Biologia molecolare

Caratteristiche dei vettori di clonaggio

Possiedono un'origine di replicazione che ne permette la moltiplicazione indipendentemente dal ciclo di divisione cellulare dell'ospite.

Contengono regioni del DNA non essenziali per la propagazione nei batteri che possono essere sostituite (o interrotte) dall'inserzione di DNA estraneo.

Portano dei geni marcatori (come quelli per la resistenza a specifici antibiotici) che permettono lo screening dei ricombinanti su terreni solidi.

Contengono diversi siti di restrizione unici.

Può essere piccoli e sfruttare l'apparato replicativo dell'ospite; oppure può essere grande e codificare per enzimi specifici.

Plasmidi artificiali

I plasmidi naturali mancano di importanti caratteristiche che sarebbero invece necessarie a garantire la loro funzione di vettori di clonaggio di elevata qualità. Di conseguenza è nata la necessità di...

manipolare geneticamente i vettoriplasmidici, ad esempio inserendo siti di restrizione particolari o eliminando quelli presenti in più copie, rendendoli unici.

I vettori di clonaggio, dunque, si basano su sequenze di DNA naturali che sono state modificate e combinate per svolgere funzioni particolari e sempre più specializzate: in vitro, trascrizione espressione di proteine, per le inserzioni di trasposoni, per costruire librerie geniche, per il clonaggio di frammenti amplificati con PCR. Esistono anche dei vettori definiti shuttle, che contengono più origini di replicazione.

La scelta del vettore dipende molto spesso dalle dimensioni della molecola che deve essere clonata e dallo scopo.

Fago M13 come vettore di clonaggio: il genoma del fago M13 è costituito da una molecola di DNA circolare a singola elica che, a seguito di penetrazione nella cellula batterica, viene convertito nella forma replicativa RF a doppio filamento; la replicazione della forma replicativa

produce nuove molecole a doppio filamento, mentre la replicazione a cerchio rotante permette di produrre numerosissime copie del genoma a singolo filamento del fago: queste copie, dopo aver subito circolarizzazione, vengono utilizzate per costruire le nuove particelle virali che fuoriescono dalla cellula batterica senza causare lisi.

Il clonaggio dei DNA a singolo filamento (ssDNA) può essere utilizzato per sequenziare un inserto di interesse con il metodo enzimatico (o dei dideossinucleotidi o della terminazione di catena) di Sanger.

VETTORI DI ESPRESSIONE

Come dice il nome stesso, questi vettori presentano le informazioni molecolari richieste per trascrivere un DNA clonato in mRNA e tradurlo in proteine.

CARATTERISTICHE DI UN VETTORE DI ESPRESSIONE

- È in grado di replicarsi

- Contiene tutti i segnali necessari ad ottimizzare la corretta trascrizione e traduzione dei geni eterologhi nell'ospite in cui avviene l'espressione.

Per aumentare le rese, si cerca di

ottimizzare la stabilità dei prodotti di espressione, sia a livello trascrizionale che traduzionale.

NUMERO DI COPIE E MODALITÀ DI REPLICAZIONE

I plasmidi si replicano con due modalità diverse:

• Alcuni, generalmente di grandi dimensioni, si replicano seguendo il ciclo di replicazione della cellula ospite e per questo motivo si dicono sottoposti a controllo stringente. In genere sono presenti in una o poche copie per batterio.
• Altri, in genere quelli di piccole dimensioni, si replicano in maniera indipendente dalla replicazione del genoma dell'ospite e dunque si definiscono sottoposti a controllo rilassato. Sono presenti in molte copie, fino a 1000 per batterio.

IL PROBLEMA DELLA SELEZIONE

Necessariamente ogni tipo di clonaggio molecolare implica la ligazione di un inserto con un vettore appropriato e la successiva introduzione del costrutto combinante in un ospite, generalmente un batterio. Questa trasformazione produce 3 tipi di batteri che devono

essere discriminati nel modo più rapido esemplice possibile:

Batteri VUOTI che non hanno integrato affatto il vettore

Batteri CONTENTENTI IL SOLO VETTORE senza l'inserto, a causa della ricircolarizzazione del vettore stesso.

Batteri CONTENTI IL VETTORE RICOMBINANTE, il nostro target.

L'utilizzo di marcatori di selezione, come ad esempio geni per la resistenza a specifici antibiotici, permette facilmente di distinguere i batteri vuoti (che saranno sensibili all'antibiotico) da quelli contenenti il vettore, ricombinante o meno (che invece saranno resistenti).

Non è altrettanto immediato selezionare i cloni ricombinanti da quelli contenenti il solo vettore. Si può ricorrere ad un metodo laborioso come l'ibridazione su colonia (colony hybridization) ma attualmente sono disponibili vettori di clonaggio moderni costruiti per facilitare lo screening dei cloni positivi.

La selezione può anche essere effettuata sfruttando

l'interruzione dell'integrità strutturale e funzionale di un gene di resistenza o di un qualsiasi marcatore, secondo un meccanismo noto come inattivazione inserzionale (vedi dopo).

pBR322, CAPOSTIPITE DEI VETTORI PLASMIDICI ARTIFICIALI

Esempio tipico di vettore di clonaggio, costruito nel 1977 da Bolivar e Rodriguez; per molto tempo è stato uno dei vettori più utilizzati nei laboratori di ricerca. È un vettore di piccole dimensioni, presente in circa 20 copie per cellula batterica con un certo numero di siti unici per enzimi di restrizione.

