Biologia molecolare

Biologia molecolare: DNA, caratteristiche e struttura

Un tema comune attraversa tutti i livelli di interazione, dalle singole cellule agli organismi, fino agli ecosistemi: la comunicazione e il continuo passaggio di informazione da cellula a cellula, da organismo a organismo e, in definitiva, da generazione a generazione. Questa informazione (immagazzinata nel nostro genoma) agisce per organizzare gli esseri viventi grazie all’azione concertata di vari componenti molecolari (acidi nucleici, proteine, lipidi, carboidrati), che cooperano in una serie elaborata di processi. Questi componenti e processi sono l’argomento trattato e studiato dalla biologia molecolare.

• Acidi nucleici: Costituiti da nucleotidi. Gli acidi nucleici come il DNA e l'RNA immagazzinano e trasportano informazioni.
• Proteine: Fatte di amminoacidi, svolgono la maggior parte delle funzioni di una cellula.
• Lipidi: Composti da acidi grassi, formano membrane intorno alle cellule e agli organuli.
• Carboidrati: Fatti di piccoli zuccheri, hanno una vasta gamma di ruoli come l'immagazzinamento di energia.

Definizione di biologia molecolare

Riguarda le basi molecolari delle attività delle macromolecole e delle loro interazioni, ma anche la regolazione delle macromolecole e delle loro interazioni. Quindi l’espressione biologia molecolare potrebbe essere estesa a tutti gli studi a livello di molecole dei sistemi viventi, quindi a quasi tutta la biologia (tranne l’ecologia e gli aspetti naturalistici della zoologia, botanica e microbiologia). D’altra parte, oggi discipline come la genetica, la fisiologia, la biologia dello sviluppo, la virologia, l’immunologia sono arrivate al livello molecolare, per non parlare della biochimica che al livello molecolare c’è sempre stata.

Con un po’ di semplificazione è possibile intendere la biologia molecolare come un’area scientifica che a partire dagli anni ‘40 del secolo scorso ha permesso di unificare due aree che erano sempre state separate: genetica e biochimica. Oltre a svilupparsi in differenti ambienti culturali, queste due discipline usavano approcci scientifici molto diversi. La biochimica, seguendo un approccio tipicamente riduzionistico, isolava, purificava e analizzava i vari componenti molecolari degli organismi, con l’idea che capire come funzionano le parti di un sistema complesso è essenziale per capire come funziona l’insieme. La genetica, al contrario, utilizza l’approccio olistico, affrontando un fenomeno complesso come la trasmissione dei caratteri ereditari, studiandone gli effetti macroscopici a livello fenotipico per ottenere informazioni sui livelli microscopici come l’organizzazione del materiale genetico.

Queste differenze metodologiche implicavano anche l’utilizzo di sistemi biologici diversi: mentre la genetica era iniziata con i piselli di Mendel e aveva avuto grandi sviluppi con altri organismi (Drosophila, Neurospora, lievito, mais); la biochimica utilizzava soprattutto organi e tessuti vegetali e animali per ottenere massicce preparazioni delle macromolecole da analizzare. Queste differenze facevano sì che queste due aree di ricerca in passato avessero davvero pochi contatti e rimanessero separate da un divario culturale e metodologico.

Dopo gli anni ‘40, sentendo l’esigenza di una maggiore unità nello studio dei sistemi viventi, si è sviluppata l’area scientifica della biologia molecolare. Il suo primo grande successo è stato quello di spiegare la trasmissione dei caratteri ereditari in termini molecolari, operando così di fatto un’unificazione della genetica e della biochimica. A questi nuovi sviluppi hanno contribuito entrambi gli ambienti culturali della biochimica e della genetica, ma l’impulso decisivo è arrivato dall’esterno, e in particolare da un gruppo di fisici che negli anni 40 e 50 si sono interessati alla biologia.

Un primo stimolo è venuto dal libro intitolato “Che cos’è la vita?” di Erwin Schrödinger (il padre della meccanica quantistica), in cui veniva posto con chiarezza il problema della struttura dei geni (anche se non veniva fornita una soluzione). Questo libro, insieme all’interesse che si era diffuso tra i fisici della scuola di Niels Bohr per il problema della struttura e funzione dei geni, spinse alcuni scienziati a passare dalla fisica alla biologia. Tra questi Max Delbrück e Salvador Luria, costituirono quello che venne chiamato “Gruppo del fago”, un gruppo di ricercatori di varia origine (fisici, medici, biologi) che scelsero di utilizzare i batteriofagi per studiare la struttura e la funzione dei geni, con l’idea che per studiare un fenomeno complesso come la trasmissione dei caratteri ereditari, bisognasse cominciare da un sistema semplificato: scelsero quindi di utilizzare i batteri e i virus che li infettano (batteriofagi).

