Biologia molecolare

LEGAME FOSFODIESTERICO

Il legame fosfodiesterico giunge da ponte tra i desossiribosio di due nucleotidi adiacenti, formando due esteri, uno con il carbonio 5’ di un gruppo nucleotide, l’altro con il gruppo alcolico in posizione 3’ del nucleotide adiacente. È un polimero non ramificato di nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici. Le catene risultanti sono catene polinucleotidiche.

Un filamento di DNA è formato da una catena polinucleotidica e legami fosfodiesterici 3’, 5’. Il DNA presenta una struttura B, con basi complementari che si legano tramite legami a idrogeno: timina e adenina si legano con due legami a idrogeno, citosina e guanina si legano con tre legami a idrogeno. Il DNA presenta un solco maggiore e un solco minore, e la doppia elica ha un’orientazione destrogira. In realtà, il DNA devia dalla struttura ideale di Watson e Crick, con una struttura irregolare e una sequenza nucleotidica specifica che registra l'informazione genetica.

Molecole di DNA in natura possono presentarsi in forma lineare o in forma circolare. Le dimensioni in natura variano da qualche migliaio di coppie di basi a milioni di coppie di basi.

STRUTTURE ALTERNATIVE:

DNA-A: quando umidità relativa è ridotta al 75% il DNA va incontro a una modificazione conformazionale reversibile che è la forma A. DNA-A forma un'elica destrorsa più larga e piatta di quella del DNA-B. 2,3 Å/bp (innalzamento/coppia di basi). 25,5 Å diametro. 11bp/giro. Le coppie di basi sono angolate tilted di circa 19 gradi rispetto all'asse dell'elica.

Le regioni a doppia elica delle molecole di RNA assumono preferenzialmente la conformazione A, per la presenza di un gruppo -OH al posto di H a livello del carbonio 2' del ribosio, tale gruppo OH sembra interferire con l'impaccamento degli atomi impedendo all'RNA di assumere la conformazione B. Le molecole ibride DNA/RNA tendono anch'esse ad assumere

La conformazione A. passo dell'elica, pari a 10 coppie di basi per DNA-B: 3,4 Å/bp (innalzamento/coppia di basi)

giro dell'elica. 23,5 Å diametro. 10,4 bp/giro. Le coppie di basi sono angolate tilted di circa 6° rispetto all'asse dell'elica.

La struttura a doppia elica nella forma più frequente. Ogni molecola di DNA è formata da due catene polinucleotidiche o eliche, avvolte a spirale in senso destroso una attorno all'altra, l'avvolgimento è plectonemico, scheletro di desossiribosio fosfati è rivolto all'esterno e interagisce con l'ambiente acquoso, basi azotate sono rivolte all'interno e perpendicolarmente rispetto all'asse dell'elica, basi di un'elica sono allo stesso livello di quelle dell'altra. Diametro della doppia elica è costante, 2 nm. Eliche hanno andamento antiparallelo, una in direzione 5' 3', l'altra in direzione 3' 5'.

