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Il metodo di sequenziamento di Sanger

Il metodo di sequenziamento di Sanger sfrutta la DNA polimerasi, che necessita anche di un primer come innesco. Questo metodo, chiamato anche metodo enzimatico, si basa sull'attività catalitica (polimerasica 5'-3') della DNA polimerasi per sintetizzare un frammento di DNA. Viene utilizzato un primer come innesco, che ha un'estremità 3'-OH, e una molecola a singolo filamento di DNA come stampo, che ha una sequenza complementare a quella che deve essere determinata. Durante la sintesi del frammento di DNA, vengono utilizzati dideossiribonucleotidi caratteristici che mancano del gruppo OH all'estremità 3'. Questo gruppo OH è importante perché da questa parte avviene l'attività polimerizzante della DNA polimerasi. Sostituendo l'OH con un H, si impedisce il proseguimento dell'attività polimerasica. Viene quindi introdotta la presenza di nucleotidi terminatori, ovvero dideossinucleotidi.

odideossinucleosiditrifosfato o ddNTP) induce l'arresto della polimerizzazione in punti differenti, in maniera tale da ottenere tutte le possibili combinazioni di frammenti complementari allo stampo (in termini di lunghezza) differiscono tra loro di una sola base (dalla prima base dopo il primer fino all'ultima). Su base di tale caratteristica si basa la determinazione della sequenza nucleotidica del frammento d'interesse. L'intuizione geniale di Sanger è che marcava il primer estremità 5'. La miscela veniva poi divisa in 4 provette in cui venivano messi i 4 ddNTP, ma in quantità ridotta in modo tale da stopparlo in punti differenti. Successivamente, si eseguiva un'autoradiografia su lastra dopo elettroforesi. La sequenza che vado a leggere è complementare a quella del frammento poiché non è una lettura diretta, ma è data dall'estensione del primer. Le molecole di DNA, che vengono generate in seguito alla reazione di sequenza, da un lato hanno estremità nette, dall'altro...neosintetizzato è più corto del filamento stampola separazione delle molecole viene effettuata mediante elettroforesi su gel di <32poliacrilamide> la presenza di nucleotidi marcati radioattivamente (P), nellaUna porzione adiacente al punto in cui il frammento è stato clonato(2) se il frammento di DNA non è clonato all'interno di un vettore, si utilizza come innesco un primer avente una sequenza presente all'estremità 5' del frammento oggetto di analisi. La DNA polimerasi estende il primer (dall'estremità 3'-OH) utilizzando come substrati i 4 nucleotidi trifosfati (dNTP) + 1 solo dei 4 ddNTP. Tali molecole mancano del gruppo ossidrilico in posizione 3, oltre che in posizione 2 (come accade normalmente per i dNTP). Ogni volta che un ddNTP viene incorporato nella catena nascente, l'assenza dell'-OH in posizione 3' impedisce al nucleotide successivo di potersi legare e ciò determina l'interruzione immediata del processo di polimerizzazione. Ciascuna contente tutti e 4 i dNTP e 1 vengono allestite 4 reazioni separate, solamente dei 4 ddNTP (terminatore) caricamento dei prodotti di reazione su gel di poliacrilamide.

Scaricato da Mery emme (liveweareyoung@live.it) 39 anni più tardi (nel 1977) Allan Maxam e Walter Gilbert svilupparono un'altra metodologia per il sequenziamento del DNA. Il metodo Maxam-Gilbert, metodo CHIMICO, ebbe nell'immediato più successo. Il DNA viene ridotto a singolo filamento, uno dei due viene marcato all'estremità 5' (è sempre un'estremità fosforilata) con isotopi radioattivi, in particolare P. Il metodo è basato sulla degradazione chimica delle catene di DNA. I frammenti di DNA a singolo filamento vengono marcati radioattivamente (P) all'estremità 5' e poi suddivisi in 4 aliquote. Ciascuno dei 4 campioni viene sottoposto a un trattamento chimico differente, in grado di rompere la molecola in punti definiti. Ogni trattamento è rivolto a 1 o 2 specifici nucleotidi. Ci sono trattamenti che degradano solo G, altri solo C, altri A e G e altri C o T, dove c'è.degradazione→c'è rottura del frammento si generano frammenti di diversa lunghezza→ciascun trattamento aveva come bersaglio 1 o 2 nucleotidi specifici trattamento che degradava: solo G o solo C e G o T i frammenti di DNA vengono separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide e rilevati mediante autoradiografia su lastra (poliacrilamide: supporto semisolido per elettroforesi proteine) combinando i dati ottenuti da tutti i campioni (lettura a ritroso = dai frammenti più corti a quelli più lunghi) si ottiene la sequenza completa del frammento (indirezione 5'-3') lettura diretta→ negli anni 90 IL SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO Il metodo di Maxam-Gilbert ebbe successo all'inizio, ma fu il metodo di Sanger che generò successivi sviluppi. Le attuali metodologie per l'analisi delle sequenze di DNA si basano sul metodo di Sanger. Negli anni 90 numerose tecniche innovative hanno consentito, in parte di modificare, in parte di

Rendere automatiche le procedure relative al metodo di sequenziamento di Sanger. In assenza di tali progressi non sarebbe stato possibile sequenziare il DNA su scala genomica.

