Biologia molecolare

Biologia molecolare

Introduzione

Biologia molecolare terza versione, Cea, F. Amaldi, P. Benedetti, G. Pesole, P. Plevani

DNA nel nucleo della cellula eucariotica
DNA adeso alla parete nei procarioti → Dogma centrale prevede che l’informazione fluisca dagli acidi nucleici alle proteine e non viceversa → Il flusso di informazione procede soltanto in una direzione: dal DNA all’RNA, alle proteine.

Il DNA

Dalla sua prima estrazione dalle bende sporche come nucleina, fino alla definizione di esso come materiale genetico universale e al chiarimento della sua struttura a doppia elica nel 1953.

Il DNA è il materiale ereditario: ciascun cromosoma è una singola molecola di DNA e i geni → sono sequenze di DNA il DNA non svolge un ruolo attivo.

In tutti gli organismi le basi dell’ereditarietà sono contenute nel genoma, una lunga sequenza di DNA che fornisce la serie completa di informazioni ereditarie → Cromosoma: unità discreta (modalità con la quale la cellula divide il DNA nelle cellule figlie) del → genoma, contenente molti geni è un'unica molecola duplex, è visibile come unità nella divisione cellulare.

Gene strutturale: gene che codifica un prodotto di RNA o un polipeptide che non è regolatore DNA → sequenza di nucleotidi → RNA sequenza di nucleotidi → Polipeptide sequenza di amminoacidi.

Il DNA è materiale genetico di batteri, virus e cellule eucariotiche.

Esperimenti chiave

• Esperimento di Griffith → Principio trasformante: trasferimento di un componente dei batteri S patogeni permetteva ai batteri R non patogeni di costituire la parete polisaccaridica ed evadere la difesa immunitaria dell’ospite.
• Poi l’esperimento di Avery, McLeod e McCarty dà la risposta finale: è il DNA il principio trasformante (solo il DNA era in grado di operare la trasformazione).
• Esperimento di Chase e Hershey usano il batteriofago e un isotopo radioattivo dello zolfo e del fosforo → dimostrano che il materiale genetico di un virus che infetta i batteri (batteriofago T2) era il DNA.

Struttura degli acidi nucleici

1953 Watson e Crick si sono basati su:

• Analisi di diffrazione dei raggi X di Rosaline Franklin.
• Struttura alfa elica delle proteine di Pauling.
• Confutazione ipotesi tetranucleotide Levene.

Struttura del DNA

È una lunghissima sequenza di coppie di basi organizzate in una struttura a doppia elica simile a una scala a chiocciola.

Le basi sono disposte quasi perpendicolarmente rispetto all’asse della doppia elica.

Puo piegarsi e ruotare come un’elica, formare gobbe, arrotolare, inclinare, oscillare, allungare.

Struttura primaria

DNA = acido desossiribonucleico, deriva dalla denominazione di un acido riscontrato nel timo di vitello.

RNA = acido ribonucleico, fu trovato nel lievito.

Gli acidi nucleici sono una lunga catena o polimero di subunità ripetitive, chiamate nucleotidi:

• Zuccheri a cinque atomi di carbonio.
• Basi azotate nucleotide.
• Gruppo funzionale fosfato → i nucleotidi usati per la sintesi del DNA, sono trifosfati.

Zuccheri a 5 atomi di carbonio

• Ribosio RNA → Desossiribosio DNA → Entrambi i pentosi hanno un ossigeno nell’anello, mentre il C 5 è fuori dall’anello.
• Si differenziano per la presenza del gruppo OH al C 2 del ribosio, assente nel desossiribosio (importante → per la funzione).
• Questo gruppo OH conferisce instabilità alle molecole di RNA → il DNA ha un H in quella stessa posizione e quindi è più stabile.

Base azotata

• Contengono azoto → Hanno proprietà chimiche di una base, sostanza che accetta uno ione H+ o un protone.
• Purine: Adenina, guanina (due anelli, uno purinico e uno imidazolico) → Timina, Pirimidine: citosina e uracile (RNA) (struttura ad anello singolo).
• In posizione 5 nella timina c’è un gruppo metilico, nell’uracile no → la citosina ha un NH2 nel C4.

Modificazioni post-trascrizionali

• Inosina: base che si trova nei ribonucleotidi, simile all’adenina ed è molto presente nell RNA transfer.
• 7 Metilguanosina: ha un gruppo metilico in 7, la troviamo nell’RNA maturo.
• Simile pseudouridina: all’uracile.
• Queste modificazioni consentono interazioni diverse con le proteine, per esempio.

