Biologia molecolare

NEOSCHIZOMERI:

TAGLIANO IN PUNTI DIVERSI DELLA STESSA SEQUENZA.

ES SmaI (CCC/GGG) e XmaI (C/CCGGG)

ISOCAUDAMERI:

TAGLIANO SITI DIVERSI MA LASCIANDO IDENTICHE ESTREMITÀ SPORGENTI

APPLICAZIONI: Creazione di molecole di DNA ricombinante

Mappe di restrizione

• è la prima forma di caratterizzazione di una molecola di DNA.

• Il DNA viene “digerito” con più tipi di endonucleasi di restrizione (digestioni singole

• e multiple);

• i frammenti risultanti vengono separati ed analizzati mediante elettroforesi.

• Le dimensioni delle bande vengono calcolate rispetto ad un riferimento costituito da un

• marker di peso molecolare noto.

Analisi di RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

• Il polimorfismo genetico consiste in differenze nella sequenza di DNA tra individui o alleli

diversi:

differenze nucleotidiche, anche minime, possono generare o eliminare specifici siti di restrizione

dando luogo a frammenti di restrizione polimorfici in lunghezza.

La DNA ligasi

Nelle cellule le DNA ligasi intervengono nella replicazione del DNA (completamento della sintesi

del filamento tardivo), ma anche in altri fenomeni di ricombinazione genica e di riparo del DNA.

In vitro la reazione catalizzata dalla DNA ligasi è di importanza cruciale nella clonazione del DNA,

poichè consente di creare nuove combinazioni dimolecole ricombinanti.

• L’enzima promuove la realizzazione di un nuovo legame fosfodiesterico nella molecola di

DNA.

• Essendo una reazione endoergonica richiede energia fornita dal cofattore NAD+ per le

ligasi batteriche, ed ATP per le ligasi degli eucarioti e dei batteriofagi.

MECCANISMO DI REAZIONE

1. L’ATP reagisce con la DNA ligasi e si lega covalentemente ad un residuo di lisina (viene

rilasciato pirofosfato)

2. L’AMP attivato viene trasferito al gruppo 5’ fosfato del DNA, formando un complesso

intermedio instabile DNA- adenilato (viene rilasciato l’enzima libero).

3. Attacco nucleofilico del gruppo 3’ OH del DNA all’atomo di fosforo attivato dall’AMP e

formazione del nuovo legame fosfodiesterico (viene rilasciato AMP).

PARAMETRI DI REAZIONE

> velocità: la reazione catalizzata dalla DNA ligasi avviene in due passaggi consequenziali

strettamente associati:

1. Le estremità complementari si incontrano e restano unite. Questo passaggio può

richiedere molto tempo e pertanto determina la velocità globale della reazione.

2. La DNA ligasi forma un legame fosfodiestere nel DNA,secondo il meccanismo visto in

precedenza.

La reazione è tanto più veloce quanto più forte è il legame che tiene unite le estremità compatibili.

> temperatura: L’attività della DNA ligasi di E. coli e del fago T4 è massima a 37°C, ma nella

ligazione di estremità piatte a questa temperatura il moto termico delle molecole potrebbe essere

troppo tumultuoso.

Per stabilizzare il legame tra le estremità, è vantaggioso condurre la reazione a temperature

inferiori, tra 4 - 16°C.

La scelta della temperatura dipende anche dalla Tm delle regioni da saldare, quindi dal contenuto

Nucleotidico

E.coli DNA ligasi

• La DNA ligasi di E. coli è un enzima NAD+ dipendente, ed agisce solamente su molecole di

DNA a doppio filamento.

• L’enzima si purifica da ceppi di E. coli che sovraesprimono il gene lig clonato.

APPLICAZIONI:

> Chiusura dei “nick” nella sintesi del cDNA

> Saldatura di estremità coesive, in alternativa alla T4 DNA ligasi (la reazione è meno efficiente, ma

più accurata).

T4 DNA ligasi

La DNA ligasi del fago T4 è un enzima ATP dipendente, in grado di saldare molecole di DNA,

RNA e molecole ibride di DNA-RNA.

Inizialmente purificata da cellule infettate con T4, ora l’enzima si purifica da ceppi di E. coli che

sovraesprimono il gene 30 clonato.

APPLICAZIONI:

> Saldatura di estremità coesive

> Saldatura di estremità piatte: la giunzione di estremità piatte è la reazione più inefficiente tra

quelle catalizzate dalla DNA ligasi.

Ciò dipende dalla natura del substrato, più che da una scarsa affinità dell’enzima.

Si può aumentare l’efficienza della reazione con:

> alta concentrazione di estremità

> concentrazione di enzima molto alta

> presenza di agenti addensanti (es. PEG)

Legature di estremità piatte

• L’enzima deossinucleotidil transferasi terminale (purificata per la prima volta dal timo di

vitello) è una DNA polimerasi che catalizza l’incorporazione di deossinucleotidi all’estremità

3’ in assenza di un DNA stampo.

• Molto efficiente su DNA a singolo filamento, è efficiente su DNA a doppio filamento solo in

presenza di ioni Co2+, poco efficiente con substrati di RNA.

