Biologia molecolare

DNASoluzione C: Distribuisco il roll su tutte le coppie di basi, ma non posso inserire lo stesso valore per tutte le coppie se no otterrei la struttura a super elica di prima. Devo stare attento che il segno corrisponda alla fase dell'elica del DNA. Quindi la soluzione più fattibile è proprio quest'ultima. Ogni coppia di base ha valori di roll compresi fra -10 e +10 gradi. Roll distribuito su una funzione periodica rendendo la molecola più flessibile e capace di eseguire dei ripiegamenti che consentono all'elica di tornare su se stessa.

Alcuni batteri hanno trovato un vantaggio nel creare delle strutture in cui il DNA è piegato a forcina; In questo modo saranno, per esempio, possibili le interazioni fra proteine collocate in punti diversi del DNA e che in una conformazione lineare risulterebbero troppo lontane fra di loro. Ma come fanno i batteri ad ottenere queste strutture piegate?

I batteri contengono delle sequenze A-tract. Ogni blocchetto

in direzione 5'-3' e in direzione 3'-5' mostrano una perfetta complementarità e risultano palindrome. Dal punto di vista strutturale, possiamo definirla una sequenza simmetrica cioè, se viene traslata in una doppia elica, avrà un asse di simmetria che punta verso di noi. In più possiamo anche trovare ripetizioni speculari che apparentemente sembrano sequenze palindromiche ma in realtà sono sequenze che si ripetono con un asse di simmetria attorno al quale dobbiamo ruotare di 180 gradi per ottenere la sovrapposizione. Queste sequenze, in virtù di questa simmetria, determinano:

• un riconoscimento specifico da parte di una proteina.
• Formazione di forcine (deve esserci però uno spaziatore di 4 basi)

Un'altra struttura che la sequenza del DNA può assumere è la tripla elica: l'elica per alcuni tratti, non molto estesi, presenta tre filamenti.

COME SI FORMANO? Queste strutture sfruttano la capacità

Denaturazione e Rinaturazione della doppia elica

Questo DNA è soggetto all'urto delle molecole d'acqua che hanno una certa cinetica la quale dipende dalla temperatura. Le molecole d'acqua colpiscono il DNA e fanno si che la sua forma sia più raccolta, aggrovigliata. Se l'energia di queste molecole d'acqua aumenta (T alte intorno a 80 gradi), urtano il DNA modificandone la forma e rompendo i legami fra i due filamenti.

Quindi i filamenti si separano completamente. Sono ancora due filamenti complementari, ma non formano più un'elica. Se effettuiamo un raffreddamento, i filamenti si ritrovano e si riforma la doppia elica.

Adesso studiamo il processo di denaturazione, o melting, dal punto di vista

fisico-chimico cercando di misurare la separazione fra i due filamenti C'è un fenomeno che consente di seguire questi processi di denaturazione e rinaturazione che si rifa al seguente concetto; le basi hanno la capacità di assorbire i raggi UV visibili. durante tale processo, gli elettroni π coniugati delle basi passano dallo stato fondamentale ad uno stato energetico più elevato assorbendo fotoni con una lunghezza d'onda intorno a 260nm. Questa transizione determina un assorbimento che posso facilmente monitorare con uno spettrofotometro e attraverso la legge di Lambert Beer possiamo misurare l'assorbanza tramite il rapporto fra la luce incidente e la luce che passa attraverso la soluzione (luce che esce), il tutto rapportato alla concentrazione della soluzione. La epsilon, coefficiente di assorbimento molare, dipende dalla forma del DNA. Infatti essa aumenta se il DNA passa da doppio filamento a singolo filamento. COME SI SPIEGA QUESTO

singolo filamento riescono ad assorbire più energia. Ipocromia del DNA a doppio filamento e Ipercromia del DNA a singolo filamento

Come faccio a sfruttare agevolmente questa differenza per monitorare il melting di DNA?

1. Prendo una soluzione contenente DNA a doppia elica
2. Inserisco un termometro
3. Faccio arrivare da sinistra una luce incidente di 260nm e a destra ho un rivelatore (piastra metallica che trasforma il fotone incorrente)
4. Aumento la temperatura e nel grafico arriverò fino alla curva verde

Facciamo un grafico diverso; sulle ascisse la temperatura e sull'ordinata l'assorbanza e rappresento quei punti del grafico precedente cioè i valori di assorbanza che ho visto aumentare man mano che ho scaldato la soluzione.

