Biologia molecolare

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Le molecole biologiche sono DNA, RNA, proteine ma anche zuccheri come i glucidi, carbonio, lipidi.

• Perché tanta enfasi sui geni e sul Dna anche se le biomolecole sono molte di più? Ogni

reazione metaboliche di una cellula è catalizzata da enzimi che le svolgono; quindi, per noi

Dna e proteine dirigono gli enzimi che codificano le reazioni. Senza essi che coordinano non

avverrebbero le reazioni. Hanno le chiavi del sistema vitale stesso e la trasmissione in

generazione in generazione, permettono di organizzare tutte le molecole presenti nella

cellula.

• Cosa sono i catalizzatori? Una molecola che aumenta la velocità di reazione senza farne

parte ed essa abbassa l’energia di attivazione ma non basta, essi non cambiano l’equilibrio

della reazione quindi il catalizzatore aumenta la velocità di reazione diretta e inversa della

stessa velocità = catalisi fondamentale per la vita.

L’aumento della quantità del catalizzatore di una reazione, esso velocizza il raggiungimento

dell’equilibrio fra reagenti e prodotti.

• La termodinamica della reazione non cambia neanche quanto c’è un catalizzatore.

I problemi più importanti della biologia molecolare/genetica molecolare sono sempre stati:

• Come sono codificate le informazioni genetiche? Le informazioni genetiche di ogni

organismo sono le stesse per ogni individuo, le differenze dipendono solo dalla loro

trasformazione in caratteri.

• Il codice genetico non è il genoma.

• Il genoma è l’insieme di tutti i nucleotidi ed è chiamato patrimonio genetico.

• Quanti livelli di codifica genetica esistono? Tanti livelli diversi

legati insieme. Il CODICE GENETICO (la tabella di

corrispondenza tra triplette di nucleotidi e amminoacidici) è

memorizzato nelle cellule attraverso il tRNA che coglie le

differenze tra gli amminoacidi. Quindi le aminoacil-tRNA

sintetasi stabiliscono il codice genetico. Ma esse sono a loro

volta delle proteine che sono sintetizzate da ribosomi; quindi,

in nostro sistema vitale resta in vita grazie ad un altro sistema

vitale, questo è il ciclo della vita.

Il codice genetico è memorizzato nell’ aminoacil-tRNA.

Riconoscono il tRNA e lo appaiono al giusto amminoacido.

RNA è una molecola genetica e i ribozimi sono enzimi fatte di RNA-catalitico che sintetizza

le reazioni chimiche come gli enzimi ma invece sono proteine.

Gli amminoacil-tRNA sintetasi sono una classe di enzimi costituita da membri che hanno una

selettività per un amminoacido (quello che lega l’alanina sarà l’alanil-tRNA sintetasi), l’enzima lega

l’amminoacido da una parte e interagisce solo con il tRNA che ha l’anticodone dell’amminoacido a

cui sono legati. L’enzima attiva l’amminoacido e lo legano al tRNA. Stabiliscono l’accoppiamento

tra l’amminoacido e il tRNA con l’anticodone specifico. Siccome l’anticodone poi viene utilizzato

per legare il tRNA all’mRNA, questi enzimi sono responsabili dell’accoppiamento tra amminoacido

e il gusto codone del messaggero. Questi enzimi memorizzano il codice genetico.

Nel genoma è presente una parte cioè le istruzioni per montare le amminoacil-tRNA sintetasi ma

queste istruzioni devono essere interpretate da amminoacil-tRNA sintetasi che esistono già e che

devono essere passate insieme al patrimonio genetico alla cellula figlia. 2

I geni del genoma umano sono circa 23000 (mila). Noi produciamo anticorpi ovvero proteine, un

organismo come il nostro produce circa variati milioni di immunoglobuline.

Questo è un esempio di codifica «non del tutto convenzionale», la sorgente della diversità delle

immunoglobuline.

Fatti da due catene: leggera e pesante. La zona dell’anticorpo che lega antigene è fatta entrambe

le due catene, esse sono fatte da due geni che nel genoma sono molto peculiari che essi per

funzionare devono essere riarrangiato geneticamente.

Infatti, i geni delle immunoglobuline durante la maturazione perdono e tengono dei pezzi che

permette che essi (linfociti B e T) siano diversi.

La catena leggera è formata da una linea germinale formata da geni V1 a V40 e geni a J1 a J5.

Invece la catena presenta ha nella linea germinale con geni da V1 a V51, D1 a D27 e geni da J1 e J6.

