Biologia molecolare

REPLICAZIONE DEL DNA: PARTE 1

Il modello della struttura a doppia elica del DNA proposto da Watson e Crick nel 1953, suggeriva immediatamente che una delle possibili modalità di replicazione del DNA fosse di tipo semiconservativo, con ciascuno dei due filamenti della doppia elica che poteva funzionare da stampo per la sintesi di un filamento complementare. Gli esperimenti di Meselson e Stahl dimostrarono che in effetti il DNA si replica proprio in questo modo. Utilizzarono l'isotopo pesante dell'azoto N per differenziare i filamenti parentali da quelli di neosintesi; l'esperimento prevedeva di far crescere coli, per diverse generazioni, in due terreni diversi: uno contenente N^15 e l'altro contenente l'isotopo normale N, più leggero. Una volta estratto il DNA dalle cellule e sottoposto a centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio, quello delle cellule cresciute nel terreno N risultava più pesante e quindi...

dis8nguibile da quello delle cellule cresciute15nell’isotopo normale. I ba+eri contenen8 il DNA pesante vennero trasferi8 in un terreno contenente N e il loro DNA14fu estra+o e analizzato come prima:- alla prima generazione si osservava la comparsa di una singola banda di DNA di intensità intermedia, cheindica che le nuove molecole di DNA prodo+e in questa generazione sono tu+e cos8tuite da un filamentoleggero e uno pesante,- alla seconda generazione l’intensità di questa banda si dimezzava e compariva la banda corrispondente alDNA leggero, cos8tuito da entrambi i filamen8 di neosintesi,- di generazione in generazione, la banda del DNA leggero diventava più intensa, mentre la banda conintensità intermedia si asso/gliava, dimezzando la sua intensità a ogni generazione.Questo ha dimostrato che la replicazione del DNA richiede la separazione dei due filamen8 ed è un processosemiconserva8vo.Poiché entrambi i filamen8

dell'elica parentale del DNA vengono replicati, l'elica deve essere svolta e i due filamenti copiati separatamente. La separazione dei due filamenti genera la FORCELLA DI REPLICAZIONE, una struttura a forma di Y a livello della quale il DNA viene sintetizzato utilizzando entrambi i filamenti parentali come stampo: i due nuovi filamenti complementari vengono prodotti a opera di un complesso multienzimatico che contiene la DNA polimerasi. La forcella si muove con velocità regolare lungo l'elica parentale del DNA, producendo due eliche formate da un nuovo filamento e da uno parentale, che vanno a formare le braccia della Y. La chimica della reazione è tale che ciascun nuovo deossiribonucleoside monofosfato viene aggiunto al gruppo 3'-OH libero del ribosio del monofosfato precedente. La replicazione di ciascun filamento avviene, quindi, sempre in direzione 5'-3'. Questa direzionalità e l'andamento antiparallelo dei due filamenti nella doppia elica del DNA sono fondamentali per il processo di replicazione.elica creano un serioproblema per la replicazione: la sintesi CONTINUA del DNA è possibile soltanto su uno dei due filamen8 parentali. La sintesi del DNA sull'altro filamento deve avvenire mediante un meccanismo DISCONTINUO. Perché la sintesi del DNA avvenga è richiesta la formazione di un complesso formato in parte da DNA a singolofilamento e in parte da un ibrido a doppio filamento; questo viene chiamato GIUNZIONE INNESCO-STAMPO. Il cortoinnesco/PRIMER, complementare al DNA, deve presentare un'estremità con un gruppo 3'-OH libero che verrà allungata dall'aggiunta di nucleo8di complementari i a quelli contenu8 nello stampo. La necessità di un innesco della sintesi del DNA deriva dal fatto che la DNA polimerasi non è in grado, da sola, di iniziare una nuova catena, ma può soltanto allungare una catena esistente (che sia di DNA o di RNA), la quale fornisce il gruppo 3'-OH libero a cui

Il deossiribonucleoside trifosfato entrante può essere attaccato. Ci sono tre requisiti di base per la sintesi del DNA:

1. un filamento stampo che fornisca le informazioni della sequenza nucleotidica necessarie per la sintesi di un filamento complementare;
2. una polimerasi che catalizzi l'aggiunta di residui per formare il nuovo filamento;
3. un primer (o innesco) che fornisca il gruppo 3'-OH libero necessario per l'inizio della polimerizzazione.

La chimica della sintesi del DNA:

La sintesi chimica del DNA avviene allungando l'estremità 3' dell'innesco. Il legame fosfodiesterico si forma mediante una reazione in cui il gruppo ossidrilico 3'-OH opera un attacco nucleofilo al fosfato α del nucleoside trifosfato che deve essere polimerizzato. La molecola rilasciata in seguito a questa reazione è un pirofosfato che viene scisso da un enzima nucleare, la pirofosfatasi. Questa reazione porta alla formazione di fosfato libero ed è

molto importante perché rende praticamente irreversibile quella di polimerizzazione. Il filamento stampo determina quale dei 4 nucleotidi deve essere aggiunto al nuovo filamento; il complementare a quello sullo stampo è favorito attraverso vari meccanismi. La polimerizzazione attraverso l'aggiunta di nucleotidi alla catena polinucleotidica è descritta da queste due equazioni: XTP + (XMP) → (XMP) + P-Pn+1 P-P → 2P L'energia libera della prima reazione è modesta, circa -3.5 kcal/mol e la forza che guida la polimerizzazione è infatti fornita dalla rapida idrolisi del pirofosfato a fosfato libero da parte della pirofosfatasi. Il risultato dell'aggiunta del nucleotide e dell'idrolisi del pirofosfato è, infatti, la rottura di due legami fosfato altamente energetici. La sintesi del DNA si può definire come un processo accoppiato descritto da questa equazione: XTP + (XMP) → (XMP) + P-Pn+1 È una reazione altamente favorita con

ΔG=-7 kcal/mol corrispondente a k =10 .5eqUn valore così elevato indica che la reazione è pra8camente irreversibile.