Gruppo funzionale fosfato

• Fosfato conferisce al DNA e RNA le proprietà di un acido → sostanza che rilascia uno ione H+ o un protone in soluzione a PH fisiologico.
• Formano legami esteri stabili → Sono scissi da idrolisi enzimatica.
• Sono coinvolti nel legame fosfodiestere dove permane la carica negativa in quanto l’atomo di ossigeno del gruppo fosfato è ancora ioni negativamente.
• I fosfati carichi negativamente sono insolubili nei lipidi, questo assicura la ritenzione degli acidi nucleici all’interno della membrana cellulare o nucleare.
• Il legame tra due fosfati avviene tramite il legame fosfodiestere, la sua rottura viene effettuata da nucleasi e può essere riaggiustato dalla ligasi o durante processi di riparazione del DNA.
• Le cariche negative dei gruppi P in vitro sono neutralizzate da ioni metallici (Na+), mentre nella cellula sono neutralizzate da proteine cariche positivamente.
• I nucleotidi possono portare il gruppo fosfato in posizione 5’ o 3’.

Nucleosidi e nucleotidi

Una catena di DNA o di RNA si forma in una serie di passaggi:

• Una base è unita chimicamente a livello del carbonio 1 dello zucchero (da una legame glicosidico) all’N 1 della pirimidina o N9 della purina, formando il nucleoside.
• Uno o più gruppi fosfato si legano al carbonio 5 dello zucchero, formando il nucleotide.
• Tra uno zucchero e l’altro c’è un solo gruppo fosfato e quindi si tratta di un polimero di nucleosidi monofosfato → infatti durante la sintesi degli acidi nucleici, ciascun nucleoside trifosfato usato come substrato, perde due dei suoi gruppi fosfato.

Nucleotide: Zucchero + Gruppo fosfato + Base azotata.
Nucleoside: Zucchero + base (la base si lega alla posizione 1 dello zucchero) → può essere monofosfato, difosfato e trifosfato (i nucleotidi usati come substrato per la sintesi del DNA e dell’RNA hanno tre gruppi fosfato legati in posizione 5’).

Polinucleotide

È una lunga catena di nucleotidi collegati zucchero-fosfato 5’-3’ che formano un’ossatura da cui sporgono le basi.

• Un'estremità ha un gruppo P 5’ libero.
• Un'estremità ha un gruppo OH 3’ libero.

È acido dal DNA la carica negativa, questa carica lo porta a rimanere nel nucleo, perché c’è una repulsione di cariche negative con la membrana plasmatica.

I nucleotidi si uniscono a formare un polimero, sono legati da legami fosfodiesterici tra l’OH al 3’ e il → gruppo fosfato legato al 5’ del nucleotide successivo (5’-3’) con liberazione di una molecola di pirofosfato → da questa impalcatura protrudono lateralmente le basi azotate si forma un impalcatura, uno scheletro, in cui si alternano zuccheri e gruppi fosfato (questa struttura va a comporre le assi della scala a chiocciola).

Estremità della catena

• 5’ è il C dello zucchero a cui è attaccato il Po4
• 3’ è il C dello zucchero a cui è attaccato il gruppo funzionale OH

Polarità del filamento

Il filamento ha una polarità: (5’ → 3’)

• Da una parte c’è un nucleotide che ha il carbonio 5’ libero (porta un gruppo fosfato), mentre il carbonio 3’ è impegnato nel legame fosfodiesterico con il nucleotide adiacente.
• Dall’altra la molecola polimerica termina con un nucleotide che ha il carbonio 5’ impegnato nel legame fosfodiesterico con quello adiacente mentre il carbonio 3’ è libero (porta un gruppo OH).

Nomi derivati dalle basi del DNA

Lunghezza del DNA

Per esprimere la lunghezza di una sequenza di acido nucleico si usa il numero dei nucleotidi o delle coppie di basi. Un DNA può raggiungere centinaia di milioni di nucleotidi.

Oligonucleotidi → breve catena di DNA a singolo filamento.

Regola di Chargaff

• La percentuale di A è sempre uguale alla percentuale di T
• La percentuale di C è sempre uguale alla percentuale di G (A = T, C = G)

Struttura a doppia elica

→ 3,4 nm distanza delle basi
→ 34 nm misura di un intero giro di elica che comprende 10,5 coppie di basi
→ Diametro della molecola di DNA, 2 nm.