Di questi geni V51 nel riarrangiamento viene selezione un solo V51 e un solo D27 e un solo J6

nella catena pesante, e uno tra V40 e J5 nella catena leggera. Quindi ci sono 51 x 27 x 6 catene

pesanti e 40 x 5 catene leggere, e a volte ci sono anche delle mutazioni. Dopo questo processo la

linea di DNA germinale della catena pesante e leggera si lega a un antigene.

Ecco il perché noi produciamo milioni di anticorpi con solo 25 mila geni. Ovviamente il caso ha il

suo ruolo importante.

Non c’è un solo gene della catena pesante uno della genata leggera, perché noi siamo organismi

diploidi quindi ogni linfocita hanno 4 geni. NO! SBAGLIATO!

Il taglio della linea germinale della catena è un fenomeno difficile e perché il linfocita sopravvia

deve fare un taglio corretto sia nella catena leggera e una nella catena pesante; quindi, la maggior

parte dei linfociti muoiono perché non riescono a fare correttamente il taglio. Chi sopravvive o no

è dato dal caso.

Questo riarrangiamento è DEFINITIVO!! 3

Cosa impariamo dalla dimensione dei genomi

Scala logaritmica per il fatto che ci sono i 10

elevati a una potenza.

Il numero di nucleotidi nei vari organismi varia di 6/7

6 12

ordini di grandezza, si va da un po’ meno di 10 a 10

C’è corrispondenza tra complessità del genoma e

la sua grandezza? NO!

Ma c’è una corrispondenza tra la dimensione

MINIMA del genoma e la complessità del phylum

o della classe.

È una scala che comprende la complessità

dell’organismo e non del grado di evoluzione.

Si può trasmettere un’informazione genetica ad individui differenti, ad esempio da un batterio a

un eucariote e viceversa, e questa verrà tradotta nella stessa maniera. Il codice genetico non

differisce da specie a specie ma nemmeno da regno a regno. È universale.

Esempio: Il tritone ha un genoma molto grande per il fatto che le sue cellule cercano di mantenere

tutte le informazioni anche inutili, e quindi anche DNA ripetuto più volte quindi con informazioni

spazzatura con il quale l’individuo potrebbe vivere correttamente anche senza.

DOMANDA: il genoma umano contiene: un numero di geni circa dieci volte superiore di quello del

genoma di un tipico batterio. (Batteri geni 4 mila geni e noi circa 23 mila).

Se si guarda la dimensione minima per gruppo, questa è più correlata alla complessità. Il

minimo dei genomi degli uccelli e dei pesci è decisamente spostato rispetto al minimo dei

genomi degli organismi unicellulari o dei vegetali che sono organismi più semplici. Non si può

scendere sotto un certo numero di geni quindi per essere un animale ci vogliono un certo

numero di geni, non si può scendere sotto quel minimo. Per aumentarlo ci vuole poco, si

possono aggiungere parti che non servono. I geni delle amebe e delle felci sono pieni di parti

che non servono. Il genoma minimo diventa più grande man mano che la complessità

dell’organismo aumenta.

Se guardiamo i genomi batterici, si vede che c’è una correlazione precisa tra numero di geni e

lunghezza in paia di basi. Dal punto di vista delle dimensioni e soprattutto dal rapporto tra il

numero di geni e il numero di paia di basi, archea e batteri mostrano lo stesso tipo di

andamento anche se gli archea sono molto differenti dai batteri. C’è un rapporto di circa 950

geni/Mb (mega base cioè un milione di paia di basi), i geni dei batteri e degli archea, in media,

sono lunghi 1000 paia basi. Se esaminiamo la dimensione in termine di geni e in termine di

nucleotidi negli eucarioti, si nota che la situazione cambia. Ad esempio, per l’uomo

apparentemente i geni sono 320 volte più grandi rispetto a quelli dei batteri. In realtà non è

così, questo è dovuto al fatto che il nostro genoma non contiene soltanto geni ma contiene

anche molto altro, una componente del nostro genoma non è costituita da geni. Questo 4

paradosso di dislivello tra numero di geni e la quantità di DNA negli eucarioti rapportata ai

batteri viene chiamato paradosso C. Genomic dark matter (materia oscura genomica), è tutto

ciò che non è un gene o una struttura regolatoria ospita nel genoma degli eucarioti.

Cosa è un gene?

È un’unità funzionale del DNA che viene trascritta in RNA che può codificare una proteina ma

ricorda una proteina può essere ricombinata con lo splicing e quindi non ci può essere un gene per

una sola proteina perché essa può avere varie forme derivate dallo splicing.

