Biologia molecolare

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BIOLOGIA MOLECOLARE: studia gli acidi nucleici e le interazioni che questi hanno con le

macromolecole biologiche

La più importante è acido nucleico-proteina sta alla base della capacità cellulare di svolgere una

determinata funzione

Esperimento di Frederick Griffith:

medico e microbiologo inglese, stava speculando la possibilità di realizzare un vaccino per

polmonite e per i suoi studi utilizzava 2 ceppi di Streptococcus pneumoniae

isola 2 ceppi batterici:

colonia rugosa

1. R :

benigni, costituita da batteri con superficie rugosa per la mancanza di capsula esterna

non avendo la capsula protettiva, viene riconosciuto e distrutto dal sistema immunitario

colonia liscia

2. S :

virulento, costituita da batteri rivestiti da una capsula di natura polisaccaridica che previene

il riconoscimento da parte del sistema immunitario

Li inocula in topi:

1. R nessun cambiamento, preservava il topo dalla morte



2. S porta alla morte



3. Ceppi S trattati al calore inattivazione batterio visibile poiché il successivo inoculo non



portava alla morte

4. miscela di batteri del ceppo R (vivi) e S inattivato dal calore (morti) topo muore



Ciò significa che il calore uccideva ma evidentemente non degradava il principio responsabile della

virulenza

esisteva all’interno dei batteri S un principio trasformante



A livello molecolare questo principio non era stato annientato e poteva essere trasmesso ai batteri

del ceppo R

principio trasformante (converte il batterio da innocuo a virulento) .. in termini odierni



parleremo del gene o dei geni per la produzione della capsula polisaccaridica

Probabilmente il processo di degradazione al calore pur avendo compromesso l’integrità

molecolare ha risparmiato il principio trasformante (gene caps) passato da una cellula morta a una

cellula viva del ceppo R che ricevendo il gene venne convertito da innocuo a virulento poiché iniziò

a produrre la capsula polisaccaridica

Griffith identifica per la prima volta gli alleli R e S

Ma non potè dire altro in aggiunta su ciò che è la natura biochimica del materiale genetico

Oswald T. Avery fece un esperimento che fu definito la bomba di Avery poiché sconvolse i canoni

biochimici classici in cui le proteine erano le protagoniste

l’esperimento fu intrapreso al fine di identificare la natura chimica del principio trasformante

presente nel ceppo S

Tale studio fu effettuato utilizzando estratti cellulari di pneumococchi del ceppo S. la patogenicità

non veniva saggiata in vivo nei topi, bensì mediante semplice osservazione delle colonie bateriche

(ceppi R e S) cresciute su piastra agar

Quale delle macromolecole presenti nell’estratto da batteri del ceppo S è l’effettivo responsabile

della trasformazione (proteine, lipidi, polisaccaridi, DNA o RNA)? 2 tecniche

Partendo da culture S si frazionano tutte le componenti macromolecolari

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1. aliquote di estratto da batteri patogeni sono state suddivise in provette e trattate ciascuna

con un reagente specifico per la degradazione di un componente macromolecolare

2. partendo da estratti di batteri patogeni sono state allestite differenti aliquote contenenti

ciascuna una preparazione purificata relativa ad una componente macromolecolare

le preparazioni vengono poste a contatto con batteri R

solo la piastra nella quale era stato versato il contenuto relativo al DNA subiva una sorta di



trasformazione

i risultati ottenuti dai 2 esperimenti se pur differenti portano alla medesima conclusione, la natura

biochimica del principio trasformante è la molecola di DNA

I° prova che la natura biochimica del materiale genetico è il DNA (scardinando le proteine dal



podio)

Max Delbrück Salvador Luria:

e negli anni 40’ fondatori del <gruppo del fago> utilizzo di



batteriofagi o fagi (virus che parassitano cellule batteriche) per lo studio della struttura e della

funzione dei geni per studiare un sistema complesso era necessario partire da un sistema più



semplice

FAGO: costituito da 1 molecola di DNA ricoperta da un involucro di natura proteica in cui si estende

un collo che termina con delle gambe che hanno la funzione di aderire alla superficie del batterio

una volta aderito, il collo si contrae e inietta il contenuto genetico all’interno del batterio

ciclo litico il destino della cellula infettata è la LISI



il fago inietta il materiale genetico nel batterio di cui sfrutta il sistema di sintesi per la costituzione

di nuove cellule fagiche che mandano in lisi la cellula batterica e vengono rilasciate

alfred Hershey e Martha Chase (1952) misero in atto <<l’esperimento del frullatore>>

scopo finale: la componente depositaria del materiale genetico sono le proteine o acidi nucleici?