L’elica presenta un’asimmetria dovuta alla posizione delle molecole di desossiribosio ai lati delle basi, questa asimmetria genera due solchi di diverse dimensioni:
→ Solco minore 12 A
→ Solco maggiore 22 A: ha molti atomi che possono essere donatori o accettori di legami idrogeno.

L’alfa elica delle proteine ha la dimensione giusta per interagire con il solco maggiore.
Quasi tutte le proteine che si legano in modo specifico al DNA hanno domini ad alfa elica che riconoscono le sequenze esposte nel solco maggiore.

Entrambi sono molto importanti per il riconoscimento della sequenza del DNA.

La molecola di DNA ha un peso molecolare molto alto
La densità suggerisce che l’elica contiene 2 catene polipeptidiche
Il diametro costante rivela che le basi sono rivolte all’interno e che una purina è sempre appaiata con una pirimidina per questioni di spazio
Le due catene sono antiparallele
Le 2 catene polinucleotidiche sono appaiate tra loro secondo la regola della complementarietà
Tanto C + G (triplo legame H) > saranno questi legami e maggiore stabilità avrò
A + T (doppio legame H)
La stabilità della doppia elica è data anche dalla forza di repulsione dell’acqua.

Modello di Watson e Crick

• Le doppio filamento basi complementari si trovano in filamenti opposti e sono legate da legami idrogeno.
• La doppia elica del DNA ha una struttura regolare, destrosa.
• Le basi azotate si legano tra di loro e evitano che la loro componente idrofobica sia esposta all’esterno a contatto con l’acqua, quindi è rivolta verso l’interno.
• L’informazione del DNA è doppia.

Le basi di Hoogsteen

• Tipo di legame dove la purina può ruotare di 180 gradi rispetto al legame con lo zucchero.
• Questo può avvenire quando la soluzione è leggermente acida perché la citosina deve essere protonata o in seguito a modificazioni che il DNA subisce.
• Le basi di Hoogsteen si possono trovare per esempio nelle triple eliche dove un terzo filamento di T, può legarsi ad una doppia elica A-T di Watson e Crick.
• Inoltre si possono trovare anche nell’RNA tra G e U.

Forme alternative del DNA

• Si possono osservare forme transitorie alternative in cui alcuni pioli della spirale classica si separano e riassemblano in strutture stabili differenti dagli accoppiamenti di Watson e Crick.
• Queste coppie di basi sono state osservate in doppi filamenti di DNA, quando la molecola è legata a proteine o farmaci o quando il DNA era danneggiato.
• Anche in circostanze normali, alcune sezioni del DNA tendono a deformarsi in una struttura alternativa detta stato eccitato.

Stabilità della doppia elica

Le catene polinucleotidiche singole hanno una parte idrofilica (scheletro zucchero-fosfato) + Parte idrofobica (basi).

• I due scheletri zucchero – fosfato (idrofilici) con le catene negative dei fosfati, si dispongono all’esterno della struttura, a contatto con l’acqua.
• Le basi (idrofobiche) si dispongono all’interno → i due scheletri con atomi di fosforo carichi negativamente tendono a respingersi: questa repulsione viene controbilanciata da:
• Legami idrogeno.
• Effetto idrofobico dovuto all’impilamento (stacking) delle basi → le coppie di basi adiacenti presentano sovrapposizione anche se non completa a causa della rotazione dell’elica.

La stabilità della doppia elica in soluzione non è uguale per tutti i DNA e dipende quindi da:

• Composizione in basi del DNA → un DNA ricco in coppie di G-C con tre legami idrogeno sarà più stabile.
• Dalla sequenza di nucleotidi nel DNA → l’effetto idrofobico dipende dall’impilamento e quindi dalla sovrapposizione di coppie di basi adiacenti → quanto due coppie sono sovrapposte dipende dalla particolare sequenza di nucleotidi.

A causa appunto delle interazioni di impilamento tra le basi e ai gradi di flessibilità che hanno i legami chimici dei nucleotidi, il parallelismo tra due coppie non è mai perfetto.

Questo impilamento impone uno scivolamento laterale (slide) di una coppia di basi rispetto all’altra o un avvitamento (twist). La soluzione prescelta dal DNA è la seconda.

Le basi appaiate sono piatte e si impilano l’una sull’altra per mezzo di una torsione elicoidale (ogni base ruota 36 gradi intorno all’asse) → Questo impilamento elimina lo spazio libero tra le basi escludendo l’acqua dall’interno della doppia elica.

