Biologia molecolare

Biologia molecolare

Negli ultimi 50 anni si è assistito ad una vera e propria rivoluzione scientifica che ha visto protagonista l’avvento della tecnologia del DNA ricombinante che ha dato una forte spinta di innovazione nel campo della biologia molecolare.

Alla base del DNA ricombinante ci sono le tecniche di ingegneria genetica che consentono di:

• Isolare
• Analizzare i geni
• Modificare

Questo permette di isolare frammenti di materiale genetico in modo da sottoporli ad eventuali analisi, eventualmente trasferirli nel genoma di altre cellule in modo da moltiplicarli, studiarne la funzione ed e l’espressione.

Ma esattamente perché si rende necessario manipolare il DNA?

• Per conoscerne la sequenza di basi azotate
• Per condurre analisi filogenetiche
• Per conoscere contenuto e localizzazione dei geni, osservando quindi l’organizzazione peculiare di questi ultimi in una determinata specie
• Per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine
• Per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici
• Per lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica
• Per la produzione di proteine ricombinanti
• Per le applicazioni nella terapia genica
• Per la produzione di organismi transgenici.

La tecnologia del DNA ricombinante: clonaggio del DNA

“Clonare” vuol dire produrre copie identiche definite appunto cloni.

In generale, il clonaggio del DNA consiste nella preparazione di un determinato segmento di materiale genetico isolato a partire dal genoma dell’organismo di interesse; successivamente questo frammento viene inserito in una piccola molecola di DNA definita vettore che funge da trasportatore e che ne permette la propagazione/moltiplicazione all’interno di una cellula ospite, es. cellula batterica.

Il risultato è l’amplificazione selettiva di quel determinato frammento di DNA.

Esistono di fatto 2 tipi di clonaggio:

1. Quello definito clonaggio genico propriamente detto, in vivo, che sfrutta enzimi di restrizione e DNA ligasi per l’isolamento del segmento di DNA di interesse e la successiva inserzione in vettori opportuni, i quali vengono introdotti in cellule batteriche in cui avverrà l’amplificazione.
2. Quello nato successivamente, in vitro, nel 1983, che sfrutta l’attività della DNA polimerasi per amplificare un determinato frammento di DNA in un processo definito reazione a catena della polimerasi (PCR).

Per modificare geneticamente le piante

Molto spesso viene adoperato il cosiddetto plasmide Ti, estratto dal batterio del suolo Agrobacterium tumefaciens, capace di infettare le specie vegetali grazie alla trasmissione di un segmento di DNA contenuto in questo plasmide, il T-DNA, che penetra all’interno delle cellule integrandosi nel loro genoma; questo plasmide contiene oltre che i geni alla base del tumore delle piante definito come galla del colletto, anche quelli per la sintesi di amminoacidi inusuali prodotti dal batterio infettante e che solo quest’ultimo è in grado di utilizzare come fonte di nutrimento; opine.

In laboratorio, questo plasmide viene utilizzato come vettore per modificare geneticamente le piante andandovi ad inserire il gene di interesse, mediante enzima di restrizione e DNA ligasi, al posto delle sequenze “dannose” naturalmente presenti in questa molecola. Il plasmide ricombinante viene poi inserito in cellule vegetali in coltura dove il T-DNA potrà integrarsi nel genoma cellulare. Si attende quindi la crescita della pianta che, auspicabilmente, presenterà caratteristiche nuove.

Nella terapia genica

La terapia genica può correggere malattie imputabili ad un singolo gene difettoso, andandolo a sostituire o integrandolo con un allele normale.

Molto spesso vengono utilizzati vettori virali che, preventivamente resi innocui, possono recare il gene sano, isolato a partire ad esempio da cellule di midollo osseo prelevate da un paziente, e, infettando le cellule del midollo osseo, possono integrare il frammento di interesse nel genoma cellulare. Queste cellule recanti quindi il gene sano inserito stabilmente nel materiale genetico, potranno essere iniettate nel paziente malato.

Vettori per la produzione di small interfering RNA (siRNA)

L’interferenza a RNA è un tipo di silenziamento genico basato su un meccanismo fisiologico recentemente scoperto per cui i siRNA dirigono il riconoscimento e la degradazione selettiva di mRNA da parte di un complesso enzimatico definito RISC, effettuando un tipo di regolazione negativa.