esperimento che prevedeva la manipolazione dei fagi in particolare fago T2

come tutti i fagi ha una doppia componente: acidi nucleici e proteine

isotopi radioattivi per marcare le componenti

S e P marcano in maniera selettiva e differente proteine e DNA

a seconda di come si trasferiva la radioattività riuscirono a capire cosa si trasferiva

35 S proteine (metionina e cisteina hanno atomi di S)



32 P acidi nucleici polimero di nucleotidi (contiene P)



lo scopo di tale procedura era quello di identificare quale componente del fago parentale,

contenete gli isotopi radioattivi, entrasse nella cellula ospite e quindi ricomparisse nella cellula

fagica successiva

le 2 popolazioni fagiche marcate separatamente furono usate per infettare batteri

il frullatore stacca il fago dal batterio (poiché moltiplica il campo gravitazionale fisiologico)

cellule e fagi vengono separati per centrifugazione

PELLET : componente depositata sul fondo batteri

 

SURNATANTE : componente sopra il pellet fagi

 

i virus rispetto ai batteri sono molto più piccoli, i batteri precipitarono mentre i virus nuotavano nel

surnatante

35 S stava nel surnatante la radioattività era rimasta nei virus



32 P stava nel pellet quindi si trovava all’interno dei batteri



il risultato dell’esperimento decretò che la natura macromolecolare del principio trasformante

sosta nel DNA Scaricato da Mery emme (liveweareyoung@live.it)

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Erwin Chargaff (1950) regola di Chargaff: c’è una sorta di costanza tra il rapporto delle basi dei



differenti organismi

DNA isolato subiva un trattamento acido per idrolizzare i legami fosfodiesterici, con conseguente

rilascio dei singoli nucleotidi, i quali venivano analizzati mediante cromatografia su strato sottile

Rilasciando i singoli nucleotidi:

Osservazione 1: organismi di specie differenti hanno una concentrazione di basi differente

 Osservazione 2: indipendentemente dalla fonte di DNA l’appaiamento delle basi è

 altamente specifico (purina-pirimidina), ed è costante il rapporto

A-T il n° (o %) di A è uguale a quello di T



o G-C il n° (o %) di G è uguale a quello di C



o

Dopo l’identificazione della natura chimica (DNA) del materiale genetico, molti studi furono

struttura tridimensionale DAN

intrapresi al fine di determinare la utilizzando tecniche che



erano state applicate con successo per l’analisi della struttura delle proteine: DIFFRAZIONE A

RAGGI X

una sorgente di radiazioni ionizzanti genera raggi X che vengono collimate in un fascio da strutture

che lo concentrano nella direzione in cui si trova il campione in analisi

I raggi X sono adatti per campioni in forma cristallina (solida)

un campione biologico viene cristallizzato (soluzione con componente salina e successiva

evaporazione) e diventa idonea per un analisi a raggi X utile per poterne determinare la struttura

3-D

la tecnica venne traslata per gli acidi-nucleici

Il primo che sviluppò questo interesse fu che si dedicò alla struttura secondaria ad -elica



Pauling

di proteine sulla base di questi risultati propose il modello per il DNA a 3 eliche

Da questo trassero spunto e che effettuarono altre indagini

Maurice Wilkins Rosalind Franklin

strutturali DNA

Raggi X collimati verso il punto in cui si trovava il campione di DNA che in seguito al fenomeno di

diffrazione impressionava una lastra

nel momento in cui il raggio collide con il campione incontra le sue particelle che fanno cambiare la

direzione del raggio

al di la del campione in virtù della diffrazione il raggio cambia direzione

la lastra funge da nastro assorbente in grado di captare la variazione di direzione

(spettro derivante dal raggio uscente)

non da origine a un disegno casuale ma si osserva una certa regolarità che rivela la regolarità del

DNA

Nel 1953 proposero il modello che ambiva a descrivere la struttura a doppia elica del DNA

