proteina è fondamentale affinché questa esplichi la sua attività biologica. Denaturare una proteina significa distruggerne la conformazione spaziale, rompendo i legami idrogeno e ponti disolfuro per mezzo di acidi, basi, calore, radiazioni o agitazione (un esempio comune di denaturazione è la cottura di un uovo nel quale l'albumina, che costituisce la maggior parte dell'albume, viene denaturata). Una proteina denaturata, pur mantenendo intatta la sua struttura primaria, non è più in grado di esplicare la sua funzione, a meno che non si riesca a ristabilirne la struttura terziaria.

Struttura e funzione del DNA

La molecola di DNA fu esaminata agli inizi degli anni '50 mediante un'analisi di diffrazione ai raggi X, si scoprì allora che era composta da due filamenti del polimero avvolti in un'elica, questa descrizione fu uno degli indizi principali che portarono alla struttura di Watson e Crick. Una molecola di DNA è formata da due catene polinucleotidiche composte a loro volta da quattro subunità, ogni catena è conosciuta come filamento di DNA e i legami idrogeno che si trovano fra le basi di nucleotidi servono a tener unite le due eliche. I nucleotidi sono formati da uno zucchero e cinque atomi di carbonio ai quali sono legati uno o più gruppi fosfati e una base azotata.

Nei nucleotidi del DNA lo zucchero contenuto è il deossiribosio ed è legato ad un solo gruppo fosfato e la base può essere l'adenina, la guanina, la citosina o la timina, inoltre i nucleotidi sono uniti covalentemente tra di loro grazie a una catena alternata che formano con lo zucchero e gruppi fosfati. Il modo in cui i nucleotidi sono allineati dà al filamento di DNA una polarità chimica infatti un'estremità dello zucchero avrà la sporgenza (il fosfato 5') e l'altra avrà un buco (l'ossidrile 3') in questo modo le due estremità saranno facilmente riconoscibili e la polarità della catena di DNA viene indicata come estremità 5' ed estremità 3'.

Appaiamento e replicazione

La struttura tridimensionale del DNA è dovuta alle caratteristiche chimiche e strutturali delle due catene polinucleotidiche infatti una base con due anelli più voluminosa si appaierà con una base con un singolo anello per questo c'è l'appaiamento dell'adenina con la timina e della guanina con la citosina, e questo appaiamento complementare permette inoltre alle coppie di basi formate di compattarsi nel modo più favorevole all'interno della doppia elica. I membri delle coppie di basi possono adattarsi insieme dentro la doppia elica soltanto se i filamenti sono antiparalleli cioè uno volto in un senso e l'altro nel senso opposto.

Come è risaputo i geni contengono l'informazione genetica che deve essere copiata accuratamente per poi essere trasmessa alle generazioni successive, questo è possibile grazie al DNA poiché esso codifica l'informazione tramite l'ordine dei nucleotidi, qualsiasi base può considerarsi una lettera dell'alfabeto a quattro lettere con cui sono scritti messaggi biologici nella struttura del DNA. Precedentemente alla struttura del DNA era risaputo che i geni contenevano istruzioni per produrre proteine e questo infatti ridurrebbe al minimo il problema di come si trasmetta l'informazione biologica infatti la sequenza lineare di nucleotidi deve codificare in qualche modo la sequenza lineare di amminoacidi in una proteina.

La serie di informazioni contenuta nel DNA è detta genoma e la quantità di informazioni contenute in esso è enorme e la struttura del DNA ha rivelato com'è possibile "copiare" queste informazioni infatti ogni filamento di DNA contiene una sequenza di nucleotidi complementare al filamento partner per questo ogni filamento può fungere da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare. La capacità di ciascun filamento di fungere da stampo per produrre un filamento di DNA complementare rende una cellula in grado di replicare i suoi geni prima di passarli alla generazione successiva.

DNA e la sua struttura nelle cellule eucariotiche

Quasi tutto il DNA di una cellula eucariotica è racchiuso nel nucleo, questo compartimento è delineato da un involucro nucleare che è formato da un doppio strato lipidico formato ad intervalli da pori nucleari che trasportano le molecole fra nucleo e citosol, l'involucro è connesso direttamente alle membrane del reticolo endoplasmatico ed è supportato da due reticoli di filamenti intermedi come la lamina nucleare che forma una rete sottile a forma di foglio all'interno del nucleo e poi è formato da un reticolo che circonda la membrana nucleare esterna, inoltre altra funzione dell'involucro è quella di permettere alle proteine che agiscono sul DNA di concentrarsi dove sono necessarie alla cellula.

Negli eucarioti il DNA contenuto nel nucleo è diviso in una serie di cromosomi diversi, ciascun cromosoma è formato da una singola molecola di DNA e proteine chiamate cromatina (perché sono colorate), oltre alle proteine i cromosomi sono utili anche per la replicazione e la riparazione del DNA. Ad eccezione delle cellule germinali ed altri tipi di cellule che non possono moltiplicarsi, la cellula umana contiene due copie di ciascun cromosoma, una ottenuta dal padre l'altra dalla madre anche detti cromosomi omologhi. L'unica coppia di cromosomi definita non omologa è quella che riguarda il cromosoma sessuale infatti per il maschio sarà composta da X e Y, per la donna sarà composta da due X. Per distinguere un cromosoma dall'altro si possono usare coloranti o schemi di bendaggio, l'insieme dei 46 cromosomi è detto cariotipo umano, e se vengono persi o scambiati pezzi di cromosoma negli schemi di bendaggio sarà semplice individuarlo.

