Biologia molecolare

Biologia molecolare

Struttura del DNA

Il DNA si trova nel nucleo o nei mitocondri. DNA = acido deossiribonucleico, RNA = acido ribonucleico. La conservazione e la trasmissione dell’informazione genetica sono le funzioni peculiari del DNA. Il DNA è un polimero formato da una catena ripetuta di nucleotidi (monomeri) ciascuno formato da:

• Gruppo fosfato
• Zucchero deossiribosio (DNA) o ribosio (RNA)
• Base azotata

La differenza di base dei due zuccheri è l’assenza di un gruppo ossidrilico in posizione 2 nel deossiribosio. Le basi eterocicliche presenti negli acidi nucleici appartengono a due classi:

• Pirimidine: citosina, uracile e timina
• Purine (pirimidina+imidazolo): adenina e guanina

Adenina: in posizione 6 abbiamo un gruppo amminico. Guanina: in posizione 2 abbiamo un gruppo amminico e in posizione 6 un gruppo carbonilico. Citosina: in posizione 4 abbiamo il gruppo amminico. Uracile: in posizione 4 abbiamo il gruppo carbonilico. Timina: è una 5-metil-uracile, ovvero ha un gruppo metilico in posizione 5.

I monosaccaridi degli acidi nucleici sono:

• 2-deossi-D-ribosio (DNA)
• D-ribosio (RNA), in posizione 2 abbiamo il gruppo ossidrilico che non è presente nel deossiribosio

DNA e RNA

L’uracile e il ribosio sono presenti solo nell’RNA. La timina e il deossiribosio sono presenti solo nel DNA. L’adenina, la guanina, la citosina e il gruppo fosfato sono comuni ad entrambi.

Nucleosidi

Il nucleotide è la composizione di zucchero base + gruppo fosfato, ma quando parliamo di nucleoside ci riferiamo solo al legame tra lo zucchero e la base azotata. Quando al ribosio sarà legata la base azotata avremo i ribonucleosidi: adenosina, guanosina, citidina e uridina. Quando al deossiribosio sarà legata la base avremo i deossi-ribonucleosidi: 2-deossiadenosina, 2-deossiguanosina, 2-deossicitidina e la timidina. Il legame tra zucchero e base azotata è un legame di tipo beta-glicosidico. Il legame beta-glicosidico si forma tra il carbonio anomerico (C1) del ribosio e l’azoto in posizione 9 (nelle purine) o in posizione 1 (nelle pirimidine). Il legame può avere due tipi di orientazione: Syn e Anti. L’orientazione di tipo Anti è quella predominante.

Nucleotidi

I nucleotidi sono esteri fosfato dei nucleosidi, quindi per perdita di una molecola d’acqua dal nucleoside si forma il nucleotide. L’acido fosforico perde una molecola d’acqua e si lega al carbonio 5 dello zucchero. Il sito di fosforilazione è quindi quasi sempre all’ossidrile del carbonio 5 dello zucchero e la fosforilazione può essere mono-, di- e tri-fosfato (uno, due o tre gruppi fosfato). Il legame tra il fosfato e l’ossidrile in C5 è un legame estereo, mentre i vari gruppi fosfato sono legati da un legame fosfoanidridico.

Nomenclatura e funzioni dei nucleotidi

I nucleotidi sono:

• Unità strutturali degli acidi nucleici
• Deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato
• Mediatore di processi cellulari (cAMP)
• Parte di coenzimi (NAD, FAD, CoA)

Le strutture del DNA

Le strutture del DNA sono primaria, ovvero la sequenza di nucleotidi che costituiscono la molecola, secondaria, ovvero la configurazione tridimensionale stabile e terziaria, ovvero il ripiegamento del DNA nella cellula.

Struttura primaria

Si ha la formazione del legame fosfodiesterico, ossia come vanno ad interagire tra di loro due nucleotidi. Questa reazione è possibile se il gruppo ossidrilico in posizione 3 dello zucchero va a reagire con il fosfato in alfa del nucleotide che dovrà legarsi ad esso, con conseguente rilascio di un pirofosfato. Per cui si ha uno scheletro formato da residui di zucchero e di fosfato alternati, quindi la posizione 3’ di uno zucchero è legata alla posizione 5’ dello zucchero successivo mediante un gruppo fosfato; le basi azotate non fanno parte dello scheletro ma sporgono fuori dallo scheletro. L’alternanza tra zuccheri e fosfati è la caratteristica strutturale del DNA costante, mentre l’ordine delle basi lungo la catena è casuale. Le catene di DNA hanno un’estremità detta 5’ ed un’altra detta 3’.