Specie Caratteristiche Paia basi Geni

3

(x10 )

Mycoplasma genitalium Genoma più piccolo noto 580 468

Escherichia coli Tipico batterio di laboratorio (Gram -) 4 639 4 289

Batterio causa dell’ulcera gastrica

Helicobacter pilori 1 667 1 590

Bacillus subtilis Altro batterio da laboratorio (Gram +) 4 214 4 099

Thermatoga maritima Batterio termofilo marino 1 860 1 877

Methanococcus jannaschii Archeo litotrofico metanoproduttore 1 664 1 750

Archaeoglobus fulgidus Archeo solfato-riduttore litotrofico 2 178 2 493

Aeropyrum pernix Archeo estremotermofilo 669 2 620

Saccaromyces cerevisiae Modello minimo di eucariote 12 069 ~6 300

Arabidopsis thaliana Modello standard per angiosperme ~142 000 ~26 000

Caenorhabditis elegans Modello animale più semplice ~97 000 ~19 000

Drosophila melanogaster Modello chiave per genetica e sviluppo ~137 000 ~14 000

Homo sapiens Mammifero più studiato ~3 200 000 ~30 000

Dimensioni relative dei genomi e numero di geni:

• arancione= batteri

• blu= archea

• giallo= eucarioti.

Archei e Batteri hanno più o meno lunghi 950 geni.

L’uomo sapiens ha mille volte un nucleotide in più dei batteri ma in realtà abbiamo solo 5 volte più

geni, e non 10 volte, questo perché abbiamo introni ed esoni e hanno ¼ del nostro genoma.

Quindi si hanno Genomi diversi in grande e numero di nucleotidi che comporta differenze di

riproduzioni, ma questi genomi non variano tanti a livello di geni. 5

Ancora meno differenza c’è se guardiamo le famiglie geniche ovvero è un gruppo di geni che

mostrano una certa similarità di sequenza di DNA e derivano tutti da un gene ancestrale comune.

L'evento biologico che sta alla base delle famiglie geniche è

la duplicazione genica seguita da fenomeni di divergenza

Evolutivamente c’è stato un aumento dei geni ma un

limitato aumento dei «tipi» di geni. Sono cioè aumentati i

membri di famiglie geniche formate da geni correlati.

Quindi il genoma di 25 mila geni può essere raggruppato in

famiglie di geni che hanno simile caratteristiche (es. sono

tutte auto ma di diversi modelli).

Tutti i pluricellulari hanno un simile numero di famiglie

geniche invece il numero di geni totale è molto più ampio

durante l’evoluzione.

DOMANDA: Nel genoma umano il numero di famiglie geniche: è dello stesso ordine di grandezza

delle famiglie geniche in Drosophilia, mosca. Stesso ordine di grandezza=11000 e 17000.

Tutti i membri di una famiglia genica derivano da un gene ancestrale comune!

Durante l’evoluzione si è osservato un aumento dei membri delle famiglie geniche ma il numero di

famiglie è rimasto costante.

Il crossing over ineuguale:

Uno dei motori importanti di questo tipo di

evoluzione genomica risiede nel crossing-over

ineguale, che può generare copie aggiuntive di

geni, le quali possono «liberamente» divergere

dall’originale senza necessariamente abbassare

la fitness dell’individuo.

Nel crossing over normale alla fine si hanno due

geni normali con uno o due geni scambiati.

Nel crossing over ineguale alla fine si hanno

cromosomi diversi fatti con geni ineguali, con

uno con una coppia e uno con 3 geni e i gameti

con queste modifiche vengono utilizzati può

causare anche la morte dell’individuo di solito

muore a chi manca un gene, difficilmente si

muore perché si ha un gene di troppo.

Se l’individuo sopravvive si avranno 3 geni che

possono essere tutti attivi oppure no. Dal

momento che un genoma ha una copia in più del gene ed è

vitale, a questo gene aggiunto possono essere attribuiti compiti differenti che non potevano

essere attribuiti ai geni già presenti perché erano già importanti per altre funzioni.

→QUESTO È IL PRINCIPIO DELL’EVOLUZIONE. 6

In questo modo si sono generate famiglie geniche come il cluster (classi diverse) delle globine, i cui

membri hanno assunto caratteristiche funzionali leggermente differenti e funzionali allo sviluppo

dell’organismo. Attraverso l’analisi comparativa delle sequenze delle isoforme dell’emoglobina è

possibile risalire ad una cronologia della loro divergenza. Queste date ( di milioni di anni fa)le

sappiamo approssimamente attraverso l’analisi della documentazione fossile per vedere le

divisioni passate e confrontarle con quelle attuali.