(rappresentò un importante tappa per la biologia molecolare)

molecola di DNA costituita da 2 filamenti che si avvolgono uno intorno all’altro interagendo a

formare una doppia elica

impalcatura zuchero fosfato: lo scheletro della struttura è l’alternanza di zuccheri – fosfato rivolti

verso l’esterno e le basi azotate rivolte verso l’interno

in realtà i campioni di DNA che furono analizzati per diffrazione non erano proprio cristalli poiché è

quasi impossibile ottenere dei campioni di DNA in forma cristallina, ma si possono ottenere

(forma semisolida non totalmente disidratata)

filamenti di DNA

ciò aiutò la sua comprensione poiché il campione non essendo completamente disidratato mimava

le condizioni naturali all’interno della cellula

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lo scheletro zucchero-fosfato è la componente ragionevolmente è la componente



idrofilica

rivolta verso l’esterno (ambiente acquoso)

le basi azotate sono viene rivolta verso l’interno per minimizzare i contatti con



idrofobiche

ambiente acquoso

2 catene polinucleotidiche (polimero di nucleotidi)

l’unità monomerica è il nucleotide

ciascun nucleotide protrude verso l’interno dalla colonna portante, dal p.v chimico è costituito da 3

componenti:

1. UNO ZUCCHERO PENTOSO (5 atomi di C) che in condizioni prossime a quelle che



sussistono nella cellula ciclizza,l’ossigeno funge da ponte tra il C1 e il C4 (parti integranti

dell’anello), il C5 non fa parte dell’anello

ha la caratteristica di avere 2 H legati al C2 (il C1, C3, C4, C5 legati ad

-D-2-DEOSSIRIBOSIO

1 H e un altro sostituente)

RIBOSIO la struttura subisce una piccola variazione nel C2 abbiamo un gruppo OH con una

serie di ripercussioni

2. UNA BASE AZOTATA composti che riassumono contemporaneamente nella loro struttura:

Composti aromatici

a. Composti eterociclici

b. Molecole planari

c.

Si dividono in:

PURINE: composti costituite da 2 anelli aromatici condensati

 ADENINA

o GUANINA

o

PIRIMIDINE: singolo anello aromatico

 CISTOSINA

o TIMINA

o

La differenza tra queste 2 categorie è la modalità con cui si legano al ribosio

nell’assemblaggio del nucleotide

le basi azotate sono 4, ma esistono variazioni sul tema (enzimi possono modificare a livello

strutturale i 4 nucleotidi classici dando origine a nucleotidi modificati)

3. UN GRUPPO FOSFATO

(ciascuna componente si lega in modo specifiche all’altra)

formazione nucleotide, le 3 componenti si assemblano

il fulcro è il ribosio:

C1 lega la base azotata (N in posizione 1 pirimidine // N posizione 9 purine)

 con un legame C-N chiamato in seguito ad una reazione di disidratazione

-N-glicosidico

formando una struttura che prende il nome di NUCLEOSIDE

Quando il nucleoside si lega all’acido fosforico si forma in nucleotide

C5 lega gruppo fosfato fosfoesterico

(residuo di acido fosforico) con un legame (tra un

 gruppo alcolico e un gruppo acido)

il nucleoside così composto può essere definito NUCLEOSIDE MONOFOSFATO

a questo livello il grado di fosforilazione può essere incrementato

i nucleosidi esistono in diverse forme. I nucleosidi 5’-trifosfati sono precursori nella sintesi degi

acidi nucleici.

I legami tra il primo () e il secondo () fosfato, e tra il secondo () e il terzo () fosfato, sono

legame fosfoanidridici,

diversi, sono legami ad alta energia. Il legame tra il primo () fosfato e C5’

è un legame a bassa energia (fosfoesterico)

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ciascun nucleotide ha un’estremità:

3’ ossidrilica

 5’ fosforilata



ciascuno dei 2 filamenti termina alle estremità con una differente polarità

modalità con cui ciascun nucleotide si lega agli altri nell’allungamento della catena

la DNA polimerasi allestisce la catena utilizzando come precursori i nucleotidi5’-trifosfati e

necessita di un filamento do DNA che funge da stampo (enzima coinvolto nella duplicazione del

DNA)

il nucleotide incorporato nella catena è monofosfato legame

all’interno di ciascuna catena polinucleotidica, i nucleotidi sono uniti tra loro mediante un

fosfodiesterico che si instaura sempre tra l’ossidrile in posizione 3’ del 2’-deossiribosio e il fosfato

in 5’ di un nucleotide adiacente

nel modello che descrive il DNA è implicito l’ambiente in cui si trova

le catene polinucleotidiche costituenti la molecola di DNA sono costituite da una parte idofilica