Cromatina e replicazione del DNA

Le proteine che si legano al DNA per formare i cromosomi sono divise in due classi: istoni e proteine cromosomiche non istoniche. Il complesso di entrambe le classi è conosciuto come cromatina. Gli istoni sono i responsabili del primo livello di organizzazione dei cromosomi ovvero il nucleosoma che è formato da un nucleo proteico e da otto molecole di istoni intorno al quale si avvolge la doppia elica del DNA, nonostante l'irregolarità nel posizionamento dei nucleosomi sul DNA essi sono di solito compattati insieme in schiere quasi regolari a formare una fibra di 30 nm. E inoltre nonostante l'alto grado di cromatina contenuta la loro struttura deve essere altamente dinamica affinché possa permettere alla cellula di accedere al DNA.

I cromosomi sono generalmente decondensati durante l'interfase eccezione fatta, l'eucromatina compone la maggior parte dei cromosomi interfasici ed è molto probabile che corrisponda a domini ad ansa di fibre d 30nm. Essa è tuttavia interrotta da tratti di eterocromatina, ovvero una parte più condensata di cromatina, la maggior parte di DNA che è ripiegato in eterocromatina non contiene geni o i geni che contiene non possono essere espressi. Però non si deve pensare che l'eterocromatina incapsuli DNA morto ma anzi che crei tipi diversi di cromatina con ruoli e caratteristiche diverse.

Sebbene siano meno considerati dei cromosomi mitotici, ovvero quelli che sono possibili da visualizzare durante la mitosi, i cromosomi interfasici occupano territori distinti nel nucleo della cellula ovvero sono consistentemente intrecciati, tutti i cromosomi adottano una conformazione altamente condensata durante la mitosi inoltre quando sono colorati i cromosomi mitotici hanno una struttura a bande che permette di riconoscere ogni cromosoma senza ambiguità inoltre queste bande contengono milioni di nucleotidi.

Replica del DNA

Tutti gli organismi devono replicare il DNA con accuratezza prima di qualsiasi divisione cellulare per questo l'appaiamento delle basi sta alla base della replicazione del DNA infatti l'uso del DNA come stampo è il processo in cui una sequenza nucleotidica di un filamento viene copiata, grazie all'appaiamento delle basi, in una sequenza complementare questo processo richiede la divisione dei filamenti dell'elica e questa separazione fa sì che sia gli accettori che i donatori di legami idrogeno su ogni base diventino esposti per l'appaiamento delle basi con l'apposito nucleotide libero e lo allineano per la sua polimerizzazione catalizzata da un enzima ed il primo enzima è la DNA polimerasi che fu scoperto nel 1957 i nucleotidi che servono per l'enzima sono stati riconosciuti come deossiribonucleotidi trifosfati e la loro polimerizzazione richiede uno stampo di DNA a singolo filamento.

Durante la replicazione del DNA all'interno di una cellula ciascun filamento vecchio serve da stampo per uno nuovo per questo nelle cellule figlie sarà presente un filamento vecchio ed uno nuovo e si dirà che la doppia elica di DNA sarà stata replicata in modo semiconservativo. La replicazione del DNA avviene in strutture dette forcelle di replicazione, la loro struttura è asimmetrica poiché possiedono un'unica DNA polimerasi che va solo in direzione 5'-3'. Infatti poiché i filamenti di una doppia elica sono antiparalleli e la DNA polimerasi, come già detto prima può percorrere solo la direzione 5'-3', la sintesi 5'-3' può avvenire in modo continuo soltanto su uno dei due filamenti che sarà dunque chiamato "filamento guida" questa sintesi precede per giunta di poco la sintesi del filamento figlio sintetizzato in modo discontinuo e chiamato "filamento lento o ritardo" inoltre per il filamento lento la direzione è opposta e la sintesi comporta che solo il tipo 5'-3' di DNA polimerasi sia necessario per la replicazione del DNA.

Come detto in precedenza l'alta fedeltà di replicazione comporta parecchi meccanismi di correzione. Il prima passaggio spetta alla DNA polimerasi. Poiché è possibile che durante la replicazione venga incorporato un nucleotide errato che se non rimosso può portare ad una mutazione, inoltre questa attività di correttore di bozze permette alla DNA polimerasi di rimuovere gli errori di appaiamento infatti se l'enzima durante la sintesi aggiunge un nucleotide sbagliato, se ne accorge si ferma e prima di continuare la polimerizzazione rimuove il nucleotide sbagliato in direzione opposta. Ma la replicazione richiede anche la cooperazione di altre proteine come la DNA primasi che serva a catalizzare la polimerizzazione di nucleosidi trifosfati; la DNA elicasi e proteine (ssb) che legano il dna a singolo filamento per aiutare ad aprire l'elica in modo da poterla copiare; la DNA ligasi che insieme a un enzima che degrada gli RNA primer unisce insieme i frammenti di dna sintetizzati in modo discontinuo; e la DNA topoisomerasi che serve ad aiutare a risolvere i problemi di aggrovigliamento e avvolgimento dell'elica del DNA. Molte di queste proteine si associano tra di loro.