Questi erano considerati sistemi genetici più semplici e si pensava potessero contenere uno o pochi geni. Oggi sappiamo che questo è solo parzialmente vero e che i fagi possono essere più complessi e contenere fino a 100 o più geni. Nei primi anni 50 il Gruppo del fago mise a punto metodi, sistemi e concetti che posero le basi della nuova biologia molecolare.

Scoperta del DNA

Anche se ha attirato l’attenzione dei biologi solo nel 1940-50, in realtà il DNA era stato scoperto molto prima.

• 1868 – Friedrich Miescher: Intorno al 1870, il chimico svizzero Friedrich Miescher isolò dai globuli bianchi (ricavati dal pus sulle bende chirurgiche) una sostanza ricca di fosforo che chiamò “nucleina”, di cui cominciò a studiare le proprietà chimiche. Nei decenni successivi la nucleina (poi acido timonucleico, acido nucleico e infine acido deossiribonucleico = DNA) divenne oggetto di vari studi che miravano a caratterizzarne la struttura chimica. Fu subito chiarito che la sostanza era un nuovo tipo di polimero, differente da tutti quelli identificati fino a quel momento.
• Fine del XIX secolo – Albrecht Kossel: Intorno alla fine del XIX secolo, Albert Kossel osservò che gli acidi nucleici (DNA e una molecola simile chiamata acido ribonucleico RNA) contenevano composti basici contenenti azoto (basi azotate), di cui identificò 5 tipi (A, T, C, G, U). Già nel 1910 altri scienziati avevano dimostrato che le basi azotate erano un componente di un’unità più grande denominata “nucleotide” che consiste di un gruppo fosfato, uno zucchero pentoso e appunto una base azotata.

Per quanto riguarda la massa molecolare del DNA (e quindi la lunghezza della molecola in numero di nucleotidi) la sua determinazione è un caso curioso. Ora sappiamo che è molto grande, ma che durante le procedure di estrazione e purificazione può subire una progressiva degradazione, soprattutto se, come succedeva all’epoca, non si utilizzano particolari accorgimenti e precauzioni. Così, le stime di peso molecolari del DNA ottenute nei 40 anni successivi alla scoperta di Miescher, davano un peso molecolare approssimativo di poco più di 1000 Da. Il caso vuole che questo corrisponda approssimativamente al peso molecolare di 4 nucleotidi. Dal momento che i tipi di base che costituiscono i nucleotidi sono 4 e che queste sembravano essere presenti in quantità più o meno uguali, fu proposto il modello del Tetranucleotide, che descriveva il DNA come una molecola piccola, costituita da soli 4 nucleotidi, con una ciascuna delle basi azotate. È chiaro quindi perché all’epoca il DNA non venisse preso in considerazione per alcun ruolo sofisticato nei processi cellulari (e tanto meno per la trasmissione dei caratteri ereditari): si pensava fosse una molecola troppo semplice e per questo l’attenzione venne rivolta verso un altro biopolimero complesso, le proteine.

Anni ‘30: A partire dagli anni ‘30, le misure di massa molecolare del DNA cominciarono a dare risultati diversi: le tecniche di preparazione e manipolazione diventarono sempre più raffinate e mostrarono che il DNA ha sempre un peso molecolare molto alto, in alcuni casi eccezionalmente alto. Questo è stato un passo essenziale verso la scoperta del ruolo del DNA come materiale genetico.

1928- Frederick Griffith: Nel frattempo, altre importanti ricerche vennero svolte in un ambiente scientifico diverso. Il medico e microbiologo inglese Frederick Griffith stava studiando la possibilità di produrre un vaccino per prevenire la polmonite e per i suoi studi utilizzava due ceppi del batterio Streptococcus pneumoniae. Infatti, questo pneumococco esiste in due forme, una virulenta (responsabile della patologia) e una non virulenta. Griffith aveva notato che il batterio virulento produceva colonie lisce (ceppo S- smooth) quando veniva fatto crescere su piastre petri, mentre le colonie del ceppo non virulento erano rugose (ceppo R – rough). La diversità di forma era dovuta a una capsula di rivestimento che era presente solo nel ceppo virulento. Il ceppo R, privo di capsula polisaccaridica, non causa polmonite nei topi in cui viene iniettato perché questo attiva le difese immunitarie. Al contrario, il ceppo S, causa polmonite e successiva morte dei topi in cui viene iniettato, perché la capsula polisaccaridica lo protegge dal sistema immunitario dell’ospite. Quando il ceppo S viene inattivato al calore e iniettato nei topi, perde l’effetto patogeno. Tuttavia, quando il ceppo S inattivato viene mescolato con il ceppo R e la miscela viene iniettata nei topi, questi contraggono la polmonite e muoiono. Isolando i batteri dal sangue di questi topi morti, Griffith scoprì che il ceppo R acquisisce la capsula polisaccaridica e mantiene questa caratteristica fenotipica per molte generazioni. Per questo concluse che si verificasse il trasferimento di qualche componente dei batteri patogeni che permetteva a quelli non patogeni di produrre il rivestimento di polisaccaridi che permetteva poi di eludere le difese immunitarie del topo (questo componente venne definita principio trasformante).