(scheletro zucchero-fosfato) e da una parte idrofobica (basi azotate)

nella struttura a doppia elica i 2 scheletri si dispongono all’esterno a contatto con l’H O, mentre le

2

basi si dispongono all’interno

esistono forze che si controbilanciano nel modello del DNA

i 2 scheletri, che contengono i gruppi fosfato carichi negativamente tendono a respingersi

 gli scheletri di zucchero-fosfato generano tra loro forze di tipo repulsivo generate da cariche

negative vicine, tendenzialmente le eliche si respingono, in virtù di ciò in linea teorica le

catene si repellono

ciò viene bilanciato da 2 tipi forze, che tendono invece a mantenere uniti i filamenti

stabilizzano la doppia elica

(appaiamento) legami H tra le basi complementari

 (impilamento) staking: interazioni idrofobiche dovute all’impilamento delle basi adiacenti

 le basi azotate sono composti aromatici si caratterizzano per un elevato grado di

idrofobicità, nel momento in cui queste si impilano gli anelli aromatici intraprendono

relazioni di natura idrofobica che tendono ad avvicinare le basi (le tengono unite)

queste forze tendono ad avvicinare 2 basi contigue tuttavia se queste forze avvenissero in

senso unicamente verticale tenderebbe ad appiattirsi, ma nel dipanarsi, la struttura del

DNA è un'unica macromolecola e le forze di staking si ripercuotono su tutta la struttura

portando la doppia elica proprio all’avvolgimento



i vincoli sono i legami fosfodiesterici il reale avvicinamento può esserci solo se c’è



anche una torsione la torsione è il frutto dell’avvicinamento

le forze di staking derivano dalla caratteristica delle basi e dal fatto che la molecola è

immersa in acqua

riducendo lo spazio che c’è tra le 2 basi impedisce all’acqua di entrare al suo interno

ottemperando

l’avvolgimento è il frutto del soddisfacimento strutturale legato all’ambiente in cui le molecole si

trovano

esistono circostanze in cui le basi si trovano orientate all’esterno

le singole basi a volte possono protrudere dalla doppia elica rotazione della base all’esterno



flipping)

(base

gli enzimi che metilano le basi e quelli che rimuovono le basi danneggiate inducono questo

fenomeno di rotazione Scaricato da Mery emme (liveweareyoung@live.it)

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se la base rimanesse nella sua posizione (rivolta all’interno della doppia elica) per questioni

steriche l’enzima non avrebbe la possibilità di alloggiare il substrato (la base stessa) nel proprio sito

catalitico

altri enzimi coinvolti nella ricombinazione omologa e nella riparazione del DNA, <<scandagliano>>

la molecola di DNA rotando le basi all’esterno ad una ad una

i filamenti complementari decorrono nella medesima direzione (destrorsa) con polarità opposta

diametro costante dell’elica di 20 Å (2 nm)

esistono delle ripetitività che decorrono in maniera periodica

la struttura del DNA fa si che l’avvolgimento intorno all’asse principale avviene con una periodicità

da cui si ricavano il parametro dimensionale

giro dell’elica: distanza percorsa dalla doppia elica per compiere un giro completo intorno all’asse

in questa distanza sono compresi 10-11 nucleotidi, tra un nucleotide e l’altro vi è una distanza pari

3,4 Å

a 1 giro d’elica=34 Å



a livello di struttura del DNA ritroviamo soddisfatta la regola di Chargaff (appaiamento regolare

delle basi) i 2 filamenti oltre ad essere avvolti sono appaiati tenuti uniti a seguito di legami H tra le

basi azotate dei filamenti

T-A = 2 legami H (sono più facili da separare, la sommatoria delle F che tengono uniti i

 filamenti è minore)

C-G = 3 legami H



ciascuno dei 2 filamenti è avvolto ad attorno ad un asse centrale in modo antiparallelo

-elica

orientate tra loro in maniera antiparallela

La doppia elica del DNA ruota in senso destrorso

la presenza dei solchi (soprattutto maggiore) genera la capacità dal DNA di interagire con le

proteine (il DNA svolge le sue funzioni in maniera correlata alle proteine le proteine regolano



l’espressione dei geni)

i 2 filamenti si avvolgono in maniera tale da formare 2 solchi (c’è una ragione chimica) di