Costruire delle librerie genomiche e trascrittomiche

Per conservare tutto il genoma, l’insieme di tutto il DNA cellulare sia nucleare che mitocondriale, o il trascrittoma, la totalità degli RNA trascritti a partire da un genoma, di un organismo in una collezione di cloni, chiamata libreria, viene sfruttata la tecnologia del DNA ricombinante: i tratti di DNA di dimensioni diverse, derivanti ad esempio dalla frammentazione di tutto il genoma, o tutti i trascritti (mRNA) prodotti da una cellula, vengono conservati inserendoli in vettori che successivamente vengono introdotti in cellule ospiti batteriche, ciascuna delle quali conterrà un diverso frammento del genoma di partenza; verranno prodotti quindi numerosi cloni batterici, grazie alla divisione cellulare, ciascuno dei quali conterrà uno specifico frammento amplificato: l’insieme di tutti i cloni batterici che comprendono tutti i segmenti del genoma di partenza, costituisce la libreria.

Lo stesso concetto può essere sfruttato andando ad adoperare vettori fagici: l’insieme dei cloni fagici che nel complesso contengono ciascuno un segmento particolare del genoma frammentato, costituisce la libreria fagica.

Per i progetti GENOMA, gli scopi sono:

• Determinare l’intera sequenza di basi azotate di un organismo
• Identificare tutti i geni di ogni singola specie
• Creare un database
• Sviluppare sistemi di analisi dei dati

La genomica

Branca della biologia molecolare che si divide in:

• Strutturale: si occupa di studiare la struttura del genoma, identificare geni e i loro prodotti di espressione, elementi regolatori ed altre entità informazionali
• Funzionale: studio delle funzioni dei prodotti dei geni, delle loro interazioni, pathways metabolici, e dei meccanismi che ne regolano l’espressione
• Comparata: riguarda il confronto di entità “omologhe” tra specie diverse e ci aiuta ad interpretare l’informazione genica. Genomica strutturale e funzionale traggono grande vantaggio dall’analisi comparativa dei genomi e dei loro prodotti di espressione.

Nella genomica comparata è di fondamentale importanza il concetto di conservazione, concetto che assume senso se riferito all’evoluzione: se un qualcosa, ad esempio un determinato gene, o una determinata sequenza di DNA, è conservato, ovvero preservato nel corso dell’evoluzione, è molto probabile che quel qualcosa abbia una precisa funzione biologica che ne ha permesso il trasferimento nel corso delle generazioni, ad esempio una caratteristica che ha permesso la sopravvivenza dell’organismo o che risulta essere stata vantaggiosa nel corso dell’evoluzione.

Alla base della tecnologia del DNA ricombinante ci sono dei particolari enzimi in grado di tagliare e altri in grado di risaldare.

Cosa sono i vettori? Sono unità di DNA, di dimensioni variabili, capaci di replicarsi autonomamente all’interno della cellula ospite, in cui vengono introdotti, in cui è possibile inserire frammenti di DNA estraneo di interesse. Nella cellula ospite questi vettori saranno in grado di moltiplicarsi, e quindi di moltiplicare anche il frammento di interesse, indipendentemente dai cicli replicativi del cromosoma dell’ospite.

Tra i vettori, quelli più utilizzati sono:

• Plasmidi -- molecole di DNA circolari ed extracromosomiche presenti naturalmente nelle cellule batteriche, in grado di replicarsi autonomamente rispetto al cromosoma batterico.
• Vettori fagici – derivati da particolari virus, batteriofagi, che parassitano i batteri.