1940 - Oswald T. Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarry: Questo esperimento portò a un successivo passo fondamentale nella ricerca, fatto presso il Rockfeller Institute Hospital di New York dal gruppo di Oswald T. Avery, che ripeté l’esperimento di Griffith ma con le tecniche di frazionamento che andavano affinandosi e identificò nell’estratto cellulare del ceppo S, il componente chimico con la proprietà di principio trasformante attraverso un saggio in vitro (la trasmissione del principio trasformante veniva verificata osservando il fenotipo delle colonie dei batteri su piastra). La domanda era: quale dei componenti macromolecolari presenti nell’estratto di batteri del ceppo S è il responsabile della trasformazione dei batteri non patogeni (con l’acquisizione della capsula)? Avery e suoi collaboratori rimossero selettivamente dall’estratto del batterio virulento inattivato al calore, DNA, RNA, proteine trattando gli estratti cellulari con DNAsi, RNAsi, proteasi e osservarono che solo i campioni trattati con DNAsi perdevano la capacità di trasformare i batteri da non patogeni (R) a virulenti (S) una volta che questi venivano aggiunti all’estratto trattato. Fecero inoltre delle vere e proprie purificazioni delle componenti degli estratti, a cui vennero aggiunti batteri del ceppo S e a conferma delle precedenti osservazioni, solo la frazione contente DNA portava alla trasformazione dei batteri.

Questa scoperta, che per molti anni è stata chiamata la “bomba di Avery” per l’enorme impatto che successivamente ebbe nei progressi negli studi sul materiale genetico, arrivò però prematura all’epoca, quando ancora gran parte dell’ambiente scientifico non era in grado di accettarla. C’era in particolare la tendenza a considerare come materiale genetico le proteine – che si stavano dimostrando delle molecole con straordinarie proprietà strutturali e funzionali. Fatto sta che la scoperta di Avery ebbe poco credito, finché, dal gruppo del fago, venne pubblicato nel 1952 un esperimento completamente diverso, che confermò il DNA come materiale genetico.

1952 – Alfred Hershey, Martha Chase: Questo esperimento, chiamato l’esperimento del frullatore, fu condotto da Alfred Hershey e Martha Chase utilizzando il batteriofago T2, che come altri virus batterici è composto da un involucro proteico e da una porzione centrale di DNA. I due ricercatori sfruttarono una differenza cruciale fra queste due macromolecole. Tenendo conto che lo zolfo si trova nelle proteine ma non nel DNA, e che il fosforo si trova nel DNA ma non nelle proteine, prepararono delle popolazioni di fagi marcati radioattivamente con ³⁵S o il ³²P, in modo che fossero marcate solo le proteine o solo il DNA, rispettivamente. Le due popolazioni di fagi marcate venivano poi utilizzate per infettare un batterio ospite (E. coli), in due beute separate. Dopo l’infezione il brodo di coltura veniva frullato, in modo da provocare il distacco del capside fagico vuoto dai batteri in cui era stato trasferito il materiale genetico. La centrifugazione permetteva di recuperare i batteri venivano sul fondo della provetta, mentre i fagi intatti rimanevano nel surnatante. L’analisi delle due frazioni dimostrò in modo definitivo che il DNA marcato con ³²P si trovava all’interno dei batteri, mentre le proteine marcate con ³⁵S erano rimaste fuori e non potevano essere responsabili della trasmissione dell’informazione genetica. Ad ulteriore conferma, la progenie fagica conteneva ³²P e non ³⁵S.