Alla periferia della molecola due solchi di diversa ampiezza sono il solco maggiore e il solco minore. Le eliche sono tenute insieme da legami idrogeno tra basi complementari e da interazioni di Van der Waals tra basi impilate. Nella doppia elica, le catene polinucleotidiche hanno sequenze diverse: una può avere qualsiasi sequenza, mentre l'altra deve essere complementare. Il DNA-Z è stato scoperto nel 1979 grazie alla determinazione della struttura di un cristallo di d(CGCGCG) da parte di Wang e Rich. Si tratta di una doppia elica sinistrorsa, con una punta di trapano sinistrorsa. L'unità ripetitiva è un di nucleotide d(XpYp) invece di un singolo nucleotide, dove X è di solito una pirimidina e Y una purina. La linea che unisce i gruppi fosfato successivi su un filamento polinucleotidico di DNA-Z procede quindi a zig zag intorno all'elica. Il DNA-Z è meno stabile del DNA-B perché le cariche negative dei gruppi fosfato sono molto più vicine tra loro rispetto al DNA-B, causando una maggiore repulsione.fra le basi azotate (A-T e G-C), legami idrogeno tra le basi complementari, interazioni idrofobiche tra le basi impilate, interazioni elettrostatiche tra i fosfati negativi e i cationi positivi (come il magnesio), interazioni van der Waals tra le basi e la doppia elica del DNA. La forma a doppia elica del DNA è fondamentale per la sua stabilità e funzionalità. La conformazione a zig zag del DNA levogiro, causata dalla presenza della forma sin del residuo purinico, può influenzare la struttura e la funzione del DNA. Inoltre, la presenza di anticorpi anti-DNA-Z in alcune malattie autoimmuni suggerisce l'esistenza del DNA-Z in vivo. La conversione reversibile di tratti di DNA nella conformazione Z può funzionare come un interruttore nella regolazione dell'espressione genica. Inoltre, la formazione di una tripla elica del DNA può essere coinvolta in processi biologici come la replicazione e la ricombinazione del DNA. In conclusione, la struttura e la conformazione del DNA sono fondamentali per la sua funzione e regolazione.

idrofobiche: gruppi idrofobici all'interno - gruppi idrofilici all'esterno, stabilizzano. Molecola del DNA fortemente asimmetrica.

Energia di impilamento: relativamente deboli (forze di Van der Waals) ma additive, stabilizza.

Legami a idrogeno: relativamente deboli ma additivi e facilitano l'impilamento, stabilizzano.

Interazioni elettrostatiche: causate da gruppi fosfato carichi negativamente, condizionano le interazioni intra e interfilamento, le forze repulsive possono essere neutralizzate da cariche positive, destabilizzano.

POSIZIONE DELLE COPPIE DI BASI NEL DNA:

Twist (asse avvitamento) Roll (asse roll-slide, determina solco minore e maggiore) Tilt

DNA si può piegare in maniera sequenza specifica, le perturbazioni dovute a A-T e G-C se sono disposte in maniera casuale, tendono a elidersi, se invece ci sono delle ripetizioni dello stesso tipo, posizionate sempre nella stessa direzione, si ottiene DNA curvo.

SEQUENZE RIPETUTE INVERTITE: palindromi,

sono chiamate forcine di trascrizione. Le sequenze invertite possono anche essere coinvolte nella formazione di loop di trascrizione, dove una sequenza invertita si appaia con una sequenza complementare all'interno della stessa molecola di RNA. Queste strutture a loop possono influenzare la stabilità e l'efficienza della trascrizione. Le sequenze invertite sono spesso coinvolte in processi di ricombinazione genetica, come la ricombinazione omologa e la ricombinazione non omologa. Durante la ricombinazione omologa, le sequenze invertite possono appaiarsi e scambiarsi tra le due molecole di DNA, portando a una riorganizzazione del materiale genetico. Durante la ricombinazione non omologa, le sequenze invertite possono causare l'incorporazione di frammenti di DNA estranei nel genoma. Inoltre, le sequenze invertite possono essere coinvolte nella formazione di strutture a quadrupla elica chiamate G-quadruplex. Queste strutture si formano quando sequenze di DNA ricche di guanina si appaiano tra loro e si piegano in una conformazione a quadrupla elica. I G-quadruplex possono influenzare l'espressione genica e sono stati associati a processi biologici come la replicazione del DNA e la regolazione trascrizionale. In conclusione, le sequenze invertite sono importanti elementi del genoma che possono influenzare la struttura e la funzione del DNA e dell'RNA. La loro presenza e la loro capacità di formare strutture alternative contribuiscono alla complessità e alla diversità del materiale genetico.