Studiare l’evoluzione dei genomi è importante per sapere come costruire test genetici specifici

(bisogna sapere che spesso il genoma ha dei geni che si assomigliano quindi bisogna essere

sicuri di rilevare quel determinato gene e non un gene simile ad esso) e per cercare dei farmaci

specifici che agiscono su determinati tipi di organismi ma non su altri (alcuni organismi hanno

enzimi diversi dai nostri perché hanno avuto divergenze in momenti differenti e quindi un

farmaco specifico agirà su questi enzimi senza agire sulla cellula ospite).

EXON SHUFFLING:

Un'altra linea di cambiamento dei genomi è il RIARRANGIAMENTO ESONICO (EXON SHUFFLING)

ovvero vediamo tra geni non correlati ci sono dei moduli, domini funzionali comuni ovvero

utilizzati in entrambi i geni. Ad esempio nel fattore nono e nella urochinase hanno la stessa

struttura modulare di una proteina (blocchetto marrone ripetuto).

I nostri genomi sembrano che siano stati costruiti partendo da un numero limitato

di elementi che vengono riarrangiati in modi differenti.

Quindi vari moduli si trovano «riutilizzati» in molte proteine non correlate

come funzione e che non sono derivate l’una dall’altra attraverso

duplicazione e diversificazione.

ESONI E INTRONI= Questo fenomeno collega l’evoluzione con

l’esistenza stessa dell’organizzazione di esoni ed

introni. Abbiamo un genoma formato da introni ed esoni, gli introni esistono per far sì che

esistono gli esoni. Gli esoni nell’evoluzione sono stati riarrangiati. Si osserva che i moduli che

compongo i vari geni sono contenuti integralmente negli esoni (un esone corrisponde ad un

modulo oppure due esoni corrispondono a un modulo). Gli esoni sono una base favorevole per i

riarrangiamenti genomici. Gli introni si autodefiniscono come tali grazie alle loro estremità di

inizio e di fine, un introne viene riconosciuto dai meccanismi di splicing come tale grazie alla

sequenza iniziale e a quella finale. Tutti gli introni hanno estremità compatibili cioè tutte le

estremità di inizio sono compatibili con le estremità finali. Gli introni sono circa 10 volte più

lunghi degli esoni, quindi un gene che si rompe, si romperà a livello di un introne che è molto

più lungo

RICORDA= tutti gli introni sono delimintati da brevi sequenze iniziali e finali uguali che si

conservano. I riarrangiamenti casuali all’interno di sequenze codificanti, possono essere

facilmente produttivi grazie al fatto che gli introni sono molto più grandi (10 volte) degli esoni e

che sono delimitati da sequenze brevi e conservate. 7

Esempio= ho due geni, gene 1 e gene 2. Se un frammento casuale del gene 1 si rompe (sia

composto da due introni che circondano un esone), la cosa più facile che accada è che questo

pezettino si inserisca in un nuove gene e si inserisca nella parte intronica del nuovo gene. Quindi,

l’introne chimerico funziona come un introne normale e quindi potrà andare incontro ad uno

splicing normale. Se questo gene viene trascritto, si formerà un nuovo RNA messaggero in cui è

stato aggiunto un esone in più.

Gene1 Frammento casuale del gene 1

(nuovo) Gene2 Nuovo messaggero

L’esone che è stato aggiunto può contenere un modulo funzionale che potrà aggiungere

una funzione alla proteina che viene trascritta dal gene. È più facile ottenere proteine con un

significato funzionale riarrangiando dei pezzetti già funzionanti piuttosto che riarrangiando i

singoli nucleotidi all’interno di un gene.

Questo meccanismo non ha niente a che fare con lo splicing che è un fenomeno che avviene

quotidianamente in tutte le cellule che devono esprimere dei geni. Il riarrangiamento esonico

avviene su scala evolutiva, gli esoni costituiscono dei mattoncini con i quali il genoma viene

costruito attraverso riarrangiamenti. I moduli che costituiscono le proteine sono contenuti nei

singoli esoni o in una coppia di esoni adiacenti. È come se questi moduli fossero contenuti negli

esoni.

Questo metodo favorire il RIARRANGIAMENTO per il fatto che è molto più facile riarrangiare un

gene già conosciuto rispetto che a riarrangiare moduli sconosciuti o fa creare dal nulla. Questo è

stato fatto nelle proteine funzionali. L’evoluzione ha sfruttato la possibilità di riarrangiare

blocchetti funzionali per generare delle nuove proteine funzionali. 8

QUALE È LA CAUSA DEI RIARRANGIAMENTI DEL DNA?

• In alcuni casi si tratta di eventi casuali, dovuti al fatto

che il DNA si trova in un ambiente acquoso (l’acqua è una sostanza reattiva che provoca

l’idrolisi del