L'andamento con cui cresce l'assorbanza in funzione della temperatura è di tipo sigmoidale. Ciò ci dice che la denaturazione si divide in più fasi:

1. In una prima fase abbiamo bassa pendenza
(l'effetto che ho per un certo intervallo di temperatura è piccolo)
2. una seconda fase in cui la pendenza è più alta in cui basta una piccola variazione di temperatura per avere grandi effetti relativi all'assorbanza.
3. Una terza fase con pendenza di nuovo bassa e poi si arriva al massimo del valore del DNA a singolo filamento
Questo andamento sigmoide, in un processo biologico, determina la cooperatività. Nella doppia elica è tenuta insieme da diversi tipi di interazione e quando il DNA è tutto impacchettato, separare due basi (tenute insieme dallo stacking), a meno che non siamo all'estremità, risulta difficile. Invece, se aumentiamo la temperatura, ad un certo punto il DNA comincia a rompersi e il processo di melting costerà energeticamente di meno poiché le basi sottostanti avranno già subito denaturazione.
Processo cooperativo anche quello contrario, di raffreddamento. Man mano che aumentiamo

La temperatura si formeranno delle bolle che porteranno ad una netta separazione fra i due filamenti.

Il 50% della denaturazione avviene a una temperatura specifica, chiamata temperatura di melting.

Questa temperatura di melting cambierà a seconda della lunghezza del DNA e della quantità di coppie di basi GC rispetto ad AT. Le coppie di basi GC sono più difficili da spezzare, quindi la temperatura di melting sarà più alta.

Questo mi permette di effettuare una separazione localizzata, aggiungendo delle coppie di basi AT.

Nel grafico iniziale, l'assorbanza ha un valore sperimentale ma non mi consente di capire cosa sta effettivamente succedendo al DNA. Per capirlo meglio, posso fare un grafico in cui sostituisco l'assorbanza con la percentuale di denaturazione.

Un altro aspetto da considerare è il delta G. Questo sarà negativo nel caso della denaturazione, indicando che è un processo spontaneo.

positivo nella rinaturazione. Però questa variazione dell'energia di Gibbs dipende da un fattore entalpico determinato dalle interazioni fra le basi e uno entropico che dipenderà dalle interazioni con l'acqua e che sarà maggiore in un singolo filamento.

Favoriscono la dissociazione:

• Repulsione elettrostatica (data dalle cariche negative dei fosfati) tra i due filamenti (ΔH < 0) - punto di vista entalpico
• Il random coil è più disordinato (ΔS > 0) - punto di vista entropico

Impediscono la dissociazione:

• I ponti a idrogeno tra le basi (ΔH > 0)
• Lo stacking tra le basi (ΔH > 0)
• La liberazione dell'acqua dovuta allo stacking (ΔS < 0) -> aumenta l'entropia

Per ora abbiamo detto che la temperatura di melting dipende dalla sequenza del DNA (dal numero e dal tipo di basi).

Altri elementi determinanti:

• Il pH (se lo abbasso i filamenti si denaturano prima)
• ioni positivi inseriti
nella soluzione influenzano la Tm (aumenta) sfavorendo la dissociazione poiché stabilizzerebbero i due filamenti affievolendo le cariche negative dei fosfati. Più aggiungo sale, più la curva si sposta a destra e la Tm aumenta rendendo più difficile il processo di denaturazione. 53 I punti rossi sono le Tm di tante curve di denaturazione ottenute con percentuali di GC crescenti. In verde viene mostrato lo stesso esperimento ma fatto in alto sale (1M NaCl). La Tm aumenta sempre in funzione del contenuto di GC, ma la curva sarà più spostata a destra. Mondo a RNA e il suo ruolo nell'evoluzione della vita L'RNA ha un ruolo centrale in processi come la maturazione dell'RNA, la sintesi delle proteine, della regolazione genica. Molti cofattori enzimatici sono ribonucleotidi. L'RNA può assumere strutture tridimensionali complesse in grado di riconoscere altre molecole e catalizzare reazioni: ribozimi, e ribointerruttori. Molte molecole cheivanti da vitamine che svolgono un ruolo fondamentale nel metabolismo delle cellule. I coenzimi sono necessari per attivare specifici enzimi e facilitare le reazioni chimiche all'interno delle cellule. Senza di essi, molte reazioni metaboliche non potrebbero avvenire in modo efficiente. Alcuni esempi di coenzimi includono il NAD+ (nicotinamide adenina dinucleotide) e il FAD (flavin adenine dinucleotide), entrambi derivati dalla vitamina B3. Questi coenzimi sono coinvolti nel trasferimento di elettroni durante la respirazione cellulare, un processo chiave per la produzione di energia nelle cellule. Altri coenzimi importanti includono il coenzima A, derivato dalla vitamina B5, che è coinvolto nel metabolismo dei grassi, e il tetraidrobiopterina, derivato dalla vitamina B9, che è coinvolto nella sintesi di alcuni neurotrasmettitori. In conclusione, i coenzimi sono molecole essenziali per il corretto funzionamento delle cellule e svolgono un ruolo cruciale nel metabolismo.