Struttura secondaria

La struttura secondaria è data dal modello di Watson-Crick, ovvero il DNA è una molecola formata da due catene di nucleotidi appaiate secondo la regola della complementarietà andando a formare la cosiddetta doppia elica. Sarà un’elica destrorsa, costituita da due catene polinucleotidiche antiparallele (una catena in 5’-3’ e l’altra in 3’-5’) e le basi sono all’interno dell’elica allineate ad angolo retto con l’asse dell’elica. Le basi si legano per appaiamento: ogni base presenta su un filamento forma un legame con la base posta sul filamento opposto. Tale evento è noto come appaiamento complementare.

I gruppi funzionali che permettono la formazione di 3 legami a idrogeno tra guanina e citosina sono: il gruppo carbonilico in posizione 6 della guanina che formerà un legame con il gruppo amminico in posizione 4 della citosina, l’azoto in 1 della guanina che formerà un legame con l’azoto in 3 della citosina attraverso l’H portato dall’N1 e in ultimo il gruppo amminico in posizione 2 della guanina che formerà un legame con il carbonio carbonilico in posizione 2 della citosina. I gruppi funzionali che permettono la formazione di 2 legami a idrogeno tra adenina e timina sono: il gruppo amminico in posizione 6 dell’adenina che formerà un legame con il gruppo carbonilico in posizione 4 della timina e l’azoto in posizione 1 dell’adenina che formerà con il suo idrogeno un legame con l’azoto in posizione 3 della timina.

Caratteristiche strutturali del DNA secondo Watson e Crick

• La distanza tra due coppie di basi azotate è sempre di 0,34 nm
• Per ogni volta che l’elica gira intorno all’asse (giro d’elica) ci sono 10 coppie di basi e avremo una distanza di 3,4 nm

Quello che hanno dedotto Watson e Crick è stato che le due coppie di basi hanno esattamente lo stesso ingombro trasversale, presentano gli zuccheri in modo tale da avere una distanza non dissimile dalle due coppie (11,1 A) ed è una caratteristica costante nel DNA perché i legami a H tra le basi non sono gli unici legami che stabilizzano il DNA, ma dobbiamo considerare anche tante altre interazioni che sono quelle che portano all’impilamento tra le basi. Ossia si stabiliscono tra le basi azotate disposte una sull’altra delle forze che tendono a fare in modo che le basi rimangano impilate l’una sull’altra e si dispongano in maniera parallela tra di loro. Lo faranno in maniera tale da evitare che ci sia un contatto con le basi azotate con l’acqua, in modo da stabilizzare la struttura del DNA. Tra le basi impilate si stabiliscono interazioni idrofobiche e delle interazioni di van der Waals.

Può capitare che alcune basi all’interno di questa struttura siano rivolte verso l’esterno dell’elica, questo fenomeno prende il nome di base flipping, un fenomeno che si può verificare quando il DNA deve essere riparato, ovvero se è una base danneggiata che deve essere rimossa, la base si sposta verso l’esterno e permette l’interazione con quegli enzimi che serviranno per ripararla; oppure può succedere che questa base si sposti verso l’esterno perché deve essere modificata per rendere il DNA più o meno accessibile alle proteine (es. metilazione del DNA). Questo però è un evento che ha un altro costo energetico, quindi verrà messo in atto solo se necessario (ovvero in caso di danneggiamento del DNA o in caso di regolazione genica di quel DNA).

All’interno della struttura del DNA, a parte le interazioni covalenti che si verificano a livello dello scheletro del DNA (zucchero-fosfato), abbiamo una serie di interazioni non-covalenti che sono:

• Forze di van der Waals (interazioni da impaccamento fra le basi impilate, sono additive)
• Legami idrogeno: tra le basi azotate appaiate di filamenti opposti
• Effetti idrofobici: escludendo molecole H₂O dall’impaccamento delle coppie di basi si rafforzano i legami H
• Interazioni carica/carica legata alla presenza di gruppi fosfato all’interno della struttura del DNA, che andranno poi ad interagire con delle cariche positive presenti sugli AA che serviranno per impacchettare il DNA, ovvero gli istoni

Queste interazioni non-covalenti vanno a stabilizzare la doppia elica del DNA. Tornando al discorso dei legami che si formano tra le coppie di basi, perché un’adenina e una citosina non possono legarsi? Perché, pur sempre rispettando la distanza tra gli zuccheri di 11,1 A, si troveranno davanti due gruppi donatori e all’interno ci saranno due gruppi accettori (i due azoti) e quindi non si formano gli appropriati legami H e le basi non si legano, per cui la coppia fra queste basi risulta instabile.