La sua caratteristica più importante consiste nel possedere 2 geni per la resistenza: uno all'ampicillina e uno alla tetraciclina. Sfruttando la presenza di siti di restrizione all'interno di questi due geni è possibile clonare un inserto al loro interno, identificando i cloni positivi (ricombinanti) selezionandoli per la perdita della resistenza corrispondente (inattivazione inserzionale).

REPLICAPLATING

pUC18,

UN VETTORE PLASMIDICO EVOLUTO

Si tratta di un vettore plasmidico appartenente alla serie pUC, realizzata nel 1982. È più piccolo di pBR322 (2686 bp VS 4363 bp) e presente in maggior numero di copie nell'ospite batterico. Inoltre, rispetto a pBR322, contiene un maggior numero di siti di restrizione utilizzabili (in gran polylinker) parte raggruppati nel rende possibile un'ulteriore modalità di selezione per inattivazione inserzionale: l'alfa-complementazione o screening bianco-blu.

I vettori della serie pUC possono esprimere, sotto il controllo del promotore del lattosio, un piccolo peptide corrispondente alla regione N-terminale dell'enzima β-galattosidasi (frammento alfa) che metabolizza il lattosio; di fatto questi vettori sono in grado di esprimere una porzione del prodotto genico del gene LacZ (appunto la β-galattosidasi). Questo peptide è in grado di complementare la funzionalità enzimatica di β-galattosidasi, in cellule.

di E.coli mutanti che producono β-galattosidasi prive della corrispondente regione N-terminale (ceppo lacZΔM15) a causa di una mutazione nel gene LacZ nel cromosoma dell’ospite. Utilizzando, in terreno solido, un substrato cromogenico come l’X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-betagalattopiranoside), l’attività enzimatica viene recuperata e le colonie appaiono colorate di BLU. Dal momento che il polylinker di pUC è localizzato nel gene che codifica l’alfa-peptide, l’inserzione di un frammento di DNA ne interrompe l’integrità funzionale e la capacità di dare α-complementazione. In questo caso i cloni corrispondenti appariranno BIANCHI e segnalano dunque la presenza di un clone positivo/ricombinante. LacZ. Dal momento che la sintesi di β-galattosidasi è controllata dall’operone per lo screening è necessario, oltre all’X-Gal, anche un induttore (l’isopropil-beta-tiogalattoside, o

IPTG) necessario a rendere inattivo il repressore dell'operone. Inoltre, dal momento che l'operone è represso quando il batterio cresce in presenza di glucosio, sarà necessario impiegare un terreno privo di tale monosaccaride e contenente ampicillina (necessaria per identificare le cellule che hanno introdotto il vettore, sia ricombinante che non).

Terreni di coltura soluzioni contenenti sostanze nutritive su cui è possibile far crescere cellule. Un terreno di coltura può essere reso solido aggiungendo agar all'1,5% (1,5 g su 100 mL), un polisaccaride estratto da un alga rossa che agisce da agente solidificante trasformando il terreno in matrice gelatinosa:

LO SCREENING BIANCO-BLU PERO' NON È UN METODO DI SELEZIONE TOTALMENTE AFFIDABILE!

IL BATTERIOFAGO LAMBDA REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE DEI GENI FAGICI

Una volta infettata la cellula ospite, i geni del fago vengono espressi seguendo un preciso ordine temporale,

necessario ad una efficiente coordinazione deglieventi che porteranno alla produzione della progenie virale. Si riconosconodunque:

• Geni precoci immediati trascritti subito dopo l'ingresso in cellula, codificano per prodotti che bloccano le attività del batterio e indirizzanola cellula verso il ciclo litico o il ciclo lisogeno. La loro trascrizione siarresta nel giro di pochi minuti.
• Geni intermedi o precoci ritardati permettono la successiva replicazione del DNA virale.
• Geni tardivi partecipano la replicazione e ricombinazione del DNA, codificano per le proteine capsidiche, per fattori che partecipanoall'assemblaggio dei virioni e per proteine litiche.

I geni con funzioni correlate sono generalmente raggruppati in modo tale da essere espressi contemporaneamente in un preciso istante del ciclo di replicazione.

Il passaggio da una fase all'altra è geneticamente controllato attraverso la sintesi di nuova RNA polimerasi (T7) o fattori

che alterano la specificità della RNA polimerasi batterica.

RNA polimerasi batterica

CELLULE NON SOFFERENTI - abbondante attività di proteasi cII → instabile → no produzione di cI (repressore) ciclo litico → stabile

CELLULE SOFFERENTI - scarsa attività da parte delle proteasi cII → viene prodotto cI, repressore → mantenimento del ciclo lisogeno

INDUZIONE DEL CICLO LITICO

L'induzione rappresenta una risposta a fattori ambientali (come la luce UV) o mutageni chimici che danneggiano il DNA dell'ospite.

Come risposta al danneggiamento, aumenta la concentrazione di una proteina normalmente responsabile della ricombinazione gene