Preparazione del materiale per il clonaggio

Esistono diversi tipi di enzimi di restrizione:

1. Tipo I: enzimi complessi con subunità multiple, tagliano il DNA in modo casuale lontano dal sito di riconoscimento anche 1000 pb. Hanno scarso valore pratico in quanto producono frammenti di restrizione non discriminabili e distinguibili come bande definite in gel di agarosio.
2. Tipo II: sono i più utilizzati nella biologia molecolare e in ingegneria genetica in quanto sono in grado di tagliare il DNA in posizioni precise in prossimità o direttamente all’interno del sito di riconoscimento. I frammenti prodotti quindi sono di lunghezze definite e possono essere discriminati mediante elettroforesi su gel. Si tratta di un insieme di proteine non correlate che spesso differiscono completamente tra loro nella sequenza amminoacidica. Inoltre non usano ATP e spesso utilizzano Mg²⁺ come cofattore per la loro attività.
3. Tipo III: tagliano generalmente 20-30 pb al di fuori della sequenza riconosciuta e richiedono inoltre la presenza di due sequenze in orientamenti opposti all’interno della stessa molecola di DNA per realizzare il taglio; utilizzano ATP e raramente realizzano digestioni complete.
4. Tipo IV: riconoscono DNA modificati, tipicamente DNA metilato, e necessitano di Mg²⁺ come cofattore.
5. Tipo V: enzimi di restrizione artificiali.

A questa tipologia appartiene l’endonucleasi Cas9, facente parte del complesso CRISPR, la quale si associa ad una molecola di RNA definita single-guide RNA dirigendo il complesso verso il DNA target da questo specificato.

Questi enzimi di restrizione artificiali sono prodotti in laboratorio associando il dominio di taglio del DNA dell’enzima FokI ad altre proteine in grado di riconoscere e legare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche come le nucleasi a dita di zinco (ZFN); queste ultime lavorano in coppia e la loro dimerizzazione in situ è mediata attraverso il dominio di FokI. Ogni unità di ZFN è in grado di riconoscere circa 12 coppie di basi e ciò si traduce nel complesso in circa 24 pb riconosciute a seguito di dimerizzazione. La specificità di queste nucleasi è accresciuta se presente un distanziatore di circa 5-7 pb tra i siti di taglio.

Gli enzimi di restrizione sono capaci di riconoscere specifiche sequenze palindromiche di DNA, siti di restrizione, e di realizzare successivamente un taglio su ciascuna delle due eliche. Ma cosa sono le palindromi? Sono sequenze a simmetria binaria che presentano la medesima sequenza se letta in direzione 5’ → 3’ su ciascuna delle eliche. Il taglio può lasciare estremità sporgenti, coesive/appiccicose, oppure piatte a seconda dell’enzima di restrizione.

Ad esempio EcoRI, estratto da Escherichia coli, riconosce la sequenza palindromica G/AATTC, che ha infatti come sequenza complementare CTTAA/G, tagliando successivamente, a livello del legame fosfodiesterico nello scheletro zuccherino delle catene, tra guanina e adenina, generando estremità sporgenti, coesive.

AluI, invece, riconosce la sequenza AG/CT tagliando tra guanina e citosina e generando estremità piatte.

La maggior parte degli enzimi di restrizione di tipo II riconosce sequenze teoricamente palindromiche di 4 o 6 nucleotidi, quindi, quelli che riconoscono sequenze di 4 nucleotidi introdurranno un taglio ogni 256 nt (4⁴), mentre quelli che riconoscono sequenze di 6 nt introdurranno, sempre teoricamente, un taglio ogni 4096 nt (4⁶); questo assumendo che la frequenza delle quattro basi nel DNA sia la stessa e che la distribuzione delle 4 basi che compongono il DNA sia casuale, in ogni posizione del DNA ci sarà 1 probabilità su 4 di trovare una delle quattro basi.

Gli enzimi di restrizione isolati da vari procarioti sono più di 3500, mentre le sequenze bersaglio identificate su cui esso agiscono, sono poco più di 200; questa discrepanza si spiega con l’esistenza di enzimi detti isoschizomeri, ovvero enzimi isolati da batteri diversi che però riconoscono la medesima sequenza palindromica. Esempio è FunII isoschizomero di EcoRI.