Nucleo idrofobico: basi impilate.

• Zuccheri e fosfati (idrosolubili) si orientano esternamente: i gruppi P polari interagiscono con l’ambiente polare.
• L’energia dell’impilamento delle basi fornisce stabilità chimica alla doppia elica.

Gli orbitali π degli anelli aromatici delle basi tendono a formare legami deboli che stabilizzano l’elica. Esistono tre variazioni del parallelismo tra le basi:

• Twist → è l’angolo tra due coppie di nucleotidi rispetto all’asse della doppie elica.
• Roll → inclinazione, dovuta alle forze di repulsione tra due coppie di nucleotidi.
• Tilt → l’angolo che si forma rispetto all’asse dello scheletro zucchero-fosfato → queste influenzano il DNA che può diventare curvo in basi alla ripetizione di particolari sequenze.

Inoltre grazie alla doppia elica, si ha una protetta conservazione dell’informazione genetica → ed è possibile individuare e correggere errori e rotture che possono prodursi nel genoma.

Scanalatura principale

• → 22Å(2,2nm) Scanalatura principale (solco maggiore).
• → 12Å(1,2nm) scanalatura secondaria (solco minore).

La spaziatura zucchero-fosfato non è uniforme perché le eliche appaiate sono antiparallele.

Importante per interazioni sequenze specifiche DNA-proteine: gli atomi N e O delle basi sono accessibili, possono reagire con le catene laterali degli amminoacidi. La maggior parte dei fattori di trascrizione si lega nella scanalatura principale.

Tipologia di DNA

DNA A

• Destroso.
• Le coppie di basi hanno una maggiore angolatura e ce ne sono di più a giro (11).
• Non è presente in lunghe sezioni della cellula.
• Si riscontra nel DNA duplex in condizioni artificiale di bassa umidità ma anche in vivo → nei duplex di RNA e in eteroduplex di RNA/DNA.
• Si forma se si riduce l’umidità relativa in cui si trova la fibra di DNA.

DNA B

• Destroso, le basi sono quasi perpendicolari rispetto all’asse.
• Poiché l’interno della cellula è costituito di acqua e ha una concentrazione salina bassa è la forma predominante in vivo.
• È una struttura media perché subisce variazioni.

DNA Z

• Ha una struttura a zig zag.
• È stabile in condizioni fisiologiche se si aggiungono gruppi metilici alle citosine.
• È presente in porzioni ricche in GC.
• Ha un ruolo nella regolazione di espressione genica e ci sono gruppi di proteine con cui interagisce.
• È generato da un cambiamento di orientamento del legame glicosidico tra guanina e desossiribosio.
• Inoltre lo zucchero e la base si trovano in conformazione syn (mentre nel DNA B in “anti”) → l’alternanza tra conformazioni anti e conformazioni syn di nucleotidi contigui causa l’andamento a zigzag.

Denaturazione o fusione reversibile del DNA

È lo svolgimento e la separazione dei filamenti di DNA.

• Si verifica quando si rompono i legami idrogeno.
• In vivo avviene molto velocemente.
• Può essere indotta in vitro aumentando la temperatura → i legami fosfodiesterici restano intatti.
• Con l’aumento dell’agitazione termica, si supera la forza dei legami idrogeno, delle interazioni idrofobiche e delle altre altre forze.

Aumenta l’assorbimento alla luce UV a 260 nm del 40%. Le basi impilate fanno diminuire l’assorbanza (assorbanza data dall’anello aromatico delle base).

Abbassando la temperatura il DNA si rinatura, si può ibridare anche un DNA di diversa fonte, ma → se complementare (sonde) c’è una porzione complementare due filamenti si possono appaiare anche se hanno origine diversa → avviene.

Appaiamento basi sia nel DNA duplex che in interazioni intra e intermolecolari in RNA (o DNA) a singolo filamento.

Costituisce annealing o ibridazione = capacità di due molecole (RNA o DNA) di ibridare tra loro un test preciso della loro complementarietà.

Ibridazione

• DNA-DNA
• RNA-RNA
• DNA-RNA (es. nei retrovirus viene sintetizzato DNA a partire da RNA, quindi c’è questo ibrido, grazie alla trascrittasi inversa).

TM Temperatura di melting

È la temperatura di fusione alla quale il DNA è presente al 50% nella forma ibridata (a doppio filamento) e al 50% nella forma rinaturata.