DNA POLIMERASII principali enzimi deputa8 alla replicazione delDNA sono le DNA polimerasi. Tu+e le cellulehanno diversi 8pi di DNA Pol, ognunaspecializzata per svolgere una par8colarefunzione: alcune sono responsabili dellareplicazione del genoma, altre dellariparazione del DNA, altre ancora di farproseguire la replicazione quando lo stampo èdanneggiato. Inoltre, esistono DNA Polspecializzate, come quelle coinvolte nellareplicazione dei telomeri. Alcune DNA Pol sonomonomeriche (un’unica catena polipep8dicacapace di svolgere funzioni diverse), altre sonooligomeriche e in questo caso le diversesubunità sono dotate di funzioni diverse(l’a/vità dell’enzima si esplica quando tu+e lesubunità sono unite nel complessomul8proteico).

Le principali DNA Pol replica8ve, sono la DNAPol III nei ba+eri e le DNA Pol delta e

epsilonnegli eucario8. L'alto grado di conservazionedelle polimerasi replica8ve di ba+eri archea eeucario8 rifle+e la loro origine evolu8vaprecoce.

DNA Pol ILa prima DNA Pol (la DNA Pol I di E. coli) fuiden8ficata nel 1950 da Arthur Kornberg, che diede inizio a quello che sarebbe diventato un intero campo di studio,l'enzimologia della replicazione del DNA. Inizialmente si pensava che questa fosse l'unica DNA Pol presente in coli(ora sappiamo che sono 5, con diverse funzioni). In effe/, la DNA Pol I opera principalmente nella riparazione delDNA danneggiato. Nonostante questo, qui ci concentreremo su questa Pol (che rimane la meglio cara+erizzata),perché gli studi su questo enzima ci hanno portato a comprendere le cara+eris8che della sintesi del DNA che sonocomuni a tu+e le DNA Pol: tu+e le DNA Pol ad oggi conosciute richiedono un complesso innesco-stampo. La DNA Polaggiunge, ad ogni evento di condensazione, un nuovo nucleo8de, catalizzando la formazione del

legame fosfodiesterico nel rispetto della regola della complementarietà tra le basi con il filamento stampo. La maggior parte dei primer sono oligonucleotidi di RNA e sono sintetizzati da polimerasi specializzate (le PRIMASI), quando e dove sono richiesti.

La struttura cristallografica della DNA Pol I di coli assomiglia a una mano destra (con i domini palmo, pollice e dita) e riassume le caratteristiche strutturali di tutte le DNA Pol. Il DNA legato viene alloggiato nel dominio del palmo che contiene il sito attivo della Pol (la caratteristica più conservata fra le DNA Pol). Il dominio delle dita contiene il sito di legame per il dNTP e il dominio pollice è parzialmente ripiegato attorno alla doppia elica dello stampo innescato, come se stringesse la presa a fissare il DNA.

REAZIONI CATALIZZATE

Sintesi del DNA

Il gruppo 3'-OH del primer è attivato per attaccare l'α-fosfato del dNTP in entrata, con conseguente formazione del legame fosfodiesterico e il rilascio di

pirofosfato (PPi). Subito dopo l'incorporazione di un nuovo nucleotide, la Pol I deve scivolare più a valle rispetto all'estremità 3' del primer per incorporare un altro dNTP. Quindi il sito attivo della DNA Pol per questa reazione contiene due siti di legame: il nucleotide presente sullo stampo che si deve appaiare con il dNTP entrante si posiziona nel SITO DI INSERZIONE, l'estremità 3' del primer occupa il SITO DI POST-INSERZIONE. Dopo l'incorporazione del nucleotide la nuova base terminale 3' deve essere traslocata nel sito di post-inserzione, permettendo a un nuovo nucleotide dello stampo di posizionarsi nel sito di inserzione. La traslocazione del DNA può avvenire attraverso lo slittamento dell'enzima o attraverso una sua dissociazione dal DNA seguita da una nuova riassociazione (nel primo caso la reazione sarebbe più rapida e efficiente!). La sintesi del DNA procede con solo un minimo cambiamento di energia libera,

dato che un legame fosfodiesterico è formato alle spese del legame fosfoanidridico (cioè un legame mano stabile). Inoltre, le interazioni non covalenti del nuovo nucleotide con la base appaiata e le interazioni con le basi impilate, forniscono un'ulteriore stabilizzazione che favorisce la corretta incorporazione del nucleotide nel filamento di DNA in allungamento. La Pol I è in grado anche di catalizzare la reazione inversa (chiamata pirofosforolisi), cioè la rimozione di un nucleotide che viene rilasciato come dNTP. Nelle cellule questa reazione è efficientemente bloccata dalla pirofosfatasi, che idrolizza il PPi (reazione energeticamente favorita) e impedendo di fatto la pirofosforolisi che lo richiede. Attività esonucleasica 3'->5' - proofreading Le DNA Pol sono spesso enzimi polivalenti e hanno anche attività esonucleasica. Lo stesso Kornberg si accorse che nonostante i ripetuti tentativi di isolare l'attività esonucleasicadella Pol I, le due opposte a/vità (polimerasica e 5'->3' esonucleasica) sono svolte da due domini separati della stessa proteina. La subunità polimerasica è responsabile della sintesi del filamento di RNA, mentre la subunità esonucleasica è coinvolta nella rimozione dei primi nucleotidi dall'estremità 5' del filamento di RNA appena sintetizzato.