Dato il diametro costante dell’elica le basi si troveranno sempre verso l’interno e avranno limitate possibilità di combinazione, legata proprio alla possibilità di formare legami H. Avremo sempre una grossa base purinica che si trova di fronte a una piccola base pirimidinica. Impossibili le combinazioni:

• Purina-purina, anche se teoricamente si potrebbero formare dei legami H, cambiano le distanze tra gli zuccheri per cui quella struttura non si forma (si allargherebbe la struttura)
• Pirimidina-pirimidina, perché al contrario andrebbero a ristringere la struttura dello scheletro
• Purina-pirimidina incompatibili tra di loro per impossibilità di formare legami H come ad esempio adenina-citosina

Quando le catene girano una intorno all’altra si può vedere un’altra caratteristica importante della struttura del DNA che è quella della formazione di due solchi: un solco maggiore e un solco minore che hanno ampiezza diversa. Il solco maggiore avrà un’ampiezza di 22 A e sarà più profondo e largo; mentre il solco minore avrà un’ampiezza di 12 A e sarà più stretto e superficiale. È proprio a livello di questi solchi che andranno ad interagire le proteine, vedremo che quasi tutte le proteine che interagiscono con il DNA lo fanno a livello del solco maggiore perché ci sarà una maggiore accessibilità da parte delle proteine nel solco maggiore piuttosto che nel solco minore. (soprattutto i fattori di trascrizione andranno a legarsi nel solco maggiore). Ci sono però anche delle proteine che legano nel solco minore quando il DNA deve compattarsi all’interno del nucleo oppure quando deve iniziare il processo di trascrizione.

Il motivo per il quale le proteine si legano maggiormente al solco maggiore non è solo per una questione di accessibilità, ma anche perché il solco maggiore può essere letto più facilmente rispetto al solco minore. Vediamo i diversi casi:

• G-C, i gruppi funzionali delle basi esposti nel solco maggiore sono diversi dai gruppi funzionali esposti nel solco minore (come nel caso di A-T). Nel solco maggiore avremo un gruppo accettore, accettore, donatore e un idrogeno non polare e nel solco minore avremo un accettore, donatore e accettore.
• C-G, avremo nel solco maggiore un idrogeno non polare, donatore, accettore e accettore e nel solco minore avremo accettore, donatore e accettore (come nella coppia G-C)
• A-T, avremo nel solco maggiore un accettore, donatore, accettore e gruppo metilico e nel solco minore avremo accettore, idrogeno e accettore
• T-A, avremo nel solco maggiore gruppo metilico, accettore, donatore e accettore e nel solco minore avremo accettore, idrogeno e accettore (come nella coppia A-T)

Possiamo notare che il solco minore se lo leggiamo in direzione A-T o T-A o in direzione G-C e C-G sono indistinguibili; quindi una proteina che deve andare ad interagire con il solco minore se si trova davanti una coppia G-C o C-G si trova davanti gli stessi gruppi funzionali e non li distingue, invece se va ad interagire con il solco maggiore si trova davanti una coppia G-C rispetto a una coppia C-G, o una coppia A-T rispetto a una coppia T-A, vede gruppi funzionali diversi e sarà in grado di distinguerli.

Regole di Chargaff (1950)

Nel DNA la quantità di adenina (A) è sempre uguale alla quantità di timina (T) e la quantità di citosina (C) è sempre uguale alla quantità di guanina (G). Di conseguenza il quantitativo di basi puriniche (A+G) è sempre uguale al quantitativo di basi pirimidiniche (C+T). Conoscendo questo saremo sempre in grado di definire la percentuale di composizioni in basi di un frammento di DNA. Se la quantità di Adenina è del 32%, di conseguenza la quantità di Guanina sarà 18%. Perché Adenina+Timina= 32+32= 64%, 100-64= 36% di Guanina-Citosina, per cui avremo che la quantità di Guanina sarà 36/2=18%.