Di una sequenza ripetuta invertita nel DNA costituiscono una caratteristica comune e importante delle molecole di RNA, in particolare negli rRNA, nei tRNA e nei precursori dei miRNA. Consiste nella perdita dell'organizzazione tridimensionale della doppia elica, lasciando intatta la continuità delle singole eliche. Esse si separano e assumono una conformazione variabile nel tempo e da catena a catena, causata da agenti denaturanti fisici come riscaldamento, radiazioni ionizzanti, estremi di pH, elevate concentrazioni di sali, di sostanze che interferiscono con i legami a idrogeno, solventi organici, o trattamento con basi forti come il NaOH. Questo processo accompagna a modificazioni nelle proprietà chimico-fisiche del DNA. La denaturazione avviene tramite riscaldamento e raffreddamento rapido, mentre la rinaturazione avviene tramite riscaldamento e raffreddamento lento. Allontanando lentamente l'agente denaturante, eliche complementari si incontrano e riformano una doppia elica indistinguibile.

Da quella nativa, condizione necessaria affinché due catene polinucleotidiche formino una doppia elica è che le loro sequenze nucleotidiche siano complementari, fenomeno è indipendente dall'origine delle catene, quando provengono da DNA di origine diversa o sono una catena di DNA e l'altra di RNA si ha ibridazione degli acidi nucleici.

Basi azotate del DNA assorbono la luce ultravioletta a 260 nm (picco di assorbimento). Tuttavia la capacità di assorbire nell'UV varia a seconda che si considerino nucleotidi liberi, piccoli oligonucleotidi, DNA a singolo filamento o SS, DNA a doppio filamento o DS.

Curva di denaturazione del DNA: La Temperatura di melting Tm: temperatura alla quale metà delle molecole sono denaturate. La denaturazione avviene in un intervallo di temperature piuttosto ristretto. La Tm è proporzionale al contenuto in GC.

Cinetica di denaturazione termica del DNA:

1. Curva di denaturazione termica: sottoponendo il DNA a...

temperatura crescente l'assorbimento nell'UV aumenta gradualmente, poi cresce improvvisamente e successivamente va a plateau. Nella scissione di legami a idrogeno c'è un effetto cooperativo. La denaturazione inizia nelle regioni a maggiore contenuto di A+T (bolle di denaturazione). 2. Raffreddamento lento: se si raffredda lentamente il DNA denaturato l'ipercromismo rientra e il DNA si rinatura seguendo una curva che coincide esattamente (in senso inverso) con quella di denaturazione. La rinaturazione avviene perché il DNA cerca di raggiungere la forma energeticamente più stabile, ovvero di riformare il maggior numero possibile di legami a idrogeno. In genere si ottiene un refolding del 95%. 3. Raffreddamento rapido: l'ipercromismo non rientra. Viene quindi impedita la rinaturazione del DNA, questo avviene perché i primi appaiamenti di brevi regioni del DNA a temperature basse non sono seguiti da eventi di slittamento dei due filamenti che

Consentono il raggiungimento dellasituazione energetica più stabile come nel caso precedente. DNA per presenza di basi azotate assorbe la luce ultravioletta, in seguito a denaturazione l'assorbimento aumenta (effetto ipercromico). Tm o temperatura di melting o melting point: dipende da diversi fattori, dalla composizione in basi del DNA (%GC), dalla lunghezza della molecola (se <600), dalla forza ionica del tampone (> è la forza ionica > è la Tm), dalla presenza di agenti destabilizzanti l'elica come urea e formamide, dalla presenza di mismatch.

Cinetica di denaturazione del DNA: Denaturazione: forza ionica, Tm, %GC. IBRIDAZIONE MOLECOLARE: rinaturazione. Sonde oligonucleotidiche complementari ad una sequenza specifica di DNA (target DNA). Lavaggio: serve a rimuovere gli oligonucleotidi che non si sono legati alla sequenza target. Denaturazione termica/chimica+ Ibridazione: le sonde si appaiano unicamente con la sequenza target, formando legami

H

tra le basi c