VETTORI DI CLONAGGIO

•possono replicarsi indipendentemente insieme ai segmenti di DNA estraneo che trasportano, in

quanto hanno una loro origine di replicazione (ori)

•contengono un certo numero di siti di taglio per endonucleasi di restrizione che sono presenti

una volta soltanto nel vettore

•portano un marcatore selezionabile (gene di resistenza ad un antibiotico o che non è presente

nella cellula ospite)

•facilmente recuperabili dalla cellula ospite

•Contengono regioni del DNA non essenziali per la propagazione nell’organismo ospite che

possono essere o sostituite o interrotte dall’inserzione di DNA estraneo

TIPI DI VETTORI

I plasmidi

•Sono piccole molecole di DNA per lo più circolare a doppio filamento presenti nei batteri, in

alcuni funghi e in alcune piante superiori

•Sono extracromosomici, indipendenti, capaci di autoreplicarsi

•Ipotesi di origine simbiontica

•2-100 kb

•Portatori di resistenza ad antibiotici

•Opportunamente modificati, diventano vettori di clonaggio

❖ I plasmidi si replicano autonomamente.

❖ Esempi di plasmidi batterici naturali sono i plasmidi ColE1 di E.coli, i plasmidi Sym di

rhizobium, i plasmidiTi o Ri di Agrobacterium.

❖ Nell'ospite batterico i plasmidi si presentano come molecole circolari superavvolte, che

possono rilassarsi o linearizzarsi in seguito a rotture a singolo o a doppio filamento.

I vettori plasmidici sono caratterizzati da sequenze e regioni specifiche:

1. Una sequenza ORI (origine di replicazione che permette al plasmide di replicarsi nelle

cellule batteriche).

2. Un marcatore selettivo, un gene che conferisce resistenza ad un antibiotico (tetraciclina,

ampicillina).

Ossia in presenza di antibiotico la cellula batterica contenente plasmidi resistenti si

moltiplicheranno, quella che contiene plasmidi che non hanno resistenza moriranno.

3. Siti unici di taglio per gli enzimi di restrizione

pBR322, 1977 Bolivar e Rodriguez ed é stato per molti anni uno dei vettori più utilizzati nei

laboratori di ricerca.

•E' un vettore di piccole dimensioni, presente in circa 20 copie per cellula batterica, con un certo

numero di siti unici per enzimi di restrizione.

•Ha due geni di resistenza, uno all'ampicillina e uno alla tetraciclina.

• é possibile clonare un inserto all’interno di un gene per la resistenza e identificare i cloni positivi

selezionandoli per la perdita della resistenza corrispondente (INATTIVAZIONE INSERZIONALE).

Un’ ulteriore evoluzione dei vettori di clonaggio é rappresentata dalla serie pUC, costruita nel 1982

da J. Messing e collaboratori.

E' un plasmide più piccolo, presente nell'ospite batterico in un alto numero di copie.

Rispetto a pBR322 contiene più siti di restrizione utilizzabili (in gran parte presenti in un'unica

regione chiamata polylinker o multi cloning site) e specialmente un’altra forma di selezione per

inattivazione inserzionale nota come α-complementazione o selezione bianco-blu.

saggio di α-complementazione prevede che due peptidi inattivi dell’enzima β-galattosidasi si

associno in vivo e formino un enzima funzionale.

Il sistema funziona solo in presenza di coppie opportune di plasmide-ospite:

• il plasmide codifica il peptide α (primi 146 aminoacidi della β-galattosidasi, gene lacZ’)

• Il batterio ospite porta la cosiddetta delezione M15 nel gene lacZ e codifica un peptide ω

privo degli aminoacidi 11-41 del terminale

•α complementazione

•I plasmidi esprimono il frammento N terminale della β-galattosidasi

(lacZ5’)

•La cellula ospite E.coli esprime il frammento C terminale dell’enzima

(lacZ3’)

•I frammenti N terminale e C terminali si uniscono e 4 subunità formano un enzima tetramerico

funzionante

LIMITE DELLA SELEZIONE BIANCO-BLU:

> falsi positivi

Può accadere che colonie bianche risultino in realtà contenere solo vettori vuoti.

È sufficiente, infatti, la delezione di anche una sola base per modificare lo schema di lettura della

proteina, facendo perdere completamente l’attività enzimatica.

> falsi negativi

Se l’inserto è relativamente piccolo e risulta inserito in registro con lo schema di lettura della

ß’galattosidasi o dell’ α -peptide, si può formare una proteina di fusione parzialmente o

totalmente attiva.

In questo caso, dunque, un clone ricombinante con un inserto correttamente inserito, manterrà

comunque attività ß’galattosidasica e produrrà colonie blu.

È sempre opportuno, quindi, selezionare un piccolo numero di colonie bianche, putativamente

positive, e sottoporle ad ulteriore analisi con altri metodi (PCR colony, ibridazione,…).

FAGI

I batteriofagi furono descritti per la prima volta intorno alla seconda decade del '900, come

placche di lisi osservabili su popolazioni batteriche cresciute a confluenza su terreni solidi.

Ciascuna placca rappresenta una popolazione clonale.

A partire dalla scoperta iniziale sono stati isolati e caratterizzati numerosi batteriofagi, ciascuno

con differenze genetiche e strutturali.

Per esempio il fago λ capace di integrarsi nel genoma batterico sfruttando delle integrasi virali, o il

batteriofago µ, che si integra a caso nel cromosoma batterico sfruttando l'enzima transposasi.

Il batteriofago λ, il fago di maggior interesse in Biologia molecolare, può utilizzare due stili di vita

all'interno del batterio:

> il ciclo litico

il batteriofago replica il proprio corredo genetico, si assembla in virione maturo e lisa la cellula

uccidendola.

> il ciclo lisogeno

il fago é capace di integrare il proprio DNA nel cromosoma batterico, mantenendolo in uno stato

profagico inattivo e non dannoso per l'ospite ba