Il rapporto tra le A+T e C+G non è più uguale a 1, ed è caratteristico per ogni specie ed è spesso utilizzato nella classificazione degli organismi. Ovvero da questo rapporto siamo in grado di valutare il contenuto in C e in G; questo contenuto in G e in C sarà diverso nei vari organismi ed è stato scoperto che il genoma dei vertebrati è un mosaico di segmenti di DN che hanno una definita composizione in basi e una definita percentuale di basi G-C, questo modello è stato definito modello delle isocore che è appunto un modello che ha permesso di classificare i vari organismi. Nei vertebrati la %G-C è sempre nell’ordine dei 40-45%, nei batteri è molto più variabile (20-80%). Si è visto che i vertebrati hanno una più complessa organizzazione all’interno del genoma e si è iniziato a studiare la distribuzione dei nucleotidi all’interno del genoma. Noi sappiamo che meno del 5% del genoma è quello che serve per codificare le proteine e fino a poco tempo fa veniva considerato DNA spazzatura; in realtà non è così ma tutta quella parte ha una sua funzione.

Dall’importanza di sapere la composizione in basi del DNA è venuta fuori la teoria delle isocore che dice che all’interno di un genoma ci sono dei cluster di frammenti che possono essere distinti tra di loro per la %G-C e la diversa composizione in basi G-C di un genoma caratterizzerà quel genoma. Per definire questa struttura (per la teoria delle isocore) sono stati fatti dei frazionamenti composizionali utilizzando delle ultracentrifughe e sono riusciti a vedere che ci sono varie famiglie che loro hanno definite con i codici L1, L2, H1, H2 e H3 (che stanno ad indicare bassa densità o alta densità sulla base della %G-C presenti). Questa definizione di queste varie famiglie ha permesso di creare dei grafici in cui si è visto, sulla base della %G-C, quelli che sono a maggiore o minore densità genica. Hanno quindi definito che il genoma è un mosaico di segmenti di DNA e ogni frammento ha un suo preciso contenuto in G-C. questo dato è importante saperlo perché in base a questa % possiamo provare a definire qual è il ruolo funzionale di quella regione di genoma o possiamo definire in che modo e dove vivono gli organismi. Quindi una cosa che hanno fatto questi scienziati è stato andare a vedere come cambia la presenza di queste famiglie di isocore nei vari organismi e hanno visto che ad esempio nell’uomo, nello scimpanzé, nel cane, nel topo hanno tutti più o meno una distribuzione quasi simile tra le varie densità di gruppi G-C, ma si sono accorti che cambiando tipo di organismo (es. pesci) questa composizione cambia molto, ossia si aveva maggior quantità di %G-C (il DNA quindi era più stabile poiché vi erano più legami H). Quindi organismi che devono vivere in condizioni ambientali più estreme hanno più necessità di avere un DNA più stabile (e questa stabilità sarà legata alla %G-C). I vari organismi possono essere suddivisi sulla base della maggiore o minor presenza nel complesso di segmenti che hanno la diversa percentuale di basi GC. La classificazione di organismi in basi GC è stata possibile e ci ha fatto comprendere perché c'è questa diversa percentuale in basi, sulla base del fatto che alcuni organismi necessitano di vivere in condizioni più estreme, quindi hanno necessità di avere un DNA che abbia maggiore stabilità e di conseguenza, gli anfibi, i rettili o alcuni tipi di pesci hanno una composizione più eterogenea rispetto a quanto può avere un uomo o cane/scimpanzé.

Come cambiano da diversi organismi, le varie isoforme (low e high) in percentuale in base GC? In particolare, cambia la diversa presenza in ogni singola isocora. Possibile alcune coppie di nucleotidi. Coppie contigue di basi azotate: è stato visto quali erano più o meno presenti nelle diverse famiglie di isocore di cui è possibile fare una stratificazione. Tra tutte le possibili coppie di basi, quella che è meno presente in tutti gli organismi ed in tutte le famiglie è il dinucleotide CG; è molto importante perché queste basi CG, questa coppia di nucleotidi, è poco rappresentata per un motivo: queste citosine che si trovano nella struttura genomica, in contiguità con delle guanine, in quelli che sono i siti CpG, dove la P sta per gruppo fosfato che lega i due nucleotidi che portano queste basi azotate, sono sottorappresentate a livello del genoma, perché queste citosine hanno la tendenza ad essere metilate (possono subire una metilazione). La metilazione che possono subire è a livello del carbonio in 5. Se avviene questa modificazione, che avviene spesso nel DNA, una 5-metilcitosina, quando subisce deaminazione, una mutazione