Isocaudameri

• Si tratta di enzimi di restrizione che riconoscono sequenze bersaglio diverse ma che tagliano producendo estremità identiche: “EcoRV” (Eco R cinque)

Effetto star

• La maggior parte degli enzimi presenta quello che viene appunto definito effetto star, ovvero la possibilità di tagliare in maniera non sequenza-specifica se posti a lavorare in condizioni non ottimali o dopo aver digerito tutti i siti di restrizione presenti; l’enzima si “confonde” ed inizia a tagliare sequenze simili ma diverse da quelle target. Per questo motivo la reazione deve essere bloccata dopo un’ora e questo è possibile mediante una breve incubazione a 65-70°C o con l’aggiunta di EDTA, agente chelante che sottrae Magnesio (?), ecc…

Controllo di una restrizione mediante elettroforesi su gel

• Elettroforesi su gel tecnica analitica utilizzata per separare frammenti di DNA in funzione delle loro diverse dimensioni applicando una differenza di potenziale, mediante due elettrodi, al fluido: questo genera un campo elettrico grazie a cui le molecole cariche, come i frammenti di DNA, possono muoversi all’interno della matrice del gel venendo attratte dall’elettrodo con segno opposto alla loro carica.
• L’agarosio è un polisaccaride altamente purificato ottenuto dall’agar; è in polvere e si scioglie aggiungendolo al tampone bollente. Gelificando forma un reticolo a maglie larghe adatto alla separazione di macromolecole come acidi nucleici, grandi proteine e complessi proteici. La dimensione dei pori dipende dalla concentrazione di agarosio, concentrazione pori più piccoli.
• Generalmente la soluzione tampone utilizzata nell’elettroforesi su agarosio, definita buffer TAE, è costituita da Tris, acido acetico ed EDTA, agente chelante che inattiva le endonucleasi sequestrando ioni bivalenti come il magnesio, necessario al funzionamento, a pH 8.

TAE 1X: 40 mM Tris, 20 mM acido acetico, 1 mM EDTA, pH 8.

• La migrazione è influenzata dal peso molecolare, frammenti più piccoli migrano più velocemente, potendosi insinuare tra i pori della matrice del gel, dalla concentrazione di agarosio, o di poliacrilammide, dalla conformazione del DNA, la forma superavvolta è più veloce perché meno ingombrante, mentre il DNA circolare trova maggiore difficoltà nel muoversi all’interno della matrice. Il DNA lineare invece si colloca a metà, dal voltaggio applicato, dagli intercalanti, come il bromuro di etidio, colorante fluorescente che riduce la velocità di migrazione, e dal tampone elettroforetico.

La ligazione

• La DNA ligasi è un enzima fondamentale nel clonaggio in quanto è in grado di ricostruire il legame fosfodiesterico tra un’estremità 3’-OH e una 5’-P, anche se appartenenti a molecole di DNA diverse, purché temporaneamente vicini. Fisiologicamente, il ruolo della DNA ligasi è quello di saldare i frammenti di Okazaki durante la duplicazione del DNA, oltre che di riparare i nicks a singolo filamento del DNA danneggiato.
• Sia il genoma di E. coli che quello del fago T4 contengono un gene codificante per la DNA ligasi; queste ultime però differiscono per la richiesta di cofattori energetici: ATP per T4, NAD⁺ per E. coli.

La DNA ligasi più utilizzata è quella del fago T4, ATP-dipendente, ottenuta da cellule di E. coli infettate dal fago T4. La temperatura ottimale per la ligasi è di circa 37°C, ma in tali condizioni l’appaiamento tra le basi delle estremità coesive può risultare instabile quindi si fa avvenire tra 4 e 15°C; di fatto quindi la temperatura a cui avviene la ligazione deve essere un compromesso tra il mantenimento dell’appaiamento tra le estremità coesive ed il tasso di attività enzimatica.

DNA ricombinante

• DNA chimerico derivante dall’unione, in provetta, di due tratti di DNA che in natura non sono adiacenti. Come abbiamo già avuto modo di osservare:
• Nel caso di enzimi che tagliano in maniera sfalsata, il frammento tagliato presenterà code a singola elica che potranno appaiarsi, mediante legami a idrogeno, con le code di altri frammenti generati dalla digestione con lo stesso enzima. I due tratti da unire vengono tagliati con il medesimo enzima di restrizione.
• L’appaiamento labile di due frammenti di restrizione con estremità coesive rende più semplice il processo di ligazione.
• Se invece bisogna ligare estremità piatte (blunt), la ligazione è più complessa e si