Anni '40 – George Beadle, Edward L. Tatum: Ipotesi un gene, un enzima

Curiosamente le relazioni tra geni, mutazioni e enzimi erano state evidenziate ancora prima che venisse definita la struttura del DNA. Era anche già noto che la sintesi e la degradazione delle biomolecole avvenisse per gradi, e che ogni passaggio richiedesse l’intervento di una proteina catalizzatrice (enzima). La prova formale che i geni codificano gli enzimi venne da una serie di esperimenti condotti negli anni ‘40 da Beadle e Tatum, che introdussero un nuovo organismo modello nello studio della genetica, Neurospora crassa (una specie di muffa del pane). Questo organismo aploide è in grado di crescere in un terreno minimo (contenente zucchero, azoto, sali inorganici e biotina – le cellule devono produrre tutte le altre molecole di cui hanno bisogno a partire da questi 4 composti). Beadle e Tatum irradiarono le spore di Neurospora agli UV per generare delle mutazioni, poi fecero germinare le spore su un terreno completo (ad esempio costituito da un estratto cellulare – contenente tutti gli aa, i nucleotidi e le vitamine) per ottenere delle colonie geneticamente pure e le loro spore. Queste vennero quindi valutate per la loro capacità di germinare su terreno minimo: il fatto che non fossero in grado di farlo indicava la presenza di una mutazione che inattivava una delle vie metaboliche necessarie per la crescita. Questi mutanti vengono chiamati auxotrofi. La capacità di germinazione di diversi auxotrofi venne poi valutata utilizzando un ampio spettro di terreni minimi addizionati con composti selezionati in modo da identificare la via metabolica difettiva, e più nel dettaglio i singoli stadi alterati. Un esempio è quello degli auxotrofi per l’arginina; era noto che la via di sintesi dell’arginina includeva gli intermedi ornitina e citrullina, così in questo caso la crescita degli auxotrofi venne valutata su terreni contenenti tutti o alcuni di questi composti e li raggrupparono in tre classi, a seconda di quale intermedio fosse necessario per la crescita:

• Classe I: Mutanti crescono quando il terreno è addizionato con uno qualsiasi dei tre composti, quindi questi mutanti sono privi dell’enzima che nella via di sintesi lavora a monte dei 3 composti.
• Classe II: Mutanti non crescono in presenza di ornitina e quindi sono difettivi dell’attività enzimatica che lavora a valle di questo intermedio.
• Classe III: Mutanti crescono solo in presenza di arginina e quindi sono privi dell’enzima che converte la citrullina nel prodotto finale della via metabolica.

Beadle e Tatum mapparono anche i geni mutanti, osservando che i mutanti, all’interno di una singola classe di auxotrofi, mappavano nella stessa posizione cromosomica e concludendo quindi che per ciascuna classe di mutanti la mutazione era a carico di un singolo gene.

Sulla base di questi esperimenti Beadle e Tatum proposero l’ipotesi “un gene, un enzima” che affermava che un gene codificava un solo enzima. Oggi sappiamo che alcuni enzimi sono composti da diverse subunità codificate da geni differenti, e inoltre che non tutte le proteine sono enzimi; quindi l’ipotesi fu successivamente modificata in “un gene, un polipeptide”, che resta tuttora valida anche se sappiamo che non è completamente corretta. Vedremo infatti che alcuni geni codificano RNA funzionali piuttosto che proteine; e che attraverso un processo definito splicing, alcuni geni sono in grado di codificare per più polipeptidi o più varianti dello stesso polipeptide.

La strada verso la struttura del DNA

La definizione della struttura del DNA da parte di Watson e Crick rappresentò una svolta nella comprensione di come l’informazione genetica fluisca nei sistemi biologici.

Erwin Chargaff: Un’informazione importante sulla struttura chimica del DNA venne dagli studi del chimico Erwin Chargaff, che condusse le sue ricerche sulla composizione in basi del DNA presso la Columbia University a New York. Si accorse che preparazioni di DNA di origine diversa possono avere un differente contenuto delle 4 basi azotate. Fece poi numerose analisi quantitative e concluse che, mentre organismi di diverse specie possono avere DNA con composizione in basi differente, il DNA preparato da diversi tessuti e organi della stessa specie ha sempre la stessa composizione in basi. Inoltre, Chargaff osservò (e questo fu di grande importanza poi negli studi di Watson e Crick) che, qualsiasi fosse la fonte del DNA e nonostante la diversa composizione in basi, veniva rispettata sempre una regola: la percentuale di A è sempre uguale alla percentuale di T, e la percentuale di C è sempre uguale a quella di G.

Rosalind Franklin, Maurice Wilkins: Dopo l’identificazione del DNA come materiale genetico, vari laboratori cominciarono a investigare la struttura del DNA. Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, attraverso l’uso della diffrazione a raggi X, contribuirono notevolmente alla comprensione della struttura del DNA. I loro studi portarono alla scoperta della struttura a doppia elica del DNA, che fu confermata da Watson e Crick.