Non si lavora con sostanze radioattive, ciascuno dei ddNTP viene marcato con specifici fluorofori che lo rende distinguibile dagli altri 3. Da ciò il vantaggio di poter lavorare in una singola provetta.

I coloranti fluorescenti hanno sostituito i traccianti radioattivi. Ciascuno dei 4 ddNTP è legato a uno specifico fluoroforo. È sufficiente un'unica reazione di sequenza eseguita con tutti e 4 i ddNTP per sequenziare un filamento di DNA.

L'elettroforesi in capillare con lume molto sottile, il potere di risoluzione nel discriminare i frammenti è molto elevato (discrimina filamenti che differiscono per 1 sola base).

Nel punto di uscita del capillare c'è un raggio laser che eccita i fluorocromi che quando vengono colpiti emettono una determinata onda. Sulla base di questo si determina.

L'ultimo nucleotide del filamento che esce dall'elettroforesi capillare ha sostituito l'elettroforesi verticale. I frammenti separati vengono assoggettati a scansione della fluorescenza che ciascun fluoroforo emette in seguito all'esposizione a luce laser. I dati della sequenza quindi sono raccolti sotto forma di 4 tracciati sovrapposti (elettroferogramma), ciascuno relativo all'intensità di un fluoroforo.

Dove c'è un picco significa che le altre 3 basi sono al minimo. I picchi ci indicano la sequenza. Un picco nel tracciato indica che quella particolare base è stata incorporata per ultima in quella posizione.

Vi fu la possibilità di espletare all'interno di un unico strumento le procedure relative alla 1) reazione di sequenza, alla 2) separazione mediante elettroforesi capillare, alla 3) lettura/acquisizione dei tracciati fluorescenti: nasceva l'era dei sequenziatori.

automatici diDNA Scaricato da Mery emme (liveweareyoung@live.it)
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TRASCRIZIONE tappa fondamentale nel complesso degli eventi dell’espressione genica(l’informazione contenuta in un gene può compiere una funzione attraverso la sintesi diRNA, in cui si può fermare o da cui si ottengono proteine livello più elevatodell’espressione genica)
Espressione genica complesso di eventi che consentono all’informazione contenuta inun gene (DNA) di essere convertita in una macromolecola (RNA o proteina), in grado diconferire all’organismo la capacità di svolgere una funzione
La prima fase dell’espressione genica è rappresentata dallatrascrizione sintesienzimatica (RNA polimerasi) di una molecola di DNA a singolo filamento a partire da unostampo di DNA passaggio dell’informazione genetica dal DNA all’RNA a differenza della replicazione del DNA (integrale), la duplicazione del DNA è
  1. Un evento che coinvolge tutta la molecola costituente il genoma è la trascrizione. È un processo selettivo che, in un determinato momento, riguarda solo alcuni geni in base a determinate condizioni della cellula.
  2. Il differenziamento cellulare è un processo che porta le cellule staminali a differenziarsi secondo una linea discendente caratterizzate da una funzione sempre più specifica. Ciò comporta un cambiamento morfologico e un'espressione genica differente.
  3. A. Numero di geni espresso
  4. B. Tipo di geni espresso
  5. C. Livello di espressione genica
  6. Non tutta la sequenza genomica è codificante. Tra i tratti codificanti, la maggior parte sono geni che codificano RNA ribosomiale (strutturali).
  7. Le molecole di RNA sono molteplici.
  8. Per i geni che codificano proteine, la trascrizione genera molecole di mRNA e dà inizio ad un percorso che passa successivamente per la traduzione (sintesi proteica).
  9. Per i geni che non codificano proteine, il flusso...

dell'informazione genica si arresta alla molecola di RNA tRNA, rRNA, snRNA, siRNA, miRNA, ecc... RUOLO SVOLTO DALLE PROTEINE RNA informazionali vengono tradotti in proteine (mRNA) RNA messaggero, intermedio nel trasferimento delle informazioni dai geni alle proteine svolge funzione cruciale, sono le uniche che si possono definire RNA informazionale, permette di giungere alla sintesi delle proteine (la sequenza nucleotidica che codifica proteine si chiama codificante) UTR UTRCDS 5' 3' UTR: sequenze trascritte ma non tradotte

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I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher meeryy00 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Università Politecnica delle Marche - Ancona o del prof Di Marino Daniele.